Prokaryota Genetyka molekularna i genomika
Prokaryota nie są jedną grupą Carl Woese 2
Genomy bakterii i archeonów } Od 0,5 (mykoplazmy) do ~ 5 Mb } Wyjątkowo 9 Mb (Bradyrhizobium japonicum) 13 Mb (Sorangium cellulosum) } archeony z reguły 1,5-2,5 Mb } Gęste upakowanie genów (~1 gen/kb) } Krótkie obszary międzygenowe i regulatorowe } Tylko sporadycznie występują introny } Kodowane białka krótsze, niż u Eukaryota } Tworzy z białkami upakowaną strukturę nukleoidu 3
Gęste upakowanie genomu E. coli 4 Figure 8.6 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Nukleoid bakterii 5 Figure 8.1 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Upakowanie DNA 6 Figure 8.3 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Organizacja genomu } Typowa pojedynczy chromosom kolisty } Możliwe liczne warianty } Więcej cząsteczek kolistych } Cząsteczki liniowe } Chromosomy i plazmidy Figure 8.5 Genomes 3 ( Garland Science 2007) } Plazmidy mogą być koliste lub liniowe } Z reguły mniejsze od chromosomów, ale mogą być bardzo duże (megaplazmidy) } Plazmidy zwykle są opcjonalne, mogą też występować u wielu gatunków } Rozróżnienie chromosomy zawierają geny metabolizmu podstawowego, niezbędne do życia, plazmidy nie. 7
Ewolucyjna zmienność Prokaryota } Przy podobnej liczbie genów ogromna różnorodność zestawu genów } Duże różnice między szczepami } np. E. coli O157:H7 vs. E. coli K12 - ~1300 genów w O nie w K i ~500 w K nie w O(!) } Częsty poziomy transfer genów (do kilkunastu procent genomu), nawet między odległymi gatunkami } Problem definicji gatunku 8
Horyzontalny transfer genów Bacteria Eukarya Archaea P S Z G R Chl Mt 9
Genomy bakterii są dynamiczne } Szczepy bakterii zaliczane do tego samego gatunku znacząco różnią się zawartością genów } Genom rdzeniowy (core genome) wspólny dla wszystkich szczepów } Pangenom zbiór wszystkich genów (nie występują jednocześnie) 10
Genom i pangenom 11
Genom, pangenom 12
Co to jest Escherichia coli? Dla 61 zsekwencjonowanych szczepów: } W sumie 4157 do 5315 genów w genomie szczepu } Genom rdzeniowy 933 geny } Reszta geny pomocnicze wybrane spośród ~15 000 genów } Cały pangenom: ~ 16 000 genów Zhaxybayeva & Doolittle (2011) Curr Biology 21(7): R242-R246 13
Mechanizmy HGT u bakterii } Transformacja } poprzez DNA } elektroporacja przez wyładowania atmosferyczne? } Koniugacja } z udziałem pili płciowych } Transdukcja } z udziałem fagów } GTA } Gene Transfer Agents wirusopodobne cząstki wytwarzane przez α-proteobakterie } Nanorurki 14
Nanorurki u bakterii Dubey & Ben-Yehuda (2011) Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell 144(4):590-600. 15
Nanorurki pomiędzy gatunkami Dubey & Ben-Yehuda (2011) Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell 144(4):590-600. 16
Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii } Bakterie mają genomy podobnej wielkości, mieszczące 2000-6000 genów } Około połowy genomu tworzą rodziny podobnych genów powstałych przez powielenie (duplikację) tzw. rodziny paralogów } To, które geny są powielone świadczy o kierunku specjalizacji ewolucyjnej bakterii 17
Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii } H. influenzae heterotrof pasożytniczy powielone geny kodujące białka rozkładające różne związki organiczne } Methanococcus janaschii chemoautotrof powielone geny kodujące enzymy szlaków biosyntetycznych } Pseudomonas aeruginosa groźny patogen oporny na wiele leków i szybko dostosowujący się do zmian środowiska powielone geny kodujące białka usuwające antybiotyki, rozkładające substancje organiczne, umożliwiające zagnieżdżanie się w powierzchniach. 18
Droga od DNA do białka } Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem } Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji 19
Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 20
Ekspresja genów prokariotycznych } Prokaryota } dominuje regulacja na poziomie transkrypcji } policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej operony } mrna szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją 21
Elementy systemów regulacji } Elementy cis } Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji } Elementy cis w obrębie DNA np. promotory, operatory, enhancery } Elementy cis w obrębie RNA sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp. 22
Elementy systemów regulacji } Elementy trans } Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję } Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp. } Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.) } RNA regulatorowe (sirna, mirna itp.) 23
Podstawy regulacji genu } Regulacja pozytywna } czynnik trans jest aktywatorem zwiększa ekspresję } Regulacja negatywna } czynnik trans jest represorem osłabia ekspresję 24
Podstawy regulacji genu } Regulacja indukowalna } Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję } Regulacja reprymowalna } Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję } Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna } Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna odpowiedzi na sygnał 25
Operony } Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji } Policistronowy transkrypt wspólna ekspresja wielu genów z jednego promotora } Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki Figure 8.8 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 26
Regulacja } Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe } Rdzeń katalityczny wspólny, kilka podejednostek sigma o różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów } σ70 (RpoD) główny czynnik sigma ("housekeeping ) większość genów } σ54 (RpoN) głód azotowy } σ38 (RpoS) głód/faza stacjonarna } σ32 (RpoH) szok cieplny } σ28 (RpoF) wić } Aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA 27
Przykład operon lac 28 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005
Operon lac regulacja przez CAP 29 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005
Operon lac } Regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji } Negatywna indukowalna przez laktozę/represor laci } Pozytywna przez glukozę i camp/białko CAP } Białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon 30
Terminacja transkrypcji } Podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy } Zależy od związanych białek, struktury transkryptu } Terminatory samodzielne Rho zależne 31 Figure 12.8 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja } Antyterminacja } Regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi działanie terminatora } Typowy przykład geny kaskady litycznej faga λ Najwcześniejsze ê Wczesne-opóźnione Genomes 3 ( Garland Science 2007) 32
Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja } Fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków } Kinetyka translacji dostępność naładowanego trna } Wiązanie specyficznych białek } Wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych ryboprzełączniki (niektóre) 33
Atenuacja operon trp E. coli } Zależnie od dostępności załadowanego trna Trp sekwencja lidera mrna przyjmuje różne konformacje trna Trp dostępny trna Trp niedostępny 34 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005
Operon trp u Bacillus subtilis } Białko TRAP wiąże naładowany trna Trp } Kompleks TRAP z trna Trp wiąże mrna } Dodatkowo białko AT (anty- TRAP) wiąże TRAP gdy bardzo mało naładowanego trna Trp trna Trp dostępny W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005 35
Ryboprzełączniki } Wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mrna zmienia konformację, wpływając na ekspresję } Atenuacja } Dostępność miejsca wiązania rybosomu 36
Ryboprzełącznik TPP operon thi E. coli } Odpowiada za biosyntezę tiaminy SD- Shine-Dalgarno TPP- pirofosforan tiaminy 37 Winkler et al. (2002) Nature 419, 952-956
Transdukcja sygnału systemy dwuskładnikowe } Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja sygnału) } Sensor domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej (HK) autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał } Efektor (RR response regulator) fosforylowany przez aktywny sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję 38 West & Stock (2001). Trends Biochem. Sci., 26, 369-376
Globalne systemy regulujące - regulony } Skoordynowana regulacja działania wielu operonów } Represja kataboliczna (aktywator CAP) } zależny od poziomu glukozy poziom camp } Odpowiedź ścisła } brak składników odżywczych, alarmon ppgpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS) } Odpowiedź SOS } uszkodzenia genomu, białko RecA indukowana aktywność proteazy, tnie m. in. represor LexA 39
Życie społeczne bakterii quorum sensing } Mechanizm wyczuwania liczebności } Ekspresja zależna od gęstości bakterii } Komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe autoinduktory (peptydy, związki laktonowe, pochodne S-AM) } sygnał w postaci dyfundującej niewielkiej cząsteczki (gram-) } sygnał w postaci dużej cząsteczki (gram+) } Przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji 40
Quorum sensing Vibrio fischeri } Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości } w planktonie - nie } w symbiozie z głowonogiem - tak Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR, co aktywuje operon lucyferazy 41 http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html
Quorum sensing - biofilmy } Tworzenie biofilmu kluczowe dla patogenezy, oporności na antybiotyki } Np. Pseudomonas aeruginosa przewlekłe infekcje w płucach } Infekcje oportunistyczne, np. u chorych na mukowiscydozę Fuqua & Greenberg (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 685-695 42
Kod genetyczny } Trójkowy } 20 aminokwasów } kodony po 3 nukleotydy: 4 3 =64 możliwości (dwa: za mało) } Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje) 43
Kod genetyczny } Nienakładający się } Dowody: } załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie centralnym, możliwe tylko 4 2 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (20 2 =400). } Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie 44
Kod genetyczny } Bezprzecinkowy } Zdegenerowany } 3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów 45
Kod genetyczny 46
Regularności w kodzie } Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca } (np. UCx Ser) } ale nie zawsze nieznacząca (mp. UGG Trp, UGA STOP) } Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami } Np. } AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina } UCx: seryna; ACx: treonina 47
Parowanie wobble } W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I inozyna) 48
Translacja 49
Nobel 2009 - chemia 50
51