Ocena jakości nasienia wśród mężczyzn południowo-wschodniej Polski w latach

GinPolMedProject 4 (42) 2016: 065-070 ARTYKUŁ ORYGINALNY Ocena jakości nasienia wśród mężczyzn południowo-wschodniej Polski w latach 2003-2013 Agnieszka Leszcz 1 (ABCDEF), Marzena Rzeszowska 1 (BE), Lechosław Putowski 1,2 (E), Joanna Tkaczuk-Włach 1,2 (DE), Grzegorz Polak 1,3 (ADE) 1 Ab ovo Sp. z o.o., NZOZ Centrum Zdrowia Rodziny, ul. Bociania 6, 20-542 Lublin 2 Katedra i Klinika Ginekologii i Endokrynologii Ginekologicznej UM w Lublinie, Lublin 3 I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii UM w Lublinie (SPSK Nr 1), Lublin STRESZCZENIE WKŁAD AUTORÓW: (A) Projekt badania (B) Zbieranie Danych (C) Analiza Statystyczna (D ) Interpretacja Danych (E ) Przygotowanie Rękopisu (F ) Gromadzenie Piśmiennictwa (G ) Gromadzenie Funduszy Wstęp. Problem niepłodności w Polsce dotyczy około 1,5 mln par. Ocenia się, że przyczynę 40-60% zaburzeń rozrodu stanowi czynnik męski. Na przestrzeni ostatnich lat obserwuje się spadek jakości nasienia. Postuluje się udział w tym zjawisku czynników zewnętrznych takich jak: stres, niewłaściwa termoregulacja jąder, narażenie na metale ciężkie i ksenoestrogeny, spożywanie alkoholu, palenie papierosów, jak również zażywanie narkotyków. Cel pracy. Analiza parametrów nasienia pacjentów Ab ovo, Centrum Zdrowia Rodziny w Lublinie w latach 2003-2013. Materiał i metody. Badaniami objęto 4235. mężczyzn diagnozowanych z powodu niepłodności w latach 2003-2013. Parametry nasienia oceniono zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia. Wyniki. Analiza wykazała istotny statystycznie malejący trend dla koncentracji i prawidłowej morfologii plemników. Średnia koncentracja plemników w grupie wiekowej 18-29 lat obniżyła się z 42,31 mln/ml w roku 2003 do 23,80 mln/ml w 2013 roku. W grupie wiekowej 30-40 lat, średnia koncentracja zmniejszyła się z 47,05 mln/ml w roku 2003 do 24,17 mln/ ml w 2013 roku. Średnia procentowa liczba prawidłowych form plemników obniżała się rocznie o 2,2665% i 2,3505% odpowiednio dla grup wiekowych 18-29 lat i 30-40 lat. Wnioski. Wyniki badań są zgodne z ogólnie obserwowanym światowym trendem spadku jakości nasienia. Słowa kluczowe: niepłodność; nasienie; koncentracja plemników; morfologia plemników Adres do korespondencji: Grzegorz Polak Ab ovo Sp. z o.o., NZOZ Centrum Zdrowia Rodziny ul. Bociania 6, 20-542 Lublin Tel.: +48 081 527 71 36; e-mail: g.polak@ab-ovo.pl Liczb słów: 1453 Tabele: 2 Ryciny: 2 Piśmiennictwo: 42 Received: 29.09.2016 Accepted: 07.10.2016 Published: 12.12.2016 WSTĘP Niepłodność definiuje się jako niemożność uzyskania ciąży po roku regularnego współżycia płciowego bez stosowania środków antykoncepcyjnych. Szacuje się, że problem ten dotyczy około 15% populacji, czyli około 1 milion par w Polsce [1]. Za przyczynę około 40-60% przypadków niepłodności uznaje się czynnik męski [2]. Pod koniec minionego stulecia pojawiły się liczne doniesienia o globalnym spadku jakości nasienia. Wykazano, że w latach 1938-1990 średnia koncentracja plemników zmniejszyła się z 113 do 66 mln/ml, co odpowiada spadkowi o około 1% rocznie. Jednocześnie średnia objętość ejakulatu zmniejszyła się z 3,4 do 2,8 ml [3]. Także w badaniach porównawczych obejmujących lata 1934-1996, Swan i wsp. [4] wykazali istotny spadek jakości nasienia. Uzyskane wyniki zostały potwierdzone przez rezultaty badań przeprowadzonych w innych krajach (tab.1.). Za jedną z głównych przyczyn pogarszającej się płodności mężczyzn uważa się działanie czynników zewnętrznych. Wiele form stresu, w tym również stres psychologiczny może wpływać na płodność mężczyzn. Zarówno łagodny, jak i silny stres powoduje obniżenie stężenia testosteronu we krwi oraz zaburza spermatogenezę [5]. Analiza związku pomiędzy jakością życia ocenioną kwestionariuszem Campbella, a parametrami nasienia wykazała istotną dodatnią korelację. Podatność na stres oraz obniżenie jakości życia związane z nastrojem niejednokrotnie prowadzącym do depresji, może prowadzić do wtórnej niepłodności [6]. Zaobserwowano także negatywny wpływ stresu zawodowego na objętość ejakulatu i liczbę plemników o ruchu progresywnym [7]. Zjawisko niepłodności częściej dotyczy mężczyzn, u których występuje niewłaściwa termoregulacja jąder. Środowisko pracy, siedzący tryb życia, korzystanie z sauny i gorących kąpieli, użytko- 65

GinPolMedProject 4 (42) 2016: 065-070 Tab. 1. Przegląd piśmiennictwa dotyczącego spadku jakości nasienia Rok publikacji Autorzy Liczba przebadanych pacjentów Przedział czasowy Kraj Wnioski 1995 Auger et al. [29] 1351 1973-1992 Francja Średnia koncentracja plemników obniżała się o 2,1% rocznie Ruchliwość plemników zmniejszyła się o 0,6% rocznie Liczba prawidłowych form plemników obniżyła się o 0,5% rocznie 1996 Irvine et al. [31] 577 1984-1995 Szkocja Mediana koncentracji plemników obniżyła się z 98 mln/ml w 1959 roku do 78 mln/ml w 1970; koncentracja obniżała się o 2,1 % rocznie Ogólna liczba ruchliwych plemników w ejakulacie obniżyła się z 169 mln do 129 mln 1996 Adamopoulos et al. [32] 23850 1977-1993 Grecja Średnia koncentracja plemników wynosiła 51,07 mln/ml w roku 1977 i obniżyła się do 39,32 mln/ml w 1993 r. 2003 Almagor et al. [33] 2638 1990-2000 Izrael Liczba plemników zmniejszała się o 5,2 mln rocznie Ruchliwość obniżała się o 0,5% rocznie 2008 Shine et al. [34] 975 1987-2007 Nowa Zelandia Średnia objętość ejakulatu zmniejszyła się z 3,7 do 3,3 ml w ciągu 20 lat Średnia koncentracja plemników obniżyła się z 110 mln/ml w 1987 do 50 mln/ml w 2007 2009 Feki et al. [36] 2940 1996-2007 Tunezja Średnia objętość nasienia obniżyła się z 3,5 ml w 1996 do 3,2 ml w 2007 Średnia koncentracja plemników obniżyła się z 102,9 mln/ml w 1996 do 96,1 mln/ml w 2007 Średnia prawidłowych form plemników zmalała o 26,1% 2010 Mukhopadhyay et al. [39] 3729 1981-1985 2000-2006 Indie Mediana objętości spermy obniżyła się z 2,7 ml w 1980 do 2,5 ml w 2000 roku Mediana koncentracji plemników zmniejszyła się z 80 mln/ml do 77 mln/ml Mediana ruchliwych plemników obniżyła się od 1980 do 2000 o 5% 2011 Jørgensen et al. [35] 858 1998-2006 Finlandia Mediana objętości ejakulatu obniżyła się z 3,4 (mężczyźni urodzeni między 1979-81) do 3,3 ml (mężczyźni urodzeni w 1987) Mediana koncentracji plemników wynosiła 67, 60 i 48 mln/ml u mężczyzn urodzonych kolejno w latach 1979 81, 1982 83 i 1987 Mediana prawidłowych plemników obniżyła się z 9,8 do 8,6% 2013 Rolland et al. [30] 26609 1989-2005 Francja Koncentracja plemników dla 35.letniego mężczyzny w roku 1989 wynosiła 73,6 mln/ml i obniżyła się do 49,9 mln/ml w roku 2005; koncentracja obniżała się o 1,9 % rocznie Średnia prawidłowych plemników zmniejszyła się o 21,7% 2013 Borges et al. [41] 2300 2000-2002 2010-2012 Brazylia Średnia objętość nasienia obniżyła się z 3,4 ml w 2000-2002 do 3,3 ml w 2010-2012 Średnia koncentracja zmniejszyła się z 67,1 do 26,7 mln/ml Średnia prawidłowych plemników obniżyła się z 4,6% do 2,7% 66

A. Leszcz et al. Ocena jakości nasienia wśród mężczyzn południowo-wschodniej Polski wanie laptopów umieszczonych w sąsiedztwie moszny są przyczyną przegrzewania jąder, co z kolei prowadzi do obniżenia koncentracji i ruchliwości plemników [8-10]. Ekspozycja mężczyzn na ksenoestrogeny, takie jak diethylstilbestrol (DES), produkty przemysłowe, jak fenole (onylfenol, bisfenol A, oktylfenol), pestycydy i herbicydy czy fitoestrogeny, zakłóca naturalną równowagę estrogenowo-androgenową. Związki estrogenopodobne negatywnie wpływają na rozwój męskich płodów oraz na przebieg spermatogenezy u dorosłych mężczyzn [11,12]. Ekspozycja na pestycydy powoduje obniżenie koncentracji, żywotności i liczby prawidłowych form plemników [13]. Palenie papierosów wpływa negatywnie na koncentrację, ruchliwość i morfologię plemników. U palących mężczyzn wykazano niższą o 23% liczbę plemników i mniejszą o 13% ruchliwość, jak również zwiększony stopień uszkodzenia DNA plemników w porównaniu do niepalących [14,15]. Palenie papierosów związane jest z 48% wzrostem koncentracji leukocytów w nasieniu i 107% wzrostem poziomu RFT [16]. Także spożywanie alkoholu prowadzi do zaburzeń zdrowia reprodukcyjnego mężczyzn. Alkohol zmniejsza produkcję testosteronu, skutkując spadkiem libido i obniżeniem liczby plemników. Spożywanie alkoholu w ilościach większych niż 15,4g dziennie prowadzi do wzrostu liczby nieprawidłowych form plemników [17, 18]. Udowodniono również, że zażywanie narkotyków, takich jak: marihuana, opiaty, kokaina czy metamfetamina może być przyczyną niepłodności męskiej. Zawarte w marihuanie kannabinoidy negatywnie wpływają na proces spermatogenezy oraz obniżają stężenie testosteronu, co prowadzi do spadku ruchliwości plemników oraz negatywnie wpływa na reakcję akrosomalną [19]. U mężczyzn stosujących opiaty zaobserwowano spadek libido oraz objawy hipogonadyzmu na skutek zmniejszonych stężeń testosteronu i hormonu luteinizującego we krwi [20]. CEL PRACY Celem przeprowadzonej analizy była ocena parametrów nasienia w latach 2003-2013 u mężczyzn diagnozowanych z powodu niepłodności. MATERIAŁ I METODY Analizie poddano próbki nasienia pacjentów Ab ovo, Centrum Zdrowia Rodziny w Lublinie na przełomie 2003-2013 roku. Przeprowadzone badanie ma charakter retrospektywny i dotyczy wyników spermiogramów od 4235. mężczyzn diagnozowanych z powodu niepłodności. Populacja męska pochodziła zarówno z terenów miejskich, jak i wiejskich, mieszkających i pracujących na obszarze południowo-wschodniej Polski. Na podstawie wieku, mężczyzn podzielono na dwie grupy: grupę młodych M (18-29 lat, n= 1638) i grupę starszych S (30-40 lat, n= 2597). Z badania wykluczono pacjentów onkologicznych, jak również tych z azoospermią. Ejakulat oddawany był do sterylnego pojemnika drogą masturbacji w pomieszczeniu znajdującym się w sąsiedztwie laboratorium. Abstynencja płciowa mężczyzn wynosiła od 2. do 7. dni. Wszystkie parametry nasienia (objętość, koncentracja, ruchliwość i morfologia) oceniane były według obowiązujących wytycznych Światowej Organizacji Zdrowia (do roku 2010 stosowano metodykę z 1999 [21], a od 2010 metodykę z roku 2010 [22]). Uzyskane nasienie pozostawiano do całkowitego upłynnienia w temperaturze 37 C. Ejakulat analizowany był w trakcie 30 minut od upłynnienia, ale w czasie nie dłuższym niż 60 minut. Objętość próbki oznaczana była przy wykorzystaniu sterylnych, serologicznych pipet. Koncentrację i ruchliwość plemników oznaczono w temp 37 C przy użyciu hemocytometru (Helber Counting Chamber Hawksley 0,02mm, przeznaczony do liczenia plemników). Plemniki charakteryzowano ze względu na ruch postępowy A, progresywny B, nieprogresywny C i brak ruchu D, a ruchliwość została wyrażona w procentach. Preparaty analizowane były przez trzech jednakowo przeszkolonych pracowników. W laboratorium przeprowadzano wewnętrzną kontrolę jakości nasienia. Uzyskane dane analizowano za pomocą programu Statistica 10 i Microsoft Office Excel. Na podstawie testu t-studenta zbadano istotność poszczególnych współczynników trendu linowego. Przyjęto poziom istotności p = 0,05. WYNIKI Wyniki przeprowadzonej analizy dla każdego badanego parametru przedstawiono w tabeli (tab.2.). Średnia koncentracja plemników w grupie wiekowej 18-29 lat obniżyła się z 42,31 mln/ml w roku 2003 do 23,80 w 2013 roku. W grupie wiekowej 30-40 lat, średnia koncentracja zmniejszyła się z 47,05 mln/ml w roku 2003 do 24,17 mln/ml w 2013 roku. Według wykresu trendu liniowego koncentracja plemni- 67

GinPolMedProject 4 (42) 2016: 065-070 ków na przełomie dziesięciu lat w obu grupach wiekowych wykazuje tendencję malejącą (ryc.1. A,B). Trend liniowy w grupie mężczyzn 18-29 i 30-40 lat jest istotny statystycznie (p < 0,05). Koncentracja w grupie M zmniejszała się co roku o 1,7073 mln, natomiast w grupie S o 2,1305 mln. Porównując testem t-studenta wartości koncentracji między obiema grupami w poszczególnych latach, wykazano, że jedynie w roku 2007, 2011 i 2012, średnie wartości były istotnie statystycznie wyższe w grupie S. Ruchliwość (ruch A+B %) plemników w badanym przedziale czasowym zwiększała się rocznie w grupie pacjentów 18-29 lat o 0,4203%, a w grupie 30-40 lat o 0,4119%. Trend liniowy dla ruchliwości plemników okazał się nie istotny statystycznie (p > 0,05). Średnia procentowa liczba prawidłowych form plemników obniżyła się z 24,40% i 26,09% w roku 2003 do 3,68% i 3,93% w roku 2013 odpowiednio dla grupy M i S. Wyznaczony w obu grupach wiekowych malejący trend dla morfologii plemników jest istotny statystycznie (p < 0,0001). W grupie 18-29 lat morfologia zmniejszała się rocznie o 2,2665%. W grupie pacjentów 30-40 lat liczba prawidłowych form plemników obniżała się o 2,3505%. Porównując testem t-studenta wartości procentowe między dwiema badanami grupami w poszczególnych latach, wykazano, że tylko w roku 2011, morfologia plemników w grupie S była istotnie statystycznie wyższa (p=0,0066). W pozostałych latach średnie w obu badanych grupach nie różniły się na poziomie istotności 0,05. DYSKUSJA W ostatnich latach obserwuje się zwiększone zapotrzebowanie na zastosowanie technik wspomaganego rozrodu u par starających się o potomstwo. W dużej mierze związane jest to ze spadkiem jakości nasienia. Parametry nasienia, takie jak koncentracja, ruchliwość i morfologia są ściśle ze sobą powiązane. Czynniki, które powodują pogorszenie jednego z nich zwykle negatywnie oddziałują na dwa pozostałe [23]. Sugeruje się, że stres, ekspozycja na substancje szkodliwe, związki estrogenopodobne, używki, leki, infekcje bakteryjne, choroby przenoszone drogą płciową mogą być przyczyną pogarszających się parametrów nasienia [6,14,19,20,24]. Światowa Organizacja Zdrowia na przestrzeni lat zmieniała wartości referencyjne dotyczące poszczególnych parametrów nasienia. W roku 1980 normy dla prawidłowej koncentracji wynosiły 20-200 mln/ml, a morfologii 80,5%. W roku 1992 ustanowiono normy dla koncentracji > 20 mln/ml, a dla prawidłowej budowy plemników > 30%. Według najnowszych wytycznych koncentracja plemników powinna Tab. 2. Parametry nasienia (średnia ± SD) mężczyzn w latach 2003-2013 Grupa wiekowa Rok Liczba badanych Koncentracja mln/ml Ruchliwość (A+B%) Morfologia (%) Objętość (ml) 18-29 lat 30-40 lat 2003 156 42,31 ± 53,81 43,22 ± 21,01 24,40 ± 14,41 3,63 ± 1,92 2004 115 38,97 ± 37,39 37,67 ± 20,77 20,78 ± 12,35 3,93 ± 1,67 2005 138 30,80 ± 34,96 38,16 ± 17,60 18,47 ± 12,05 4,15 ± 1,82 2006 154 32,72 ± 56,23 40,38 ± 17,63 15,76 ±10,31 4,03 ± 1,75 2007 98 23,53 ± 25,09 38,22 ± 18,16 15,92 ± 12,66 4,15 ± 1,99 2008 153 26,80 ± 28,75 41,55 ± 17,06 9,03 ± 7,44 4,08 ± 1,65 2009 191 20,59 ±22,83 41,55 ± 17,89 6,42 ± 5,29 3,91 ± 1,92 2010 142 27,85 ± 31,01 44,06 ± 14,62 4,77 ± 3,96 4,08 ± 1,89 2011 159 23,49 ±26,73 42,26 ± 15,28 3,53 ± 3,25 4,11 ± 2,01 2012 178 23,81 ±19,74 41,93 ± 15,93 3,44 ± 3,67 3,85 ± 1,82 2013 154 23,80 ± 24,26 44,46 ± 15,76 3,68 ± 2,89 4,30 ± 2,02 2003 195 47,05 ± 54,67 45,65 ± 19,89 26,09 ± 12,89 3,89 ± 1,91 2004 264 47,61 ± 62,30 36,22 ± 19,18 21,40 ± 12,45 3,70 ± 1,96 2005 234 32,27 ± 35,14 38,44 ± 18,63 19,32 ± 12,71 3,84 ± 1,69 2006 193 35,99 ± 41,94 38,82 ± 17,73 16,19 ± 10,44 3,82 ± 1,74 2007 247 34,61 ± 46,76 39,98 ± 17,48 16,24 ± 11,71 3,98 ± 1,92 2008 196 26,34 ± 32,14 42,52 ± 15,81 8,64 ± 6,45 3,80 ± 1,81 2009 310 22,81 ± 21,24 43,93 ± 14,96 6,95 ± 5,80 4,17 ± 1,88 2010 283 25,10 ± 23,73 41,25 ± 16,01 4,38 ± 4,00 3,85 ± 1,85 2011 195 29,36 ± 26,24 44,65 ± 14,41 4,56 ± 3,84 3,95 ± 1,68 2012 287 28,20 ± 24,98 41,70 ± 15,19 3,76 ± 2,79 3,65 ± 1,70 2013 193 24,17 ± 21,17 44,84 ± 16,19 3,93 ± 2,93 3,94 ± 1,80 68

A. Leszcz et al. Ocena jakości nasienia wśród mężczyzn południowo-wschodniej Polski wynosić > 15 mln/ml, a morfologia > 4% [22, 25]. Dane prezentowane w niniejszym opracowaniu wskazują na pogorszenie parametrów nasienia w czasie i potwierdzają wcześniejsze doniesienia o globalnym spadku jakości nasienia [3,4]. Jednak Cocuzza M i Esteves SC [26] stwierdzili, że nie ma wystarczających dowodów potwierdzających na występowanie globalnego spadku parametrów nasienia. W niektórych badaniach zaobserwowano, że jakość nasienia nie obniżyła się, ani nie utrzymywała się na jednakowym poziomie, ale nieznacznie wzrosła w ostatnich latach [27,28]. W badaniach własnych wykazano istotny statystycznie malejący trend dotyczący koncentracji plemników w nasieniu. Podobne wyniki dotyczące spadku koncentracji plemników stwierdzono we Francji [29,30], Szkocji [31], Grecji [32], Izraelu [33], Nowej Zelandii [34], Finlandii [35], Tunezji [36]. Inni autorzy prezentują odmienne wyniki - przedstawiają wzrost koncentracji plemników w czasie [37]. W trakcie trwania badania od 2003 do 2013 roku zauważono nieznaczny wzrost ruchliwości plemników (ruch postępowy A i progresywny B ). Trend ten okazał się nieistotny statystycznie. Andolz i wsp. [38] również obserwowali wzrost ruchliwości plemników. W niektórych krajach zaobserwowano spadek ruchliwości plemników [29,33,39]. W innych analizach nie znaleziono żadnej tendencji dotyczącej tego parametru [36,40]. Własne dane pokazują obniżenie liczby prawidłowych form plemników w czasie. Rocznie liczba plemników o prawidłowej budowie obniżała się o 2,2665% w grupie mężczyzn 18-29 lat i o 2,3505% w grupie 30-40 lat. Zmniejszenie odsetka plemników z normalną morfologią wykazano również przez innych autorów [29, 36,38,41]. Natomiast w jednym badaniu odnotowano wzrost odsetka prawidłowo zbudowanych plemników [27]. Sugeruje się, że morfologia plemników mogła się zmienić w czasie w zależności od przyjętych kryteriów klasyfikacyjnych oraz doświadczenia laborantów oceniających preparat [38]. WNIOSKI Pomimo, że istnienie globalnego spadku jakości nasienia jest nadal przedmiotem dyskusji [42], wyniki własne wydają się być zgodne z tą hipotezą i ogólnie obserwowanym trendem dotyczącym obniżenia koncentracji i prawidłowych form plemników. Przedmiotem badań powinno być ustalenie przyczyny obserwowanego trendu, co może pozwolić na jego odwrócenie. Ryc. 1A. Trend liniowy dla zmniejszającej się koncentracji plemników mężczyzn w grupie 18-29 lat Ryc. 1B. Trend liniowy dla zmniejszającej się koncentracji plemników mężczyzn w grupie 30-40 lat 69

GinPolMedProject 4 (42) 2016: 065-070 PIŚMIENNICTWO 1. Bakunowicz A, Brenk A, Olejek A. Analiza czynników społecznych, demograficznych i psychicznych u kobiet leczonych z powodu niepłodności. Gin Pol Med Project 2015;1(35):67-71. 2. Aitken RJ. The human spermatozoon a cell in crisis? J Reprod Fertil 1999;115:1-7. 3. Carlsen E, Giwercman A, Keiding N et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. BMJ 1992;305:609-13. 4. Swan S, Elkin E, Fenster L. The question of declining sperm density revisited: An analysis of 101 studies published 1934-1996. Environ Health Perspect 2000;108: 961-6. 5. Hall E, Burt VK. Male fertility: psychiatric considerations. Fertil Steril 2012;97(2):434-9. 6. Depa-Martynow M, Walczyk-Matyja K, Szyfter J et al. Quality of life versus semen parameters. Ginekol Pol 2008;79:115-9. 7. Jurewicz J, Hanke W, Sobala W et al. The effect of stress on the semen quality. Medycyna Pracy 2010;61(6):607-13. 8. Figa-Talamanca I, Cini C, Varricchio GC et al. Effects of prolonged auto vehicle driving on male reproductive function: a study among taxi drivers. Am J Ind Med 1996; 30:750-8. 9. Brown-Woodman PDC, Post EJ, Gass GC et al. The effect of a single sauna exposure on spermatozoa. Arch Androl 1984;12:9-15. 10. Sheynkin Y, Jung M, Yoo P. Increase in scrotal temperature in laptop computer users. Hum Reprod 2005;2:452-7. 11. McLachlan JA. Environmental signaling: what embryos and evolution teach us about endocrine disrupting chemicals. Endocr Rev 2001;22:319-41. 12. Mitchell JH, Cawood E, Kinniburgh D et al. Effect of a phytoestrogen food supplement on reproductive health in normal males. Clin Sci 2001;100:613-8. 13. Hanke W, Jurewicz J. The risk of adverse reproductive and developmental disorders due to occupational pesticide exposure: an overview of current epidemiological evidence. Int J Occup Med Environ Health 2004;17(2):223-43. 14. Taha EA, Ezz-Aldin AM, Sayed SK et al. Smoking influence on sperm vitality, DNA fragmentation, reactive oxygen species and zinc in oligoasthenoteratozoospermic men with varicocele. Andrologia 2013;19. doi: 10.1111/ and.12136 15. Davar R, Sekhavat L, Naserzadeh N. Semen parameters of non-infertile smoker and non-smoker men. J Med Life 2012;5(4):465-8. 16. Saleh RA, Agarwal A, Sharma RK et al. Effect of cigarette smoking on levels of seminal oxidative stress in infertile men: a prospective study. Fertil Steril 2002; 78(3):491-9. 17. Emanuele MA, Emanuele N. Alcohol and the Male Reproductive System. Alcohol Res Health 2001;25(4):282-87. 18. Joo KJ, Kwon YW, Myung SC et al. The Effects of Smoking and Alcohol Intake on Sperm Quality: Light and Transmission Electron Microscopy Findings. J International Medical Res 2012;40:2327-35. 19. Rossato M, Ion Popa F, Ferigo M et al. Human sperm express cannabinoid receptor Cb1, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:984-91. 20. Abs R, Verhelst J, Maeyaert J et al. Endocrine consequences of long-term intrathecal administration of opioids. J Clin Endocrinol Metab 2000;8: 2215-22. 21. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th ed. WHO 1999. 22. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO 2010. 23. Bonde JP, Giwercman A, Ernst E. Identifying environmental risk to male reproductive function by occupatio- nal sperm studies: logistics and design options. Occup Environ Med 1996;53:511-9. 24. Forti G, Serio M. Male infertility: is its rising incidence due to better methods of detection or an increasing frequency? Hum Reprod 1993;8:1153-4. 25. Esteves SC. Clinical relevance of routine semen analysis and controversies surrounding the 2010 World Health Organization criteria for semen examination. Int Braz J Urol 2014;40:443-53. 26. Cocuzza M, Esteves SC. Shedding light on the controversy surrounding the temporal decline in human sperm counts: a systematic review. Scientific World Journal 2014; 2014:365691. 27. Berling S, Wölner-Hanssen P. No evidence of deteriorating semen quality among men in infertile relationships during the last decade: a study of males from Southern Sweden. Hum Reprod 1997;12:1002-5. 28. Fisch H, Goluboff ET, Olson JH et al. Semen analyses in 1,283 men from the United States over a 25-year period: no decline in quality. Fertil Steril 1996;65:1009-14. 29. Auger J, Kunstmann JM, Czyglik F et al. Decline in semen quality among fertile men in Paris during the past 20 years. N Engl J Med 1995;332(5):281-5. 30. Rolland M, Le Moal J, Wagner V et al. Decline in semen concentration and morphology in a sample of 26,609 men close to general population between 1989 and 2005 in France. Hum Reprod 2013;28(2):462-70. 31. Irvine S, Cawood E, Richardson D et al. Evidence of deteriorating semen quality in the United Kingdom: birth cohort study in 577 men in Scotland over 11 years. BMJ 1996;312(7029):467-71. 32. Adamopoulos DA, Pappa A, Nicopoulou S et al. Seminal volume and total sperm number trends in men attending subfertility clinics in the greater Athens area during the period 1977-1993. Hum Reprod 1996; 11(9): 1936-41. 33. Almagor M, Ivnitzki I, Yaffe H et al. Changes in semen quality in Jerusalem between 1990 and 2000: a crosssectional and longitudinal study. Arch Androl 2003; 49(2);139-44. 34. Shine R, Peek J, Birdsal M. Declining sperm quality in New Zealand over 20 years. N Z Med J 2008;121(1287): 50-6. 35. Jørgensen N, Vierula M, Jacobsen R et al. Recent adverse trends in semen quality and testis cancer incidence among Finnish men. Int J Androl 2011;34:37-48. 36. Feki NC, Abid N, Rebai A et al. Semen Quality Decline Among Men in Infertile Relationships: Experience Over 12 Years in the South of Tunisia. J Androl 2009;30(5):541-7. 37. Jørgensen N, Joensen UN, Jensen TK et al. Human semen quality in the new millennium: a prospective crosssectional population-based study of 4867 men. BMJ 2012;2:e000990. 38. Andolz P, Bielsa MA, Vila J. Evolution of semen quality in North-eastern Spain: a study in 22 759 infertile men over a 36 year period. Hum Reprod 1999;3:731-5. 39. Mukhopadhyay D, Varghese AC, Pal M et al. Semen quality and age-specific changes: a study between two decades on 3,729 male partners of couples with normal sperm count and attending an andrology laboratory for infertility-related problems in an Indian city. Fertil Steril 2010;93(7):2247-54. 40. Fisch H. Declining worldwide sperm counts: disproving a myth. Urol Clin North Am 2008;2:137 146, vii. 41. Borges EJ, Setti AS, Vingris L et al. Decreasing sperm quality: findings from a 10 year gap longitudinal analysis of 2300 sperm samples from Brazil. JBRA Assist Reprod 2013;17(2):89-92. 42. Wilcox AJ. On sperm counts and data responsibility. Epidemiol 2011;22(5):615-6. 70