Zeszyt Studentów Biotechnologii ACTA MYGENICA numer 14 Kraków, grudzień 2018
Zespół redakcyjny Kinga Pajdzik Artur Blat Katarzyna Radoń Monika Wieliniec Okładka Zdjęcie przedstawia akumulację białka p62 (czerwony) w śliniankach przyusznych myszy z delecją genu Atg7. Autorki zdjęcia: Kinga Pajdzik, Sophie Bergmann; Grupa Badawcza Biologii i Patobiologii Skóry, Wydział Dermatologiczny, Uniwersytet Medyczny w Wiedniu. Skład Kinga Pajdzik Korekta Zespół redakcyjny Wydawca KNSB Mygen Nakład: 500 szt. Kontakt kinga.pajdzik@gmail.com ISSN 1899-5535 Sfinansowane przez
Od redakcji DRODZY CZYTELNICY! Witamy Was na łamach czternastego już numeru naszych Zeszytów Naukowych. W tym numerze zapoznacie się z działalnością Koła w ostatnim semestrze oraz relacjami z Konferencji, w których uczestniczyli członkowie KNSB Mygen. Czytelnicy zadadzą sobie również pytanie, czy rozwój nauki doprowadzi do tego, że mężczyźni przestaną być niezbędni dla dalszego istnienia człowieka na Ziemi. Zachęcamy do zapoznania się z opublikowanymi na łamach tego numeru pozostałymi artykułami. Życzymy miłej lektury! ZESPÓŁ REDAKCYJNY 3
Koło Naukowe Studentów Biotechnologii Mygen działające przy Uniwersytecie Jagiellońskim, we współpracy z Kołem Naukowym Genetyki, serdecznie zapraszają studentów oraz doktorantów na V Ogólnopolską Konferencję Genetyczną Zaproszenie skierowane jest do młodych badaczy i pasjonatów kierunków przyrodniczych interesujących się różnymi dziedzinami genetyki, zarówno prowadzących własne badania jak i dopiero zaczynających swoją przygodę z nauką. Oprócz wystąpień uczestników konferencji odbędą się także wykłady zaproszonych gości wybitnych naukowców o znaczącym dorobku naukowym w dziedzinie genetyki. Sesje wykładowe i posterowe drugiego dnia konferencji (sobota) odbędą się po angielsku. Konferencja odbędzie się w dniach 5-7 kwietnia 2019 r. w Krakowie w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego przy ul. Gronostajowej 9. Termin zgłoszeń oraz nadsyłania abstraktów upływa 10 lutego 2019 r. www.genomica.pl Masz pytanie? Napisz do nas! genomica.uj@gmail.com 4
Z życia koła Kończąc wakacyjną sielankę i wkraczając ze świeżą dawką energii w kolejny semestr zmagań studenckich, Koło Naukowe Mygen nie osiada na laurach. Nowe półrocze rozpoczęto Walnym Zebraniem. Jego uczestnicy mogli dowiedzieć się więcej na temat pracy Koła oraz poznać plan działania podczas których licealiści z różnych szkół mieli okazję zasmakować pracy w laboratorium. Niemniej jednak nie samą nauką studenci żyją, o czym świadczą liczne spotkania integracyjne przy grach planszowych. W końcu koło naukowe to również miejsce, gdzie możemy poszerzyć grono swoich zna- na nowy rok akademicki. W ubiegłym roku akademickim przez cały semestr letni organizowane były cykliczne spotkania znane pod nazwą czwartkowych seminariów. Ogrom informacji, które można było z nich wynieść jest wręcz nie do opisania. Wykłady na tematy od medycyny sądowej z prof. dr. hab. n. med. Wojciechem Piekoszewskim z Wydziału Chemii UJ, poprzez krystalografię z Elą Wątor, pęcherzyki komórkowe zaprezentowane przez prof. dr hab. Ewę Łucję Stępień z Zakładu Fizyki Medycznej, aż po uszkodzenia DNA omówione przez Julitę Wesołowską z Zakładu Biofizyki Komórki, były w stanie zadowolić niejednego biologicznego pasjonata, jak również osoby niezwiązane z tymi dziedzinami. Dodatkowo członkowie Koła chętnie angażowali się w organizację wszelkiego rodzaju warsztatów, między innymi sporządzania posterów oraz prawidłowego pisania bibliografii, czy spotkań informacyjnych odnośnie wyjazdów studenckich. jomych oraz miło spędzić czas dzieląc się przy okazji wszelkimi zainteresowaniami. Wielkim sukcesem Koła była również organizacja kolejnej edycji Ogólnopolskiej Konferencji Genetycznej "Genomika". Dodatkowo odbyły się Warsztaty Lifescience, Podczas Walnego Zebrania sprawozdawczo - wyborczego, rozliczono dotychczasowy Zarząd Koła i wybrano nowy, który przejął jego obowiązki. W skład nowego zarządu weszły: Kinga Stopa (Prezes), Sonia Baran, Gosia Honc oraz Oliwia Koczy. Zespół redakcyjny, Zarząd Koła i Komisja Rewizyjna życzą naszym czytelnikom udanego roku akademickiego oraz dużej ilości sukcesów również poza polem zawodowo - edukacyjnym. Nadszedł czas na efektywne i wydajne wykorzystanie sił nagromadzonych podczas wakacyjnego wypoczynku. Powodzenia! Miłosz Dudzik 5
Podsumowanie X Interdyscyplinarnej Konferencji Naukowej TYGIEL 2018 Interdyscyplinarna Konferencja Naukowa TYGIEL 2018, organizowana przez Fundację na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL, odbyła się w tym roku w dniach 17-18 marca na Uniwersytecie Marii Skłodowskiej-Curie w Lublinie, "Interdyscyplinarność kluczem do rozwoju" to hasło konfe- prac B+R" (Tomasz Rozwalka, Harpo Sp. z o.o.). Organizatorzy umożliwili uczestnikom konferencji publikację rozdziału w monografii naukowej, a z szansy tej skorzystali również członkowie naszego Koła. rencji. Udział w wydarzeniu umożliwił uczestnikom wysłuchanie prelegentów specjalizujących się w różnych dziedzinach nauki, a spojrzenie na niektóre zagadnienia z całkiem innej perspektywy niewątpliwie potrafi zaskoczyć i rozwinąć. Goście Honorowi w tym roku zaprezentowali wykłady "Amfoterycyna B nowe możliwości" (prof. dr hab. Mariusz Gagoś z UMCS) oraz "Inteligentna odzież dla osób głuchoniewidomych - aplikacja wyników ukowa TYGIEL staje się według Organizatorów pewnego rodzaju tradycją, gdyż co roku powracają ci sami uczestnicy, a jednocześnie przybywa mnóstwo nowych osób z całego kraju, przez co Konferencja stała się nie tylko wspaniałą, ale również popularną inicjatywą lubelskiego środowiska naukowego. Interdyscyplinarna Konferencja Na- Kamila Nawieśniak Relacja z VII Konferencji Biologii Molekularnej 6 VII edycja Konferencji Biologii Molekularnej odbyła się w tym roku nych za swoje wzorowo przedstawione prezentacje i ciekawe wyniki. Podczas w dniach 12-14 kwietnia na Wydziale Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. Jak co roku przedstawiciele naszego Koła wzięli udział w wydarzeniu prezentując wyniki swoich badań oraz prace przeglądowe. Swoje prezentacje w formie ustnego referatu, posteru i flash-posterów wygłosili m.in.: Kinga Pajdzik, Kinga Stopa, Kamila Nawieśniak, Elżbieta Wątor, Martyna Wasilewska, Piotr Leśniak oraz Julia Sadowska. Dwóch Członków naszego Koła (Kinga Pajdzik oraz Piotr Leśniak) zostało wyróżnio- wydarzenia z pewnością nie zabrakło wnikliwej analizy oraz interpretacji prac ze strony organizatorów oraz komisji. Zadbano również o interesujące wystąpienia gości honorowych opowiadających o nowych doniesieniach w świecie nauki. Konferencja Biologii Molekularnej to doskonała możliwość na zdobycie doświadczenia w prezentowaniu własnych wyników oraz wspaniała okazja do inspirujących dyskusji naukowych ze studentami i naukowcami z ośrod-
ków w całej Polsce. Z roku na rok coraz więcej studentów naszego Wydziału uczestniczy w Konferencji Biologii Molekularnej, a KNSB Mygen gorąco poleca to wydarzenie. W kolejnej edycji nie może zabraknąć i Was! Martyna Wasilewska Nowinki ze świata nauki NAGRODY NOBLA PRZYZNANE 1 października została przyznana Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii. Otrzymali ją James P. Allison z USA oraz Tasuku Honjo z Japonii. Naukowcy zostali nagrodzeni za badania dotyczące wykorzystania immunoterapii w leczeniu nowotworów. James P. Allison badał białko występujące w limfocytach T - CTLA-4, które działa dla układu odpornościowego jak hamulec. Prowadzone przez niego w latach 90. badania wykazały, że myszy chore na nowotwór, którym podano przeciwciało anty-ctla-4, zostały wyleczone. Tasuku Honjo odkrył w 1992 roku biał- ko PD-1, które występuje na powierzchni limfocytów T. Wyniki jego badań wykazały, że białko to działa podobnie jak CTLA-4 - jest hamulcem dla limfocytów T. Badania na zwierzętach wykazały, że blokada PD-1 jest również obiecującą metodą walki z nowotworami. Naukowcy, oprócz sławy jaką niesie za sobą otrzymanie Nagrody Nobla, zostali uhonorowani nagrodą w wyskości 4,5 mln koron szwedzkich (około 1,9 mln złotych). Artur Blat Bibliografia: https://www.nobelprize.org/uploads/2018/10/press-medicine2018.pdf [dostęp: 29.10.2018]. ŚWIAT BEZ MĘŻCZYZN - CZY TO TYLKO SCENARIUSZ Z FILMU? Wiadome jest, że aby na świat przyszło potomstwo, potrzebna jest samica i samiec. Jednak badania prowadzone w Chińskiej Akademii Nauk pokazują, że nie musi być to prawdą. Tamtejszym naukowcom udało się stworzyć zdrowego potomka dwóch samic myszy. Jak to osiągnęli? Naukowcy pobrali od jednej z samic komórkę jajową, od drugiej specjalny typ komórek - haplo- idalne zarodkowe komórki embrionalne. Następnie przy pomocy techniki CRISPR-Cas9, usunęli trzy geny, które odpowiedzialne są za zjawisko imprintingu. Spośród 210 embrionów uzyskanych w ten sposób 29 myszy przyszło na świat żywych. Dożyły one dorosłości, a nawet wydały na świat własne potomstwo. Naukowcom udało otrzymać się również potomka dwóch samców, niestety 7
ten szybko zmarł po urodzeniu. Według dr Teresy Holm (Uniwersytet Auckland) badania te mogą przyczynić się w przyszłości do posiadania przez pary tej samej płci zdrowego potomstwa. Bibliografia: -792-can-two-males-or-females-makebabies [dostęp: 29.10.2018]. [1] https://www.bbc.com/news/health45801043 [dostęp: 29.10.2018]. [2] https://www.inverse.com/article/49 8 Artur Blat
Spis treści: Bayer przejmuje Monsanto Dawid Skoczek 10 Mechanizmy inhibicji proteaz przez inhibitory białkowe Marta Kubańska 14 Mechanizm działania cytochromu bc1 w kontekście pełnienia funkcji katalitycznych i produkcji wolnych rodników Oskar Lipiński 27 9
Bayer przejmuje Monsanto Dawid Skoczek Koło Naukowe Studentów Biotechnologii "Mygen" Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński w Krakowie dawid.skoczek@gmail.com W sobotę 7 lipca na oficjalnej stronie internetowej niemieckiego koncernu Bayer zamieszczono informację, że przygotowywane od kilku lat plany przejęcia Monsanto doszły do skutku, a sama transakcja została ostatecznie sfinalizowana: Dziś wielki dzień: dla naszych klientów rolników z całego świata, którym będziemy mogli pomóc w dalszej poprawie wydajności i ochronie plonów; dla naszych udziałowców- ponieważ transakcja ta niesie potencjał ogromnych korzyści; a także dla konsumentów i ogółu społeczeństwa - ponieważ będziemy w stanie jeszcze lepiej pomóc rolnikom na całym świecie wytwarzać w sposób zrównoważony bardziej zdrową żywność w bardziej przystępnych cenach. powiedział Werner Baumann, prezes zarządu Bayer. W wyniku transakcji akcje amerykańskiego giganta nie będą już dłużej notowane na Nowojorskiej Giełdzie Papierów Wartościowych, ponieważ Bayer jest obecnie jedynym właścicielem Monsanto Company. Droga do konsolidacji Na temat samej transakcji zrobiło się głośno w pierwszej połowie kwietnia tego roku, gdy DOJ (United States Department of Justice) wydał Bayerowi pozwolenie na zakup Monsanto poprzez transakcję o wartości 62,5 miliarda dolarów. Warunkiem podpisania zgody przez DOJ była konieczność sprzedania przed fuzją przez Bayer części aktywów niemieckiemu konkurentowi BASF. Należą do nich między innymi firmy sojowe i bawełniane, a także glufosynat weed killer, który jest bezpośrednim konkurentem dla flagowego herbicydu Monsanto jakim 10 jest herbicyd Roundup. Nieoficjalnie mówi się, że duży wkład w rozmowy miał sam prezydent USA Donald Trump. Zanim objął on swój obecny urząd, prezesi firm Bayer i Monsanto, Werner Baumann i Hugh Grant, spotkali się z nim w Trump Tower. W oficjalnym oświadczeniu przekazano mediom, że trójka miała "bardzo produktywne spotkanie". Dodatkowo proces przejęcia Monsanto i monopolizacja rynku rolnego w dziedzinie nasion jest zgodna z polityką Trumpa, który prawdopodobnie chce utrzymać tendencję do powstawania niewielkiej liczby dużych gospodarstw rolnych. Powołując się na Amerykański Departament Rolnictwa, portal Buisness Insider opublikował dane, z których
wynika, że wielkość gospodarstw w USA konsekwentnie zmieniła się z mniejszych ośrodków na większe w 1987 roku gdy zaledwie 15% wszystkich gruntów uprawnych było w posiadaniu gospodarstw o powierzchni co najmniej 2000 akrów, a w 2012 odsetek ten wzrósł do 36%. Na podstawie tego można uznać, że Trump będzie lobbował taki trend rozwoju rolnictwa oparty na scentralizowaniu produkcji rolnej. Decyzja DOJ, chociaż kluczowa, nie była jednym pozwoleniem, jakie gigant farmaceutyczny musiał zdobyć. Dodatkowo Bayer potrzebował zgody Komisji Europejskiej, która została wydana niecały miesiąc przed werdyktem Amerykańskiego Departamentu Sprawiedliwości. Według oświadczenia z 21 marca odpowiedzialnej za politykę konkurencji rynkowej UE Komisarz Margrethe Vestager, transakcja nie stanowi zagrożenia dla rynku, gdyż niemiecki potentat zobowiązał się między innymi do udzielenia licencji na całe swoje portfolio produktów rolnych, również tych będących w opracowaniu innym firmom, a także zaniechania wszelkich wątpliwych, zachodzących na siebie transakcji, które dotyczyły obrotów na rynkach nasion i pestycydów prowadzonych przez firmy-córki oraz aktywa kon- woduje znaczący wzrost cen nasion i środków ochrony roślin. W ich opinii cernu Bayer. o dużej konkurencji, jakim jest przemysł rolniczy, wzrost wydajności generowany przez nakłady na innowacje zwiększy dochody rolników. Obawa o monopolizację oraz wpływ transakcji na rolników wiele farmerskich rodzin, głównie ze Stanów Zjednoczonych, nie będzie stać na prowadzenie i zabezpieczenie swoich upraw produktami Bayer, co zmusi je do odsprzedania ziemi większym gospodarstwom. Obawy rolników mają odzwierciedlenie w danych. Badania przeprowadzone przez Farmers Business Network wykazują wzrost cen nasion w odniesieniu do ich udziału rynkowego - z danych wynika, że większa dominacja rynkowa była skorelowana z wyższymi cenami nasion kukurydzy (Ryc. 1), co jednak nie jest proporcjonalne względem ich zwiększonej wydajności, która w teorii powinna rosnąć z ceną. W odpowiedzi dla portalu Buisness Insider: Czy konsolidacja Bayer z Monsanto spowoduje wzrost cen i zmniejszy konkurencję oraz innowacje? - rzecznicy firmy Bayer stwierdzili: Nie zgadzamy się z tym i sądzimy, że będzie zupełnie inaczej. Konkurujemy z innymi, bardzo silnymi firmami, które oferują bardzo podobne produkty i mają szerokie zaplecze badawczo-rozwojowe. Osiągniemy sukces w zakresie sprzedaży i wyceny naszych produktów, jeśli nasza oferta jest lepsza od konkurencyjnej i dalej będziemy wprowadzać innowacje. Jesteśmy przekonani, że w biznesie Przejęcie Monsanto spowodowało także wrzawę w środowisku rolników. Spodziewają się oni, że transakcja spo- 11
Ryc. 1. Wykres zależności cen nasion kukurydzy od udziału rynkowego producenta. Farmers Buisness Network [dostęp: 28.07.2018]. Odpowiedź na to pytanie zdaje się być w świetle powyższych informacji oczywista i łatwa do wywnioskowania, natomiast prawdziwe prognozy zysków dla powiększonej firmy Bayer znają tylko jej analitycy finansowi. Pewne jest jednak, że październik 2017 miesiąc, w którym firma szeroko informowała o zakupie Monsanto, był jednym z bardziej udanych miesięcy w ciągu ubiegłego roku pod względem cen akcji dla firmy z Niemiec. Natomiast giełda w pierwszej połowie tego roku już nie była tak przychylna dla ceny akcji giganta wzrosną kosztem innych firm z branży rolniczej. To przypuszczenie oparte jest na słowach Roba Farley a, który stwierdził, że w obecnym systemie stworzenie firmy i uzyskanie zatwierdzenia nowego herbicydu trwa około dziesięciu lat. Jeśli ten produkt zdobędzie zainteresowanie, firma potrzebuje kolejnych 10 lat, aby wyprodukować cechę nasion odpowiadającą na nową substancję chemiczną. Połączone zasoby firmy Bayer i Monsanto pozwoliłyby im wspólnie opracować sparowane produkty, co skróciłoby o połowę czas potrzebny na wprowadzenie nowych produktów na rynek. Taki potencjał Bayernu co w roku 2017. Może to być spowodowane zobowiązaniami, które niemiecki koncern musiał podjąć, aby przeprowadzić zakup Monsanto. Wydaje się jednak, że w przyszłości powiększonego niemieckiego koncernu oznacza barierę nie do przejścia dla nowych firm, jak i tych istniejących, jeśli chodzi o szybkość wdrażania produktów. Jakie korzyści finansowe dla firmy Bayer niesie konsolidacja? 12
Co fuzja sumentów? oznacza dla kon- tion of Monsanto, subject to conditions, http://europa.eu/rapid/press-release_ip-182282_en.htm [dostęp: 26.07.2018]. Istnieje kilka scenariuszy mówiących jak ceny produktów rolnych zmienią się w przyszłości. Niestety wśród analityków jak i bardziej poinformowanych konsumentów przeważają ponure nastroje, według nich ceny dla ostatecznego odbiory wzrosną. Na chwilę obecną ciężko jest przedstawiać konkretne statystyki na kolejne lata, ponieważ nie wiadomo dokładnie jak Bayer poradzi sobie finansowo po fuzji. Dodatkowymi elementami utrudniającymi przedstawienie o ile ceny produktów rolnych wzrosną po konsolidacji w porównaniu do okresu przed jej zajściem są czynniki klimatyczne, takie jak globalne ocieplenie oraz aspekty ogólnospołeczne, czyli wzrost liczby ludności na Ziemi. Oba powodują, że ceny plonów stale idą w górę i ciężko przypisać je do przypuszczalnego efektu monopolu Bayer w przyszłości. [5] The Justice Department Is Going to Let Bayer Buy Monsanto. Here's Why It Matters, http://fortune.com/2018/04/10/bayer-monsantodeal-doj-approval/?#x1 [dostęp: 29.07.2018]. Bibliografia: [1] Rachael Haylock, What the Bayer-Monsanto Deal Means for the World's Farmers, https://www.yogi.press/home/how-the-bayermonsanto-deal-affects-the-worlds-farmers [do- stęp: 28.07.2018]. [2] Dana Varinsky, The $66 billion Bayer-Monsanto merger just got a major green light but farmers are terrified, https://www.businessinsider.com/bayer-monsanto-merger-has-farmersworried-2018-4?ir=t [dostęp: 27.07.2018]. [3] Bayer finalizuje przejęcie Monsanto, http://www.bayer.com.pl/pl/media/bayer-finalizuje-przejecie-monsanto.php [dostęp: 25.07.2018]. [4] Mergers: Commission clears Bayer's acquisi- 13
Mechanizmy inhibicji proteaz przez inhibitory białkowe Marta Kubańska Koło Matematyczno-Przyrodnicze Studentów Uniwersytet Jagielloński marta.kubanska@student.uj.edu.pl Praca napisana pod opieką prof. dr. hab. Jana Potempy Peptydazy (proteazy), enzymy hydrolizujące wiązania peptydowe, odgrywają istotną rolę w kontroli procesów życiowych pojedynczej komórki i całych organizmów. Wymaga to precyzyjnej kontroli ich aktywności, ponieważ hydroliza wiązania peptydowego jest procesem nieodwracanym. Nie zaskakuje zatem, że na drodze ewolucji powstało wiele mechanizmów, których celem jest kontrola aktywności proteaz. Jednym ze sposobów hamowania tych enzymów jest produkcja białkowych inhibitorów proteaz. Z racji występowania wielu różnych mechanizmów proteolizy, a przez to różnorakiej budowy dokonujących jej enzymów, możliwe było powstanie inhibitorów, które swoją funkcję spełniają na drodze zarówno oddziaływań niekowalencyjnych, jak i tworzenia kowalencyjnych kompleksów z proteazami, a także blokują dostęp do centrum aktywnego lub zmieniają jego konformację, uniemożliwiając hydrolizę wiązań peptydowych. Inhibitory zamętu? proteaz o co tyle Peptydazy (proteazy), enzymy hydrolizujące wiązania peptydowe, odgrywają istotną rolę w kontroli procesów życiowych zarówno pojedynczej komórki, jak i całych organizmów. Mechanizm proteolizy opiera się na hydrolizie wiązania peptydowego, która z racji występowania struktur rezonansowych bez udziału enzymu przebiega niezwykle wolno. Ułatwienie ataku nukleofilowego na grupę karbonylową jest kluczowe do zajścia reakcji hydrolizy wiązania peptydowego. Hydroliza ta jest procesem nieodwracalnym, przez co aktywność 14 proteaz musi być ściśle kontrolowana. Najczęstszymi mechanizami kontrolującymi aktywność enzymów proteolitycznych są: ich sekrecja w formie nieaktywnych katalitycznie proenzymów (zymogenów) oraz hamowanie ich aktywności przez białkowe inhibitory. O znaczeniu drugiego mechanizmu bardzo dobrze świadczy zawrotna liczba 134 tysięcy znanych sekwencji inhibitorów występujących w komórkach, tkankach i płynach ustrojowych człowieka. Dowodami potwierdzającymi wagę inhibitorów białkowych w utrzymaniu homeostazy
organizmu człowieka są powodowane przez ich całkowity brak lub zaburzenie ich funkcji choroby takie jak zaburzenia krzepnięcia krwi czy też Wprawdzie baza MEROPS zawiera dane na temat niskocząsteczkowych inhibitorów, ale nie są one tematem tej pracy. rozedma płuc [1, 3]. Inhibitory baza MEROPS Klasyfikacja białkowych orów proteaz inhibit- Rozbudowywana od ponad dwudziestu lat baza MEROPS [3, 4] zawiera dane na temat peptydaz, ich substratów oraz inhibitorów. Każda strona ukazuje udział peptydaz w poszczególnych szlakach sygnalizacyjnych i innych procesach komórkowych, specyficzność substratową oraz ich znane inhibitory zarówno białkowe, jak Baza MEROPS dzieli inhibitory białkowe na klany oraz rodziny. Inhibitory przydzielane są do klanów na podstawie wspólnego pochodzenia. Klany posiadają nazwy IA-IZ oraz JA-JO (oprócz IO, JG), przy czym niektóre znane rodziny nie zostały przyporządkowane do żadnego klanu. Rodzina jest z kolei grupą inhibitorów i niskocząsteczkowe. W bazie MEROPS można również znaleźć informacje na temat inhibitorów proteaz takie jak ich sekwencja, struktura czy zakres hamowanych proteaz. o dużym podobieństwie struktury pierwszorzędowej. Na podstawie tego kryterium wyszczególniono 79 rodzin, które są oznaczone literą I oraz odpowiednim numerem (Ryc. 1). Ryc. 1. Podział białkowych inhibitorów proteaz znajdujących się w bazie MEROPS na podstawie mechanizmu hamowania enzymów proteolitycznych. 15
Mechanizmy inhibicji Baza MEROPS podaje wysublimowany sposób podziału inhibitorów proteaz na klany i rodziny. Należy jednak wziąć pod uwagę, iż podział ten ma niewiele wspólnego z mechanizmem działania poszczególnych inhibitorów. Wyróżnia się dwa główne sposoby hamowania aktywności proteaz: poprzez nieodwracalny mechanizm pułapki (ang. trapping) lub przez odwracalne niekowalencyjne oddziaływania z cząsteczką proteazy. Dwie z trzech rodzin inhibitorów hamujących proteazy w sposób nieodwracalny tworzą trwały, kowalencyjny kompleks z hamowaną proteazą (I4, I50). W przypadku trzeciej rodziny (I39) takie połączenie wprawdzie występuje, ale nie jest niezbędne dla mechanizmu inhibicji [5]. Natomiast w obrębie inhibitorów nietworzących kowalencyjnych kompleksów z hamowanymi proteazami można wyróżnić dwie grupy inhibitorów: kanoniczne (naśladujące substrat, oddziałujące tylko w obrębie centrum aktywnego) i niekanoniczne (oddziaływania proteaza inhibitor zachodzą także poza obrębem centrum aktywnego [6]). Trapping mechanizm pułapki Ten sposób oddziaływania jest charakterystyczny dla endopeptydaz. Konieczna jest tutaj bowiem hydroliza specyficznego wewnętrznego wiązania peptydowego w obrębie inhibitora, która powoduje zmianę konformacyjną w obrębie jego cząsteczki prowadzącą do zahamowania aktywności proteazy. 16 Ponieważ inhibitor nie powraca do swojej pierwotnej, niezwiązanej formy, mechanizm uznaje się za nieodwracalny. I4 serpiny Rodzina inhibitorów I4 wzięła swoją nazwę od angielskiej nazwy serine protease inhibitors (inhibitory proteaz serynowych). Proteazy serynowe to jedna z najlepiej opisanych klas enzymów, której strategia katalityczna opiera się na wykorzystaniu modyfikacji kowalencyjnej silny nukleofil serynowy przejściowo wiąże się ze zwykle niereaktywną grupą karbonylową. Charakterystyczną cechą proteaz serynowych jest występowanie triady katalitycznej składającej się z asparaginianu, histydyny i seryny. Mechanizm reakcji opiera się na dwóch głównych etapach: najpierw grupa hydroksylowa seryny atakuje grupę karboksylową substratu, prowadząc do pownstania acyloenzymu, następnie produkt pośredni ulega hydrolizie, co prowadzi do regeneracji enzymu [1]. Do tej grupy zaliczamy m.in. enzymy trzustki (chymotrypsynę, trypsynę, elastazę) o zbliżonej do siebie sekwencji, a także inne popularne proteazy: trombinę, plazminę, kalikreinę, proteazę akrosomalną i lizosomalną, proteazy A i B, subtylizynę. Niektórzy przedstawiciele tej rodziny mogą oddziaływać także z proteazami cysteinowymi, których strategia katalityczna jest podobna do tej wykorzystywanej przez chymotrypsynę. Analogiczną do seryny rolę spełnia tu aktywowana przez
histydynę reszta cysteinowa. Znane I50 enzymy z tej grupy to papaina, większość katepsyn oraz różniące się nieco budową kaspazy [2]. Członkami tej rodziny są inhibitory kaspaz, proteaz cysteinowych. Przed- Serpiny odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy układu krążenia [7]. Inhibitory tworzą z hamowanymi przez siebie proteazami trwałe, kowalencyjne kompleksy [8]. Pierwszym etapem jest jednak niekowalencyjne związanie proteazy do wyeksponowanej pętli reaktywnej (ang. reactive center loop, RCL), a następnie hydroliza serpiny w miejscu aktywnym (ang. reactive site) w obrębie pętli reaktywnej RCL, które u większości serpin znajduje się w zakonserwowanej pozycji P1 P1. Hydroliza ta wywołuje istotne zmiany w konformacji inhibitora: pozostała, nieodcięta część pętli reaktywnej włączana jest jako czwarty łańcuch w strukturę β-kartki A, czemu towarzyszy translokacja związanej z serpiną proteazy na drugi biegun cząsteczki inhibitora [9]. W wyniku tego procesu proteaza ulega również częściowej denaturacji, co zostało dokładnie opisane na przykładzie trypsyny hamowanej przez α1-antychymotrypsynę. Reakcja proteolizy jest zatrzymana na etapie acylowanego enzymu, ponieważ zmiany konformacyjne proteazy skutkują powstaniem zawady sterycznej blokującej dostęp cząsteczek wody do centrum aktywnego, co jest niezbędne do regeneracji (deacylacji) enzymu [10]. Ze względu na ten wyjątkowy mechanizm hamowania proteaz, serpiny są często nazywane molekularnymi pułapkami na myszy. stawicielem tej rodziny jest m. in. wirusowe (Autographa californica nuclear polyhedrosis v.) białko p35, którego sposób oddziaływania z ludzką kaspazą 8 poprzez tworzenie kowalencyjnego kompleksu został opisany na poziomie molekularnym. Związanie aktywnej pętli rozpoznającej kaspazę powoduje wystąpienie silnych naprężeń sterycznych w jej obrębie. Natychmiast po rozcięciu podatnego wiązania przy Asp87 ulegają one rozładowaniu w wyniku relaksacji pętli FG i CD oraz uwolnienia N końca białka z jego zwartej struktury. Ten właśnie koniec ulega następnie związaniu z centrum aktywnym kaspazy, uniemożliwiając tym samym dołączenie cząsteczki wody do His317 wchodzącej w skład diady katalitycznej proteazy, a przez to hydrolizę acyloenzymu - produktu pośredniego występującego w trakcie mechanizmu proteolizy przez proteazy cysteinowe (Ryc. 2, 3). Dodatkowo Cys2 p35 tworzy wiązanie wodorowe z pierścieniem imidazolowym His317, co prowadzi do zmiany orientacji His317, która nie znajduje się w pozycji optymalnej dla przeprowadzenia katalizy [12]. 17
Ryc. 2. Struktura białka p35 bakulowirusa. Kolorami innymi niż zielony zaznaczono regiony, które zmieniają swoje położenie podczas oddziaływania z kaspazą 8. Na pomarańczowo zaznaczono pętle CD (M35-T40), FG (P157Q165) i KL (W254-G255); na niebiesko podkreślono N-koniec. Fioletowy fragment to sekwencja rozpoznająca kaspazę (Q85-D87), natomiast kolorem żółtym podkreślono reaktywną pętlę po jej przecięciu (I93-Y101). Powiększenie uwidocznionych reszt Asp87, Cys2 i Val3. Ryc. 3. Struktura białka p35 bakulowiusa w kompleksie z ludzką kaspazą 8 (błękitna). Pozostałe kolory odpowiednio jak na Ryc. 2. 18
I39 Ludzka α-2-makroglobulina, najlepiej opisany przedstawiciel tej rodziny, hamuje aktywność endopeptydaz należących do wszystkich klas katalitycznych [5]. Tak szerokie spektrum działania zawdzięcza m.in. długiemu i zróżnicowanemu specyficznemu miejscu regionowi przynęty (ang. bait region), który jest hydrolizowany przez hamowane proteazy. Większość inhibitorów tej rodziny posiada charakterystyczne wiązanie βcysteinylo-γ-glutamylotioestrowe, zlokalizowane w domenie tioestrowej (TED tioeter domain) [13, 14]. U ludzi α-2-makroglobulina występuje w osoczu w postaci tetrameru o masie 720 kda. Każdy monomer jest zbudowany z 11 domen i posiada kształt zbliżony do trójkątnego pryzmatu, przy czym przednia powierzchnia jest wypukła, a tylna. Domeny MG1-MG6 (ang. macroglobulin-like) tworzą półtora obrotu prawoskrętnej superhelisy, dzięki czemu domeny MG3- MG6 tworzą jedno z wejść dla substratu. BRD (ang. bait region domain) znajduje się na tylnej powierzchni monomerów, prawdopodobnie biegnąc poprzez wspomniane wcześniej wejście (Ryc. 4). Ryc. 4. Monomer ludzkiej α2-makroglobuliny, widok od przodu. Czerwonym kolorem oznaczono BRD (ang. bait region domain). P690 i T728 stanowiące miejsca przyczepu prawdopodobnej elastycznej pętli BRD oznaczono czerwonymi sferami. Na żółto zaznaczono część TED, w której występuje wiązanie tioestrowe. 19
Dimery powstają dzięki występowaniu mostków disiarczkowych między cysteinami 278 MG3 i 431 MG4 monomerów. Następnie, na skutek niekowalencyjnego oddziaływania dimerów, formuje się tetramer (Ryc. 5, 6). Wewnątrz tetrameru pozostaje wolna przestrzeń, w którą wchodzi proteaza. Znajduje się tu prawdopodobnie zbudowana z 39 aminokwasów ruchoma pętla, BRD. Hydroliza wiązania peptydowego w obrębie BRD przez proteazy powoduje szereg zmian w tetramerze, doprowadzając do wyeksponowania na powierzchni pierwotnie schowanego wewnątrz domeny TED wiązania tioestrowego (między C972 a G973). Wiązanie to jest następnie rozszczepiane przez znajdujące się na powierzchni proteinazy reszty lizynowe, powodując powstanie kowalencyjnego kompleksu proteazamakroglobulina. Ze względu na podobieństwo do sposobu działania roślin drapieżnych łowiących swoje ofiary, mechanizm ten nazywany jest w literaturze anglojęzycznej Venus flytrap, Złapane w pułapkę proteinazy (nie bez powodu przestrzeń między domenami nazywa się centralną komorą łowną (ang. prey chamber)) pozostają wciąż aktywne w stosunku do peptydów i białek o wielkości do 20 kda. Uwięzienie średniej wielkości endopeptydazy wymagają zaangażowania co najmniej dwóch monomerów inhibitora [14]. Pozostałe zmiany powodują wyeksponowanie C-końcowych regionów każdej z domen, wiążących specyficzne receptory komórkowe (RBD receptor binding domain) i umożliwiające błyskawiczne usunięcie kompleksu α2 makroglobulina-proteaza z krwioobiegu [15]. Ryc. 5. Tetrameryczna struktura ludzkiej α-2-makroglobuliny, widok frontalny. Oprócz wyszczególnienia struktur w ten sam sposób jak rysunku wyżej, poszczególne podjednostki zaznaczono odcieniami niebieskiego i zieleni. W środku możemy zaobserwować prey chamber, na które wskazuje strzałka. 20
Ryc. 6. Tetrameryczna struktura ludzkiej α-2-makroglobuliny, widok z boku. Inhibitory odwracalne W przeciwieństwie do opisanych powyżej inhibitorów nieodwracalnych, w przypadku tej grupy cząsteczka inhibitora po uwolnieniu z kompleksu z proteazą jest zdolna do hamowania kolejnych proteaz. Jak wspomniano wcześniej, inhibitory wiążące się do hamowanych proteaz w sposób niekowalencyjny mogą oddziaływać z proteazą tylko w obrębie miejsca wiązania substratu (inhibitory kanoniczne) lub wykazywać też dodatkowo interakcje z innymi rejonami proteazy (inhibitory niekanoniczne). modelem standardowym lub mechanizmem Laskowskiego [16], wykazują inhibitory proteaz serynowych należących do aż 19 różnych rodzin [5, 17]. Inhibitory te zbudowane są z wyeksponowanej pętli, która jest podtrzymywana przez rusztowanie (ang. scaffold) zbudowane ze struktur drugorzędowych. Ze względu na niską masę cząsteczkową, w tych inhibitorach występują liczne mostki disiarczkowe, które zwiększają stabilność białka. W czasie działania mechanizmu hamowania, pętla inhibitora wiąże się do miejsca wiązania substratu, tym samym blokując dostęp do centrum aktywnego innym substratom (Ryc. 7). Inhibitory kanoniczne Ten model inhibicji, zwany też niekiedy 21
Inhibitory niekanoniczne Inhibicja w sposób niekanoniczny zachodzi wtedy, gdy oprócz zablokowania dostępu do centrum katalitycznego, interakcja między inhibitorem a proteazą zachodzi również poza centrum aktywnym enzymu. W przeciwieństwie do inhibitorów kanonicznych ta grupa jest dużo bardziej zróżnicowana. Wobec tego w dalszej części pracy omówione zostaną wybrane inhibitory niekanoniczne. Inhibicja papainopodobnych teaz cysteinowych pro- Szczelina katalityczna tej grupy proteaz przyjmuje kształt litery V, w której znajdują się reszty Cys25, His159 i Asn175, zaangażowane w mechanizm proteolizy. Cystatyny (I25), będące dobrze zbadanymi inhibitorami tej grupy charakteryzują się mechanizmem działania polegającym na wiązaniu się do zewnętrznych powierzchni proteazy, a nie bezpośrednio do miejsca wiązania substratu i pośrednim blokowaniu centrum aktywnego. W kompleksie papainy z ludzką stefiną B (Ryc. 8) możemy zobaczyć, że inhibitor wiąże się do regionu S1 S4 proteazy poprzez dwie pętle o strukturze spinki do włosów. Z kolei jego N koniec oddziałuje z podregionami S1S3 papainy w sposób analogiczny do działania substratu. Ponadto aminokwas w pozycji P1 jest wypętlony i tym samym znajduje się z dala od centrum aktywnego, co zapobiega proteolizie pętli inhibitora [6, 19]. Ryc. 7. Kompleks egliny c (Hirudo medicinalis) z ludzką chymotrypsyną C [18]. Widoczne interakcje fioletowej pętli egliny C (fioletowy), szczeliną naśladującej katalityczną substrat, chymotrypsyny ze C. Wyszczególniona triada katalityczna proteazy. Inhibitory trombiny Trombina jest typową proteazą serynową, posiadającą w centrum aktywnym Ser195, His57 i Asp102. Centrum aktywne jest dość głębokie, otoczone przez dwie długie pętle 60 i 149 aminokwasów. Aktywacja proenzymu następuje wskutek rearanżacji, poprzez wytworzenie mostka solnego między nowopowstałym N końcem a Asp194 domeny katalitycznej. Indukowane wytworzeniem tego wiązania zmiany strukturalne prowadzą do powstania w pełni funkcjonalnego miejsca wiązania substratu (ang. substrate binding site). Kolejną cechą wyróżniającą trombinę na tle jej klasy jest występowanie dwóch dodatnio naładowanych powierzchni zewnętrznych. 22
Ryc. 8. Kompleks stefiny B (zielony) z papainą. Zaznaczona katalityczna C25 papainy. Inhibitory trombiny należące do rodziny I14 wykazują niestandardowy (niekanoniczny) mechanizm inhibicji. Związki takie jak hirudyna czy hemadina zwiększają swoją specyficzność i powinowactwo do trombiny poprzez tworzenie wiązania nie tylko w rejonie centrum aktywnego, ale również interakcję z powierzchniami zewnętrznymi (Ryc. 9). Dla przykładu rodyna (ang. rhodiin) wiąże się N-końcem w kanoniczny sposób z centrum aktywnym proteazy, podczas gdy C koniec inhibitora oddziałuje z powierzchnią zewnętrzną rozpoznającą fibrynogen zarówno przez komplementarne ładunki elektrostatyczne, jak również poprzez wytworzenie dwóch mostków solnych. TIMP inhibitory cynkowych endopeptydaz Rodzina TIMP (ang. tissue inhibitor of metaloproteinase) reguluje fizjologiczną aktywność metaloproteinaz ma- Ryc. 9. Oddziaływanie trombiny z hemadiną (żółty). Kolorem szarym oznaczono triadę katalityczną. cierzy zewnątrzkomórkowej. Charakterystyczną cechą metaloproteaz jest koordynowanie w centrum aktywnym jonu metalu, zazwyczaj cynku, który aktywuje cząsteczkę wody zwiększając jej właściwości nukleofilowe i umożliwiając jej atak na grupę karbonylową wiązania peptydowego [2]. Znamy cztery inhibitory o liczbie aminokwasów 184 (TIMP1) i 194 (TIMP2-23
4), które mogą być glikozylowane i których struktura jest stabilizowana przez mostki disiarczkowe. Z racji swojej niskiej specyficzności, inhibitory te mogą hamować wiele różnych MMP [5]. Domena katalityczna MMP (cdmmp) zbudowana jest zawsze z pięciołańcuchowej skręconej β-kartki ograniczonej z jednej strony przez pętlę S (Ryc. 10). Pomiędzy łańcuchami β-kartki znajduje się strukturalny atom cynku, natomiast z drugiej strony znajdują się trzy α-helisy. Wewnątrz stosunkowo wąskiej szczeliny centrum aktywnego znajduje się atom katalityczny cynku wiązany przez trzy reszty histydynowe. TIMP z kolei blokuje centrum aktywne prawie w całości, a jego C i N końce otaczają centralny region α-helis [6]. Podsumowanie Kataliza przeprowadzana przez proteazy jest wprawdzie niezbędna do zajścia wielu procesów życiowych w komórkach i organizmach, jednak ze względu na swój nieodwracalny charakter musi być niezwykle ściśle kontrolowana. Dowodem tego może być choćby fakt, iż niekontrolowana aktywność proteaz jest przyczyną wielu poważnych schorzeń. Nie zaskakuje zatem, że na drodze ewolucji powstało wiele mechanizmów, których celem jest kontrola aktywności proteaz. Jednym ze sposobów hamowania tych enzymów jest produkcja białkowych inhibitorów proteaz. Z racji występowania wielu różnych mechanizmów proteolizy, a przez to różnorakiej Ryc. 10. Kompleks MMP-10 z TIMP-1 [20]. Żółto-zielonym kolorem oznaczono metaloproteazę, zielonym inhibitor. 24
budowy dokonujących jej enzymów, możliwe było powstanie inhibitorów. Spełniają one swoją funkcję na drodze zarówno oddziaływań niekowalencyjnych, jak i tworzenia kowalencyjnych kompleksów z proteazami, a także blokują dostęp do centrum aktywnego lub zmieniają jego konformację, uniemożliwiając hydrolizę wiązań peptydowych. 9. Gettins, P.G.W. Serpin Structure, Mechanism, and Function. Chem. Rev. 2002; 102: 4751-4803. 10. Huntington, J.A., Readm R.J., Carrell, R.W. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition 1. Berg, Tymoczko, J.L., Stryer, L. Biochemia. Warszawa : PWN, 2005. 2005. 11. Wright, H.T., Scarsdale, J.N. Structural basis for serpin protein inhibitor activity. Proteins. 1995; 22:210-225. 12. Xu, G., Cirilli, M., Huang, Y., Rich, R.L., 3. Rawlings, N.D., Barrett, A.J., Finn, R.D. Twenty years of the MEROPS database of enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 2016; 44:D343D350. A.J. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 2008; 36:D320D325. H. Covalent inhibition 8/p35 complex. Nature. 2001; 410:494-497. The Crystal Structure Reveals Evolutionary families of peptidase inhibitors. Biochem. J. 2004; 378:704-716. of Human Unique α2- Molecular 3344. 14. Garcia-Ferrer, I., Arede, P., Gomez-Blanco, J., et al.structural and functional insights into coli α2-macroglobulin endopeptidase snap-trap inhibition. PNAS. 2015; 112(27):8290-8295. 15. Barrett, A.J., Starkey, P.M. The interaction of with proteinases. Characteristics and specificity of the reaction, and a hypothesis concerning its molecular mechanism. Biochem. J. 1973; 133(4):709-724. 6. Bode, W., Huber, R. Structural basis of endoproteinase-protein a Cage. Angew. Chem. Int. Ed. 2012; 51:3340- α2-macroglobulin 5. Rawlings, N.D., Tolle, D.P., Barrett, A.J. inhibitor interaction. Biochimica et Biophysica Acta. 2000; 1477:241252. 16. Laskowski, M. Jr, Kato, I. Protein inhibitors of Church, F.C. Serpins in thrombosis, hemostasis and fibrynolysis. J. Thromb Haemost. 2007; 5:102-115. proteinases. Annu. Rev. Biochem. 1980; 49:593-626. 17. 7. Rau, J.C., Beaulieu, L.M., Huntington, J.A., Krowarsch, D., Cierpicki, T., Jelen, F., Otlewski, J. Canonical protein inhibitors of serine proteases. Cell. Mol. Life Sci. 2003; 60:2447-2444. 18. Batra, J., Szabo, A., Caufieild, T.R., Soares, 8. Dementiev, A., Dobo, J., Gettins, P.G. Active distortion is sufficient for proteinase inhibition by serpins: structure of covalent complex Wu, Escherichia 4. Rawlings, N.D., Morton, F.R., Kok, C.Y., Kong, site D.G., Macroglobulin Barrett, 2000; 13. Marrero, A., Duquerroy, S., Trapani, S., et al. 2. Garrett, R.H., Grisham, C.M. Biochemistry. J., Nature. revealed by the crystal structure of the caspase- J.M., proteolytic deformation. 407:923-926. Myszka, Bibliografia by of alpha1-protease inhibitor with porcine pancreatic elastase. J. Biol Chem. 2006; 281:3452-3457. A.S., Sahin-Toth, M., Radisky, E.S. Long-range electrostatic complementarity governs substrate recognition by human chymotrypsin C, a key regulator of digestive enzyme activation. J Biol Chem. 2013; 288:9848-9859. 19. Stubbs, M.T., Laber, B., Bode, W., et al. The 25
refined 2,4A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 1990; 9:1939-1947. 20. Batra, J., Robinson, J., Soared, A.S., Fields, A.P., Radisky, D.C., Radisky, E.S. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2: structure. J. binding Biol. studies Chem. and 2012; crystal 287:15935-15946. 21. Laskowski, M., Qasim, M.A. What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structure of enzyme substrate complexes? 1477, 2000, Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1477:324-337. Do stworzenia ilustracji użyto programu PyMOL. 26
Mechanizm działania cytochromu bc1 w kontekście pełnienia funkcji katalitycznych i produkcji wolnych rodników Oskar Lipiński Zakład Biofizyki Molekularnej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński w Krakowie oskar.j.lipinski@gmail.com Praca napisana pod opieką prof. dr. hab. Artura Osyczki Przekształcanie energii w układach biologicznych do form fizjologicznie użytecznych jest procesem niezwykle złożonym. Jednym z białek związanych z oddychaniem komórkowym jest cytochrom bc1 znany też jako kompleks III. Białko to składa się z dwóch jednakowych monomerów tworzących funkcjonalny homodimer. W skład monomeru wchodzą trzy podjednostki katalityczne: cytochrom b, cytochrom c1 oraz ruchoma podjednostka FeS. W cyklu katalitycznym biorą udział kofaktory redoks rozlokowane w poszczególnych podjednostkach. W wyniku utleniania ubichinolu w miejscu Qo dochodzi do uwolnienia dwóch elektronów. Pierwszy z nich wędruje na łańcuch wysokopotencjałowy, a następnie redukuje cytochrom c, a drugi poprzez niskopotencjałowy łańcuch hemów typu b, redukuje związany w miejscu Qi ubichinon. Do pełnej redukcji ubichinonu w miejscu Qi potrzebne są dwa akty związania ubichinolu w miejscu Qo, co prowadzi do częściowego odtworzenia puli zredukowanej formy tego związku w środowisku błonowym. Sekwencyjne przyłączanie oraz odłączanie elektronów z cząsteczki ubichinonu/ubichinolu powoduje powstawanie form semichinonowych, które poprzez odziaływanie z tlenem mogą generować wolne rodniki. Eksperymenty ostatnich lat znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat form semichinonowych w cytochromie bc1 i sposobu ich oddziaływania ze znajdującymi się w pobliżu kofaktorami redoks. Udowodniono także, że możliwy jest transfer elektronów pomiędzy dwoma monomerami w obrębie jednego kompleksu. Wprowadzenie Konwersja energii jest jednym z najbardziej fundamentalnych procesów niezbędnych dla funkcjonowania organizmów. Wiąże się ona z generowaniem siły protonomotorycznej (PMF), która jest niezbędna do wytwarzania ATP z ADP i Pi. Generowanie PMF oparte jest przede wszystkim na transferze elektronów i sprzężonej z nim translokacji protonów w poprzek błony. W układach biologicznych, 27
w procesy te zaangażowane są wysoko wyspecjalizowane białka oraz niskocząsteczkowe związki organiczne. Tworzą one łańcuchy transportu pulę ubichinonu w błonie oraz pulę cytochromu c w przestrzeni międzybłonowej [2, 3]. elektronów, których głównym zadaniem jest przekształcenie jednego rodzaju energii w inny. Najbardziej znanymi układami przekształcającymi energię są mitochondrialny łańcuch oddechowy oraz chloroplastowy łańcuch fotosyntetyczny [1]. Jednym z powszechnie występujących enzymów jest oksydoreduktaza ubichinol-cytochrom c, opisywana jako cytochrom bc1 w układach bakteryjnych lub kompleks III w kontekście oddychania mitochondrialnego. Enzym Struktura cytochromu bc1 ten wykorzystuje reakcje utleniania/redukcji ubichinolu/ubichinonu do translokacji protonów oraz jako jedyny łączy ze sobą dwie odseparowane pule ruchomych przekaźników elektronów ałko zbudowane z ośmiu helis ułożonych prostopadle do powierzchni błony. Posiada ono dwa miejsca katalityczne: Qo oraz Qi, które odpowiedzialne są za wiązanie cząsteczek Cytochrom bc1 funkcjonuje jako homodimer [4]. Każdy z monomerów posiada rdzeń katalityczny składający się z trzech podjednostek: cytochromu b, cytochromu c1 oraz podjednostki FeS (białka Rieskego) Ryc. 1. Każda z tych podjednostek zawiera kofaktory redoks, które zdolne są do przyjęcia lub oddania elektronu [3]. Cytochrom b to największa z podjednostek tego kompleksu. Jest to transbłonowe bi- Ryc. 1. Struktura krystalograficzna cytochromu bc1 z Rhodobacter capsulatus (baza danych RCSB 1ZRT) [5]. Kolory czerwony, niebieski i zielony odpowiadają kolejno cytochromowi b, podjednostce FeS oraz cytochromowi c1. 28
ubichinonu/ubichinolu. Miejsca te połączone są łańcuchem hemów typu b (kolejno bl o niskim potencjale redoks (Em7 ~ -0,2 do 0,05 V) i bh o wysokim potencjale redoks ((Em7 ~ +0,05 do +0,15 V) w zależności od organizmu), zwanym łańcuchem niskopotencjałowym [6]. Warto tutaj wspomnieć, że hemy typu b wiążą się z białkiem tylko za pomocą wiązań koordynacyjnych, a nie koordynacyjnych i kowalencyjnych jak hemy typu c. Kolejna z podjednostek cytochrom c1 składa się z hydrofilowej domeny zawierającej kowalencyjnie związany hem typu c oraz jednej transbłonowej α-helisy. Hem c1 charakteryzuje się wysokim potencjałem redoks (Em7 ~ +0,25 do +0,35 V). Podobnie, klaster żelazowo-siarkowy ([2Fe-2S]) podjednostki FeS posiada wysoki potencjał redoks (Em7 ~ +0,25 do +0,35 V). Z tego powodu, w celu odróżnienia go od łańcucha hemów typu b, nazywa się go łańcuchem wysokopotencjałowym. Podjednostka FeS składa się z domeny hydrofilowej, w której położony jest klaster żelazowo-siarkowy, oraz transbłonowej α-helisy, która zakotwicza podjednostkę w błonie. Jej położenie sprawia, że w przeciwieństwie do pozostałych podjednostek, nie przynależy ona strukturalnie wyłącznie do jednego monomeru [7]. Co więcej, struktury krystalograficzne pokazały, że białko Rieskego może znajdować się w różnym położeniu względem pozostałych podjednostek (w pobliżu cytochromu c1 oraz w oddaleniu od rdzenia białkowego). Obserwacja ta, poparta szeregiem badań biochemicznych i kinetycznych, pozwala stwierdz- ić, że podjednostka ta wykonuje ruch rotacyjno-translacyjny w trakcie cyklu katalitycznego, co umożliwia sprawne przenoszenie elektronów z cytochromu bc1 na związane z przestrzenią międzybłonową białko cytochrom c. W skład monomeru w najprostszych kompleksach bakteryjnych, np. u Rhodobacter capsulatus, wchodzą jedynie trzy opisane wyżej podjednostki. W innych kompleksach, np. u Rhodobacter sphaeroides, występuje dodatkowa podjednostka, a w ludzkim i wołowym kompleksie jest ich osiem [8]. Ich rola nie jest do końca jasna, ale wiadomo, że nie zawierają one kofaktorów redoks. Sugeruje się, że mogą być one zaangażowane w pozycjonowanie podjednostki FeS względem reszty kompleksu poprzez swoją aktywność proteolityczną [9]. Czynniki określające transferu elektronów wydajność Biologiczny transfer elektronów związany jest z efektem tunelowym, polegającym na przejściu elektronów przez barierę potencjału o wysokości większej niż ich energia. To zjawisko opisywane jest przez mechanikę kwantową. Na szybkość transferu składają się dwa zasadnicze czynniki. Pierwszym z nich jest odległość między centrami, pomiędzy którymi zachodzi tunelowanie. Im bliżej znajdują się centra, tym szybszy jest ten proces. Związane jest to z nakładaniem się funkcji falowych donora i akceptora elektronu, którego siła zmniejsza się wraz ze wzrostem odległości. Aby taki transfer był efektywny nie powinna ona przekraczać 14 29
Ryc. 2. Schematyczne przedstawienie cyklu katalitycznego cytochromu bc1. W miejscu Qo następuje rozdział transferu elektronów na dwa łańcuchy kofaktorów. W miejscu Qi związany ubichinon w wyniku dwóch obrotów katalitycznych przyjmuje dwa elektrony oraz dwa protony i przekształca się w ubichinol. Efektem sprzęgnięcia tych dwóch miejsc w pętlę redoks jest translokacja protonów w poprzek błony. Å. Drugim czynnikiem wpływającym na szybkość transferu jest tzw. siła napędowa, proporcjonalna do różnicy potencjałów redoks obydwu centrów. Można ją interpretować jako energię uwolnioną podczas spontanicznego transferu elektronu od niskopotencjałowego kofaktora do wysokopotencjałowego. Takie reakcje są korzystne pod względem energetycznym [10,11]. Cykl katalityczny Cytochrom bc1 działa w oparciu o tzw. cykl Q, którego mechanizm został zaproponowany przez Petera Mitchella w 1975 roku [12] i nieco zmodyfikowany w późniejszych latach [13]. Polega on na sprzęgnięciu działania centrów Qo oraz Qi w pętlę redoksową. Utlenienie ubichinolu (UQH2) w miejscu Qo, 30
znajdującym się blisko dodatnio naładowanej strony błony, wiąże się z uwolnieniem dwóch elektronów oraz dwóch protonów. Związany w miejscu Qi, w pobliżu przestrzeni międzybłonowej, ubichinon (UQ) jest zdolny do redukcji i odtworzenia puli UQH2 Ryc. 2. UQH2 pełni w ten sposób jednocześnie rolę substratu oraz produktu. Miejsce Qo łączy ze sobą wcześniej wspomniane dwa funkcjonalne łańcuchy kofaktorów. Przyjrzyjmy się więc bliżej temu, jak są one wykorzystywane. W trakcie utleniania cząsteczka ubichinolu oddaje dwa elektrony. Jeden z tych elektronów wędruje na klaster żelazowo-siarkowy podjednostki FeS, która w wyniku reorientacji względem reszty kompleksu przekazuje go na hem c1. Praca mechaniczna wykonana przez podjednostkę FeS pozwala na zmianę polarności środowiska, w którym zachodzi dalszy transfer elektronów. Cytochrom c, będący małym hydrofilowym białkiem, pełni funkcję odbiorcy elektronu od kompleksu III. Drugi elektron wędruje na niskopotencjałowy łańcuch hemów b. Związany w miejscu Qi ubichinon przyjmuje ten elektron i jednocześnie redukuje się do wolnorodnikowej formy ubisemichinonu (USQ). Do pełnego cyklu katalitycznego, a więc do oddysocjowania cząsteczki ubichinolu z miejsca Qi, potrzebne są zatem dwa akty związania ubichinonu w miejscu Qo. Sumarycznie, w trakcie pełnego cyklu katalitycznego, utleniane są dwie cząsteczki UQH2, redukowana jedna cząsteczka UQ i dwie cząsteczki cytochromu c. Następuje także oddanie czterech protonów i przyjęcie dwóch protonów po przeciwnej stronie błony. Rozdzielenie szlaku elektronów, zachodzące w centrum Qo, znane jest jako reakcja bifurkacji. Jest to reakcja wyjątkowa spośród wszystkich znanych reakcji w układach biologicznych. Jednak jeśli przyjrzeć się jej bliżej, można zastanowić się nad tym, który łańcuch nisko czy wysokopotencjałowy wybierze pierwszy elektron? A może obydwa elektrony jednocześnie odrywają się od cząsteczki UQH2? Proponowane są dwa odmienne modele opisujące jej mechanizm. Pierwszym z nich jest model sekwencyjny, który zakłada, że zachodzą dwa następujące po sobie transfery elektronów. Pierwszy z elektronów redukuje klaster żelazowo siarkowy, w wyniku czego powstaje cząsteczka ubisemichinonu posiadająca niesparowany elektron. Cząsteczka ta jest mało stabilna i oddaje elektron na hem bl. Drugim modelem jest model jednoczesny, w którym oba elektrony przekazywane są jednocześnie bez powstawania wolnorodnikowego stanu pośredniego [14,15,16]. Niedawne badania wykazały, że w szczególnych okolicznościach możliwe jest zaobserwowanie formy semichinonowej, której obecność wrażliwa jest na specyficzne względem miejsca Qo inhibitory [17]. Wydaje się, że model sekwencyjny lepiej opisuje realny mechanizm bifurkacji. Transfer elektronów w obrębie dimeru Rozpatrywane powyżej mechanizmy 31
obejmowały reakcje zachodzące na poziomie jednego monomeru. Możliwość transferu elektronów pomiędzy monomerami była jednak rozpatry- rozpięty pomiędzy dwoma monomerami. W ostatnich latach udowodniono, że taki transfer rzeczywiście jest możliwy. Eksperymenty, wana już od momentu publikacji pierwszych struktur krystalograficznych [18]. Wynika z nich, że odległość pomiędzy dwoma hemami bl wynosi ok. 14 Å Ryc. 3. Dystans ten jest wystarczający na możliwy pod względem skali czasowej transfer elektronów. Obliczony czas transferu elektronu pomiędzy dwoma hemami bl wynosi 0,025 0,25 ms, podczas gdy na zajście jednego obrotu w trakcie katalizy potrzeba 0,5 5 ms [14]. Wydaje się więc, że hemy bl tworzą mostek które doprowadziły do tego odkrycia polegały na asymetrycznym wyłączeniu centrów Qi oraz Qo, tak, aby jedyna droga transferu elektronów łącząca te dwa centra prowadziła przez mostek hemowy [4,19]. Modyfikacja tego typu była trudna do zrealizowania, gdyż poszczególne monomery są nierozróżnialne na poziomie genetycznym. Aby osiągnąć modyfikację asymetryczną w dimerze, zastosowano system oparty na skonstruowaniu białka fuzyjnego za- Ryc. 3. H-kształtne rozmieszczenie kofaktorów w dimerze cytochromu bc1 z zaznaczonym połączeniem hemów bl obydwu monomerów. Sześciokątami zaznaczono przybliżone miejsca wiązania ubichinonu/ubichinolu. Odległość pomiędzy dwoma hemami bl została podkreślona. 32
stępującego pojedyncze monomery. W oparciu o badania zaproponowano model działania cytochromu bc1, który swoją budową przypomina literę H. Przez wiele lat nie udało się natomiast wykryć semichinonu wrażliwego na obecność specyficznych inhibitorów centrum Qo. Wiązano to przede wszys- Pozostaje jednak pytanie, jakie znaczenie fizjologiczne ma H-kształtne połączenie między centrami katalitycznymi. Można zakładać, że system ten jest elementem obrony przed efektami mutacji mitochondrialnych. Jest to związane z właściwością tego systemu, która polega na tym, że funkcjonalność cytochromu bc1 zostaje zachowana tak długo, jak istnieje jakiekolwiek połączenie między aktywnymi centrami Qi i Qo. tkim z jego wysoką niestabilnością i bardzo krótkim czasem życia. Inne hipotezy zakładały, że w miejscu Qo może powstawać stabilny semichinon, ale na skutek silnych oddziaływań antyferromagnetycznych z pobliskim klastrem żelazowo-siarkowym jest on niewidoczny w eksperymentach wykorzystujących spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) do jego detekcji [21]. Ostatnie badania wykazały jednak jednoznacznie, że dochodzi do for- Stany semichinonowe i generacja reaktywnych form tlenu mowania się tego stanu pośredniego. Semichinon wygenerowany w miejscu Qo oddziałuje magnetycznie z klastrem [2Fe-2S] białka Rieskego. Jest to jednak stosunkowo słabe oddziaływanie wymienne, prowadzące do pojawienia się na widmie EPR nowego przejścia rezonansowego, którego amplituda jest niezależna od obecności tlenu. Obecność tego sygnału wykazano także w cytochromie b6f [22]. Przejściu temu towarzyszy sygnał o charakterze wolnorodnikowym, który jest identyfikowany jako ubisemichinon niezwiązany oddziaływaniem wymiennym z [2Fe-2S] [17]. Na podstawie tej obserwacji zaproponowano nowy mechanizm bifurkacji, który zakłada że para USQo-FeS jest początkowym etapem tej reakcji, kiedy białko żelazowo-siarkowe odebrało już elektron, ale nie odsunęło się jeszcze od centrum Qo. Stan ten nie reaguje z tlenem cząsteczkowym, co chroni enzym przed nadmierną produkcją reaktyw- Formowanie się ubisemichinonu w centrum Qi jest zjawiskiem obserwowanym od wielu lat. Sygnał pochodzący od tego stanu pośredniego wrażliwy jest na antymycynę, czyli inhibitor specyficzny względem centrum Qi. Rodnik ten charakteryzuje się wysoką stabilnością i nie reaguje z tlenem, co zabezpiecza enzym przed produkcją reaktywnych form tlenu (RFT). Z najnowszych badań wynika, że istnieją dwie formy tego związku forma wolno- oraz szybko-relaksująca. Pierwszą z nich wiąże się ze zredukowanym hemem bh, a drugą z utlenionym hemem bh [20]. Forma szybko-relaksująca oddziałuje jonowo ze wcześniej wspomnianym hemem, odzwierciedlając stan pośredni powstający w trakcie cyklu katalitycznego enzymu. 33
nych form tlenu. Warto się jeszcze zastanowić, czy istnieją inne mechanizmy zabezpieczające enzym przed produkcją RFT 2004;81(3):251-75. oprócz wcześniej wspomnianego oddziaływania ubisemichinonu z klastrem żelazowo-siarkowym. Odpowiedzią może być H-kształtny transfer elektronów pomiędzy monomerami. Połączenie czterech hemów b może być traktowane jako element chroniący przed produkcją wolnych rodników w miejscu Qo, gdyż zredukowany hem b L, będący nieodłączną częścią tego zjawiska może oddać elektron zarówno hemowi bh, jak również hemowi bl znaj- Biomembr. 2008;40(5):493-9. dującemu się na sąsiednim monomerze [23]. peptidase from potato is an integral part of 6. Zhang H, Chobot SE, Osyczka A, Wraight CA, Dutton PL, Moser CC. Quinone and non-quinone redox couples in Complex III. J Bioenerg 7. Darrouzet E, Valkova-valchanova M, Moser CC, Dutton PL, Daldal F. Uncovering the [2Fe2S] domain movement in cytochrome bc1 and its implications for energy conversion. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97(9):4567-72. 8. Xia D, Esser L, Tang WK, et al. Structural analysis of cytochrome bc1 complexes: implications to the mechanism of function. Biochim Biophys Acta. 2013;1827(11-12):127894. 9. Braun HP, Emmermann M, Kruft V, Schmitz UK. The general mitochondrial processing cytochrome c reductase of the respiratory chain. EMBO J. 1992;11(9):3219-27. Bibliografia 10. Marcus RA, Sutin N. Electron transfers in 1. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to chemistry and biology. Biochim Biophys Acta. electron and hydrogen transfer by a chemi- 1985;811(3):265-322. osmotic 11. Moser CC, Farid TA, Chobot SE, Dutton PL. type of mechanism. Nature. 1961;191:144-8. Electron tunneling chains of mitochondria. 2. Pintscher, S. et al., Molekularny mechanizm Biochim Biophys Acta. 2006;1757(9-10):1096- reakcji wolnych 109. Postępy 12. Mitchell P. The protonmotive Q cycle: katalitycznych rodników przez i produkcji cytochrom bc1. Biochemii. 2014;60(3):285 294. a 3. Sarewicz M, Osyczka A. Electronic connection 1975;59(2):137-9. between the quinone and cytochrome C redox 13. Crofts AR, Meinhardt SW, Jones KR, Snozzi pools and its role in regulation of mitochondrial M. The role of the quinone pool in the cyclic electron transport and redox signaling. Physiol electron-transfer chain of Rhodopseudomonas Rev. 2015;95(1):219-43. sphaeroides: A modified Q-cycle mechanism. 4. Swierczek M, Cieluch E, Sarewicz M, et al. An Biochim Biophys Acta. 1983;723(2):202-218. electronic bus bar lies in the core of cytochrome 14. Osyczka A, Moser CC, Daldal F, Dutton PL. bc1. Science. 2010;329(5990):451-4. Reversible redox energy coupling in electron 5. Berry EA, Huang LS, Saechao LK, Pon NG, transfer chains. Nature. 2004;427(6975):607-12. Valkova-valchanova M, Daldal F. X-Ray Structure 15. Muller F, Crofts AR, Kramer DM. Multiple Q- of Rhodobacter Capsulatus Cytochrome bc (1): cycle bypass reactions at the Qo site of the Comparison with and cytochrome Chloroplast Counterparts. Res. 2002;41(25):7866-74. its Mitochondrial Photosyn general formulation. bc1 complex. FEBS Lett. Biochemistry. 34
16. Zhu J, Egawa T, Yeh SR, Yu L, Yu CA. Energy Transduction, and Signaling. 2016:281- Simultaneous reduction of iron-sulfur protein 294. and cytochrome b(l) during ubiquinol oxidation in cytochrome bc(1) complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(12):4864-9. 17. Sarewicz M, Dutka M, Pintscher S, Osyczka A. Triplet cluster state as bifurcation an of the semiquinone-rieske intermediate catalyzed by of electronic cytochrome bc1. Biochemistry. 2013;52(37):6388-95. 18. Xia D, Yu CA, Kim H, et al. Crystal structure of the cytochrome bc1 complex from bovine heart mitochondria. Science. 1997;277(5322):60-6. 19. Czapla M, Cieluch E, Borek A, Sarewicz M, Osyczka A. Catalytically-relevant electron transfer between two hemes bl in the hybrid cytochrome bc1-like complex containing a fusion of Rhodobacter sphaeroides and capsulatus cytochromes b. Biochim Biophys Acta. 2013;1827(6):751-60. 20. Pintscher S, Pietras R, Sarewicz M, Osyczka A. Electron sweep across four b-hemes of cytochrome bc revealed by unusual paramagnetic properties of the Q semiquinone intermediate. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2018;1859(6):459-469. 21. Link TA. The role of the 'Rieske' iron sulfur protein in the hydroquinone oxidation (Q(P)) site of the cytochrome bc1 complex. The 'protongated affinity change' mechanism. FEBS Lett. 1997;412(2):257-64. 22. Sarewicz M, Bujnowicz Ł, Bhaduri S, Singh SK, Cramer WA, Osyczka A. Metastable radical state, nonreactive with oxygen, is inherent to catalysis by respiratory and photosynthetic cytochromes bc1/b6f. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114(6):1323-1328. 23. Sarewicz M, Ekiert R, Osyczka A. InterMonomer Electron Transfer in Cytochrome bc Complexes. In: Cramer W, Kallas T, ed. Cytochrome complexes: Evolution, Structures, 35
Publikacja w Acta Mygenica XV Zachęcamy do publikacji w kolejnym numerze Zeszytów Naukowych "Acta Mygenica" Koła Naukowego Studentów Biotechnologii "Mygen". Akceptujemy artykuły przeglądowe i badawcze o tematyce z zakresu lifescience. Najlepsze z nadesłanych artykułów zostaną opublikowane w XV wydaniu "Acta Mygenica" w maju 2019. Termin nadsyłania abstraktów mija 17 marca, natomiast artykułów oraz zgód opiekuna naukowego 24 marca. W razie pytań prosimy o kontakt z Kingą Stopą (kinga.sstopa@gmail.com). Poprzednie edycje zeszytów naukowych Acta Mygenica oraz szczegółowe informacje są dostępne pod adresem: www.mygen.wbbib.uj.edu.pl/dzialalnosc/actamygenica 36