Mgr Justyna Ulańska-Poutanen

Mgr Justyna Ulańska-Poutanen Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Wszczęcie: 11.04.2014 r. Temat: Modulowanie różnicowania prekursorów oligodendrocytów w procesie remielinizacji ośrodkowego układu nerwowego Promotor: prof. dr hab. Bożena Kamińska-Kaczmarek Promotor pomocniczy: dr Małgorzata Zawadzka Recenzenci: prof. dr hab. Leonora Bużańska, prof. dr hab. Joanna Lewin-Kowalik

2.1. STRESZCZENIE Demielinizacja to patologiczny proces zachodzący w układzie nerwowym, w wyniku którego zniszczeniu ulegają osłonki mielinowe odpowiadające za integralność aksonów i przewodnictwo sygnału. Naturalną, endogenną odpowiedzią na demielinizację ośrodkowego układu nerwowego jest remielinizacja. Jest to proces regeneracyjny, na który składa się szereg następujących po uszkodzeniu zmian komórkowych i molekularnych prowadzących do różnicowania i dojrzewania prekursorów oligodendrocytów w kierunku dojrzałych oligodendrocytów odbudowujących utracone osłonki mielinowe. Regeneracja osłonki mielinowej zachodzi również spontanicznie u niektórych pacjentów cierpiących na choroby o podłożu demielinizacynym, jednak wydajność tego procesu spada znacznie wraz z wiekiem chorego i postępem choroby. Celem terapii mających wzmocnić zjawisko endogennej remielinizacji jest więc modyfikowanie środowiska i uruchomienie mechanizmów regulujących regenerację tkanki. W przypadku rozległych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego remielinizacja może być wspierana także przez komórki Schwanna. Udział tych komórek w remielinizacji ośrodkowego układu nerwowego opisywano w literaturze badań podstawowych i doniesieniach klinicznych od wielu lat m.in. w uszkodzeniach rdzenia kręgowego oraz u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym o szczególnie nasilonym przebiegu (Itoyama i wsp., 1983). Wytworzenie mieliny typu obwodowego dookoła aksonów może być szczególnie istotne we wspieraniu regeneracji w uszkodzeniach, w których celem ataku układu odpornościowego są oligodendrocyty wytwarzające mielinę typu ośrodkowego. Zarówno pochodzenie komórek Schwanna mielinizujących aksony ośrodkowego układu nerwowego jak i mechanizm ich różnicowania pozostawał dotąd niewyjaśniony. Przez lata przyjmowano, że komórki prekursorowe ośrodkowego układu nerwowego są źródłem jedynie oligodendrocytów, jednak w badaniach różnicowania prekursorów oligodendrocytów za pomocą genetycznego mapowania ich losów w uszkodzonej tkance wykazano, że komórki te mogą różnicować także na ścieżce alternatywnej do komórek Schwanna, w zależności od kontekstu mikrośrodowiska uszkodzenia (Zawadzka i wsp., 2010). Ponadto, zaobserwowano, że komórki Schwanna, pochodzące od prekursorów

ośrodkowego układu nerwowego, zlokalizowane są w uszkodzonej istocie białej wyłącznie w obszarach dookoła naczyń krwionośnych pozbawionych astrocytów. Na podstawie powyższych danych zaproponowano hipotezę zakładającą, że wzajemne interakcje między komórkami zasiedlającymi niszę naczyniową i wytworzone przez nie mikrośrodowisko sprzyjają różnicowaniu prekursorów oligodendrocytów do komórek Schwanna. Celem doświadczeń opisanych w niniejszej rozprawie było scharakteryzowanie środowiska dookoła naczyń krwionośnych w uszkodzeniu demielinizacyjnym, zidentyfikowanie czynników różnicujących tkankę dookoła naczyń krwionośnych od pozostałej tkanki w obszarze uszkodzenia oraz zbadanie wpływu wytypowanych czynników na proces alternatywnego różnicowania prekursorów oligodendrocytów. Aby rozwiązać postawiony problem badawczy rozdzielono niszę naczyniową i niszę bez naczyń w tkance we wczesnych czasach po uszkodzeniu istoty białej mózgowia dorosłego szczura (6 i 10 dni po uszkodzeniu) przy pomocy precyzyjnej techniki laserowej mikrodysekcji. Uzyskane ze zdefiniowanych obszarów uszkodzonych tkanek preparaty RNA poddano wielkoskalowej porównawczej analizie poziomu ekspresji genów wykorzystując do tego mikromacierze ekspresyjne cdna. Analiza wykazała, że badane nisze istotnie różnią się między sobą poziomem ekspresji wielu genów w analizowanych punktach czasowych po uszkodzeniu. Na podstawie uzyskanych danych wyłoniono ścieżki przekaźnictwa sygnału aktywne w badanym obszarze, opierając się na znamiennie istotnych różnicach w poziomie ekspresji genów kodujących kluczowe białka w danej niszy. Wśród nich na szczególną uwagę zasługują szlaki przekaźnictwa sygnału BMP, Wnt i Hedgehog, opisywane w literaturze, jako istotne dla procesu różnicowania oligodendrocytów (Tanaka i Yoshida, 2014). W celu weryfikacji uzyskanych wyników wyizolowano niezależny materiał pochodzący od zwierząt z różnych grup czasowych (6, 10 i 14 dpu) i przeanalizowano poziomy ekspresji genów z wytypowanych szlaków przekazywania sygnału przy użyciu metody ilościowego PCR. Analiza poziomu transkryptów genów z wybranych szlaków przekaźnictwa sygnału ujawniła różnice w poziomie ekspresji genów Bmp4, Wnt6 oraz ich inhibitora Sostdc1 pomiędzy niszami mikrośrodowiskowymi w różnych punktach czasowych. Istotnie wyższy poziom ekspresji genów Bmp4 i Wnt6 w niszy naczyniowej w 10 dni po uszkodzeniu, przy jednoczesnym niskim poziomie ekspresji inhibitora

Sostdc1, może być jednym z czynników regulujących różnicowanie prekursorów oligodendrocytów na ścieżce alternatywnej. W kolejnym etapie zidentyfikowano populacje komórek produkujące ligandy i białka efektorowe szlaków przekaźnictwa sygnału oraz ich inhibitory w różnych obszarach uszkodzenia. Wykorzystując techniki immunohistochemiczne wykazano, że głównym komórkowym źródłem białka BMP4 są prekursory oligodendrocytów i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, podczas gdy inhibitor szlaku, białko SOSTDC1, jest produkowane w uszkodzonej tkance jedynie przez astrocyty. Wyniki te potwierdzono analizując poziomy transkryptów genów w wyizolowanych populacjach komórek pochodzących z hodowli in vitro: prekursorach oligodendrocytów, astrocytach oraz komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu. W warunkach hodowli in vitro potwierdzono istotnie wyższy poziom ekspresji genu Bmp4 w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych w porównaniu do astrocytów. Z kolei poziom ekspresji genu Sostdc1 w komórkach astrocytów był istotnie wyższy niż w śródbłonku. Wykazano ponadto, że w czasie remielinizacji, równolegle z kolejnymi etapami różnicowania prekursorów oligodendrocytów, dochodzi do stopniowego odbudowania ciągłości bariery krew-mózg. Uzyskane wyniki sugerują, że regenerujące w obszarze uszkodzenia naczynia krwionośne mogą być źródłem sygnałów ułatwiających przełączanie różnicowania prekursorów oligodendrocytów na ścieżkę alternatywną, natomiast obecne w tkance pozbawionej naczyń astrocyty są źródłem inhibitora tych sygnałów, białka Sostdc1. Ponadto wykazano, że w niszy naczyniowej dochodzi do wzmożonej ekspresji genu kodującego jedno z efektorowych białek szlaku Wnt Ascl2. Doniesienia literaturowe wskazują, że białko to odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji genów odpowiedzialnych za dojrzewanie komórek Schwanna i produkcję mieliny w obwodowym układzie nerwowym (Krox24 i Krox20). W kolejnym etapie badań, w celu potwierdzenia zdolności prekursorów oligodendrocytów do różnicowania w kierunku komórek Schwanna, zbadano ich różnicowanie w warunkach uszkodzenia obwodowego układu nerwowego. W tym celu prekursory oligodendrocytów, uzyskane ze szczurzej hodowli pierwotnej, przeczepiono do nerwu kulszowego dorosłych zwierząt typu dzikiego w 1, 3 i 6 dni po jego uszkodzeniu. Wykazano, że jedynie w grupie zwierząt, którym przeszczepiono

prekursory oligodendrocytów do nerwu kulszowego w 24 godz. po jego uszkodzeniu zaobserwowano różnicowanie prekursorów do komórek Schwanna. W nerwach kulszowych pozostałych grup zwierząt zaobserwowano obecność komórek produkujących białko GFP, które nie wytwarzały osłonki mielinowej. Obserwowany kierunek różnicowania skorelowany był z różnym poziomem ekspresji genów ze ścieżek przekazywania sygnału BMP i Wnt oraz ich inhibitora Sostdc1 w uszkodzonym nerwie. W 24 godz. po uszkodzeniu nerwu kulszowego wykazano wysoki poziom ekspresji genu Bmp4 przy jednoczesnym niskim poziomie ekspresji inhibitora Sostdc1. Ponadto, tylko w tej grupie, wysoki poziom ekspresji genu Bmp4 był skorelowany z wysokim poziomem ekspresji genów kodujących czynniki transkrypcyjne regulujące dojrzewanie komórek Schwanna Krox20 i Ascl2, co może wskazywać na ich kluczową rolę w procesie modulowania różnicowania prekursorów oligodendrocytów. Podsumowując, w niniejszej rozprawie wykazano, że nisza naczyniowa różni się istotnie od niszy bez naczyń poziomem ekspresji genów z kluczowych ścieżek przekazywania sygnału, które mogą być zaangażowane w proces alternatywnego różnicowania prekursorów oligodendrocytów, takich jak BMP, Wnt i Hedgehog. Wykazano również, że Ascl2 - białko efektorowe szlaku Wnt potencjalnie regulujące różnicowanie komórek Schwanna- ulega zwiększonej ekspresji w obszarze niszy naczyniowej uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego. Uzyskane wyniki sugerują, że interakcje pomiędzy komórkami odpowiadającymi na uszkodzenia rezydującymi w różnych obszarach tkanki regulują różnicowanie prekursorów oligodendrocytów poprzez modulowanie przekaźnictwa sygnału białek ze szlaków BMP i Wnt. Ponadto, wykazano multipotencjalność prekursorów oligodendrocytów, przeszczepiając je do uszkodzonego obwodowego układu nerwowego, gdzie różnicowały do komórek Schwanna.

2.2. SUMMARY Demyelination is a pathological process that occurs in the central nervous system when, due to genetic defects or pathological insults, myelin sheaths responsible for the integrity of axons and saltatory conduction are destroyed. Natural, endogenous response to demyelination is remyelination, a regenerative process driven by the progenitor cells - the precursors of oligodendrocytes (OPCs). Regeneration occurs spontaneously also in some patients suffering from demyelinative diseases, but the efficiency of this process decreases with age and disease progression. CNS remyelination may be supported by the Schwann cells, in case of the extensive damage of white matter. The contribution of these cells to the CNS axons remyelination have been reported for many years in the clinical reports of patients with multiple sclerosis with a particularly severe course (Itoyama et al., 1983). Production of the peripheral type myelin around the axons may be particularly important in promoting recovery in injuries, where the target of the immune system attack are the oligodendrocytes that produce myelin of the central type. Comprehensive understanding of the role of alternative differentiation and enhancing endogenous remyelination may, therefore, become a basis for generating novel therapeutic strategies for treating demyelinating disorders. Origin of the Schwann cells in the central nervous system and the mechanism of their differentiation remained hitherto unclear. Over the years, it was assumed that the precursor cells of the central nervous system are the source of oligodendrocytes, exclusively. However, it has been demonstrated, in the genetic fate mapping study of oligodendrocyte precursor differentiation, that these cells can also differentiate along the alternative pathway, giving rise to the Schwann cells in the injured CNS, and this phenomenon depends on properties of the microenvironment of the damaged tissue (Zawadzka et al., 2010). Furthermore, it was observed that Schwann cells derived from OPCs in the central nervous system occupied almost exclusively the tissue around blood vessels in astrocyte deficient areas. Therefore the hypothesis postulating the occurrence of specific niche creating microenvironment that modulates fate of OPC and favors their differentiation into Schwann cells was conceived. The aim of the studies described in this dissertation was

to characterise the environment around the blood vessels in the lesion area, to identify the factors that distinguish the tissue around blood vessels from the rest of the tissue (non-vascular niche) and to investigate the effect of selected factors on the process of alternative differentiation of oligodendrocyte progenitors. To address this hypothesis the vascular niche was separated from non-vascular niche at the early time points after injury (6 and 10 days after injury, dpi) of the demyelinated brain white matter of adult rats using laser capture microdissection system. This technique allows to obtain precise, high quality RNA samples that were later used to large-scale comparative analysis of the level of genes expression with a use of the cdna microarray. Global gene expression profiling and bioinformatic analysis revealed 138 genes most significantly discriminating (adj.pv<0,05) between vascular and non-vascular niche in the 10 dpl group. Based on the expression profiles obtained, the signal transduction pathways active in the specific area of interest were selected. BMP, Wnt and Hedgehog signalling pathways have been identified as crucial players in the vascular niche. To verify the obtained results independent material from animals of different time groups (6, 10 and 14 dpi) was isolated and the expression level of genes selected from signal transduction pathways was analysed using quantitative PCR method. Based on comparative bioinformatic analysis and verification of the results by quantitative PCR, we selected candidate genes which significantly discriminate two niches. Analysis of transcript levels of genes from the selected signal transduction pathways revealed significant difference in the level of Bmp4, Wnt6 and their inhibitor Sostdc1 gene expression between the microenvironmental niches at different time points. Significantly higher level of Bmp4 and Wnt6 gene expression in the vascular niche at 10 days after injury, while low expression of Sostdc1 inhibitor, might serve as a crucial factor for the alternative differentiation fate of OPC. In the next step, the cell populations which produce some ligands and effector proteins of the signal transduction pathways and their inhibitors in different areas of damage were identified. It was demonstrated that the main cellular source of BMP4 and Wnt2b are oligodendrocyte precursors and endothelial cells, whereas SOSTDC1, an inhibitor of both pathways, is produced only by astrocytes in the injured tissue. These results were confirmed by the gene expression analysis in vitro, in the pure cell

populations (oligodendrocyte precursors, astrocytes and endothelial cells) derived from the brain. Significantly higher level of Bmp4 gene expression in the endothelial cells compared to astrocytes was confirmed, whereas the level of Sostdc1 gene expression was significantly higher in the astrocytes compared to the endothelium in the in vitro culture conditions. It was also shown that gradual restoration of the blood-brain barrier integrity takes place in parallel to the remyelination within injured areas. The results suggest that all of components and actions taking place in the vascular niche creates its specific microenviroment which favors differentiation of OPC on the alternative pathway. The regenerating blood vessels in the damaged area might be the source of signals that facilitate switch of the differentiation of oligodendrocyte precursors to alternative pathway, whereas astrocytes present in this niche 14 dpi might inhibit Schwann cells generation. It has been shown that in the vascular niche, there is an increased expression of the gene encoding for Ascl2 protein, one of the Wnt signalling pathway effector. Literature reports indicate that this protein plays an important role in the regulation of expression of genes responsible for maturation of Schwann cells (Krox24 and Krox20) and production of myelin in the peripheral nervous system. In the next step of the study, in order to confirm the ability of oligodendrocyte precursors to differentiate into Schwann cells, their differentiation capacity was examined in the conditions of the peripheral nervous system damage. For this purpose, GFP-positive oligodendrocyte precursors obtained from rat primary culture were transplanted into the sciatic nerve of adult wild type animals at 1, 3 and 6 days after the crushed injury. It was shown that oligodendrocyte precursors differentiate to the Schwann cells within the sciatic nerves where cells were transplanted at 24 hours after injury. In the sciatic nerves of other groups of animals the GFP producing cells were present, but they did not produce the myelin sheath. The observed direction of differentiation was correlated with different levels of gene expression in the injured nerve. In the 24 hours after sciatic nerve injury animal group we observed a high level of Bmp4 and low level of Sostdc1 expression, this pattern correlated with high level of expression of genes coding for transcription factors that regulate the maturation of

Schwann cells - Krox20 and Ascl2. This correlation may indicate their critical role in modulation of the differentiation of oligodendrocyte precursors on alternative pathway. To sum up, in this dissertation it was demonstrated that vascular niche significantly differs from the niche without blood vessels by distinct pattern of gene expression coding for the proteins that belong to the key signalling pathways and may be involved in alternative differentiation of oligodendrocyte precursor, such as BMP, Wnt, and Hedgehog. It was also shown that Ascl2, the Wnt signalling pathway effector protein, that potentially regulates Schwann cell differentiation is upregulated in the vascular niche of the injured CNS white matter. These results suggest that interactions between cells that respond to damage in nervous system and reside in different areas of tissue, regulate the differentiation of oligodendrocyte precursors by the modulation of signal transduction of proteins from BMP and Wnt pathways. Furthermore, the multipotentiality of the oligodendrocyte precursors was demonstrated by transplanting them to the damaged peripheral nervous system, where they differentiated to the Schwann cells.