Auksyny jako regulatory wzrostu i morfogenezy roślin

Auksyny jako regulatory wzrostu i morfogenezy roślin

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI http://www.pbkom.pl POSTĘPY BIOCHEMII http://www.postepybiochemii.pl Current Opinion in Plant Biology Trends in Plant Sciences

Teale et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 847 859 ( 2006)

Fazy ontogenezy roślin nasiennych: - faza rozwoju embrionalnego, która rozpoczyna się powstaniem zygoty, a kończy wykształceniem nasion, - faza kiełkowania i wykształcenie siewek (w tym faza juwenilna), - faza rozwoju wegetatywnego, tj. rozwoju organów wegetatywnych, - faza generatywna obejmująca okres zawiązywania się pąków kwiatowych, kwitnienie i owocowanie, - faza starzenia się i obumierania organów wegetatywnych.

Procesy wzrostu i rozwoju kontrolowane przez hormony Dominacja wierzchołkowa Fotosynteza Fototropizm, grawitropizm Kiełkowanie Obrona przed patogenami Pobieranie wody i soli mineralnych Reakcje na stresy Regeneracja organów Różnicowanie tkanek Ruchy aparatów szparkowych Ruchy organów Spoczynek nasion i pąków bocznych Starzenie Transport wody i asymilatów (cyrkulacja roztworów) Wytwarzanie kwiatów Wytwarzanie owoców (wytwarzanie organów) Wzrost pędu i korzenia Zrzucanie organów

Auksyny

Klasyczne i nowe fitohormony Auksyny Cytokininy Gibereliny Kw. abscysynowy Etylen Brasinosteroidy Salicylany Strigolaktony Jasmoniany

Auksyny - metabolizm - polarny transport - wzrost kwasowy - regulacja morfogenezy - percepcja i transdukcja sygnału

Najczęściej spotykane naturalne i sztuczne (w ramce) auksyny

Homeostaza (fito)hormonu H Koniugacja De-koniugacja H Synteza Stężenie aktywnego hormonu Degradacja Transport

Homeostaza IAA

J Exp Bot 63:2853 2872, 2012. Biosynteza IAA

J Exp Bot 63:2853 2872, 2012.

Trp-dependent pathways Szlaki biosyntezy auksyny IAA is produced from tryptophan (Trp) via several pathways, and one Trp-independent pathway IAOx pathway IAOx IAN Szlak IAOx może występować tylko u Arabidopsis i jego bliskich krewnych IAM IAM pathway Indole Trp IAA TAM IAAld TAM pathway IPA IPA pathway Trp-independent pathway Adapted from Rosquete M.R., Barbez, E. and Kleine-Vehn, J. (2011) Cellular auxin homeostasis: gatekeeping is housekeeping. Mol. Plant 5: 772 786. See also Mashiguchi, K.,et al. (2011) The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 18512 18517..

Większość auksyny syntetyzowana Szlak IPA spotykany jest u roślin powszechnie. Poziom aktywności obu enzymów regulowany jest na różne sposoby. jest w dwuetapowym szlaku IPA Tryptofan Kwas indolilo-3-pirogronowy (IPA) IAA Tryptophan amino acid transferase 1 (TAA1) Flavin monooxygenase (YUCCA) Encoded by 11 genes in Arabidopsis Rate-limiting step Jakość światła Zacienienie Temperatura Komórkowo specyficzna ekspresja Składniki odżywcze Cheng, Y., Dai, X. and Zhao, Y. (2007). Auxin synthesized by the YUCCA flavin monooxygenases is essential for embryogenesis and leaf formation in Arabidopsis. Plant Cell 19: 2430-2439. 2013 American Society of Plant Biologists

Szlak IPA i jego enzymy występują TRP u roślin powszechnie VANISHING TASSEL2 (VT2) IPA SPARSE INFLORESCENCE1 (SPI1) IAA wild type vt2 wild type spi1 VT2 i SPI1 są ortologami TAA1 i YUC u kukurydzy. Loss-offunction vt2 lub spi1 wykazuje podobny fenotyp, sugerując zaburzenia przebiegu tego samego szlaku. Gallavotti, A., Barazesh, S., Malcomber, S., Hall, D., Jackson, D., Schmidt, R. and McSteen, P (2008) sparse inflorescence1 encodes a monocot-specific YUCCA-like gene required for vegetative and reproductive development in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 15196 15201, Copyright (2008) National Academy of Sciences, USA.. Phillips, K.A., Skirpan, A.L., Liu, X., Christensen, A., Slewinski, T.L., Hudson, C., Barazesh, S., Cohen, J.D., Malcomber, S. and McSteen, P. (2011) vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. Plant Cell 23: 550 566.

Homeostaza auksyny regulowana jest również przez koniugację i degradację IAA Nadekspresja genów GH3 kodujących enzymy koniugujące auksyny zmniejsza poziom auksyny i powoduje rozwój fenotypów karłowatych. Rice GH3 genes are auxininduced (GH3 genes) Arabidopsis Wild-type GH3.13 overexpression Wild-type GH3.13 overexpression Zhang, S.-W., et al., (2009) Altered architecture and enhanced drought tolerance in rice via the down-regulation of indole-3-acetic acid by TLD1/OsGH3.13 activation. Plant Physiol. 151:1889-1901. Staswick, P.E., et al., (2005) Characterization of an Arabidopsis enzyme family that conjugates amino acids to indole-3-acetic acid. Plant Cell 17: 616-627. See also Ludwig-Müller, J. (2011) Auxin conjugates: their role for plant development and in the evolution of land plants. J. Exp. Bot. 62: 1757 1773. 2013 American Society of Plant Biologists

Tworzenie koniugatów IAA

IAA-Asparaginian 1-O-IAA-Glukoza Tworzenie koniugatów IAA

Tumory u pomidora - drobnoustroje modyfikują tkankę przez zaburzenie biosyntezy auksyn i cytokinin

Przykłady bakterii wytwarzających IAA i cytokininy

tzs (tmr) transferaza izopentylu tms1 - monooksygenaza tryptofanu tms2 hydrolaza indoliloacetamidu

Biosynteza IAA indukowana przez Agrobacterium Biosynteza cytokinin indukowana przez Agrobacterium

Auksyny - metabolizm - narzędzia w badaniach fitohormonów - polarny transport - wzrost kwasowy - w regulacji morfogenezy - percepcja i transdukcja sygnału

Narzędzia w badaniach auksyn Oznaczenia ilościowe z ekstraktów tkankowych i komórkowych Ekspresja genów reporterowych indukowanych przez auksyny Lokalizacja in situ przez specyficzne przeciwciała Orientacja białek transportujących auksyny 2013 American Society of Plant Biologists

Analiza poziomów auksyny w ekstraktach z roślin Chemical analysis by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) is an important way to quantify auxin. This experiment shows an auxin gradient from tip to base in young leaves but not mature leaves. Edlund, A., Eklof, S., Sundberg, B., Moritz, T., and Sandberg, G. (1995) A microscale technique for gas chromatography-mass spectrometry measurements of picogram amounts of indole-3-acetic acid in plant tissues.plant Physiol. 108: 1043-1047.

Pomiary komórkowo-specyficzne Dissociate cells and isolate protoplasts Recently the resolution of GC-MS measurements have been greatly refined. Separate into single-cells Laser Charged plates deflect cells into labeled and unlabeled pools. Start with roots expressing GFP in defined cell populations Petersson, S.V., Johansson, A.I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J.Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P.N., Sandberg, G., and Ljung, K.(2009) An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell 21:1659-1668.

Pomiary komórkowo-specyficzne The highest auxin concentration is in the quiescent center (QC) of the root apex. Auxin amount Using this method, a high resolution map has been produced of auxin concentration in the Arabidopsis root apex. QC Petersson, S.V., Johansson, A.I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J.Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P.N., Sandberg, G., and Ljung, K.(2009) An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell 21:1659-1668.

Monitorowanie zmian stężenia auksyny za pomocą genu reporterowego TGTCTC AuxRE GUS (or GFP) The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxinresponse level. Hours of staining DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs). Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA) Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971.

Ekspresja DR5 wskazuje na wysokie stężenie auksyny w wierzchołku korzenia i QC Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Blilou, I., et al. (2005) The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature 433: 39-44.

DII-VENUS is an auxin destabilized protein that responds quickly DII-VENUS Auxin DII-VENUS shows more rapid auxin responses than DR5 DII-VENUS DII-VENUS DR5 mrna DR5::VENUS 0 60 120 180 240 300 360 Time (min) +Auxin DR5::VENUS The two reporters show complementary patterns demonstrated here at the Arabidopsis shoot apex Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Brunoud, G., et al and Traas, J., Bennett, M.J. and Vernoux, T. (2012) A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatiotemporal resolution. Nature 482: 103 106. Vernoux, T., et al. and Traas, J. (2011) The auxin signaling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol Syst. Biol. 7: 508. 2013 American Society of Plant Biologists

Wykorzystanie przeciwciał anty-auksynowych Primary root Anti-IAA antibody Auxin accumulation during lateral root initiation Anti-IAA antibody DR5::GUS + auxin QC Negative control Reprinted from Benková, E. et al. (2003) Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell 115: 591-602, with permission from Elsevier.

Kierunek przepływu auksyny można wywnioskować z orientacji białek PIN A shoot apical meristem imaged over time, with the orientation of PIN proteins indicated by arrows. Auxin transport is facilitated by auxin efflux carriers including PIN proteins, which can have a polar distribution on the cell membrane. Analysis of the orientation of PIN proteins provides an approximate picture of intercellular auxin transport directions. Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899 1911, with permission from Elsevier. 2013 American Society of Plant Biologists

Auksyny - metabolizm - narzędzia w badaniach fitohormonów - polarny transport - wzrost kwasowy - w regulacji morfogenezy - percepcja i transdukcja sygnału

Polarny transport auksyn

Cechy polarnego transportu auksyn: - kierunek niezależny od położenia tkanki - odbywa się w określonych komórkach (pochwa okołowiązkowa) - jest specyficzny w stosunku do IAA i jego syntetycznych analogów - jest procesem wymagającym energii - brak tlenu oraz inhibitory oddychania, takie jak cyjanki i dwunitrofenol hamują ten transport - transport hamowany jest również przez kwas 2,3,5-trijodobenzoesowy (TIBA), kwas N-1-naftyloftalamowy (NPA) i quercetynę I COOH I COOH I TIBA OH CONH HO O OH NPA OH OH O Quercetyna

Rodzaje i kierunki transportu auksyn

Mutant PIN1 (pin formed 1) PIN1

Mechanizm polarnego transportu auksyn (hipoteza chemiosmotyczna)

ph pk log 10 _ [ A ] [ HA ] _ [A ] [ HA ] 10 (ph pk ) Równanie Hendersona-Hasselbalcha. gdzie: [A-] - stężenie zdysocjowanej formy słabego kwasu, np. IAA-, [HA] - stężenie niezdysocjowanej formy słabego kwasu, np. IAAH, pk - stała równowagi reakcji dysocjacji słabego kwasu.

Auksyny przemieszczają się dzięki różnego rodzaju białkowym przenośnikom ABCB ABCB Białka PIN przyczyniają się do ukierunkowanego wypływu auksyny z komórki. Nośniki AUX1/LAX przyczyniają się do ruchu IAAH do cytoplazmy. ABCB Cell-to-cell polar auxin transport Transportery ABCB przyczyniają się do transportu auksyn w sposób zróżnicowany. (Białka te dawniej określane były jako MDR lub PGP). Reprinted with permission from Macmillan Publishers, Ltd. Robert, H.S., and Friml, J. (2009) Auxin and other signals on the move in plants. Nat. Chem. Biol. 5: 325-332.

U roślin występuje kilka morfologicznie różnych białek PIN. Występują one w różnych tkankach i posiadają nieco inne właściwości.

Lokalizacja komórkowa PIN3 zmienia się wraz ze zmianą wektora pola grawitacyjnego Vertical Horizontal PIN3 is responsible for the lateral reorientation of auxin during shoot and root phototropism and gravitropism. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Friml, J., Wisniewska, J., Benkova, E., Mendgen, K., and Palme, K. (2002). Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis. Nature 415: 806-809. Adapted from Tanaka, H., Dhonukshe, P., Brewer, P. & Friml, J. (2006) Spatiotemporal asymmetric auxin distribution: a means to coordinate plant development. Cell. Mol. Life Sci. 63: 2738 2754.

E. Rola białka PIN3 w grawitropizmie korzenia

Wierzchołek wzrostu korzenia wybarwiony płynem Lugola

Rozkład białek PIN i transport auksyn w rozwijającym się zarodku

Rozmieszczenie białek PIN przyczynia się do realizacji wzorca rozwojowego z udziałem auksyn Amongst other things, they specify the location of auxin maxima necessary for embryonic patterning. Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: 2675-2688.

Zróżnicowana lokalizacja białek PIN PIN Křeček, P., Skůpa, P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN- FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249. 2013 American Society of Plant Biologists

Transport auksyny - podsumowanie Regulowany przepływ auksyny ma kluczowe znaczenie dla fototropizmu, grawitropizmu i organogenezy. Choć białka transportowe zostały zidentyfikowane, czynniki, które kontrolują ich pozycję i aktywność są ciągle badane. Arabidopsis has 6 AUX1/LAX proteins, 21 ABCB proteins, 8 PIN proteins and 7 PILS proteins - we don t yet understand all the complexity of auxin transport! 2013 American Society of Plant Biologists

Polarny transport IAA jest niezbędny dla właściwego przebiegu: tworzenia korzeni bocznych powstawania wiązek filotaksji powstawania osi embrionalnej tropizmów

Auksyny - metabolizm - polarny transport - wzrost kwasowy - w regulacji morfogenezy - percepcja i transdukcja sygnału

Receptory auksyn ABP1 (Auxin Binding Protein1) SKP2A (S-Phase Kinase associated Protein 2A) TIR1/AFB- Aux/IAA (Transport Inhibitor Response1/ Auxin signaling F-Box- Auxin/Indole-3-Acetic Acid) zmiany w cytoszkielecie oraz błonie komórkowej, bez zmiany ekspresji genów zmiany ekspresji genów przez degradację białek aktywacja lub hamowanie ekspresji genów poprzez degradację białek

ABP1 - białko wiążące auksynę

ABP1 u Arabidopsis ABP1 (Auxin Binding Protein 1) CBP1 (C-Terminal Peptide-Binding Protein1) TMK (transmembrane kinase) ROP (RHO-like GTPases of Plants) RIC4 (ROP-Interactive Crib motif-containing protein 4)

ABP1 promuje zależną od klatryny endocytozę PIN1 Low auxin Low flux High auxin High flux

Receptor SKP2A SKP2A (S-Phase Kinase associated Protein 2A) EF2C i DPB- represory transkrypcji