Zastosowanie spektrometrii masowej MALDI-TOF MS w identyfikacji bakterii izolowanych z materiałów klinicznych od ludzi i zwierząt

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(1): 23-30 Praca oryginalna Original Article Zastosowanie spektrometrii masowej MALDI-TOF MS w identyfikacji bakterii izolowanych z materiałów klinicznych od ludzi i zwierząt Application of MALDI-TOF MS for identification of clinical isolates of bacteria from humans and animals 1 Urszula Kosikowska, 2 Dagmara Stępień-Pyśniak, 3 Dorota Pietras-Ożga, 1 Sylwia Andrzejczuk, 1 Marek Juda, 1 Anna Malm 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Zakład Prewencji Weterynaryjnej i Chorób Ptaków, Instytut Biologicznych Podstaw Chorób Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej UP w Lublinie 3 Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej UP w Lublinie Streszczenie Rutynowo stosowane metody diagnostyczne są niewystarczające w identyfikacji drobnoustrojów o nietypowych właściwościach biochemicznych lub rzadziej spotykanych, w tym mikroorganizmów odzwierzęcych. W pracy porównano możliwość identyfikacji różnych bakterii wyizolowanych od ludzi oraz od ptaków hodowlanych z użyciem techniki MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) oraz metod biochemicznych. Materiałem do badań było 6 szczepów referencyjnych z kolekcji ATCC, 30 izolatów wyosobnionych od zdrowych ludzi (wymazy z gardła i z nosa) oraz 16 izolatów wyosobnionych od ptaków hodowlanych (wymazy z okolic gardła od ptaków niewykazujących objawów chorobowych oraz bioptaty z serca od padłych ptaków). Izolaty identyfikowano w oparciu o ich cechy biochemiczne (mikrotesty biochemiczne oraz panele biochemiczne do analizatora Vitek 2) lub w oparciu o profil białkowy techniką MALDI-TOF MS. Do identyfikacji najczęściej występujących i istotnych z punktu widzenia patologii człowieka patogenów, takich jak np. Escherichia coli czy Staphylococcus aureus wystarczająca okazała się identyfikacja biochemiczna; wyniki te były zgodne z danymi uzyskanymi techniką MALDI-TOF MS. Identyfikacja rzadziej występujących bakterii wymagała użycia MALDI-TOF MS, ponieważ metodami biochemicznymi nie sklasyfikowano niektórych drobnoustrojów izolowanych od człowieka czy od ptaków hodowlanych. Największe rozbieżności zaobserwowano w przypadku bakterii z rodziny Pasteurellaceae, które w oparciu o cechy biochemiczne klasyfikowano głównie jako Haemophilus spp., natomiast zgodnie z wynikami otrzymanymi na podstawie profilu białkowego jako Avibacterium endocarditidis. Identyfikacji mikroorganizmów wykonana z użyciem MALDI-TOF MS okazała się bardziej przydatna w diagnostyce drobnoustrojów rzadko izolowanych lub sprawiających problemy w rutynowej diagnostyce. Summary Routinely used diagnostic methods are insufficient to identify the microorganisms with unusual biochemical properties or less commonly occurring, including zoonotic microorganisms. During our study the possibility of identification of different bacteria isolated from humans and from breeding birds using MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) and biochemical methods was compared. The material for the study were 6 reference strains from ATCC, 30 isolates selected from healthy people (throat and nasal swabs) and 16 isolates selected from birds breeding (throat swabs from the vicinity of throat of asymptomatic birds and biopsies from the heart of the dead birds). Isolates were identified based on their biochemical properties (biochemical microtests and panels for biochemical analyzer Vitek 2) or based on a protein profile using MALDI-TOF MS technique. Biochemical methods were sufficient to identify the most common and relevant to human pathology pathogens such as e.g. Escherichia coli and Staphylococcus aureus; these results were consistent with the data obtained using MALDI-TOF MS. Identification of less common bacteria required the use of MALDI-TOF MS, because some bacteria isolated from humans or breeding birds could not be classified by their biochemical properties. The biggest differences were observed in the case of bacteria from the Pasteurellaceae family, which on the basis of biochemical properties were classified mainly as Haemophilus spp., whereas in accordance to the results obtained from the protein profile as Avibacterium endocarditidis. Identification of microorganisms using MALDI-TOF MS has proved to be more useful in the diagnosis of micro-organisms rarely isolated or problematic in routine diagnostics. Słowa kluczowe: Key words: diagnostyka bakteriologiczna, MALDI-TOF MS bacteriological diagnostic, MALDI-TOF MS 23

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Wstęp Współczesna diagnostyka mikrobiologiczna, rozumiana jako zespół badań mających na celu wykrycie, identyfikację i ewentualnie określenie lekowrażliwości patogenów i/lub drobnoustrojów mających znaczenie dla szerzenia się zakażeń i rozprzestrzeniania genów lekooporności, musi sobie radzić z wieloma problemami. Wynikają one m.in. z narastającej liczby zakażeń wywoływanych przez bakterie oportunistyczne i środowiskowe, o małym potencjale inwazyjnym i niskiej wirulencji [1, 2]. Również rozprzestrzenianie się zakażeń bezobjawowych lub objawowych wywoływanych przez mikrobionty bytujące u zwierząt i przenoszone na ludzi budzi coraz większe zainteresowanie [3, 4]. Kolonizacja organizmu ludzkiego przez bakterie pochodzące m.in. od ptaków hodowlanych może sprzyjać ich transmisji oraz mieć konsekwencje epidemiologiczne, wielokrotnie jest także przyczyną infekcji, takich jak zapalenie wsierdzia, choroby układu krążenia, przewlekłe choroby układu oddechowego lub bakteriemia czy sepsa [5, 6]. Większość badań i dostępnych metod diagnostycznych skupia się na od dawna znanych i często izolowanych patogenach istotnych z punktu widzenia patologii człowieka, np. Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris i innych pałeczkach Enterobacteriaceae. Obecność w materiałach diagnostycznych mikrobiontów człowieka, a tym bardziej zwierzęcych lub środowiskowych wielokrotnie była i nadal jest traktowana przez niektórych mikrobiologów jako klinicznie nieistotne zanieczyszczenie. Jeśli jednak przyjąć, że materiał diagnostyczny był pobierany profesjonalnie i z zachowaniem odpowiednich procedur oraz że nie wystąpiły inne błędy przedlaboratoryjne lub laboratoryjne, a rodzaj materiału powinien wykluczać zanieczyszczenia mikrobiologiczne, obecność bakterii rzadko występujących w etiologii chorób infekcyjnych stawia zarówno przed diagnostami jak i lekarzami ogromne wymagania. Nie bez znaczenia jest również rozszerzający się zakres badań diagnostycznych lub metod leczniczych wymagających naruszenia ciągłości tkanek, a tym samym umożliwiających translokację drobnoustrojów do środowiska, gdzie mogą bytować jako patogeny. Rutynowo stosowane metody diagnostyczne oparte m.in. na hodowli i określaniu cech biochemicznych drobnoustrojów są nieocenione i umożliwiają diagnostykę dużej grupy najczęściej izolowanych patogenów, są jednak wielokrotnie niewystarczające w identyfikacji drobnoustrojów o nietypowych właściwościach lub rzadziej spotykanych. Jedną z technik o bardzo obiecującym potencjale diagnostycznym, która obok rutynowych metod mikrobiologicznych może znaleźć szerokie zastosowanie w laboratoriach klinicznych, jest identyfikacja drobnoustrojów z użyciem spektrometrii masowej (MS; Mass Spectrometry) [7, 8]. MALDI-TOF MS pozwala na wiarygodną identyfikację patogenów ludzkich, jak również drobnoustrojów odzwierzęcych i środowiskowych [9, 10, 11]. Technika ta, oparta o profil białkowy badanych drobnoustrojów, będący charakterystycznym i niepowtarzalnym dla gatunku molekularnym odciskiem palca, ze względu na prostotę wykonania, znaczną automatyzację oraz bardzo szeroką bazę danych pozwala na znaczne skrócenie czasu diagnostyki mikrobiologicznej (kilka minut dla pojedynczej próbki) i przeprowadzenie wiarygodnej identyfikacji nawet przy niewielkiej liczbie komórek drobnoustrojów (minimum 10 5 ) [12, 13, 14]. Celem pracy było porównanie możliwości identyfikacji różnych bakterii wyizolowanych od ludzi oraz od ptaków hodowlanych z użyciem rutynowo stosowanych metod biochemicznych oraz spektrometrii masowej MALDI-TOF MS opartej na desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej wykorzystaniem matrycy oraz analizatora czasu przelotu jonów. Materiały i metody Materiał mikrobiologiczny Materiałem do badań było 30 izolatów wyosobnionych z wymazów pobieranych z gardła i z nosa od zdrowych dorosłych osób zamieszkujących w okolicach Lublina (zezwolenie nr KE- 0254/75/2011 Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie), oraz 16 izolatów wyosobnionych od ptaków hodowlanych (kury i brojlery kurze), od których pobierano wymazy z okolic gardła (ptaki niewykazujące objawów chorobowych) oraz bioptaty z serca (materiał sekcyjny) podczas badań diagnostycznych wykonywanych w gabinecie weterynaryjnym Zakładu Prewencji Weterynaryjnej i Chorób Ptaków Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. W badaniach wykorzystywano również szczepy referencyjne, pochodzące z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection): Haemophilus influenzae ATCC 10211, Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901 (klasyfikowany obecnie jako Aggregatibacter aphrophilus), H. parainfluenzae ATCC 51505, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 29212. Diagnostyka biochemiczna Pobrane materiały diagnostyczne posiewano na agar z krwią, podłoże Chapmana (Mannitol Salt LAB-AGAR, Biocorp, Polska), podłoże Mac Conkey a (Mac Conkey LAB-AGAR, Biocorp, Polska) i agar czekoladowy HAEM (Haemophilus Chocolate Agar, Haemophilus Medium, biomérieux, Francja). Posiewy inkubowano przez 24 48 h w temp. 35 o C w warunkach tlenowych (hodowla w kierunku gronkowców oraz pałeczek Gram-ujemnych fermentujących i niefermentujących) i mikroaerofilnych (hodowla w kierunku pałeczek z rodziny Pasteurellaceae oraz paciorkowców). Po inkubacji przesiewano drobnoustroje rosnące w postaci zróżnicowanych morfologicznie kolonii na podłoża namnażające (agar odżywczy, agar z krwią) i/lub wybiórczo-namnażające HAEM w kierunku Haemophilus spp. oraz Bile Esculin Azide Lab-Agar (Biocorp, Polska) w kierunku Enterococcus spp. i inkubowano w warunkach atmosferycznych właściwych dla bakterii tlenowych i mikroaerofilnych w temperaturze 35 o C przez 24 h. Wyizolowane bakterie rozpoznawano wstępnie na podstawie morfologii kolonii oraz mikroskopowo po wybarwieniu metodą Grama, w przypadku gronkowców wykonywano również test na koagulazę oraz Slidex Staph Kit (biomérieux, Francja). Do identyfikacji biochemicznej wykorzystywano mikrotesty i panele diagnostyczne biomérieux (Francja), w tym API NH (identyfikacja Haemophilus spp.), API 20E (bakterie oksydazo-ujemne), API 20NE (bakterie oksydazo-dodatnie), ID 32 Staph (gronkowce), API Strep 24

Diagn Lab 2015; 51(1): 23-30 (paciorkowce). Do identyfikacji Enterococcus spp. wykorzystywano STREPTOtest 24 (Erba Lachema, Czech Republic). Diagnostykę biochemiczną wykonywano zgodnie z instrukcjami producentów. Do identyfikacji w oparciu o cechy biochemiczne wykorzystywano także analizator mikrobiologiczny Vitek 2 Compact (biomérieux, Francja) oraz panele NH (bakterie z rodzaju Neisseria, Haemophilus i inne wolnorosnące bakterie Gram-ujemne) i GN (pałeczki Gram-ujemne oksydazo-dodatnie i oksydazo-ujemne oraz inne bakterie, niedające się zidentyfikować z użyciem panelu NH). Inokula badanych izolatów o gęstości 0,5 lub 4 w skali McFarlanda (zgodnie z zaleceniem producenta) otrzymywano po zawieszeniu niewielkiej ilości bakterii z całonocnej hodowli w odpowiednim medium lub 0.85% NaCl, zgodnie ze wskazówkami producenta. Zarówno mikrostudzienki na paskach API, ID i STREPTOtest 24, jak i panele do analizatora Vitek2 zawierają substraty, których wykorzystywanie przez drobnoustroje podczas inkubacji prowadzi do zmian kolorymetrycznych i umożliwia ocenę wzrokową (reakcje samoistne lub po dodaniu odpowiednich odczynników) lub z użyciem czytnika kodów numerycznych. Kody te wykorzystywano do identyfikacji gatunku z użyciem programu komputerowego lub książek kodów. Spektrometria masowa MALDI-TOF Uzyskane w toku badań izolaty bakterii poddawano identyfikacji z wykorzystaniem techniki MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik, Germany). Wykonywanie identyfikacji poprzedzał etap wstępnej ekstrakcji białek z użyciem etanolu i kwasu mrówkowego. W tym celu niewielką ilość 18 24 godzinnej hodowli badanego drobnoustroju zawieszano w 300 µl jałowej wody dejonizowanej, po czym dodawano 900 µl czystego etanolu (POCH, Polska) i dokładnie mieszano z użyciem worteksu. Następnie próbkę wirowano przez 2 minuty przy obrotach 13 000 rpm/min. Po odrzuceniu supernatantu, do uzyskanego osadu dodawano kolejno 50 μl 70% wodnego roztworu kwasu mrówkowego i 50 μl acetonitrylu (Fluka Analytical), po czym dokładnie mieszano na worteksie. Po ponownym odwirowaniu (13 000 rpm/min przez 2 min) pobierano 1 μl supernatantu, który nakładano na metalową płytkę i pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie nakładano po 1 μl roztworu matrycy i pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Metalową płytkę z nałożonymi próbkami umieszczano w komorze pomiarowej aparatu MALDI Biotyper, usuwano powietrze celem uzyskania próżni i poddawano działaniu promienia laserowego. Pod jego wpływem dochodziło do desorpcji i jonizacji białek bakteryjnych, następnie zjonizowane peptydy przyspieszano w silnym polu elektrycznym i mierzono czas przelotu jonów (Tof; time of flight). W oparciu o otrzymywany rozkład peptydów według masy cząsteczkowej, ładunku oraz zróżnicowanego czasu przelotu, system MALDI-TOF MS automatycznie generował spektrometryczne widma pików odpowiadających jonom o różnym stosunku masy do ładunku oraz analizował ilość, intensywność i korelację pików, a także porównywał badane widmo z widmami referencyjnymi drobnoustrojów. Automatyczny pomiar widma i jego analiza porównawcza z widmami wzorcowymi drobnoustrojów były wykonane przez spektrometr masowy Ultraflextreme w połączeniu z programem MALDI-Biotyper 3.0 (Bruker Daltonik, Niemcy), zawierający w bazie danych 3672 profili drobnoustrojów. W oparciu o ten program określono również spektralny profil białkowy wybranego drobnoustroju. Prawdopodobieństwo poprawnej identyfikacji w systemie MALDI Biotyper 3.0 wyrażane jest w postaci wskaźnika punktowego: 2,300 3,000 wiarygodna identyfikacja drobnoustroju do poziomu gatunku; 2,000 2,299 wiarygodna identyfikacja drobnoustroju do poziomu rodzaju oraz prawdopodobny wynik identyfikacji do poziomu gatunku; 1,700 1,999 wskazuje na prawdopodobny wynik identyfikacji do poziomu rodzaju; 0 1,699 niewiarygodny wynik identyfikacji. Wyniki W pracy porównano wyniki identyfikacji użytych w badaniach szczepów wzorcowych bakterii z kolekcji ATCC, jak również izolatów bakterii wyosobnionych z materiałów klinicznych pobranych od ludzi i ptaków hodowlanych. Identyfikację prowadzono z użyciem metod biochemicznych oraz techniki MALDI-TOF MS. Jak wskazują dane przedstawione w tabeli I, identyfikacja szczepów wzorcowych z użyciem obydwu wymienionych technik diagnostycznych była zgodna, z wyjątkiem szczepu oznaczonego numerem ATCC 7901. Szczep ten, klasyfikowany wcześniej jako H. parainfluenzae, został zidentyfikowany techniką MALDI-TOF MS zgodnie z obecnie obowiązującą nomenklaturą jako A. aphrophilus. W przypadku większości zebranych w pracy izolatów nie uzyskano jednoznacznej klasyfikacji do gatunku w oparciu o metody biochemiczne. Porównanie wyników identyfikacji wybranych bakterii izolowanych z materiałów klinicznych pobranych od ludzi, uzyskanych z użyciem mikrotestów biochemicznych (API, ID) Tabela I. Porównanie identyfikacji wybranych szczepów wzorcowych w oparciu o rutynowo stosowane metody biochemiczne i technikę MALDI-TOF MS. Szczep referencyjny Identyfikacja biochemiczna* MALDI-TOF MS* Aggregatibacter aphrophilus Haemophilus parainfluenzae Aggregatibacter aphrophilus (Haemophilus parainfluenzae) ATCC 7901 Haemophilus parainfluenzae ATCC 51505 Haemophilus parainfluenzae Haemophilus parainfluenzae Haemophilus influenzae ATCC 10211 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis ATCC 29212 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis *metody biochemiczne (identyfikacja >98%), technika MALDI-TOF MS (wartość identyfikacji w zakresie 1,89-2,28) 25

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Tabela II. Porównanie identyfikacji wybranych izolatów bakterii wyosobnionych z materiałów klinicznych w oparciu o rutynowo stosowane metody biochemiczne i technikę MALDI-TOF MS. Metody biochemiczne Spektrometria mas Mikrotesty Wartość % identyfikacjkacji % identyfi- Vitek 2 Compact MALDI-TOF MS identyfikacji Enterobacter spp. Enterobacter cloacae complex Enterobacter pyrinus 1,878 Nie zidentyfikowano Pantoea spp. Pantoea agglomerans 1,916 Klebsiella spp. 98,3 Klebsiella pneumoniae 99 Klebsiella pneumoniae 2,079 Escherichia coli 99,0 Escherichia coli 99 Escherichia coli 2,086 Escherichia coli 99,9 nb - Escherichia coli 2,287 Escherichia coli 99,9 nb - Escherichia coli 2,265 Escherichia coli 96,0 nb - Escherichia coli 2,23 Haemophilus parainfluenzae 99,9 Haemophilus parainfluenzae 89 Haemophilus parainfluenzae 1,995 Haemophilus parainfluenzae 99,1 Haemophilus parainfluenzae 99 Haemophilus parainfluenzae 1,93 Haemophilus parainfluenzae 99,1 Haemophilus parainfluenzae 91 Haemophilus parainfluenzae 2,04 Haemophilus parainfluenzae 71,1 Burkholderia cepacia group 96 Haemophilus parainfluenzae 2,118 Haemophilus parainfluenzae 51,2 Pasteurella canis 96 Aggregatibacter segnis 1,92 Haemophilus parainfluenzae 71,7 Pasteurella canis 95 Not reliable identification - Haemophilus parainfluenzae 82,0 Pasteurella pneumotropica 99 Haemophilus influenzae 1,91 Haemophilus spp. 95,5 Unidentified organism Haemophilus parainfluenzae 1,925 Haemophilus spp. 95,5 Haemophilus parainfluenzae 88 Haemophilus parainfluenzae 1,909 Haemophilus spp. 95,3 Sphingomonas paucimobilis 90 Haemophilus parainfluenzae 2,138 Haemophilus spp. 95,5 Pasteurella pneumotropica 96 Haemophilus parainfluenzae 2,032 Haemophilus spp. 95,3 Sphingomonas paucimobilis 97 Haemophilus parainfluenzae 2,073 Haemophilus spp. 95,5 Pasteurella pneumotropica 86 Haemophilus parainfluenzae 2,032 Bacillus spp. - Sphingomonas paucimobilis 87 Bacillus licheniformis 1,882 Bacillus spp. - nb - Bacillus pumilus 1,78 Bacillus spp. - nb - Bacillus safenis 1,767 Staphylococcus spp. Unac. nb - Staphylococcus aureus 2,241 Staphylococcus spp. Unac. nb - Staphylococcus pseudointermedius 1,904 Staphylococcus spp. Unac. nb - Staphylococcus intermedius 1,836 Staphylococcus gallinarum Unac. nb - Staphylococcus aureus 2,177 Aerococcus viridans Unac. nb - Staphylococcus aureus 2,324 Aerococcus viridans Unac. nb - Staphylococcus aureus 2,174 Aerococcus viridans Unac. nb - Staphylococcus aureus 1,921 nb nie badano; not reliable identification niewiarygodna identyfikacja; unac. unaceptable, nie do zaakceptowania i w analizatorze Vitek 2 z wynikami uzyskanymi techniką MALDI- -TOF MS przedstawiono w tabeli II. Zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli II, nie wykazano dużych rozbieżności w identyfikacji wyosobnionych z materiałów klinicznych izolatów z użyciem metod biochemicznych, w których zgodność cech była bardzo wysoka (identyfikacja > 96%) i techniki MALDI-TOF MS (wartość identyfikacji >1,93). Różnice w identyfikacji poszczególnych gatunków wystąpiły w grupie mikroorganizmów rzadziej diagnozowanych i o specyficznych wymaganiach wzrostowych, w oparciu o niektóre cechy biochemiczne zaklasyfikowanych głównie np. do Haemophilus spp. albo Aerococcus viridans. W oparciu o profil białkowy zidentyfikowano również niektóre gronkowce lub laseczki Bacillus spp., których nie można było zaklasyfikować do gatunku na podstawie cech biochemicznych. Wykazano różnice w identyfikacji bakterii izolowanych od ptaków hodowlanych z użyciem metod biochemicznych stosowanych do identyfikacji bakterii pochodzących od człowieka i techniki MALDI- -TOF MS (tab. III). Metoda STREPTOtest 24 pozwalała na określenie gatunków bakterii z rodzaju Enterococcus, ale odsetek jednoznacznie odczytywanych cech był zróżnicowany (69,0 99,9%). Rozbieżności w identyfikacji zaobserwowano w odniesieniu do bakterii izolowanych z agaru czekoladowego, które zgodnie z wynikami uzyskanymi z użyciem mikrotestu API NH (identyfikacja w zakresie 57,8 99,6%) były klasyfikowane głównie jako Haemophilus aphrophilus/h. paraphrophilus/h. parainfluenzae (oznaczone jako Haemophilus spp.), natomiast w oparciu o spektrometrię mas były identyfikowane najczęściej jako Avibacterium endocarditidis. 100% zgodność w klasyfikacji niektórych gatunków obserwowano, gdy wartość identyfikacji w oparciu o cechy biochemiczne i profil białkowy mieściła się w zakresie odpowiednio 96 99,9% i 2,086 2,287 dla E. coli oraz >99% i 1,93 2,04 dla H. parainfluenzae. Porównywalne wyniki klasyfikacji E. faecalis obserwowano w sytuacji, gdy wartość identyfikacji metodami biochemicznymi i z użyciem spektrometrii masowej wynosiła odpowiednio 99,9% i 1,992 2.0. W przypadku rozpoznawalności na poziomie 1,7 <1,992 częściej występowały trudności z identyfikacją z użyciem metod biochemicznych. Różnice pomiędzy szczepami tego samego gatunku można było określić w oparciu o widma spektralne profilu białkowego. 26

Diagn Lab 2015; 51(1): 23-30 Tabela III. Porównanie identyfikacji wybranych izolatów bakterii wyosobnionych od ptaków hodowlanych w oparciu o rutynowo stosowane metody biochemiczne i technikę MALDI-TOF MS. Identyfikacja biochemiczna MALDI-TOF MS Gatunek % identyfikacji Gatunek Wartość identyfikacji Enterococcus casseliflavus 69,0 Enterococcus gallinarum 2,317 Enterococcus faecalis 99,9 Enterococcus faecalis 2,359 Enterococcus mundtii 94,0 Enterococcus hirae 2,057 Enterococcus mundtii 97,0 Enterococcus faecalis 2,170 Enterococcus faecalis 99,9 Enterococcus faecalis 2,413 Enterococcus faecalis 99,9 Enterococcus faecalis 1,992 Haemophilus spp. 95,5 Gallibacterium anatis 2.054 Haemophilus spp. 95,7 Gallibacterium anatis 2.014 Haemophilus spp. 95,5 Avibacterium endocarditidis 2,134 Haemophilus spp. 99,6 Avibacterium endocarditidis 1,775 Haemophilus spp. 99,3 Avibacterium endocarditidis 1,845 Haemophilus spp. 91,1 Avibacterium endocarditidis 1,891 Haemophilus spp. 57,8 Avibacterium endocarditidis 1,728 Haemophilus spp. 99,3 Avibacterium endocarditidis 1,971 Haemophilus spp. 99,3 Avibacterium endocarditidis 2,043 Haemophilus spp 74,6 Pantoea agglomerans 2,154 Dyskusja Rutynowa diagnostyka mikrobiologiczna jest czasochłonna i może ograniczać identyfikację drobnoustrojów mniej znanych lub rzadziej izolowanych, zwłaszcza o znacznych wymaganiach wzrostowych. Ze względu na różnorodność mikroorganizmów nie zawsze jest możliwe otrzymywanie jednoznacznych i wiarygodnych wyników. Ponadto, dostępne testy biochemiczne są przeznaczone głównie do identyfikacji ludzkich patogenów. W związku z tym zastosowanie tych metod w identyfikacji drobnoustrojów typowych dla organizmów zwierzęcych może nastręczać trudności. Jak wykazano w pracy, z użyciem systemu MALDI-TOF MS możliwe było zidentyfikowanie wyosobnionych od ludzi rzadko występujących i/lub sprawiających trudności diagnostyczne bakterii, takie jak np. Bacillus spp. czy Aggregatibacter segnis. Zaklasyfikowano również do gatunku izolaty z rodzaju Enterococcus oraz z rodziny Pasteurellaceae wyosobnione od ptaków, których nie można było oznaczyć prawidłowo metodami biochemicznymi. Ponadto szczep referencyjny H. parainfluenzae ATCC 7901 został oznaczony z użyciem systemu MALDI-TOF MS jako A. aphrophilus ATCC 7901, co jest zgodne z reklasyfikacją dokonaną w oparciu o badania 16S rrna przez Nørskov-Lauritsen i Kilian [15]. Problemy z identyfikacją bakterii do gatunku w oparciu o metody biochemiczne związane były m.in. z ich różnorodnością gatunkową i funkcjonalną, specyficznymi wymaganiami odżywczymi, niską aktywnością metaboliczną i enzymatyczną oraz pochodzeniem bakterii. Przedstawione badania, wykonywane na grupie drobnoustrojów o specyficznych, wysokich preferencjach odżywczych mają charakter pilotażowy i wymagają wykonania dodatkowych oznaczeń w celu określenia dokładnych korelacji pomiędzy stosowanymi metodami biochemicznymi, a metodą MALDI-TOF MS przy użyciu odpowiednich testów statystycznych. Uzyskane dane są zgodne z sugestiami wielu badaczy, że spektrometria masowa i oparta o nią technika MALDI-TOF MS może być ważnym elementem uzupełniającym rutynową diagnostykę mikrobiologiczną [8, 16, 17, 18, 19]. Często wykorzystywane metody biochemiczne, oparte na ocenie aktywności białek czy szlaków metabolicznych występujących w komórkach drobnoustrojów, mogą być niewystarczające. Wydaje się także, że producentom dostępnych na rynku testów biochemicznych trudno jest szybko reagować na szerokie spektrum oraz zmienność i różnorodność mikroorganizmów, zwłaszcza o niskiej aktywności biochemicznej, co skutkuje ograniczeniami testów biochemicznych. Metody oparte na spektrometrii masowej pozwalają na analizę złożonej mieszaniny białek, a tym samym identyfikację nawet bardzo rzadko izolowanych mikroorganizmów w oparciu o specyficzny i charakterystyczny dla nich profil białkowy. Umożliwia to m.in. bardzo duża i stale aktualizowana baza danych, która liczy obecnie kilka tysięcy rozpoznanych i potwierdzonych gatunków drobnoustrojów z całego świata, w tym również pochodzących od pacjentów z przewlekłymi lub chronicznymi chorobami, także odzwierzęcymi. Do takich oportunistycznych patogenów izolowanych od ludzi, a zidentyfikowanych w pracy, należy m.in. A. endocarditis czy H. parainfluenzae, które mogą być czynnikami etiologicznymi zapalenia wsierdzia [20, 21], różne gatunki laseczek tlenowych Bacillus spp. [22] oraz Klebsiella spp. [23] izolowane od pacjentów, zwłaszcza z immunosupresją, u których zdiagnozowano m.in. sepsę. System MALDI-TOF MS jest obecnie często wykorzystywanym narzędziem analitycznym m.in. w identyfikacji mikroorganizmów i w analizie pokrewieństwa w obrębie izolatów tego samego gatunku [7, 9, 17-18]. Ponadto koszt pojedynczej analizy nie jest wysoki, a także wiele prób może być analizowanych w krótkim czasie w wystandaryzowanych warunkach. Identyfikacja bakterii metodą MALDI-TOF MS nie wymaga również wstępnej diagnostyki lub innego niż w przypadku rutynowo stosowanych metod przygotowania próbki, niezależnie od rodzaju drobnoustroju. Coraz intensywniej poszukuje się także możliwości oznaczenia drobnoustrojów bezpośrednio w materiałach diagnostycznych (np. w moczu lub we krwi) pobranych od pacjenta [24, 25, 26, 27]. Zdaniem Croxatto i wsp. [26], znaczące ograniczenia w za- 27

www.diagnostykalaboratoryjna.eu stosowaniu metody MALDI-TOF w tym zakresie wynikają często z małej liczby drobnoustrojów występujących w próbach, braku odpowiednich protokołów badań i niedoboru widm dla szczepów referencyjnych. Pomimo wielu zalet, jak dużej dokładności i czułości, metody spektrometrii masowej obciążone są również ograniczeniami. Szybka i wiarygodna identyfikacja czynników etiologicznych zakażenia rzutuje na kolejne badania oraz umożliwia podjęcie leczenia antybiotykami, głównie w postępowaniu empirycznym. Metoda spektrometrii nie gwarantuje jednoznacznej identyfikacji każdego drobnoustroju [8, 17, 26]. Problemy takie występują m.in. kiedy pomiędzy mikroorganizmami występuje wysokie pokrewieństwo filogenetyczne, czego efektem jest bardzo podobny profil białkowy oraz zbliżone cechy biochemiczne [17]. Jak wykazano w pracy, jeden z izolatów, którego nie zidentyfikowano techniką MALDI-TOF MS, został zaklasyfikowany na podstawie cech biochemicznych jako H. parainfluenzae (71,7% prawdopodobieństwo identyfikacji z użyciem API NH) oraz jako Pasteurella canis (95% prawdopodobieństwo identyfikacji z użyciem systemu Vitek 2). W związku z wieloetapową procedurą przygotowania próbek do analizy, ważnym problemem jest również brak standaryzacji metodyki między labora toriami. Wprowadzenie określonych norm pozwoliłoby na doskonalenie tej metody diagnostycznej, jej usprawnianie, łatwiejsze i szybsze reagowanie na różne problemy. Ograniczenia dotyczą również możliwości zastosowania systemu MALDI-TOF MS do oznaczania lekowrażliwości oraz mechanizmów oporności na leki. Nie został także rozwiązany problem różnicowania wewnątrzgatunkowego mikroorganizmów, co w niektórych przypadkach jest istotne diagnostycznie (np. identyfikacja typu serologicznego) [26]. Z tego względu celem wprowadzenia terapii celowanej konieczna jest weryfikacja oceny lekowrażliwości izolatu z użyciem innych metod, w tym klasycznego antybiogramu i/lub oceny MIC (minimal inhibitory concentration). Poszukiwanie nowych metod identyfikacji drobnoustrojów, stosunkowo łatwych w wykonaniu, szybkich i tanich, jest znakiem czasu i warunkiem przystosowania realiów diagnostycznych do współczesnych standardów. W chwili obecnej traktowanie patogenów oportunistycznych jako nieistotnych klinicznie i nieważnych, ponieważ nie mieszczą się w od dawna przyjętych kanonach, wydaje się nie mieć uzasadnienia wobec dynamicznie zachodzących zmian w otaczającym świecie. Obecnie kładzie się coraz większy nacisk na rozwój metod diagnostycznych, umożliwiających w rutynowych warunkach szybką i wiarygodną identyfikację bakterii oraz innych drobnoustrojów, również oportunistycznych i rzadziej izolowanych z materiałów diagnostycznych. Podsumowanie Największe rozbieżności pomiędzy identyfikacją bakterii izolowanych od ludzi i ptaków hodowlanych z użyciem metod biochemicznych i techniki MALDI-TOF MS zaobserwowano wśród izolatów bakterii z rodziny Pasteurellaceae. Uzyskane dane potwierdzają, że MALDI-TOF MS jest użyteczną metodą diagnostyczną, umożliwiająca identyfikację różnych gatunków mikroorganizmów o specyficznych wymaganiach wzrostowych, rzadko izolowanych z materiałów diagnostycznych lub sprawiających problemy w rutynowej diagnostyce, opartej głównie na metodach biochemicznych. Piśmienictwo 1. Wang HH. Commensal bacteria, microbial ecosystems, and horizontal gene transmission: adjusting our focus for strategic breakthroughs against antibiotic resistance. In: Jaykus L-A, Wang HH, LS Schlesinger, (eds.). Food-borne microbes: shaping the host ecosystem, ASM Press, Washington, DC, 2009. 2. Berg G, Erlacher A, Smalla K, et al. Vegetable microbiomes: is there a connection among opportunistic infections, human health and our gut feeling? Microbial Biotechnology 2014; 7: 487 495. 3. Boseret G, Losson B, Mainil JG, et al. Zoonoses in pet birds: review and perspectives. Vet Res 2013; 44: 1186 (doi: 10.1186/1297-9716-44-36). 4. Hanski I, von Hertzen L., Fyhrquist N, et al. Environmental biodiversity, human microbiota, and allergy are interrelated. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109: 8334 9. 5. Christou L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect 2011; 17: 326 30. 6. Love S. Zoonoses animal diseases transmissible to humans. 2014, http:// www.dpi.nsw.gov.au/ 7. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry: a fundamental shift in the routine practice of clinical microbiology. Clin Microbiol Rev 2013; 26: 547-603. 8. Silpak B, Rolain JM. Use of MALDI-TOF mass spectrometry for identification of bacteria that are difficult to culture. J Microbiol Methods 2013; 92: 14 24. 9. Van Veen S, Claas E, Kuijper EJ. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J Clin Microbiol 2010; 48: 900-7. 10. Böhme K, Fernandez-No IC, Barros-Velazquez J, et al. Species differentiation of seafood spoilage and pathogenic Gram-negative bacteria by MALDI-TOF mass fingerprinting. J Proteome Res 2010; 9: 3169-83. 11. Dupont C, Sivadon-Tardy V, Bille E, et al. Identification of clinical coagulase-negative staphylococci, isolated in microbiology laboratories, by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry and two automated systems. Clin Microbiol Infect 2010; 16: 998-1004. 12. Knoester M, van Veen SQ, Claas ECJ, et al. Routine identification of clinical isolates of anaerobic bacteria: matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry performs better than conventional identification methods. J Clin Microbiol 2012; 50: 1504. 13. Lavigne JP, Espinal P, Dunyach-Remy C, et al. Mass spectrometry: a revolution in clinical microbiology? Clin Chem Lab Med 2013; 51: 257-70. 14. Sauer S, Freiwald A, Maier T, et al. Classification and identification of bacteria by mass spectrometry and computational analysis. PLoS ONE 3, e2843, 2008 (doi: 10.1371/journal.pone.0002843). 15. Norskov-Lauritsen N, Kilian M. Reclassification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus and Haemophilus segnis as Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen. nov., comb. nov., Aggregatibacter aphrophilus comb. nov. and Aggregatibacter segnis comb. nov., and emended description of Aggregatibacter aphrophilus to include V factor-dependent and V factor-independent isolates. Int J Syst Evol Microbiol 2006; 56: 2135-46. 16. Alispahic M, Hummel K, Jandreski-Cvetkovic D, et al. Species-specific identification and differentiation of Arcobacter, Helicobacter and Campylobacter by full-spectral matrix-associated laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry analysis. J Med Microbiol 2010; 59: 295-301. 17. Azarko J, Wendt U. Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej. Diagn Lab 2011; 47: 409-417. 18. Kosikowska U, Stępień-Pyśniak D, Pietras-Ożga D, et al. Identification of Bacillus spp. colonizing the nasal mucosa of healthy adults living in the suburban area using the matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) system. Curr Issues Pharm Med Sci 2014; 27: 137-141. 19. Seng P, Rolain, JM, Fournier PE, et al. MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical microbiology. Future Microbiology 2010; 5: 1733-54. 20. Wassef N, Rizkalla E, Shaukat N, et al. HACEK-induced endocarditis. BMJ Case Rep. 2013, doi (10.1136/bcr-2012-007359). 28

Diagn Lab 2015; 51(1): 23-30 21. Wright P, Keane C, Ricketts HC, et al. Aggregatibacter aphrophilus endocarditis: a case report. Scott Med J 2012; 57: 247. 22. Connor N, Sikorski J, Rooney AP, et al. Ecology of speciation in the genus Bacillus. Appl Environ Microbiol 2010; 76: 1349-58. 23. Sahly H, Podschun R, Ullmann U. Klebsiella infections in the immunocompromised host. Adv Exp Med Biol 2000; 479: 237 49. 24. Patel R. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry in clinical microbiology. Clin Infect Dis 2013; 57: 564-72. 25. DeMarco ML, Burnham C-AD. Diafiltration MALDI-TOF mass spectrometry method for culture-independent detection and identification of pathogens directly from urine specimens. Am J Clin Pathol 2014; 141: 204-12. 26. Croxatto A, Prod hom G, Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. Microbiol FEMS Rev 2012; 36: 380-407 27. Buchan BW, Ledeboer NA. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev 2014; 27: 783 822. Adres do korespondencji: dr Urszula Kosikowska Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej Uniwersytet Medyczny w Lublinie 20-093 Lublin, ul. Dr. W. Chodźki 1 Tel. +48 81 4487106 e-mail: urszula.kosikowska@umlub.pl Zaakceptowano do publikacji: 19.01.2015 29

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 30