\ =fi /ą4-* f f l.ui.m9 hi#oad Streszczenie Słowa kluczowe: żółć, złogi żółciowe, kamica żółciowa, zakażenie żółci, bakterie. Wstęp Kamica żółciowa jest szeroko rozpowszechnioną chorobą. Szacuje się, że dotyczy od 15 do 18 proc. osób dorosłych. W Polsce kamica Żółciowa jest 2-3 razy częstsza u kobiet. W wieku powyżej 601at ponad 30 proc. kobiet ma złogi w pęcherzyku żółciowym. Etiologia kamicy żółciowej jest złożona. Uznaje się za prawdopodobne, że złogi Żółciowe mogą rozwijać się po zakończeniu procesu zapalnego z udziałem bakterii. W podobny sposób złogi żółciowe mogą występować jako ciała obce zwiększające skłonność koloiiiz{.icji przez bakterie. Rozwój złogów żółciowych może objąć interakcję obu mechanizmów: bakteryjnego i niebakteryjnego. Nie mniej jednak do tej por}' nie udowodniono roli bakterii w powstawaniu złogów Żółciowych. W myśl dotychczasowych poglądów uważa się, iż żółć i złogi w pęcherzyku Żółciowym mogą być jałowe w przypadku bezobjawowej kamicy pęcherzykowej, natomiast kamicy przewodowej prawie zawsze towarzyszy zakażenie. Powoduje to konkretne konsekwencje kliniczno-terapeutyczne związane ze sposobem leczenia a zwłaszcza stosowaniem antybiotyków. Pomimo tych założeń, jak dotąd znaczenie kliniczne obecności bakterii w złogach żółciowych nie jest znane. Wykazanie obecności DNA bakteryjnego w złogach Żółciowych i określenie udziału bakterii w ich tworzeniu może pomóc w prognozowaniu i zmniejszeniu ryzyka kamicy żółciowej. Może umożliwić to nie tylko skuteczną profilaktykę, ale także leczenie oraz zmniejszenie liczby powikłań ww. jednostki chorobowej poprzez stosowanie leków przeciwbakteryjnych.
Cel pracy Celem pracy była identyfikacja bakterii w złogach żółciowych oraz w żółci u pacjentów operowanych z powodu objawowej kamicy żółciowej. Materiał i metody Badaniem objęto 52 pacjentów, operowanych w trybie planowym i pilnym w Klinice Chirurgii Ogólnej i Onkologicznej Centralnego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, w okresie od września 2014 do marca 2017 roku. W badanej grupie były 34 (65,4 /o) kobiety oraz 18 (34,6%) mężczyzn w wieku 20-87 lat, średnio 57,4 lata. Wśród badanej populacji 39 (75 %) pacjentów przyjęto w trybie planowym z powodu objawowej!camicy pęcherzyka żółciowego, a 13 (25 %) w trybie dyżurowym z objawami ostrego zapalenia pęcherzyka żółciowego na tle kamiczym. Chorzy poddani zostali operacjom: cholecystektomii metodą laparoskopową - 42 osoby (81 %) oraz metodą laparotomii -9 osób (17 %). U jednego pacjenta (2 /o) wykonano endoskopową cholangiopankreatografię wsteczną z ewakuacj ą złogu (ECPW). Każdemu pacjentowi w chwili przyjęcia do Kliniki pobrano próbkę krwi żylnej obwodowej celem oznaczenia morfologii krwi. Parametrem, który analizowano było stężenie leukocytów w próbce krwi. Usunięte pęcherzyki poddawano diagnostyce histopatologicznej celem oceny obecności procesu zapalnego i stopnia jego zaawansowania. Śródoperacyjnie pobierano żółć do badania bakteriologicznego. W przypadku stwierdzenia zakażenia z uzyskanych hodowli identyfikowano florę bakteryjną. Pobrany złóg żółciowy był czyszczony z zewnątrz metodami fizycznymi oraz chemicznymi. Złóg następnie kruszono w młynku kriogeniczym. Z tak przygotowanego materiału izolowano DNA w
układzie zamkniętym. Stężenie wyizolowanego DNA oceniano fluorometrycznie, następnie namnażano z wykorzystaniem pary starterów komplementamych z fragmentami 16S rrna. Do procesu amplifikacji wykorzystano dwie metody. Następnie przeprowadzono reakcję sekwencjonowania, a uzyskane wyniki zostały poddane analizie bioinfomatycznej. Wyniki W badanej grupie, u 11 (21 %) chorych stwierdzono leukocytozę, definiowaną jako liczbę leukocytów powyżej 10xl03/Hl (min. 3,5xl03/Hl, max. 22,3xl03/Hl, średnio 8,Oxl03/H1). W badaniu histopatologicznym wyciętych pęcherzyków żółciowych w 7 (13,7 %) przypadkach stwierdzono ostrą formę zapalenia pęcherzyka ropno-zgorzelinowe, ropowicze, zgorzelinowe (4 u kobiet oraz 3 u mężczyzn), a u 44 (86,3 %) chorych (15 mężczyzn i 29 kobiet) stwierdzono przewlekłe i przewlekłe zaostrzone zapalenie pęcherzyka (cholecystitis chronica calculosa). Z żółci pobranej śródoperacyjnie w 15 (29%) przypadkach wyhodowano bakterie. Wyhodowane z posiewu Żółci drobnoustroje stanowiła mieszana flora bakteryjna: bakterie tlenowe i beztlenowe. W 10 przypadkach identyfikowano jeden gatunek bakterii, natomiast w 5 więcej niż 1 gatunek. Obecność bakteryj nego materiału genetycznego zidentyfikowano w 7 złogach żółciowych z grupy 52 (13,5 %) stosując metodę 1 oraz w 20 z grupy 20 (100%) stosując metodę 2. Metodą biologii molekulamej zidentyfikowano bakterie do rodzaju i gatunku we wszystkich złogach żółciowych izolowanych od 20 pacj entów, u których łącznie zidentyfikowano 28 szczepów bakterii. Dominowały szczepy bakterii Gram-dodatnich należące do rzędu Łczc/o!3czcz.//c}/es, rodziny Streptococcaceae, rodriih.. Streptococcus - 9 (32; y(o) i Z,czcŹococczA -4 ( 14%), dodatkowo -rodzaj SfczpAy/ococt,.#s -2 (7%) należący
do rodz:my Staphylococcaceae, rz;ędh Bacillales ora;z rz;ąd Clostridiales, rodzj+m Clostridiaceae, reprez;ertlowa:m prz!ez rodza:] Clostridium -2 (7 y{o). Przedstawicielami pałeczek Gram-ujemnych występującymi najliczniej były bakterie z rodzaju 4cz.77efoć)c7c/ć3r należącego do rodziny n4:cłrczxe//czcec7ć7, rzędu Psć?#c7omo#czc7cz/ć7s - 7 (25%), również dwa rodzaje należące do rzędu Enterobacterales, rodziriy Enterobacteriaceae.. Buchnera -2 (7 /o).i Klebsiella ~ 1 (4%) oraz Salmonella - 1 (4%). Z grupy bakterii Gram-dodatnich najczęściej izolowano gatunki: 1aseczka z;gorz;eri ga;z!owe:] - Clostridium perf iringens -2 (7 y;o), Streptococcus salivarius - 4 (14 y{o), Lactococcus garvieae - 2 (7 /o) ora;z Lactococcus lactis - 2 (7 y{o), Sf7~Ć3pfococca4 cr73gz.72o c4-4 (14%), Streptococcus constellatus - 1 (4%) jak i dwa gatunki gronkowców - S/czpAy/ococccĄs cr#re#s - 1 (4%) i SźczpAy/ococcz4s epz.c7ermz.c7z.s - 1 (4%). Florę Gram - ujemną reprezentowały gatunki - Ac:mstobaicter ba;um2iriri - 7 (25 /o), Buchnera aphidicola - 2 (7 y{o), Salmonella Ć)o77gorj. - 1 (4%) oraz Klebsiella pneumoniae - 1 (4%). Posiew bakteriologiczny Żółci u 20 chorych, u którycłi zidentyfikowano w złogach żółciowych bakteryjny materiał genetyczny, był jałowy u 12 (60%) pacjentów i dodatni u 8 (40%) pacjentów, u których wyhodowano w sumie 15 szczepów bakterii: 8 (53,3%) izolatów bakterii Gram-ujemnych oraz 7 (46,7%) izolatów bakterii Gram-dodatnich. Bakterie Gram-ujemne reprezentowane były głównie przez rząd Enterobacterales, rodz:ma Enterobacteriaceae, rodri].. Escherichia -3 (20 /o), Klebsiella -2 (13 /o), Enterobacter - 1 (6,5 /o) or8;z rz;qd Pseudomonadalesg rodzina. Pseudomonadaceae, rodzaj] Pseudomonas -2 (13 y;o). Wśród pałeczek Gram-ujemnych dominowały gatunki: EL`'c%ć?rz.c%z.cz co/j. - 3 (20 /o), Klebsiella pneumoniae - 2 (13 y(ob, Pseudomonas aeruginosa - 2 (13 y{o), a tęlkże Enterobacter cloacae - 1 (6,5 y{o). Najczęściej izolowane szczepy bakterii Gram-dodatnich to rząd Lactobacillales, rodzim Enterococcaceae, rodz;a:] Enterococc:us -3 (2f J /o) ora;z.
należąca do tego samego rzędu rodzina Sf7`Gpfococcczceczć?, rodzaj S/rć?pfococc#s- 3 (20 /o). Wyhodowano również rodzaj SfczpAy/ococc% - 1 (6,5 /o) należący do rodz:my Staphylococcaceae, rz!ędn Bacillales. Ziarenkowce Gram-dodatnie reprezentowane były głównie przez gatunki paciorkowców kałowych: E#ferococc3As /czeccz/z.s - 1 (6,5%), E73ferococc%s ftecium - 1 (6,S y{o), Enterococcus galinarum - 1 (6,5 i'o), paclorkowców zieleniących jamy ustnej - Sfrepfococc#s orc!/z.s - 1 (6,5%) i gronkowca r\flskórkowego -Staphylococcus epidermidis -L (6,5 y;o). Zarówno w przypadku posiewów żółci, jak i oceny profilu bakteriologicznego kamieni żółciowych, u niektórych pacjentów izolowano więcej niż jeden rodzaj lub gatunek drobnoustroju. Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań sformułowano następuj ące wnioski: 1. We wszystkich złogach z grupy 20 chorych (badanych z użyciem metody 2) identyfikowano materiał genetyczny bakterii. 2. Najczęściej izolowane rodzaje bakterii to S/7'ć?pfococc#s,.4cz.7zĆ3/oZ)czc/er oraz Lactococcus. 3. Zarówno w przypadku dodatnich posiewów bakteriologicznych żółci, jak i złogów, w których stwierdzono materiał genetyczny bakterii w większości identyfikowano więcej niż j eden rodzaj/gatunek drobnoustroju. 4. Skład flory bakteryjnej wnętrza złogu oraz żółci był w wielu przypadkach różny, co sugeruje, że w samym procesie tworzenia się złogu mogły brać udział ime rodzaje drobnoustrojów niż obecne w żółci podczas operacji. T--ĄQŹ#-(2-4