CTnI Advanced Test do oznaczeń w pełnej krwi, osoczu lub surowicy

CTnI Advanced Test do oznaczeń w pełnej krwi, osoczu lub surowicy ZASTOSOWANIE TESTU Do szybkiego jakościowego wykrywania sercowej troponiny I (ctni) w ludzkiej pełnej krwi, surowicy lub osoczu, jako test pomocniczy w diagnozowaniu zawału serca. Badanie ctni pozwala na uzyskanie jakościowego wyniku analizy. Ze względu na jakościowy charakter tego testu jego jednorazowe użycie nie dostarcza informacji na temat dynamicznej zmiany stężenia ctni (tj. wzrostu lub spadku). W celu dokładnej oceny stężenia ctni w danym momencie, w zależności od potrzeb, należy zastosować metodę ilościową. Pełna profesjonalna ocena stanu klinicznego pacjenta powinna być rutynowo wykonana, zwłaszcza po jedynie pojedynczym wykonaniu testu ctni. OPIS TESTU Złożona cząsteczka troponiny składa się z trzech podjednostek: troponiny T (TnT), troponiny C (TnC) oraz troponiny I (TnI). Te trzy podjednostki troponiny pełnią różne funkcje: TnC - wiąże jony wapnia [Ca++], TnT - wiąże tropomiozynę, a TnI ma działanie hamujące. Kompleks troponiny wraz z tropomiozyną, tworzy główną komponentę, która reguluje aktywność ATP-azy aktomiozyny, wrażliwej na jony wapnia [Ca++-] w mięśniach poprzecznie prążkowanych (szkieletowych i sercowym).w mięśniach szkieletowych i sercowym występują różne izoformy TnI (odpowiednio stni oraz ctni), które charakteryzuje strukturalna heterogenność. Wpływa to na produkcję przeciwciał, specyficznych dla poszczególnych izoform. Te przeciwciała (specyficzne dla rodzaju izoform) zostały wykorzystane w opracowaniu różnych metod wykrywania. Najnowsze badania wykazały przydatność określania poziomów różnych izoform TnI w surowicy. Stężenie ctni w surowicy było przedmiotem badań klinicznych na temat jej przydatności jako metody oceny martwicy mięśnia sercowego u pacjentów z ostrym zawałem serca [5]. Badania te wykazały dużą wartość diagnostyczną oznaczania poziomu ctni w surowicy w rozpoznawaniu zawału serca. Czasowy związek uwalniania ctni do surowicy był badany i porównywany do innych, powszechnie uznanych markerów sercowych, jak np. CK-MB, mioglobina oraz TnT. Na podstawie danych z tych badań zostało wykazane, że u pacjentów z zawałem serca, ctni jest uwalniana do krwioobiegu, w stężeniach przekraczających prawidłową górną wartość referencyjną po 4-6 godzinach od wystąpienia objawów klinicznych zawału i osiąga szczytowe stężenia po 12-24 godz. [8]. Ten wczesny profil uwalniania jest podobny do CK-MB. Jednakże stężenia CK-MB powracają do normalnych wartości po 72 godz., podczas gdy poziomy ctni pozostają podwyższone do 5-7 dni. Z powodu różnej struktury ctni oraz dostępności wysoce swoistych metod wykrywania ctni badano użyteczność tego markera w diagnozowaniu ostrego zawału serca oraz w przypadku skomplikowanych stanów klinicznych, obejmujących uszkodzenie mięśni szkieletowych. Wysoka swoistość pomiarów ctni w rozpoznawaniu martwicy mięśnia sercowego została wykazana w takich stanach, jak np. okres okołooperacyjny, po biegu maratońskim oraz po tępym urazie klatki piersiowej. Uwalnianie ctni do krwi zostało również udokumentowane w stanach klinicznych, które obejmowały uszkodzenie myocardium z innych przyczyn niż zawał serca, takich jak np. niestabilna choroba wieńcowa, zastoinowa niewydolność serca oraz uszkodzenie niedokrwienne w przebiegu operacji pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG). Wykazano i udokumentowano wartość diagnostyczną pomiarów ctni w rozpoznawaniu zawału serca u pacjentów, którzy zgłaszali się do Izby Przyjęć lub Oddziału Pomocy Doraźnej z powodu bólu w klatce piersiowej. ZASADY TESTU Troponina-I (ctni) oznaczana jest przy pomocy testu immunologicznego o nazwie sandwich immunoassay. Kaseta testu zawiera pasek błony nitrocelulozowej nasączony mysimi przeciwciałami anty-ctni, unieruchomionymi w strefie testowej (T) paska. Inne, pochodzące od kozy anty-mysie przeciwciała są natomiast unieruchomione w odrębnym miejscu tego paska zwanym strefą kontrolną (C). Kiedy próbka krwi (zawierająca badany analit np. z ctni) zostanie dodana do podłoża dochodzi do rozdziału elementów krwi. Specjalny obszar separujący zatrzymuje erytrocyty, co zapobiega ich przemieszczaniu się do błony nitrocelulozowej. Podłoże testowe zawiera mysie przeciwciała anty-ctni, które są połączone z koloidalnym złotem. Analit (w tym przepadku antygen ctni) z próbki krwi reaguje z koloidalnym złotem, związanym z ctni, pochodzącym z podłoża, tworząc w ten sposób kompleks: przeciwciało - antygen koloidalne złoto, następnie płyn próbki, dzięki napięciu kapilarnemu, przepływa wzdłuż błony i przenosi te kompleksy do obszarów reakcji. Kiedy kompleksy przeciwciało - antygen koloidalne złoto dotrą wzdłuż błony do swoistych dla nich mysich przeciwciał anty-ctni w odpowiednim obszarze na błonie, zostają one zatrzymane i tworzą wówczas kompleks o nazwie sandwich complex [kompleks kanapkowy]. Kompleks taki składa się z unieruchomionych przeciwciał - antygenów (z analitu) przeciwciał koloidalnego złota. Tworzenie się tego kompleksu wystąpi tylko wtedy, gdy badana próbka krwi zawiera określone stężenie ctni. Utworzenie kompleksu powoduje uwidocznienie fioletowego paska w wyznaczonym polu testowym T błony nitrocelulozowej. W przypadku, gdy próbka krwi nie zawiera (lub zawiera zbyt małą ilość) ctni kompleksy nie powstają, a pole testowe T na błonie pozostanie bezbarwne (fioletowy pasek testowy nie będzie widoczny). Płynne połączenie koloidalnego złota przemieszcza się dalej wzdłuż błony nitrocelulozowej, w kierunku strefy kontrolnej (C). Tutaj połączenie to utworzy kompleks z unieruchomionymi anty-mysimi przeciwciałami na błonie, co spowoduje fioletowe zabarwienie kontrolnego paska testowego C. Jego uwidocznienie wskazuje, że test został wykonany prawidłowo. UWAGI CTnI Advanced Test powinien być przechowywany w temperaturze pokojowej 4-30 o C. Test jest wrażliwy na nadmierną wilgotność i gorąco. Oznaczenie należy wykonać niezwłocznie po otwarciu foliowej saszetki, w którą każdy test jest zapakowany indywidualnie. Nie używać po terminie ważności. str. 1/6

MATERIAŁY ZAWARTE W ZESTAWIE 1. Foliowa saszetka z testem ctni, pochłaniaczem wilgoci oraz kroplomierzem. 2. Instrukcja wykonania testu. MATERIAŁY, KTÓRE MOGĄ BYĆ NIEZBĘDNE, ALE NIE SĄ ZAWARTE W ZESTAWIE 1. Probówka na badaną krew z heparyną lub EDTA. 2. Czasomierz. 3. Mikropipety i jednorazowe końcówki pipet - konieczne tylko wtedy, gdy nie używa się kroplomierza. POBIERANIE PRÓBKI I JEJ PRZECHOWYWANIE Krew pełną należy pobierać do probówki z antykoagulantem heparyną. Uwaga: Troponina I jest bardzo niestabilna w surowicy, osoczu lub krwi pełnej, dlatego oznaczanie należy wykonać niezwłocznie po pobraniu. Przygotowanie próbki osocza/surowicy 1. Odwirować krew pełną w celu pozyskania osocza/surowicy. 2. Jeżeli oznaczanie nie będzie wykonane natychmiast próbki należy przechowywać w lodówce w temp. 2-8 o C. Przed oznaczaniem należy próbki ogrzać do temperatury pokojowej. 3. Próbki z widocznym precypitatem mogą dawać nieprawidłowe wyniki. Takie próbki należy wyklarować przed badaniem. OSTRZEŻENIA 1. Test tylko do oznaczania in vitro. 2. Wykonujący nie może jeść i palić papierosów podczas oznaczania. 3. Badanie wykonać w rękawiczkach ochronnych. Po wykonaniu badania dokładnie umyć ręce. 4. Unikać wylania lub rozpylenia roztworu odczynnika. 5. Rozlany ewentualnie płyn dokładnie zmyć za pomocą środka dezynfekującego. 6. Zużyte testy i zestawy umieścić w odpowiednich pojemnikach sanitarnych na odpady skażone oraz krew i utylizować. 7. Nie używać testu, jeśli widoczne jest uszkodzenie jego opakowania zewnętrznego (saszetki foliowej). SPOSÓB WYKONANIA TESTU 1. Wyciągnij kasetkę testu z saszetki i umieść ją na płaskiej, suchej powierzchni. 2. Kroplomierz z próbką krwi umieść nad kasetką (Rysunek 1) i wpuść jedną kroplę do centrum studzienki testowej (S) w kasetce. Uwaga: odczekaj 10 sekund (aż pierwsza kropla krwi ulegnie wchłonięciu) następnie wpuść drugą kroplę i powtórz czynność aż 3 krople będą wchłonięte (w sumie około 120 μl krwi). Jeśli krople badanej próbki naniesie się zbyt szybko, zwłaszcza krwi pełnej, to może dojść do wykrzepiania w polu testowym i błędu w oznaczaniu. 3. Z chwilą rozpoczęcia reakcji (testu) widoczny jest fioletowy kolor przesuwający się wzdłuż okienka wyniku znajdującego się po środku kasetki. Uwaga: jeśli fioletowy kolor nie zacznie się przesuwać przez okienko wyniku po 30 sekundach, należy dodać jeszcze 4-tą kroplę krwi z badanej próbki do studzienki testowej. 4. Odczytaj wyniki po 15 minutach. Nie odczytywać wyniku później niż po 17 minutach od początku reakcji. Uwaga: powyższy czas odczytywania wyników podano dla temperatury pokojowej 15-30 o C. Jeśli temperatura pomieszczenia jest znacząco niższa niż 15 o C należy odczyt wykonać odpowiednio później. INTERPRETACJA WYNIKU 1. Fioletowy pasek w lewym polu okienka wyniku - Pasek Kontroli C - oznacza, że zestaw testowy działa prawidłowo. 2. Prawe pole okienka wyniku - to Pasek Testowy T uwidoczniony kolorowy pasek w tym polu oznacza pozytywny wyniki testu. str. 2/6

WYNIK POZYTYWNY: Obecność dwóch kolorowych pasków T i C w okienku wyniku, niezależnie który pasek pojawi się pierwszy, oznacza pozytywny wynik testu (Rysunek 2). Uwaga: im intensywniejsze zabarwienie paska testowego T, tym wyższe stężenie analitu w próbce. Jeśli natomiast kolor któregoś paska będzie słabo nasycony oznacza to wprawdzie wykrycie analitu w próbce, ale jego stężenie plasuje się tuż powyżej granicy czułości (powyżej limitu detekcji). WYNIK NEGATYWNY: Obecność tylko jednego fioletowego paska w okienku wyniku wskazuje na wynik negatywny (Rysunek 3). TEST WYKONANY NIEPOPRAWNIE: Jeśli w okienku wyników nie pojawi się żaden z kolorowych pasków oznacza to, że badanie nie było wykonane poprawnie (błąd techniczny) (Rysunek 4). Wykonano badanie niezgodnie z instrukcją lub test był uszkodzony. Zaleca się ponowne wykonanie nowego badania. Uwaga: wynik pozytywny, aby był wiarygodny należy odnotować przed upływem 15 minut od rozpoczęcia testu. Nie należy się sugerować zmianami kolorów w okienku testowym po upływie 17 minut, gdyż może to prowadzić do błędów w interpretacji. Niektóre próbki z podwyższoną zawartością czynnika reumatoidalnego mogą dawać niespecyficzny wynik dodatni testu (fałszywie dodatni). Niewielka ilość krwi może dostać się do okienka wyników (maksymalnie dopuszcza się do 10% wielkości pola okienka wyników), co powinno być uwzględnione przy interpretacji testu. FAŁSZYWE WYNIKI: W pewnym procencie przypadków mogą wystąpić błędne wyniki: fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne. Znane czynniki zakłócające obejmują immunoglobuliny i heterofilne przeciwciała IgG/IgM. Chociaż test jest tak zaprojektowany, aby zminimalizować te zakłócenia, to ich nasilenie zmienia się w zależności od badanej próbki. U pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek ctni może być podwyższone w surowicy bez wystąpienia innych objawów ostrej martwicy mięśnia sercowego, co może zakłócać diagnozę. OGRANICZENIA TESTU Chociaż ctni Advanced Test jest wysoce dokładny w wykrywaniu ctni, to jednak w niewielkiej ilości przypadków mogą wystąpić wyniki fałszywe. W razie wątpliwości, co do wyniku należy wykonać badanie weryfikujące z użyciem innych metod oznaczania. Podobnie jak przy innych badaniach dodatkowych nie powinno się stawiać ostatecznej diagnozy na podstawie wyłącznie jednego testu, a lekarz powinien uwzględnić całość obrazu klinicznego pacjenta oraz inne dostępne badania laboratoryjne i dodatkowe pacjenta, zgodnie z aktualną wiedzą medyczną. Próbki zawierające znacznie podwyższone miano przeciwciał, jak np. ludzkie anty-mysie lub ludzkie anty-królicze przeciwciała mogą zakłócać wykonywanie lub wyniki testu. KONTROLA JAKOŚCI Badanie kontroli jakości z zastosowaniem dodatnich i ujemnych testów kontrolnych powinno być wykonywane w regularnych odstępach czasu jako element dobrej praktyki laboratoryjnej. A także przed użyciem nowej serii testów w celu potwierdzenia, że test dostarcza wyniki spełniające kryteria kontroli jakości. Dodatnia kontrola powinna być wybrana tak, aby dostarczyć wynik umiarkowanie dodatni w obu polach T i C. Ujemna kontrola powinna przynieść ujemny wynik (widoczny tylko pasek kontrolny C). Próbki kontrolne powinny również być wykonane, jeśli rzetelność wyników testu jest kwestionowana. Po potwierdzeniu oczekiwanych wyników zestaw testowy jest gotowy do badania próbek krwi pacjentów. W celu dodatkowych informacji dotyczących uzyskania próbek kontroli jakości skontaktuj się z lokalnym dystrybutorem. Obecność paska w polu C działa jako wewnętrzna kontrola dla prawidłowego wykonania testu. W przypadku braku paska w polu C wyniki testu są niepoprawne, a badanie musi być wykonane ponownie. Jeśli problem ten się powtarza, należy zwrócić się o pomoc do Serwisu Technicznego. Pasek kontroli C nie jest wewnętrzną referencją dla intensywności zabarwienia paska testowego T. OCZEKIWANE WARTOŚCI Troponin I Test był kalibrowany w oparciu o Dade Stratus Cardiac Troponin-I Fluorometric Enzyme Immunoassay. W tym komercyjnym zestawie pomiarowym jako diagnostyczny punkt odcięcia stosuje się wartość równą 1,0 ng/ml. W Troponin I Test również uznano za dodatnie wyniki stężeni ctni równe lub większe niż 1,0 ng/ml. Wykazano, że takie stężenia ctni we krwi osiągane są po 4-6 godzinach od wystąpienia objawów zawału serca. Maksymalne stężenie osiągane jest po 12-24 godzinach [14]. Poziom ctni pozostaje w niektórych przypadkach podwyższony przez 5 do 7 dni. A zatem ujemny wynik testu w ciągu pierwszych godzin od wystąpienia objawów nie wyklucza ostrego zawału serca w sposób pewny. Jeśli istnieje kliniczne podejrzenie zawału należy powtórzyć test w kolejnych właściwych odstępach czasu. Wykazano, że badanie poziomu ctni pomaga w diagnostyce szeregu objawów klinicznych, które występują w okresie pooperacyjnym, po traumatycznych urazach, u pacjentów z niewydolnością nerek, drgawkami oraz w przypadku miopatii szkieletowych. str. 3/6

Pole wyników Rysunek 1 Rysunek 2 Wynik pozytywny Rysunek 3 Wynik negatywny Rysunek 4 Wynik nieprawidłowy str. 4/6

CHARAKTERYSTYKA SKUTECZNOŚCI TESTU Substancje zakłócające: Poziomy następujących substancji nie wydają się wpływać zakłócająco na wyniki testu Troponin I Test: Ludzka Albumina 16 g/dl Bilirubina (niezwiązana) 60 mg/dl Wolna Hemoglobina 4 g/dl Triglicerydy 1,300 mg/dl Następujące leki były oceniane ze względu na ich potencjalne dodatnie i ujemne zakłócenia. W ocenie tej dodano te leki in vitro do: (1) ctni- ujemnej próbki osocza lub (2) zbiornika próbki osocza zawierającej 3 ng/ml ctni (2x punkt odcięcia). Leki te były dodane w ilościach około dwukrotnie większych niż ich zalecany poziomu terapeutyczny. Nie odnotowano zakłóceń wyniku testu dla żadnego z tych leków. Acetaminophen Acetylsalicylic acid Allopurinol Ambroxol Ampicillin Ascorbic acid Atenolol Caffeine Captopril Chloramphenicol Chlordiazepoxide Cinnarizine Cyclosporine Diclofenac Digoxin Dipyridamole Dopamine Erythromycin Furosemide Glibenclamide Hydrochlorothiazide Indomethacin Isosorbide dinitrate L-Thyroxine Methaqualone D,L-μ-Methyldopa Nicotinic acid Nifedipine Nitrofurantoin Noraminopyrine Nystatine Oxazepam Oxytertacycline Phenobarbital Phenytoin Probenecid Procainamide D,L-Propronolol Quinidine Sulfmethoxazol Theophylline Trimethoprim Verapamil Badania reakcji krzyżowych: Odpowiednie ludzkie białka były dodane do normalnego ludzkiego osocza, aby zbadać ich potencjalną reaktywność z Troponin I Test. Ujemny wynik został otrzymany z poniższymi białkami i przy ich następujących stężeniach: Sercowa Tropomiozyna 8,000 ng/ml Sercowa Miozyna Ciężki Łańcuch 20,000 ng/ml Sercowa Troponina T 2,000 ng/ml Sercowa Troponina C 1,000 ng/ml Szybko-Kurczliwa Szkieletowa Troponina I 10,000 ng/ml Ocena wiarygodności testu: Trzy różne szpitale (ośrodki badawcze) zostały zaopatrzone w specjalnie przygotowane 3 rodzaje próbek pełnej krwi włośniczkowej. W pierwszym rodzaju - próbki krwi zawierały częściowo oczyszczoną ludzką ctni o stężeniu 2,5 ng/ml (zgodnie z pomiarem za pomocą Dade Stratus Cardiac Troponin-I Fluorometric Enzyme Immunoassay), w drugim - 10 ng/ml ctni, a w trzecim - nie dodano ctni (kontrola). Każdy z trzech ośrodków otrzymał 5 sztuk próbki danego rodzaju, czyli łącznie 15 próbek na ośrodek. Dane pokazane w poniższej tabeli wskazują, że odnotowano 100% zgodności wyników zarówno pomiędzy ośrodkami badania, jak i w każdym ze szpitali w obrębie wymienionych trzech zakresów badanego stężenia ctni. Ośrodek badawczy Ujemna Kontrola Z dodaniem 2.5 ng/ml Z dodaniem 10 ng/ml % Zgodność wewnątrz ośrodka Ośrodek 1 0/5 5/5 5/5 100 Ośrodek 2 0/5 5/5 5/5 100 Ośrodek 3 0/5 5/5 5/5 100 % Zgodność pomiędzy ośrodkami 100 100 100 - str. 5/6

Korelacja wyników badania pomiędzy pełną krwią i osoczem: Trzydzieści (30) próbek pełnej krwi było przebadanych za pomocą Troponin I Test. Osocze z tych próbek zostało oddzielone i przebadane w tym samym czasie. Zgodność pomiędzy tymi dwoma procedurami wynosiła 100% (30/30). Wynik ctni w osoczu Wynik ctni w pełnej krwi Dodatni Ujemny Dodatni 12 0 12 Ujemny 0 18 18 Całość 12 18 30 Razem Nieścisłości badania w pobliżu punktów odcięcia: Do zweryfikowania precyzji wyników badania w pobliżu wartości odcięcia tj. 1,0 ng/ml przeprowadzono ocenę klinicznej korelacji wyników badania (1,0 ng/ml przyjęto jako wzorcowy punkt odcięcia stosowany w metodzie pomiaru Dade Stratus Cardiac Troponin-I Fluorometric Enzyme Immunoassay). Osiemdziesiąt osiem (88) próbek klinicznych zawierających ctni o wartości 0,5 do 2,5 ng/ml (oznaczonych uprzednio wzorcowym badaniem ilościowym) zostało podzielonych na grupy w przedziałach co 0,5 ng/ml stężenia ctni. Uzyskane wyniki Troponin I Test zostały odpowiednio odnotowane jako dodatnie lub ujemne. Przedstawia to poniższa tabela: Grupa Próbek Klinicznych Liczba Próbek Wyniki ctni (ng/ml ctni stężenie) Liczba Wyników Dodatnich Liczba Wyników Ujemnych 0,50 0,99 21 3 18 1,00 1,49 15 11 4 1,50 1,99 28 20 8 2,00 2,49 24 21 3 REFERENCJE 1. Mehegan, J.P. & Tobacman, L.S., Cooperative interaction between troponin molecules bound to the cardiac thin filament. J. Biol. Chem. 266: 966 (1991). 2. Ebashi, S., Ca2+ and the contractile proteins. J. Mol. Cell Cardiol. 16: 129 (1984). 3. Bodor, S. G. et al., Development of monoclonal antibody for an assay of cardiac troponin I and preliminary results in suspected cases of myocardial infarction. Clin. Chem. 38:2203 (1992). 4. Takahashi, M. et al., Use of immunoassay for measurement of skeletal troponin I utilizing isoform-specific monoclonal antibodies. Clinical Chemistry 29: 301 (1996). 5. Adams, J.E., et al., Biochemical markers of myocardial injury. Is MB creatin kinase the choice for the 1990 s? Circulation 88:750 (1993). 6. Apple, F.S. et al., Cardiac troponin, CK-MB, and myoglobin for the early detection of myocardial infarction and monitoring of reperfusion following thrombolytic therapy. Clinica Chimica Acta 237: 59 (1995). 7. Adams, J.E. et al., Improved detection of cardiac contusion with troponin I. Circulation 88, Abstract No. 0805 (1993). 8. Adams, J.E. et al., Diagnosis of perioperative myocardial infarction with measurement of cardiac troponin-i. N. Eng. J. Med. 330: 670 (1994). 9. Machler, H. et al., Perioperative myocardial cell damage in patients with unstable angina undergoing coronary artery bypass graft surgery. Anesthesiology 81: 1324 (1994). 10. Stanton, E. et al., Detection of postoperative MI by measuring the serum level of troponin I. Canadian J. Caridol, 10, Abstract No. 216 (1994). 11. Hossein-Nia, M. et al., Cardiac troponin I release in heart transplantation. Ann. Thorac. Surg. 61: 277 (1996). 12. Bertinchant, J.P. et al., Clinical and angiographic findings in troponin I positive and troponin I negative patients admited with unstable angina. European Heart J. 16, Abstract No. 1488 (1995). 13. Wu, A. et al., Prognostic value of cardiac troponin I in patients with chest pain. Clin. Chem. 42: 651 91996). 14. Hanfner, S. et al, Cardiac troponins in serum in chronic renal failure. Clin. Chem. 40: 1790 (1994). 15. Adams, J.E. et al., Comparable detection of acute myocardial infarction by creatin kinase MB isoenzyme and cardiac troponin I. Clin. Chem. 40: 1291 (1994). 16. Flisiński M, et al., Cardiac troponin I in patients with chronic kidney disease treated conservatively or undergoing long-term haemodialysis. Kardiol Pol. 2007 Sep;65(9):1068-75; UŻYTE SYMBOLE GRAFICZNE str. 6/6