Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego Review articles 113 Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego podłoże potencjalnych mechanizmów interakcji z lekami syntetycznymi. Część I Marcin Ożarowski 1, 2, Przemysław łukasz Mikołajczak 1, 3, radosław Kujawski 1, teresa Bobkiewicz-Kozłowska 3, Przemysław M. Mrozikiewicz 1 1 Instytut Roślin i Przetworów Zielarskich ul. Libelta 27 61-707 Poznań 2 Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej i Biotechnologii Roślin Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego ul. Św. Marii Magdaleny 14 61-861 Poznań 3 Katedra i Zakład Farmakologii Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego ul. Rokietnicka 5a 60-806 Poznań *autor, do którego należy kierować korespondencję: e-mail: mozarowski@iripz.pl S t r e s z c z e n i e Rozwój badań nad molekularnymi mechanizmami fitoterapii pozwala na coraz lepszą identyfikację mechanizmów neurochemicznych prowadzących do występowania interakcji pomiędzy lekami roślinnymi a syntetycznymi na poziomie receptorów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W naszej pracy podjęliśmy próbę podsumowania oraz krytycznej analizy doniesień o tego rodzaju interakcjach pomiędzy wybranymi roślinami leczniczymi: Ginkgo biloba (Ginkgo), Hypericum perforatum (St. John s Worth) (część I cyklu artykułów), Valeriana officinalis (Valerian) oraz Panax ginseng (Ginseng) (część II) a lekami syntetycznymi (np. benzodiazepiny i barbiturany, opioidy) na poziomie receptorów OUN (między innymi: receptorów GABA-ergicznych, glutaminianergicznych, dopaminergicznych, adenozynowych) zarówno wynikających z badań in vitro, jak i z in vivo. Analiza danych bibliograficznych wykazała, że ginkgolidy oraz bilobalid wiążą się z receptora- Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 114 mi GABA-ergicznymi (jako antagoniści niekompetycyjni), a także skracają czas snu indukowanego heksobarbitalem oraz uretanem. Inne badania pozwoliły na stwierdzenie, że hiperforyna, hiperycyna oraz amentoflawon wpływają na aktywność różnych receptorów ośrodkowego układu nerwowego (NMDA, DA, GABA, 5-HT). Kilka badań wykazało wiązanie kwasu walerenowego do receptorów GABA, co potwierdziło, że ekstrakty Valeriane radix mogą powodować interakcje z anestetykami, anksjolitykami oraz lekami uspokajającymi i nasennymi oraz mogą nasilać sedatywny efekt działania tych leków. Ponadto stwierdzono, że ginsenozydy mogą powodować interakcje z morfiną oraz apomorfiną na poziomie receptorów dopaminergicznych. Wydaje się, że w celu wyjaśnienia dokładnej natury receptorowych mechanizmów interakcji pomiędzy lekami roślinnymi a syntetycznymi konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań neurochemicznych i farmakologicznych. Słowa kluczowe: receptor, ośrodkowy układ nerwowy, interakcja, lek roślinny, lek syntetyczny Zastosowanie leku roślinnego w chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Klasyfikacja roślin leczniczych o aktywności zmieniającej czynność ośrodkowego układu nerwowego Długa historia tradycyjnego stosowania surowców roślinnych pokazuje, że wiele roślin leczniczych wywiera wpływ na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) i ma zastosowanie w licznych chorobach tego układu zarówno w medycynie tradycyjnej, jak i współczesnej. Wraz z rozwojem nauk medycznych (psychiatria, neurologia, geriatria) i lepszym poznawaniem biologicznego podłoża chorób OUN konieczna staje się zmiana sposobu postrzegania możliwości terapeutycznych leków pochodzenia naturalnego w kontekście optymalizacji farmakoterapii, poszukiwań nowych strategii leczenia (prewencja pierwotna i wtórna) oraz wyjaśniania receptorowych mechanizmów interakcji leków roślinnych z lekami syntetycznymi. Coraz częściej w rozlicznych badaniach rozwojowych roślinnych produktów leczniczych zwraca się uwagę na biologiczną i farmakologiczną aktywność substancji roślinnych w modyfikowaniu procesów starzenia się OUN. Do współczesnych zadań fitoterapii chorób ośrodkowego układu nerwowego należą nerwice oraz zaburzenia nastroju (depresje), zaburzenia snu oraz zaburzenia pamięci. Podłożem tych stanów chorobowych są urazy psychiczne, lęki, frustracje i przede wszystkim stres, szczególnie przewlekły [1]. Nowe badania dostarczają coraz więcej dowodów na aktywność receptorową roślinnych związków biologicznie czynnych w OUN. Nie powinno więc dziwić, że wielu autorów podejmuje próby klasyfikowania i nazywania całej grupy surowców o takiej aktywności neuroaktywnymi lekami roślinnymi [2] lub psychoterapeutycznymi lekami roślinnymi [3]. Największą liczbę badań naukowych o charakterze przedklinicznm i klinicznym wykonano na czterech roślinach lecznicze o działaniu neuro- i psychoaktywnym: Ginkgo biloba, Hypericum perforatum, Valeriana officinalis oraz Panax ginseng.
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego Na podstawie systematycznego przeglądu bibliograficznego można przyjąć, że do grupy roślin stosowanych w nadpobudliwości, stanach niepokoju, lęku i trudności w zasypianiu należą kozłek lekarski (Valeriana officinalis L., surowiec: Valerianae radix), melisa lekarska (Melissa officinalis L., surowiec: Melissae folium), chmiel zwyczajny (Humulus lupulus L., surowiec: Lupuli strobilus), męczennica cielista (Passiflora incarnata L., surowiec: Passiflorae herba) oraz lawenda wąskolistna (Lavandula angustifolia Mill., surowiec: Lavandulae flos) [4]. Do grupy roślin leczniczych wykazujących działanie tonizujące zaliczane są żeń-szeń (Panax ginseng C. A. Mey., żeń-szeń właściwy, surowiec: Ginseng radix), eleuterokok kolczysty, nazywany żeń-szeniem syberyjskim (Eleutherococcus senticosus Maxim., surowiec: Eleutherococci radix), różeniec górski (Rhodiola rosea L., surowiec: Rhodiolae radix), maca (Lepidium peruvianym Chacon syn. Lepidium meyenii Walp., surowiec: radix) oraz śpioszyn lekarski (Withania somnifera L., surowiec: Withaniae radix). Grupę surowców roślinnych zawierających kofeinę stanowią: nasienie kakaowca (Cacao semen, Theobroma cacao L., kakaowiec właściwy), nasienie kawy (Coffea arabica L., kawa arabska), nasienie guarany (Paulinia cupana Kunth., cierniopląt guarana), nasienie kola (Colae semen; Cola sp.: C. nitida Schott et Endlih., C. acuminata Pal de B., C. vera K. Schum.), liść herbaty (Theae folium, Camellia sinensis syn. Thea sinensis L., herbata chińska), a także liść mate, nazywany również herbatą paragwajską (Mate folium, Ilex paraquariensis St. Hil., ostrokrzew paragwajski). W zaburzeniach krążenia mózgowego i upośledzonej koncentracji oraz obniżonej wydolności umysłowej, wyczerpaniu i przemęczeniu stosowany jest liść miłorzębu dwuklapowego (Ginkgo biloba L.), który również wspomaga działanie terapeutyczne w początkowych stadiach choroby Alzheimera [5-7]. W stanach lękowych i napięcia psychicznego oraz bezsenności na podłożu przewlekłego stresu do niedawna stosowany był pieprz metystynowy (Piper methysticum Forster, surowiec Methystyci rhizoma) znany pod nazwą kava-kava [8, 9]. Do tej grupy zaliczana jest także Passiflora incarnata L. [10, 11, 12], Magnolia spp. (głównie honokiol, magnolol) [13-16], a także Scutellaria baicalensis Georgi (głównie wogonina) [17-20]. Na szczególną uwagę farmakognostów i fitoterapeutów zasługuje dziurawiec zwyczajny (Hypericum perforatum L., surowiec: Hyperici herba), który jest rośliną leczniczą o potwierdzonej skuteczności w terapii zaburzeń psychowegetatywnych, lęków, niepokojów nerwowych oraz łagodnej i umiarkowanej depresji [21, 22]. Profil skuteczności i bezpieczeństwa tego surowca roślinnego został potwierdzony wieloma badaniami klinicznymi przeprowadzonymi w większości w Niemczech (metaanaliza 31 badań klinicznych zawarta jest w monografii European Scientific Cooperative on Phytotherapy [23]). Zgodnie z indeksem terapeutycznym zawartym w amerykańskiej monografii PDR for Herbal Medicines [24] do kategorii surowców o działaniu przeciwlękowym włączono 49, o działaniu uspokajającym i nasennym 37, przeciwmigrenowym 20, stymulującym ośrodkowy układ nerwowy 13 oraz o działaniu przeciwdepresyjnym 10 roślin leczniczych pochodzących z różnych regionów świata. Obecnie podejmuje się również próby dalszych klasyfikacji surowców roślinnych ze względu na uchwytne i potwierdzone farmakologiczne działania kierunkowe nowo poznanych roślin, które mogą mieć znaczenie w terapii chorób ośrodkowego układu nerwowego [25]. 115 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 116 Działanie roślinnych związków biologicznie czynnych na receptory OUN Coraz więcej wiadomo na temat oddziaływania związków biologicznie czynnych pochodzenia roślinnego na receptory OUN. Nowe odkrycia pozwalają na podjęcie prób wyjaśniania mechanizmów odpowiedzialnych za aktywność farmakologiczną i skuteczność terapeutyczną preparatów ziołowych stosowanych w różnych schorzeniach OUN. Odkrycia te pozwalają również wyjaśniać lub przewidywać potencjalne interakcje pomiędzy lekiem roślinnym a lekiem syntetycznym w fazie farmakodynamicznej. Do tej pory jednak nie opublikowano prac, które by jasno wyjaśniały tego rodzaju interakcje nie tylko w warunkach in vitro, ale także w klinice. W tabeli 1 zaprezentowano wyniki badań in vitro potencjalnych oddziaływań związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych (Ginkgo biloba, Hypericum perforatum, Valeriana officinalis, Panax ginseng) na receptory OUN dające pogląd na możliwość zachodzenia interakcji na poziomie receptora z lekami syntetycznymi o takim samym lub podobnym farmakologicznym punkcie uchwytu działania w ośrodkowym układzie nerwowym. Ta b e l a 1. Próba usystematyzowania dostępnych informacji pochodzących z badań in vitro i in vivo dotyczących oddziaływania wybranych roślin leczniczych (związków czynnych lub ekstraktów surowców otrzymanych z roślin leczniczych Ginkgo biloba, Hypericum perforatum, Valeriana officinalis, Panax ginseng) na receptory ośrodkowego układu nerwowego rodzaj receptora receptory glutaminianergiczne (typu NMDA) receptory GABA-ergiczne receptory glicynowe Receptory BDZ, benzodiazepinowe receptory dopaminergiczne receptory adenozynowe (A 1 ) receptory serotoninowe rośliny lecznicze wchodzące w skład leków roślinnych działanie antagonistyczne: Panax ginseng (frakcja saponin -ginsenozydy Rb1, Rc, Rg1, Rg3) [26-29] Hypericum perforatum (ekstrakt LI160S, amentoflawon) [30, 31] Ginkgo biloba (bilobalid, kempferol, kwas kynureninowy, 6-hydroksykynureninowy) [32-35] działanie agonistyczne: Valeriana officinalis (kwas walerenowy) [36] działanie antagonistyczne: Ginkgo biloba [37-40] Hypericum perforatum (amentoflawon) [42] działanie antagonistyczne: Ginkgo biloba [35, 47-50] działanie agonistyczne: Valeriana officinalis (seskwiterpeny, monoterpeny) [36] działanie antagonistyczne: Hypericum perforatum [41] działanie modulujące: Panax ginseng (ekstrakt G115, PHL-00701) [52, 53] działanie agonistyczne: Valeriana officinalis (lignany, ekstrakty) (receptor A 1 częściowy agonizm) [54] działanie agonistyczne i modulujące: (5-HT 2 ) Hypericum perforatum (up-regulacja) [55, 56] Ginkgo biloba (frakcja flawonoidowa) (up-regulacja) [57] Valeriana officinalis (ekstrakt metanolowy, kwas walerenowy) (5-HT 2B, 5-HT 5A, częściowy agonizm) [58]
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego Mechanizmy receptorowe leżące u podłoża interakcji związków biologicznie czynnych liści Ginkgo biloba z lekami syntetycznymi Spośród kilkudziesięciu dostępnych badań opublikowanych w latach 1982 2008 dotyczących interakcji związków czynnych lub/i ekstraktów roślinnych z receptorami komórkowymi wyselekcjonowano do analizy wyniki badań, które dotyczyły ośrodkowego układu nerwowego i receptorów: GABA-ergicznych, glutaminianergicznych, glicynowych, dopaminergicznych, cholinergicznych oraz serotoninowych, których funkcje oraz struktura zostały w znacznej mierze poznane. Zaburzenia w funkcjonowaniu tych receptorów (i odpowiednio neuronów) między innymi zaangażowane są w powstawanie zaburzeń funkcji poznawczych oraz depresji, której główny patomechanizm polega na osłabieniu neurotransmisji serotoninowej i/lub noradrenergicznej oraz procesów aktywacji w obszarach korowo-limbicznych z uwzględnieniem wpływu na kaskadę glikokortykoidową [59-63]. Dysfunkcje receptorowe biorą również udział w rozwoju otępienia, definiowanego według Światowej Organizacji Zdrowia (ICD-10) jako zespół objawów wywołany chorobą mózgu, zwykle przewlekłą lub o postępującym przebiegu, charakteryzujący się klinicznie licznymi zaburzeniami wyższych funkcji korowych, takich jak pamięć, myślenie, orientacja, rozumienie, liczenie, zdolność do uczenia się i posługiwania się językiem, którego podłożem jest głównie deficyt przekaźnictwa cholinergicznego z charakterystyczną sekwencją zdarzeń [64, 65]. Z kolei w rozwoju choroby Parkinsona dochodzi do uszkodzenia neuronów dopaminergicznych szlaku czarno-prążkowiowego, co prowadzi wtórnie do pobudzenia układu glutaminianergicznego oraz cholinergicznego [66, 67]. Wyżej wymienione układy neuroprzekaźnikowe i odpowiadające im receptory oraz adenozyna są zaangażowane również w przebieg faz snu i czuwania [68], a ich dysfunkcje mogą prowadzić do zaburzeń rytmów biologicznych. Interakcje bilobalidu Badania przeprowadzone przez Kleina i wsp. [34] nad aktywnością trilaktonu seskwiterpenowego bilobalidu in vitro z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej wykazały, że związek ten miał aktywność hamującą w stosunku do receptora N-metylo-D-asparaginowego (NMDA) poprzez oddziaływanie na miejsce glicynowe niezależne od strychniny. Ma to szczególne znaczenie w procesie powstawania niedotlenienia, które powoduje uszkodzenia fosfolipidów na drodze złożonych reakcji patologicznych (masywne uwalnianie glutaminianu, aktywacja receptora NMDA, napływ wapnia do komórki, ekscytotoksyczność). Inni badacze również wykazali aktywność bilobalidu w tym zakresie (zahamowanie aktywności receptora NMDA) [35]. Dalsze badania przeprowadzone przez Huang i wsp. [38] w modelu z ludzkim rekombinowanym receptorem α 1 β 2 γ 2L GABA A wykazały, że bilobalid wywierał aktywność jak niekompetycyjny antagonista receptora GABA A. Badanie wykazało, że aktywność bilobalidu była zależna od jego stężenia i zaobserwowano, że wraz ze wzrostem stężenia bilobalidu (3 µm, 10 µm, 30 µm) maksymalna odpowiedź 117 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 118 GABA wobec receptora GABA A wyniosła odpowiednio 83,3%, 66,6% oraz 62,4%. Ponadto bilobalid w badanych stężeniach 3 µm, 10 µm i 30 µm zwiększył wartość EC 50 dla GABA o odpowiednio 1,5 raza, 1,8 raza i 2,7 raza. Stwierdzono również, że bilobalid (IC 50 = 4,6±0,5 µm) był prawie tak samo aktywny jak bikukulina (antagonista kompetycyjny) oraz pikrotoksyna (antagonista niekompetycyjny). Późniejsze badania [39] potwierdziły, że bilobalid wchodzi w interakcje z receptorem GABA A i że ma aktywność właściwą dla antagonistów tego receptora. Efekt ten wykazano po podaniu do kultury błon komórkowych neuronów korowych szczura bilobalidu (w stężeniach mikromolarnych) łącznie z [ 35 S] TBPS (t-butylobicyklofosforotionat), związkiem o wysokim powinowactwie do kompleksu receptora GABA A kanał chlorkowy (antagonista niekompetycyjny). Stwierdzono, że wraz ze zwiększaniem stężenia bilobalidu zmniejszało się wiązanie TBPS do receptora GABA A (IC 50 =3,7 µm). Zdolność bilobalidu do hamowania wiązania tego związku do receptora może wynikać ze strukturalnego podobieństwa bilobalidu do pikrotoksyny. Udowodniono, że podawanie bilobalidu w wysokich dawkach, w przeciwieństwie do pikrotoksyny (niekompetycyjny antagonista) oraz bikukuliny (kompetycyjny antagonista receptora GABA A ), nie powoduje drgawek. Według Jonesa [40] brak prodrgawkowego działania bilobalidu może wynikać z hamowania uwalniania glutaminianu. Kolejny eksperyment tych samych autorów [39] dotyczacy wpływu bilobalidu na przepływ [ 36 Cl] w synaptoneurosomach (preparat fragmentów dendrytów z kolcami dendrytycznymi) pozwolił na stwierdzenie, że podawanie bilobalidu hamuje funkcje receptora GABA A w 10-krotnie wyższych stężeniach (IC50>39 µm) w porównaniu ze stężeniem powodującym wiązanie bilobalidu do receptora GABA A. Oznacza to, że niskie stężenie bilobalidu potrzebne do związania tego związku z receptorem nie powoduje hamowania prądu Cl -. Badanie przeprowadzone przez Kondratską i wsp. [45] na modelu rekombinowanego receptora glicynowego (GlyRs), którego ekpresję wywołano w oocytach gatunku Xenopus, wykazało, że podanie bilobalidu blokowało podjednostkę β receptora, czego konsewencją było niekompetycyjne hamowanie napięcia indukowanego glicyną. Inne badanie, przeprowadzone przez Ivic i wsp. [46] dotyczące aktywności bilobalidu (BB, 10 µm) wyizolowanego z ekstraktu z liści Ginkgo biloba w stosunku do receptorów Gly oraz GABA A, wykazało, że związek ten antagonizował aktywację receptora GABA A, a także obniżał zwiększone stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego indukowane glicyną, lecz w wyższym stężeniu niż ginkgolid B. Interakcje ginkgolidów A, B, C, M, J Chatterjee i wsp. [35] wykazali, że ginkgolidy A, B, C i J występujące w ekstrakcie EGb 761 (24% glikozydów flawonowych, 6% laktonów terpenowych, w tym 2,9% bilobalidu, 3,1% ginkgolidów A, B, C; DER 50:1; 60% acetonu; producent: Dr Willmar Schwabe Pharmaceuticals) mają aktywność selektywnych antagonistów receptora glicynowego (GlyR). Badania nad mechanizmem działania ginkgolidu B pozwoliły autorom na stwierdzenie, że związek ten można zaklasyfikować do grupy blokerów
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego otwartego kanału receptora glicynowego (ang. GlyR-open-channel blocker, GlyROB). Wykazano również, że efekt działania ginkgolidów jest zależny od napięcia i stężenia (stężenia tych związków rzędu µm oraz nm blokują otwarty kanał chlorkowy receptora glicynowego) oraz różni się od specyficznego działania strychniny. kolejne badanie przeprowadzone przez Heads i wsp. [47] miały na celu wykazanie aktywności ginkgolidów w zależności od ich struktury w stosunku do rekombinowanego receptora glicynowego (GlyR) zbudowanego z pięciu podjednostek α1 α4, β (różne izoformy). W eksperymencie uwzględniono również badanie wpływu konserwatywnej i niekonserwatywnej mutacji receptora Gly na jego wrażliwość po podaniu ginkgolidów a, B, c i j i na mechanizm wiązania tych związków do kanału receptora Gly (izoforma α1 GlyR). W pracy stwierdzono, że ginkgolidy wykazują podobieństwo strukturalne do siebie z uwzględnieniem obecności lub braku dwóch podstawników tlenowych w pozycji R1 i R2 (ryc. 1). Podczas badania elektrofizjologicznego stwierdzono, że ginkgolid j (Gj) hamował aktywność izoformy α1 receprora Gly (średnia wartość ic 50 = 5,3 ± 1,3 µm), a także izoformy α1β receptora Gly (średnia wartość ic 50 = 1,6 ± 0,5 µm, p<0,05). Wcześniejsze badania elektrofizjologiczne wykazały wartości ic 50 Gj na poziomie mikromolarnym w stosunku do receptora Gly [48, 35]. 119 a) R1 R2 ginkgolid a H H ginkgolid B OH H ginkgolid c OH OH ginkgolid j H OH b) bilobalid Rycina 1. struktura chemiczna ginkgolidów a (Ga), B (GB), c (Gc), j (Gj) z uwzględnieniem obecności lub braku podstawnika w pozycji R1 i R2 oraz struktura bilobalidu (BB) Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 120 Kolejny eksperyment wykazał, że GJ może zostać związany do kanału receptora Gly tylko wówczas, gdy receptor zwiazany jest z glicyną. Wykazano również, że mutacje w regionie 2-6 domeny M2 receptora glicynowego [69, 70], a szczególnie mutacja w pozycji 6 - T6 A (alanina), T6 V (walina), zupełnie eliminowały zdolność wszystkich ginkgolidów do blokowania kanału receptora (zmiana struktury kanału). Natomiast mutacja w pozycji T6 S (seryna) oraz T6 G (glicyna) receptora Gly w sposób statystycznie istotny hamowała tę aktywność ginkgolidów. Stwierdzono, że w zależności od stężenia GJ odgrywa rolę klasycznego niekompetytywnego antagonisty receptora Gly [47], podobnie jak GA, GB oraz GC [49, 50], natomiast dzięki mutacjom receptora w pozycji T6 odkryto miejsce i mechanizm wiązania ginkgolidów do kanału receptora Gly. Ponadto stwierdzono, że w wiązaniu do pozycji T6 biorą udział którakolwiek lub wszystkie 4 grupy hydroksylowe ginkgolidów (dwie niezmienne i dwie zmienne w pozycjach R1 i R2), a eliminacja hydrofobowego odcinka na receptorze prowadzi do redukcji aktywności wszystkich ginkgolidów. Ze względu na silne podobieństwo w położeniu grup funkcyjnych ginkglidu B (GB) i pikrotoksyny (PTX) [46] mechanizm wiązania tych związków do receptora Gly może być podobny: grupa hydroksylowa przy podstawniku R1 ginkgolidu B może ulec wiązaniu z resztą 6 natomiast grupa hydroksylowa przy podstawniku R2 z resztą 2 na receptorze [71]. Krystalograficzna analiza struktury ginkgolidów wykazała u wszystkich obecność w budowie sześciu pierścieni, natomiast GA różnił się od pozostałych związków brakiem dwóch grup hydroksylowych. Wykazano przy tym, że GA może ulegać wiązaniu w różnych położeniach do otwartego lub zamkniętego receptora Gly [47]. Inne badanie, przeprowadzone przez Ivic i wsp. [46], dotyczące aktywności związków czynnych wyizolowanych z ekstraktu liści Ginkgo biloba: GA, GB, GC oraz GJ i bilobalidu (BB) w stosunku do receptorów Gly oraz GABA A, wykazały, że podawanie glicyny (200 µm) powodowało zwiększenie stężenia wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, które zostało zredukowane po podaniu GB (10 µm). Odpowiedź na podanie glicyny była zmniejszana do 67, 48 oraz 30% w miarę zwiększania liczby powtórzeń podawania glicyny łącznie z GB. Wykazano, że GC oraz GM po potrójnym podaniu (10 µm) również zmniejszały działanie glicyny do 30 40% (w porównaniu z kontrolą), podczas gdy GA oraz GJ wykazały słabsze działanie w tym zakresie (70 80% w porównaniu z kontrolą). Kolejne doświadczenie przeprowadzone przez tych samych autorów na wyizolowanej tkance nerwowej mózgu szczura wykazało, że podawanie GB (50 µm) lub BB (50 µm) łącznie z GABA (30 µm) powodowało zredukowanie odpowiedzi po podaniu GABA odpowiednio do 63 oraz 47% (IC 50 =73 µm dla GB, IC 50 =46 µm dla BB). Otrzymane wyniki potwierdziły, że GB wykazuje aktywność właściwą dla selektywnego niekompetytywnego antagonisty receptora Gly, przy czym GB, GC oraz GM mają większy potencjał w tym zakresie niż GA i GJ. Wynika z tego, że za większą aktywność GB, GC i GM może odpowiadać grupa hydroksylowa w pozycji R1 [46].
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego Inne badania, przeprowadzone przez Shyam Chatterjee i wsp. [35], również wykazały, że ginkgolidy (ginkgolidy A, B, C, J) są efektywnymi blokerami kanałów chlorkowych aktywowanych glicyną w neuronach hipokampu szczura. Wykazano, że wszystkie badane związki miały aktywność blokowania kanałów aktywowanych glicyną. Nasycenie blokowania dla ginkgolidu B zaobserwowano przy wartości IC 50 =0,273 µm, dla ginkgolidu C przy wartości IC 50 =0,267 µm, dla ginkgolidu A przy wartości IC 50 =1,97 µm, dla ginkgolidu J przy wartości IC 50 =2,0 µm. W badaniu tym wykazano także, że bilobalid jest słabym inhibitorem receptora NMDA. Z powyższego wynika, że związki czynne ekstraktu EGb 761 mają interesującą możliwość modulowania homeostazy anionowej w OUN poprzez odpowiednie receptory jonotropowe [36]. Interakcje kwasu kynureninowego i 6-hydroksykynureninowego Innymi związkami ekstraktu EGb 761 modulującymi aktywność układu glutaminianergicznego są kwas kynureninowy (KYNA) oraz 6-hydroksykynureninowy (6-HKA) [32]. KYNA oddziałuje głównie poprzez miejsce glicynowe B w receptorze NMDA oraz jest słabym antagonistą o niewielkim powinowactwie do metabotropowych receptorów glutaminianergicznych (mglur) [72, 73]. Badania przeprowadzone przez Webera i wsp. [74] miały na celu wykazanie interakcji KYNA oraz 6-HKA z receptorami glutaminianergicznymi (typu NMDA, AMPA), a tym samym zbadanie aktywności neuroprotekcyjnej badanych związków. Wcześniejsze badania wykazały bowiem, że KYNA jest niespecyficznym i niekompetycyjnym antagonistą miejsca glicynowego receptora NMDA [75]. Weber i wsp. [74] testowali wyizolowane KYNA oraz 6-HKA pod względem antagonizmu do receptorów glutaminianergicznych (GluR) w porównaniu z innymi związkami w kulturze komórek piramidowych rejonu CA1 hipokampu. Wykazano, że 6-HKA ma małe powinowactwo do receptora NMDA jako antagonista (IC 50 =136 µm) w porównaniu z KYNA (IC 50 =59 µm), ale wyższe do receptora AMPA (K B =22 µm vs 172 µm). Ponadto zaobserwowano, że dwa badane związki czynne kompetycyjnie hamowały odpowiedź aktywacji receptora AMPA. Otrzymane wyniki pozwoliły autorom na stwierdzenie, że hydroksylacja znacznie zmienia profil farmakologiczny KYNA, na co wskazuje większe powinowactwo 6-HKA do receptora typu AMPA. Pomimo stosunkowo małej lipofilności tych związków ich właściwości mogą mieć znaczenie kliniczne, pod warunkiem że będą przenikać barierę krew-mózg [74]. Przedstawione interakcje związków czynnych Ginkgo folium z receptorami OUN podsumowano w tabeli 2. 121 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 122 Ta b e l a 2. Podsumowanie interakcji związków czynnych ekstraktu z liści Ginkgo biloba z receptorami OUN interakcje receptorowe dotyczące ośrodkowego układu nerwowego model in vitro receptor/kanał związek czynny/ekstrakt zbadany efekt interakcji piśmiennictwo NMDA kwas kynureninowy (KYNA) niespecyficzny i niekompetycyjny antagonista miejsca glicynowego receptora NMDA 32, 72, 73, 74 NMDA bilobalid zapobieganie uszkodzeniom fosfolipidów błony komórkowej spowodowanym 34 działaniem NMDA; antagonista AMPA kwas 6-hydroksykynureninowy antagonista 74 GABA A (receptor rekombinowany) glicynowe receptory serotoninowe, noradrenergiczne ginkgolid B (*), ginkgolidy A, C (**) bilobalid (**) ginkgolidy, bilobalid ekstrakt EGb 761 ginkgolidy antagoniści niekompetycyjni (efekt zależny od stężenia GABA) antagoniści (efekt zależny od stężenia glicyny i struktury badanych związków czynnych) wpływ modulujący na receptorowe układy w OUN 46 (*) 38, 39, 40 (**) 35, 46, 47, 48, 49, 50 57, 76 (*), (**), (***) oznaczenia zamieszczone przy numerach pozycji piśmiennictwa odnoszą się do wyników badań cytowanych w tabeli Interakcje receptorowe ekstraktów z Ginkgo biloba z lekami syntetycznymi zbadane w modelu zwierzęcym Niewiele jeszcze wiadomo na temat skutków klinicznych interakcji preparatów Ginkgo biloba z lekami syntetycznymi na poziomie receptorowym (in vitro), pomimo że istnieje już szeroka wiedza dotycząca oddziaływania związków biologicznie czynnych zawartych w Ginkgo folium na receptory OUN. Badania nad interakcją produktów otrzymywanych z liści Ginkgo biloba z lekami syntetycznymi w modelu zwierzęcym wskazują na możliwe efekty zachodzących interakcji lekowych wynikających z podobnego mechanizmu działania farmakologicznego. Badania przeprowadzone przez Wadę i wsp. [77] miały na celu wykazanie wpływu wodnego ekstraktu z liści Ginkgo biloba oraz wyizolowanych związków biologicznie czynnych (bilobalid, ginkgolidy) na czas snu indukowanego heksobarbitalem (90 mg/ kg, i.p.) u myszy. W pierwszym etapie badań wykazano, że podawanie zwierzętom diety zawierającej 5% liści Ginkgo biloba lub 5% ekstraktu z liści Ginkgo biloba skracało czas snu indukowanego heksobarbitalem. Współczynnik redukcji czasu snu dwóch grup wyniósł 35,7% w porównaniu z kontrolą. W drugim etapie badania wykazano, że największy współczynnik redukcji obecny był po podaniu bilobalidu (10 mg/kg m.c., współczynnik redukcji 54%), natomiast po podaniu ginkgolidu A oznaczono mniejszy współczynnik (44%). Najwyższą wartość współczynnika redukcji wyznaczono po podaniu bilobalidu (30 mg/kg/dzień przez 4 dni, p.o.) gdy sen indukowano uretanem (500 mg/kg i.p.). Otrzymane wyniki wskazują na to, że bilobalid oraz ginkgolid A bezpośrednio stymulują ośrodkowy układ nerwowy, odwrotnie niż
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego heksobarbital oraz uretan. Nie wykazano wpływu ekstraktu Ginkgo folium na enzymy mikrosomalne wątroby. Na podstawie tych obserwacji można przypuszczać, że doszło do interakcji antagonistycznej pomiędzy związkami czynnymi ekstraktu z liści miłorzębu japońskiego a anestetykami, co stanowi ona potwierdzenie obserwacji in vitro [46]. Wyniki badań [38] wykazały także, że ginkgolidy (A, B) skracały czas snu indukowanego barbituranami w modelu zwierzęcym. Badania Hugueta i wsp. [57] wykazały, że długotrwałe podawanie ekstraktu EGb 761 szczurom spowodowało istotne zwiększenie wiązania (o 33%) radioliganda ([3H]8-hydroksy-2(di-n-propyloamino)tetraliny) do receptorów 5-HT 1A na komórkach kory mózgowej w grupie starych szczurów, u których wcześniej stwierdzono istotną redukcję (o 22%) miejsc wiązania (B max ) radioliganda, co było związane ze zmniejszeniem gęstości receptorów. Huguet i wsp. [57] wykazali protekcyjne działanie związków czynnych ekstraktu na błony komórkowe neuronów prowadzące do zwiększenia liczby miejsc wiążących, czyli wzrostu gęstości receptorowej. Mechanizmy receptorowe leżące u podłoża interakcji preparatów Hypericum perforatum z lekami syntetycznymi Zarówno frakcja naftodiantronów, jak i flawonoidów w ekstraktach na bazie Hypericum perforatum ma w znacznym stopniu udokumentowaną badaniami in vitro aktywność biologiczną skierowaną na enzymy metabolizujące neurotransmitery (monoaminooksydazy typu A i B MAO A, MAO B, metylotransferaza katecholowa COMT) [44, 82, 84]. Wyniki nowych badań neurochemicznych coraz wyraźniej wskazują także na powinowactwo związków czynnych ekstraktów z ziela dziurawca do różnych receptorów OUN [41-43, 51, 83]. Aktywność ta nie tylko wyjaśnia skuteczność ekstraktów na bazie Hypericum perforatum ale również wskazuje punkty uchwytu dla potencjalnych interakcji farmakodynamicznych z lekami syntetycznymi o ośrodkowym punkcie uchwytu działania farmakologicznego. Systematyczny przegląd piśmiennictwa wykazał, że zarówno izolowane związki biologicznie czynne (hiperycyna, hiperforyna, amentoflawon), jak i zawarte w ekstraktach z ziela Hypericum perforatum (działające jako zespół związków czynnych), wpływały na wiązanie radioligandów do różnych receptorów OUN: benzodiazepinowych (BDZ), dopaminergicznych, GABA-ergicznych, glutaminergicznych (typ NMDA), opioidowych (µ, κ, δ), serotoninergicznych, receptorów dla CRF1 (czynnik uwalniający kortykotropinę, ang. corticotropin releasing factor), receptorów dla neuropeptydu Y (NPY), receptorów SIGMA oraz do transportera dopaminowego [44, 51, 78-86], które biorą udział w patogenezie zaburzeń depresyjnych i lękowych [85]. W licznych pracach badawczych in vitro wykazano również wpływ związków czynnych dziurawca zwyczajnego na gęstość receptorową i wychwyt neurotransmiterów oraz na aktywność enzymów metabolizujących neurotransmitery [31, 44, 78, 87-89]. 123 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 124 Interakcje hiperycyny Badania neurochemiczne z zastosowaniem nowych technik badawczych pozwoliły na określenie hamującego wpływu hiperycyny na wiązanie ligandów ze znacznikiem radioaktywnym wyrażonego wartościami IC 50. Badania przeprowadzone przez Gobbiego i wsp. [43] wykazały, że hiperycyna w zależności od warunków badań (zaciemnienie lub jego brak) w sposób statystycznie istotny hamowała wiązanie radioligandów do receptorów dla neuropeptydu Y (receptory NPY-Y1 i NPY-Y2) oraz SIGMA. Badania in vitro nad interakcjami hiperycyny z innymi receptorami OUN nie wykazały statystycznie istotnych efektów. Z przeglądu badań przeprowadzonego przez Kubina i wsp. [44] wynika, że hiperycyna w stężeniach mikromolarnych hamowała wiązanie radioliganda do receptorów opioidowych typu µ, κ, δ, podczas gdy wiązanie do receptorów serotoninergicznych 5-HT było hamowane przez hiperycynę w przybliżeniu trzykrotnie słabiej. Stwierdzono, że hiperycyna wykazała najsilniejszą aktywność inhibicyjną wobec radioliganda ulegającego wiązaniu do receptora CRF (IC 50 =0,3 μmol/l). Stwierdzono również, że w ciemności hiperycyna wykazywała słabszą aktywność inhibicyjną w stosunku do radioligandów dla receptora NPY1 oraz NPY2 (w porównaniu z wynikami eksperymentu przeprowadzonego z oświetleniem). Podobny efekt zaobserwowano w badaniu wpływu hiperycyny na wiązanie radioliganda do receptora SIGMA. Ponadto stwierdzono, że hiperycyna w sposób statystycznie nieistotny (zahamowanie wiązanie radioliganda o <10%) wykazywała powinowactwo do receptorów: adenozynowych (A 1, A 2 ), adrenergicznych (α 1, α 2, β 1 ), angiotensynowych AT 1, benzodiazepinowych, dopaminergicznych D 1, GABA-ergicznych, opioidowych, glikokortykosteroidowych, receptorów dla bradykininy, dla tachykininy (NK 1 ), dla neuropeptydu Y (NPY) i dla wazopresyny (V 1 ). Wyniki badań przedstawione w pracy poglądowej przez Kubina i wsp. [44] podsumowano w tabeli 3. Ta b e l a 3. Działanie hiperycyny na różne receptory lub kompleksy receptorowe OUN hamowanie wiązania radioliganda (IC 50 ) [wg 44] receptor/kompleks receptora pochodzenie receptora /kompleksu receptora wartość IC 50 [µg/ml] radioligand (stężenie nm/l) piśmiennictwo glutaminergiczny NMDA np 1 np 31 opioidowy µ ludzki rekombinowany 1 [ 3 H] nalokson (3,6) 82 opioidowy κ ludzki rekombinowany 3 [ 3 H] nalokson (3,6) 82 opioidowy δ ludzki rekombinowany 4 [ 3 H] deltorfina (0,28) 82 serotoninergiczny 5-HT 6 ludzki rekombinowany 6 [ 3 H] LSD (1,2) 82 serotoninergiczny 5-HT 7 ludzki rekombinowany >10 [ 3 H] LSD (1,2) 82 serotoninergiczny 5-HT 6 szczurzy rekombinowany >>1 [ 3 H] 5-HT (10) + światło 43 serotoninergiczny 5-HT 6 szczurzy rekombinowany nd [ 3 H] 5-HT (10) + ciemność 43
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego 125 receptor/kompleks receptora pochodzenie receptora /kompleksu receptora wartość IC 50 [µg/ml] serotoninergiczny 5-HT 7 szczurzy rekombinowany >>1 serotoninergiczny 5-HT 7 szczurzy rekombinowany nd radioligand (stężenie nm/l) [ 3 H] 5-HT (10) + światło [ 3 H] 5-HT (10) + ciemność piśmiennictwo gabaergiczny GABA A szczurzy, izolowany z mózgu >>1 [ 3 H] muscimol (2) + światło 43 gabaergiczny GABA A szczurzy, izolowany z mózgu nd [ 3 H] muscimol (2) + światło 43 gabaergiczny GABA A /BDZ szczurzy, izolowany z mózgu > 1 [ 3 H] flumazenil (1) 42 benzodiazepinowy szczurzy, izolowany z mózgu >>1 [ BDZ H] flumazenil (1) + światło 43 benzodiazepinowy BDZ szczurzy, izolowany z mózgu >>1 [ 3 H] flumazenil (1) + ciemność 43 receptor dla CRF 1 (*) ludzki rekombinowany 0,3 [ 125 J] astressin (0,1) 82 receptor dla neuropeptydu szczurzy, izolowany z kory 2,1 [ Y NPY-Y1 mózgowej J] Pro 34 PYY (0,015) + światło 43 >>3 [ 125 J] Pro 34 PYY (0,015) ciemność 43 1,9 [ 125 J] PYY 3-36 (0,015) + światło 43 >>3 [ 125 J] PYY 3-36 (0,015) + ciemność 43 szczurzy, izolowany z kory SIGMA 1,4 [ mózgowej H] DTG (4) + światło 43 szczurzy, izolowany z kory SIGMA 3,7 [ mózgowej H] DTG (4) ciemność 43 transporter dopaminowy (DA) szczurzy, izolowany z prążkowia >>1 [ 3 H] WIN 35, 428 (2) + światło 43 transporter dopaminowy (DA) szczurzy, izolowany z prążkowia nd [ 3 H] WIN 35, 428 (2) + ciemność 43 receptor dla neuropeptydu receptor dla neuropeptydu receptor dla neuropeptydu szczurzy, izolowany z kory szczurzy, izolowany z kory szczurzy, izolowany z kory Y NPY-Y1 Y NPY-Y2 Y NPY-Y2 mózgowej mózgowej mózgowej * CRF czynnik uwalniający kortykotropinę, ang. Corticotropin releasing factor, nd nie oznaczono, np nie podano Kolejne badania dotyczące wpływu hiperycyny na wiązanie radioligandów do wybranych receptorów przeprowadzone przez Raffę i wsp. [85] wykazały, że hiperycyna (1 µm) wykazywała wiązanie do receptorów 5-HT 1A (zahamowanie wiązanie radioliganda o 30%). Stwierdzono również, że hiperycyna wykazywała silne powinowactwo (10 40% zahamowanie wiązania radioliganda) do receptorów NMDA, nikotynowych receptorów cholinergicznych (nach, OUN), dopaminergicznych D2, histaminowych H1 (OUN) oraz do receptorów dla endoteliny (ET A ) i CCK A. Największy efekt hamowania wiązania radioligandów po podaniu 1 µm hiperycyny (>40%) wykazano w modelu muskarynowych receptorów cholinergicznych (49%, bez pomiaru w podtypach receptorów mach) oraz w modelu receptorów opioidowych δ, w przypadku których takie samo stężenie hiprycyny hamowało wiązanie radioliganda średnio o 48%. Interakcje hiperforyny Badania neurochemiczne z zastosowaniem nowych technik badawczych pozwoliły na określenie hamującego wpływu hiperforyny wyrażonego wartościami IC 50 na wiązanie ligandów ze znacznikiem radioaktywnym do badanych receptorów OUN. Wyniki badań przedstawione w pracy poglądowej przez Kubina i wsp. podsumowano w tabeli 4. 43 43 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 126 Podsumowanie wyników badań nad aktywnością receptorową hiperforyny in vitro [wg 44] Ta b e l a 4. receptor/kompleks receptora pochodzenie receptora wartość IC50 /kompleksu receptora (µg/ml) radioligand piśmiennictwo glutaminergiczny NMDA szczurzy, hipokampalny 3,2 np 86 glutaminergiczny AMPA szczurzy, hipokampalny 4,6 np 86 opioidowy ludzki rekombinowany 0,4 [ 3 H] nalokson 82 serotoninergiczny ludzki rekombinowany 3 [ 3 H] LSD 82 gabaergiczny GABA A szczurzy, izolowany z kory mózgowej >>1 [ 3 H] muscimol (2 nm) 43 benzodiazepinowy BDZ szczurzy, izolowany z kory mózgowej >>1 [ 3 H] flumazenil (1 nm) 43 receptor dla neuropeptydu Y NPY-Y1 szczurzy, izolowany z kory mózgowej >>1 [ 125 J] Pro 36 PYY (15 pm) 43 receptor dla neuropeptydu [ szczurzy, izolowany z kory mózgowej >>1 J] PYY 3-36 Y NPY-Y2 (15 pm) 43 SIGMA szczurzy, izolowany z kory mózgowej >>1 [ 3 H]DTG (4 nm) 43 serotoninergiczny 5-HT 6 szczurzy, rekombinowany >>1 [ 3 H] 5 HT (10 nm) 43 serotoninergiczny 5-HT 7 szczurzy, rekombinowany >>1 [ 3 H] 5 HT (10 nm) 43 transporter dopaminowy (DA) szczurzy, izolowany z prążkowia 2,6 [ 3 H] WIN 35, 428 (2 nm) 43 np nie podano W badaniach przeprowadzonych przez Kumara i wsp. [86] stwierdzono, że hiperforyna w mikromolarnym stężeniu wykazywała aktywność właściwą dla antagonistów receptorów NMDA i AMPA hipokampu mózgu szczura. Wartość IC 50 po podaniu hiperforyny in vitro wyniosła odpowiednio 3,2 µm (receptory NMDA) oraz 4,6 µm (receptory AMPA). Gobbi i wsp. [43] wykazali z kolei, że hierforyna hamowała wiązanie radioliganda do transportera dopaminowego zlokalizowanego w prążkowi mózgu szczura, a wartość IC 50 po podaniu hiperforyny in vitro wyniosła 5 µm. Wyniki badaczy wskazały, że do 50% hamowania wiązania radioliganda ([ 3 H] 5 HT) do receptorów serotoninergicznych typu 5-HT 6 i 5-HT 7 potrzebne były wysokie wartości stężeń hiperforyny, podobnie jak w przypadku badania receptorów dla neuropeptydu NPY-Y1 i NPY-Y2 oraz receptorów gabaergicznych GABA A i benzodiazepinowych BDZ. Inne badania neurochemiczne [82] pozwoliły na stwierdzenie, że hiperforyna hamowała wiązanie 3 H naloksonu do ludzkich rekombinowanych receptorów opioidowych (IC 50 = 0,4 µm) oraz 3 H LSD do ludzkich rekombinowanych receptorów serotoninergicznych (IC 50 = 3 µm). Interakcje amentoflawonu Wyniki badań z zastosowaniem metod neurochemicznych dotyczące interakcjami na poziomie receptorowym wskazują na to, że jeden ze związków czynnych ekstraktu dziurawca amentoflawon wykazał aktywność hamowania wiązania
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego [ 3 H]-flumazenilu do receptora GABA A. Flumazenil jest antagonistą benzodiazepinowym, tak więc zahamowanie jego wiązania świadczy o powinowactwie amentoflawonu do miejsca benzodiazepinowego na receptorze GABA A na drodze konkurencji. Zwraca to uwagę, że frakcja flawonoidowa w ekstraktach jest ważnym czynnikiem działającym zwłaszcza przeciwlękowo i że może wchodzić w interakcje z ligandami dla receptora GABA A. Hiperycyna i hiperforyna wykazały szersze spektrum aktywności na poziomie receptorowym. Badania Baureithela i wsp. [42] nad zawartością amentoflawonu w metanolowych ekstraktach z kwiatów różnych gatunków Hypericum wykazały, że największe stężenie tego związku oznaczono w ekstrakcie Hypericum olympicum (100 µg/100 mg ekstraktu) w porównaniu ze stężeniem amentofawonu w ekstrakcie Hypericum perforatum (78 µg/100 mg ekstraktu). Dalsze badania tych samych autorów wykazały, że w przeliczeniu na zawartość amentoflawanu w pięciu badanych ekstraktach Hypericum olympicum, Hypericum perforatum, Hypericum hirsutum oraz Hypericum patulum wartości IC 50 wobec [ 3 H]flumazenilu, ulegającego wiązaniu do miejsca benzodiazepinowego receptora GABA A, wyniosły odpowiednio 11,4; 9,9; 6,5 oraz 4,9 nm. Stwierdzono również, że wyizolowany amentoflawon hamował wiązanie flumazenilu z wartością IC50=14+/-1,9 nm, co wskazało na możliwość zachodzenia synergizmu pomiędzy związkami ekstraktu zwiększającego działanie amentoflawonu w badanym zakresie. Podsumowano, że amentoflawon, w przeciwieństwie do hiperycyny, może decydować o hamowaniu wiązania flumazenilu do kompleksu receptora GABA A /BDZ i dzięki temu może brać udział w mechanizmie działania przeciwdepresyjnego ekstraktów z dziurawca zawierających amentoflawon. Interakcje ekstraktów nadziemnych części Hypericum perforatum Udowodniony wpływ najbardziej popularnego ekstraktu z Hyperici herba LI160 i jego związków czynnych na aktywność receptorów OUN i enzymów metabolizujących neurotransmitery wskazuje na podłoże możliwych interakcji z lekami syntetycznymi stosowanymi w chorobach OUN. Liczne badania przeprowadzone w warunkach in vitro ukazały interakcje zachodzące pomiędzy związkami czynnymi ekstraktu z ziela dziurawca a lekami syntetycznymi zastosowanymi w badaniach ze znacznikiem radioaktywnym. Badania przeprowadzone przez Baureithela i wsp. [42] na homogenacie kory mózgowej szczura wykazały, że ekstrakty metanolowe otrzymane z kwiatów Hypericum perforatum, Hypericum hirsutum, Hypericum patulum i Hypericum olympicum (1 ml ekstraktu po 1h inkubacji) hamowały wiązanie [ 3 H]flumazenilu (1nM) do benzodiazepinowych miejsc wiązania na receptorze GABA A. Wartości IC 50 dla ekstraktów kolejno wymienionych gatunków wyniosły odpowiednio 6,83; 6,97; 13,2 oraz 6,14 µg/ml. Wykazano, że pojedyncze, wyizolowane związki czynne ekstraktów w stężeniu do 1 µm (hiperycyna, kwercetyna, rutyna, hiperozyd, kwercetryna, biflawon I3, II8-biapigeniny) nie hamowały wiązania antagonisty do receptora. 127 Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 128 W badaniu Simmena i wsp. [82] wykazano, że wodnoetanolowy ekstrakt z ziela dziurawca Hypericum perforatum (Ze117; 0,2% hiperycyn, mniej niż 1% hiperforyny) hamował wiązanie [ 3 H] muscimolu do receptora GABA A (IC 50 =3 µg/ml). Ponadto badany ekstrakt wodno etanolowy hamował wiązanie radioligandów do receptorów opioidowych µ (IC 50 = 40 µg/ml), typu κ (IC 50 = 200 µg/ml) oraz typu δ (IC 50 = 50 µg/ml). W badaniu tym wykazano również, że metanolowo-acetonowy ekstrakt z ziela Hypericum perforatum (0,2% hiperycyny, 5% hiperforyny), zawierający większe stężenie hiperforyny niż ekstrakt Ze117, hamował efektywniej wiązanie [ 3 H] muscimolu do receptora GABA A (IC 50 = 1 µg/ml). Stwierdzono także, że ekstrakt metanolowo-acetonowy efektywniej hamował wiązanie radioligandów do receptorów opioidowych µ (IC 50 =4 µg/ml), typu κ (IC 50 =3 µg/ml) oraz typu δ (IC 50 =5 µg/ml) w porównaniu z ekstraktem zawierającym mniejsze stężenie hiperforyny Ze117. W kolejnym etapie badań neurochemicznych wykazano, że biflawonoid I3,II8-biapigeniny hamował wiązanie [3H]-estradiolu do receptora estrogenowego (typ α), przy czym wartość IC 50 wyniosła 1 µm. Stwierdzono także, że wartość IC 50 dla wodnoetanolowego ekstraktu z ziela dziurawca Hypericum perforatum (Ze 117) wyniosła 200 µg/ml, a więc ekstrakt Ze117 był mniej efektywny niż wyizolowany biflawonoid [82]. Kolejne badania neurochemiczne przeprowadzone przez Gobbiego i wsp. [43] pozwoliły na stwierdzenie, że wodno-metanolowy ekstrakt z ziela Hypericum perforatum, w przeciwieństwie do lipofilnego ekstraktu uzyskanego metodą z zastosowaniem CO 2 w warunkach nadkrytycznych, wchodził w interakcję z receptorem GABA A (IC 50 =5,5 µg/ml). Wykazano również, że dwa badane ekstrakty: wodnometanolowy i lipofilny, tworzyły interakcję z transporterem dopaminowym, przy czym wartości IC 50 wyniosły odpowiednio 24,5 µg/ml oraz 12,9 µg/ml. W tabeli 5 podsumowano wyniki badań dotyczące wpływu różnych ekstraktów Hypericum perforatum i innych gatunków z rodzaju Hypericum na różne receptory lub kompleksy receptorowe OUN wyrażony wartością IC 50 (µg/ml). Ta b e l a 5. Wpływ różnych ekstraktów Hypericum perforatum (i innych gatunków z rodzaju Hypericum) na różne receptory lub kompleksy receptorowe OUN wyrażony wartością IC 50 (µg/ml) [42, 43, 82] badany ekstrakt metanolowy ekstrakt z kwiatów Hypericum perforatum metanolowy ekstrakt z kwiatów Hypericum hirsutum metanolowy ekstrakt z kwiatów Hypericum patulum metanolowy ekstrakt z kwiatów Hypericum olympicum receptor / kompleks receptora opioidowy µ opioidowy κ opioidowy δ gabaergiczny GABA A transporter dopaminowy GABA A /BDZ - - - - - 6,83 - - - - - 6,97 - - - - - 13,2 - - - - - 6,14 piśmiennictwo 42
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego 129 Ze 117 ekstrakt wodonoetanolowy z ziela Hypericum perforatum (0,2% hiperycyny, mniej niż 1% hiperforyny) metanolowo-acetonowy ekstrakt z ziela Hypericum perforatum (0,2% hiperycyny, 5% hiperforyny) wodnometanolowy ekstrakt z ziela Hypericum perforatum lipofilny ekstrakt uzyskany metodą z zastosowaniem CO2 w warunkach nadkrytycznych 40 200 50 3 - - 4 3 5 1 - - - - - 5,5 24,5 5,5 (GABA A ) >>10 (BDZ) - - - n. w. 12,9 >>10 oznaczenia w tabeli: nie badano, n. w. nie wykazano interakcji z receptorem 82 43 Według przeglądu bibliograficznego dokonanego przez Greesona i wsp. [78] także inny ekstrakt z ziela Hypericum perforatum: LI 160, zawierający 0,3% hiperycyn, 3% hiperforyny (80% metanol; producent Lichtwer Pharma) w zależności od dawki (in vitro) modulował aktywność receptorów OUN. W tabeli 6 zaprezentowano przegląd wyników badań dotyczących powinowactwa ekstraktu i/lub związków biologicznie czynnych ekstraktu LI 160 do receptorów OUN oraz wpływu na ich gęstość. Ta b e l a 6. Farmakologiczna aktywność ekstraktu LI 160 na receptory OUN w porównaniu z konwencjonalnymi lekami antydepresyjnymi [31] klasa biochemiczna powinowactwo do receptora gęstość (D density) receptorowa ekstrakt Hypericum perforatum (LI 160) 5-HT1A (serotoninowy) [31, 79] 5-HT2 (up-regulacja) [55, 56, 87] GABA A, GABA B [31] BDZ (benzodiazepinowy) [31] AR (adenozynowy) [31] mach (cholinergiczny, muskarynowy) [79] D3 (dopaminowe) [51] obniżenie, zwiększenie β-adrenoreceptor (D; down-regulacja) [88] 5-HT1A (D; up-regulacja) [87] 5-HT2A (D; up-regulacja) [87, 88] NE (noradrenergiczne) [89] beta 1, beta 2 [31] Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 130 Interakcje receptorowe ekstraktów Hypericum perforatum z lekami syntetycznymi zbadane w modelu in vitro i na zwierzętach Interakcje zbadane w modelu zwierzęcym Badania przeprowadzone przez Kumara i wsp. [41] miały na celu wykazanie aktywności (interakcji) antagonistycznej ekstraktu Hypericum perforatum (50% etanol) w stosunku do skopolaminy indukującej amnezję u szczurów. Zwierzętom podawano ekstrakt dziurawca w dwóch dawkach: 100 mg/kg oraz 200 mg/kg p.o. (1 x dziennie przez 3 dni). Inna grupa przyjmowała piracetam jako standardowy lek nootropowy (500 mg/kg, i.p.). Wyniki testów behawioralnych wykazały, że tylko wysoka dawka ekstraktu dziurawca (200 mg/kg) wyraźnie odwracała skutki podania skopolaminy, która wywoływała pogorszenie wykonywania zadań w teście biernego unikania. Ponadto wykazano, że ekstrakt z dziurawca w zależności od dawki poprawiał wyniki w teście aktywnego unikania, a tym samym zmniejszał skutki działania skopolaminy. Wyniki tego badania pozwoliły autorom na wyciągnięcie wniosków, że ekstrakt dziurawca wykazywał aktywność nootropową jakościowo porównywalną z aktywnością piracetamu. Ponadto wyniki badania pozwoliły na stwierdzenie, że ekstrakt dziurawca może wchodzi w interakcję farmakodynamiczną o charakterze antagonizmu ze skopolaminą [41]. Hussain [90] wykazał w badaniu na zwierzętach możliwość interakcji pomiędzy morfiną a ekstraktem dziurawca. Zwierzętom podawano ekstrakt dziurawca (nie podano składu ekstraktu) w dawce 171 mg/kg przez 7 dni, a następnie 7. dnia zaaplikowano morfinę (5 mg/kg, i.p.). Wyniki testów oceniających działanie przeciwbólowe wykazały, że podawanie ekstraktu o około 60% zwiększyło działanie analgetyczne morfiny w porównaniu z grupą otrzymującą placebo przez 7 dni. Podawanie samego ekstraktu dziurawca zwierzętom nie wywoływało efektu przeciwbólowego. Mechanizm tej interakcji nie jest do końca poznany. Dane o tego rodzaju oddziaływaniu pochodzą z doniesienia konferencyjnego tego autora (nie opublikowano wyników badań). Badanie w modelu zwierzęcym przeprowadzonym przez Jakovljevic i wsp. [91] wykazało zachodzenie interakcji na poziomie OUN pomiędzy fenobarbitalem a różnymi ekstraktami z ziela Hypericum perforatum (HP) (A ekstrakt etanolowy, B ekstrakt po zastosowaniu octanu etylu, C ekstrakt wodny) lub naparem (infusum: 50 g suchego materiału roślinnego + 500 ml gorącej wody, naparzanie przez 15 min.). Ekstrakt otrzymany przy zastosowaniu octanu etylu zawierała związki flawonoidowe oraz naftodiantronowe z wysoką zawartością hiperycyn (8,34 mg/g). Ekstrakt etanolowy zawierał te same związki czynne, ale z mniejszą zawartością hiperycyn (3,21 mg/g), natomiast ekstrakt wodny zawierał najmniejszą ilość hiperycyn (0,98 mg/g). Myszom podawano ekstrakty HP per os codziennie przez 12 dni (autorzy nie podali wielkości dawek), a 13. dnia ekstrakty HP podano śródotrzewnowo (1% i.p., 10 ml/kg m.c). Następnie po 30 min. od ostatniego podania HP zaaplikowano fenobarbital w dawce 40 mg/kg. Wyniki badań behawioralnych wykazały, że u myszy
Wpływ związków biologicznie czynnych zawartych w roślinach leczniczych na receptory ośrodkowego układu nerwowego czas zasypiania został wydłużony z 13,5±6,5 min do więcej niż 25 min (ekstrakty A, B). Ekstrakt wodny (C) również powodował podobny efekt, lecz nie był on statystycznie istotny. Zaobserwowano także, że czas trwania snu został skrócony. Brak wpływu na czas snu indukowanego fenobarbitalem wykazywał napar, który zawierał 1,23 mg/g hiperycyn. Wykazano także, że podawanie myszom ekstraktów (A, B, C) oraz naparu łącznie z diazepamem wpływało na aktywność lokomotoryczną myszy w wybranych testach behawioralnych. Zwierzętom podawano diazepam (2 mg/kg m.c., i.p.) 13 min po uprzednim zaaplikowaniu ekstraktów A, B i C (1% i.p., 10 ml/kg m.c), naparu lub wody. Następnie badano zachowanie zwierząt przy użyciu testu mierzącego koordynację ruchową ( the rota rod, z obrotowym prętem). Wyniki wykazały, że ekstrakt A powodował znaczącą redukcję aktywności miorelaksacyjnej diazepamu mierzoną wydłużeniem czasu przebywania zwierząt w urządzeniu. Możliwym uzasadnieniem farmakodynamicznych efektów indukowania i czasu trwania snu oraz koordynacji ruchowej jest wpływ związków czynnych ekstraktu z ziela dziurawca (głównie hiperycyny) na aktywność izoenzymów cytochromu P450, które metabolizują większość leków. Należy jednak mieć na uwadze, że wyniki tylko niektórych badań w modelu zwierzęcym wskazują na indukowanie CYP450 przez ekstrakty i wyizolowane związki czynne ziela dziurawca [92]. Badanie przeprowadzone przez Foldera i Chatterie [92] na szczurach, którym przez 10 dni podawano 300 mg/kg ekstraktu ziela dziurawca, nie wykazało zmian w aktywności katalitycznej izoenzymów CYP450. Jednakże podawanie zwierzętom ekstraktu w dawce 1000 mg/kg dziennie przez 14 dni powodowało indukcję ekspresji wątrobowego CYP3A1/2 [93]. Efekt indukowania CYP450 uzależniony jest zatem od dawki i czasu podawania ekstraktów z ziela dziurawca [94]. Podsumowując, wydaje się, że w celu wyjaśnienia natury receptorowych mechanizmów interakcji pomiędzy lekami roślinnymi a syntetycznymi konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań neurochemicznych i farmakologicznych. 131 Podziękowanie Praca była finansowana z projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N405 023 31/1522. Piśmiennictwo 1. Ożarowski M. Interakcje pomiędzy lekami roślinnymi i składnikami diety zawierającymi surowce roślinne oraz lekami syntetycznymi dotyczące ośrodkowego układu nerwowego. Rozprawa doktorska. Uniwersytet Medyczna im. Karola Marcinkowskiego, Wydział Farmaceutyczny, Instytut Roślin i Przetworów Zielarskich, Poznań 2007. 2. Costa LG, Steardo L, Cuomo V. Structural effects and neurofunctional sequelae of developmental exposure to psychoterapeutic drugs: experimental and clinical aspects. Pharmacological Rev 2004; 56(1):103-47. 3. Spinella M. The psychopharmacology of herbal medicine. Plant drugs that alter mind, brain, and behavior. The MIT Press, Cambridge, Massachusetts, London 2001. Vol. 54 No 3 2008
M. Ożarowski, PŁ. Mikołajczak, R. Kujawski, T. Bobkiewicz-Kozłowska, PM. Mrozikiewicz 132 4. Muszyński J. Surowce zawierające pochodne tropanu. W: Farmakognozja. Zarys nauki o surowcach leczniczych. PZWL, Warszawa 1957:578-84. 5. Le Bars PL, Katz MM, Berman N, Itil TM, Freedman AM, Schatzberg AF. A placebo-controled, doubleblind, randomized trial of an extract of Ginkgo biloba for dementia. JAMA 1997; 278:1327-32. 6. Le Bars PL, Kieser M, Itil KZ. A 26-week analysis of a double-blind, placebo-controlled trial of the Ginkgo biloba extract EGb 761 in dementia. Dement Geriatr Cogn Disord 2000; 11:230-7. 7. Oken BS, Storzbach DM, Kaye JA. The efficacy of Ginkgo biloba on cognitive function in Alzheimer s disease. Arch Neurol 1998; 55:1409-15. 8. Witte S, Loew D, Gaus W. Meta-analysis of the efficacy of the acetonic kava-kava extract WS1490 in patients with non-psychotic anxiety disorders. Phytother Res 2005; 19(3):183-8. 9. Pittler MH, Ernst E. Efficacy of kava extract for treating anxiety: systematic review and meta-analysis. J Clin Psychopharmacol 2000; 20(1):84-9. 10. Speroni E, Minghetti A. Neuropharmacological activity of extracts from Passiflora incarnata. Planta Med 1988; 54(6):488-91. 11. Dhawan K, Kumar S, Sharma A. Anti-anxiety studies on extracts of Passiflora incarnata Linneaus. J Ethnopharmacol 2001; 78:165-70. 12. Dhawan K, Kumar S, Sharma A. Anxiolytic activity of aerial and underground parts of Passiflora incarnata. Fitoterapia 2001; 72(8):922-6. 13. Xu Q, Yi LT, Pan Y, Wang X, Li YC, Li JM, Wang CP, Kong LD. Antidepressant-like effects of the mixture of honokiol and magnolol from the barks of Magnolia officinalis in stressed rodents. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2008; 32(3):715-25. 14. Patocka J, Jakl J, Strunecka A. Expectations of biologically active compounds of the genus Magnolia in biomedicine. J Appl Biomed 2006; 4:171-8. 15. Johnston GAR, Hanrahan JR, Chebib M,. Duke RK, Mewett KN. Modulation of ionotropic GABA receptors by natural products of plant origin. Adv Pharmacol 2006; 54:286-316. 16. Wang X, Wang Y, Geng Y, Li F, Zheng C. Isolation and purification of honokiol and magnolol from cortex Magnoliae officinalis by high-speed counter-current chromatography J Chromatography A 2004; 1036(2):171-5. 17. Piao HZ, Jin SA, Chun HS, Lee JC, Kim WK. Neuroprotective effect of wogonin: potential roles of inflammatory cytokines. Arch Pharm Res 2004; 27(9):930-6. 18. Cho J, Lee HK. Wogonin inhibits ischemic brain injury in a rat model of permanent middle cerebral artery occlusion. Biol Pharm Bull. 2004; 27(10):1561-4. 19. Wang H, Hui KM, Chen Y, Xu S, Wong JT, Xue H. Structure-activity relationships of flavonoids, isolated from Scutellaria baicalensis, binding to benzodiazepine site of GABA(A) receptor complex. Planta Med 2002; 68(12):1059-62. 20. Hui KM, Huen MS, Wang HY, Zheng H, Sigel E, Baur R, Ren H, Li ZW, Wong JT, Xue H. Anxiolytic effect of wogonin, a benzodiazepine receptor ligand isolated from Scutellaria baicalensis Georgi. Biochem Pharmacol 2002; 64(9):1415-24. 21. Kasper S, Gastpar M, Müller WE, Volz HP, Dienel A, Kieser M, Möller HJ. Efficacy of St. John s wort extract WS 5570 in acute treatment of mild depression: a reanalysis of data from controlled clinical trials. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 2008; 258(1):59-63. 22. Papakostas GI, Crawford CM, Scalia MJ, Fava M. Timing of clinical improvement and symptom resolution in the treatment of major depressive disorder. A replication of findings with the use of a double-blind, placebocontrolled trial of Hypericum perforatum versus fluoxetine. Neuropsychobioogy 2007; 56(2-3):132-7. 23. ESCOP monographs. The Scientific Foundation for Herbal Medicinal Products. Hypericum perforatum (St. John s Worth). 2 nd ed. The European Scientific Cooperative on Phytotherapy, New York, Stuttgart 2003:257-82. 24. Fleming T. (ed.). Therapeutic Category Index [In:] PDR (Physicians Desk Reference) for Herbal Medicines. 2 nd ed. Thomas Medical Economics at Montvale, New Jersey 2000. 25. Wiart C. Ethnopharmacology of Medicinal Plants: Asia and the Pacific. Humana Press 2006. 26. Kim HS, Jang CG, Oh KW, Oh S, Rheu HM, Rhee GS, Seong YH, Park WK. Effects of ginseng total saponin on morphine-induced hyperactivity and conditioned place preference in mice. J Ethnopharmacol 1998a; 60(1):33-42. 27. Kim HC, Shin EJ, Jang CG, Lee MK, Eun JS, Hong JT, Oh KW. Pharmacological action of Panax ginseng on the behavioral toxicities induced by psychotropic agents. Arch Pharm Res 2005; 28(9):995-1001.