ENTEROCOCCUS SP. OPORNE NA WANKOMYCYNĘ

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 351-357 Sylwia Kożuszko, Tomasz Bogiel, Eugenia Gospodarek ENTEROCOCCUS SP. OPORNE NA WANKOMYCYNĘ Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Przeprowadzono analizę szczepów Enterococcus sp. opornych na wankomycynę izolowanych z materiału od chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 w Bydgoszczy w latach 2005-2009. Ogółem w tym okresie od 123 chorych wyosobniono 159 szczepów o fenotypie VRE, z czego 133 (83,6%) zidentyfikowano jako E. faecium, pozostałe należały do gatunku E. faecalis. W okresie objętym badaniem notowano wzrost częstości izolacji VRE. Gram-dodatnie paciorkowce z rodzaju Enterococcus stanowią mikroflorę fizjologiczną dolnego odcinka układu pokarmowego. W ciągu ostatnich dwóch dekad enterokoki stały się czynnikiem etiologicznym zakażeń szpitalnych o wzrastającej częstości występowania. W związku z narastającą opornością na antybiotyki, stanowią one wyzwanie terapeutyczne. Szczepy Enterococcus sp. mogą wywoływać poważne i zagrażające życiu zakażenia, takie jak: zakażenia krwi, wsierdzia, układu moczowego i ran. Dotyczą one głównie chorych leczonych na oddziałach intensywnej terapii (OIT), pacjentów z niedoborami odporności immunologicznej, poddawanych długotrwałej i szerokozakresowej antybiotykoterapii (1, 4, 6, 11, 12). Zakwalifikowanie wankomycynoopornych enterokoków (Vancomycin Resistant Enterococcus, VRE) do patogenów alarmowych wynika m.in. ze zdolności przekazywania przez Staphylococcus aureus genów van oraz trudności w zapobieganiu i kontroli rozprzestrzeniania się szczepów posiadających geny oporności na wankomycynę (18). Największe znaczenie kliniczne mają szczepy VRE o fenotypie VanA i VanB, notowane najczęściej wśród gatunków E. faecalis (85-90%) i E. faecium (10-15%) (1, 15). Glikopeptydy, do których należy wankomycyna, są zaliczane do antybiotyków ostatniej szansy w leczeniu ciężkich zakażeń wielolekoopornymi (Multi Drug Resistant, MDR) szczepami enterokoków. Fakt ten skłania do zwrócenia uwagi na ocenę lekowrażliwości i poszukiwanie alternatywnych antybiotyków umożliwiających leczenie zakażeń powodowanych przez szczepy VRE i MDR (8, 19). Celem pracy była retrospektywna ocena częstości izolacji oraz lekowrażliwości szczepów E. faecium i E. faecalis o fenotypie VRE wśród pacjentów Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dra A. Jurasza Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (SU CM UMK) w latach 2005-2009, z uwzględnieniem materiału klinicznego oraz oddziałów, w których leczeni byli pacjenci.

352 S. Kożuszko, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 4 MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły szczepy Enterococcus sp. izolowane od pacjentów leczonych w SU CM UMK. Identyfikację Enterococcus sp. przeprowadzano na podstawie morfologii kolonii na podłożu agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej (biomérieux) i Bile Esculine Azide Agar (Becton Dickinson) oraz wyników reakcji biochemicznych uzyskanych z wykorzystaniem testów ID 20 STREP lub Rapid ID 32 STREP (biomérieux). Wrażliwość na antybiotyki szczepów Enterococcus sp. oznaczono metodą krążkowo dyfuzyjną według Kirby Bauera i metodą przeglądową, zachowując wymagane warunki standaryzacji podane przez Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (2, 9). Używano zawiesiny bakteryjnej o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda i podłoża Mueller-Hinton Agar (biomérieux). Krążki z antybiotykami (Becton Dickinson) dobierano zgodnie z zaleceniami KORLD. Jako kontrolę stosowano szczepy: S. aureus ATCC 25923 oraz E. faecalis ATCC 29212. Płytki antybiogramowe inkubowano 16-18 godzin (24 godziny dla wankomycyny) w temperaturze 35ºC w atmosferze tlenowej. Wyniki interpretowano zgodnie z aktualnymi tabelami CLSI na podstawie pomiaru średnic (mm) stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z antybiotykami. Badaniem objęto szczepy Enterococcus sp. izolowane między 2005 rokiem a pierwszą połową 2009 roku, uznane zgodnie z wytycznymi CLSI za oporne na wankomycynę, którym oznaczono wartości najmniejszego stężenia hamującego (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) dla wankomycyny i teikoplaniny przy użyciu E testów (AB Biodisk). Za szczepy o fenotypie VanA uznawano te, których wartości MIC dla wankomycyny wynosiły 64-100 μg/ml, a dla teikoplaniny - 16-512 μg/ml. Wartości MIC szczepów o fenotypie VanB dla wankomycyny i teikoplaniny wynosiły odpowiednio: 4-1024 μg/ml i 0,5-1 μg/ml (9). Badaniem objęto szczepy wykluczając powtarzające się izolaty. Za powtórny uznawano kolejny izolat danego gatunku o takiej samej lekowrażliwości uzyskany od tego samego pacjenta. WYNIKI Ogółem w okresie objętym badaniem od 123 chorych wyosobniono 159 szczepów o fenotypie VRE, z czego 133 (83,6%) zidentyfikowano jako E. faecium, pozostałe należały do gatunku E. faecalis. Liczba izolacji szczepów VRE wzrastała: od dwóch w 2005 roku, 8 w 2006 roku, 30 w 2007 roku do 79 w 2008 roku. W pierwszym półroczu 2009 roku liczba ta wyniosła 40. Liczbę szczepów oraz chorych, od których izolowano szczepy VRE w tym okresie przedstawia rycina 1. Materiał kliniczny, z którego izolowano badane szczepy w latach 2007 2009 został zestawiony na rycinie 2, a ich pochodzenie na rycinie 3. Lekooporność szczepów VRE, z pominięciem pierwszego roku objętego badaniem ze względu na izolację tylko dwóch szczepów, przedstawiono w tabeli I. W okresie obejmującym rok 2007, 2008 i pierwsze półrocze 2009 roku gatunkiem dominującym wśród wyosobnionych szczepów VRE był E. faecium, a odsetek izolacji

Nr 4 Oporność enterokoków na wankomycynę 353 120 112 100 Liczba 80 60 40 20 0 4 2 1 10 8 8 * - badaniem objęto szczepy z pierwszego półrocza 2009 roku Ryc. 1. Izolacje szczepów Enterococcus sp. opornych na wankomycynę 60 30 23 2005 2006 2007 2008 2009* Lata 79 63 62 40 28 Liczba izolacji (n=248) Liczba szczepów (n=159) Liczba chorych (n=123) Odsetek izolacji 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 2007 (n=30) 2008 (n=79) 2009* (n=40) 0,0 KAO (n=84) OD (n=41) MO (n=9) INNE (n=15) Rodzaj materiału klinicznego KAO - kał, OD - wymaz z odbytu, MO - mocz, INNE płyn z otrzewnej, wymaz z gardła, jamy otrzewnej, owrzodzenia, pochwy, stomii * - badaniem objęto szczepy z pierwszego półrocza 2009 roku Ryc. 2. Materiał kliniczny, z którego izolowano badane szczepy Enterococcus sp. oporne na wankomycynę wynosił odpowiednio: 90,0%, 78,5% i 90,0%. Pozostałe szczepy VRE należały do gatunku E. faecalis. W 2005 roku izolowano od jednego pacjenta dwa, różniące się fenotypem oporności na wankomycynę szczepy E. faecium. Pacjent leczony był w OIT, a szczepy VanA i VanB izolowano z wymazu z rany i drenu. Izolaty były oporne na większość antybiotyków oprócz chloramfenikolu i tetracykliny (szczep wyosobniony z rany - VanA) oraz rifampicyny (szczep izolowany z drenu VanB).

354 S. Kożuszko, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 4 Odsetek izolacji 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 2007 2008 2009* CHID (n=66) PHOO (n=69) PAG (n=9) INNE (n=5) Lata CHID - Klinika Chirurgii Dziecięcej, PHOO - Klinika Pediatrii Hematologii i Onkologii, PAG Klinika Pediatrii Alergologii i Gastroenterologii, INNE Klinika Chirurgii Ogólnej i Naczyń, Klinika Transplantologii i Chirurgii Ogólnej, Klinika Rehabilitacji, Klinika Nefrologii, Wojewódzki Szpital Obserwacyjno-Zakaźny * - badaniem objęto szczepy z pierwszego półrocza 2009 roku Ryc. 3. Pochodzenie wankomycynoopornych szczepów Enterococcus sp. Tabela I. Lekooporność wankomycynoopornych szczepów Enterococcus sp. Antybiotyk 2006 2007 2008 2009* n % n % n % n % Penicylina NB NB 23 92,0 34 81,0 27 84,4 Ampicylina 8 100,0 26 92,9 39 79,6 28 87,5 Streptomycyna 5 62,5 13 52,0 12 30,8 8 25,8 Gentamicyna 8 100,0 22 88,0 29 74,4 23 74,2 Ciprofloksacyna** NB NB 2 100,0 5 71,4 1 100,0 Tetracyklina 3 37,5 2 8,0 11 22,4 9 28,1 Chloramfenikol 2 33,3 1 4,0 0 0,0 0 0,0 Rifampicyna 8 100,0 24 96,0 17 100,0 8 100,0 Teikoplanina 3 37,5 2 7,1 8 23,5 18 56,3 Chinupristyna/dalfopristyna 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 3,2 Linezolid 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 * - badaniem objęto szczepy z pierwszego półrocza 2009 roku ** - badano oporność u szczepów izolowanych z moczu n liczba szczepów opornych NB nie badano W 2006 roku zidentyfikowano 8 szczepów VRE od różnych pacjentów po dwa z Klinik: OIT, Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej, Chirurgii Ogólnej oraz Chirurgii Dziecięcej. Dwa spośród tych szczepów zidentyfikowano jako E. faecalis; pochodziły one od różnych pacjentów tej samej kliniki, tego samego materiału (stomii) i posiadały taki sam wzór lekowrażliwości. Spośród wyosobnionych 6 szczepów E. faecium, dwa wyosobniono z wymazów ran, a pozostałe z płynu z jamy opłucnej i płynu z jamy otrzewnej.

Nr 4 Oporność enterokoków na wankomycynę 355 DYSKUSJA W ostatnich latach notowana jest oporność enterokoków na glikopeptydy w różnych ośrodkach (5, 7, 14). Wyniki badań własnych wskazują na wzrost liczby izolacji VRE w latach 2005-2008, a liczba izolacji z pierwszego półrocza 2009 roku potwierdza tę tendencję. Według Młynarczyk i wsp. (10) wyniki badań za okres 5 lat prowadzone w klinice transplantologii wskazują na stopniowy wzrost liczby izolacji szczepów VRE. Od chorych z tej kliniki w okresie dwóch pierwszych lat nie notowano izolacji VRE, a w trzech kolejnych wzrosła do 6%. Z naszych obserwacji wynika, że gatunkiem dominującym wśród szczepów VRE izolowanych w latach 2005-2009 był E. faecium, a szczepy E. faecalis stanowiły 10,0 25,0% izolatów. Wyniki badań z Instytutu Transplantologii w Warszawie w latach 2001-2005 wskazują, że E. faecium był gatunkiem dominującym wśród szczepów VRE tylko w ostatnim roku badań (10). Nie jest to zgodne w większością wyników uzyskanych na świecie, gdzie szczepy VRE należą głównie do gatunku E. faecalis (1, 4, 12, 13, 19). Częstość izolacji szczepów o fenotypie VRE ma związek z liczbą wywoływanych przez nie zakażeń, także tych o ciężkim przebiegu. Potwierdzają to badania przeprowadzone w Wielkiej Brytanii obejmujące okres 9 lat, które wskazują na wzrost częstości przypadków bakteriemii wywoływanych przez szczepy VRE. W czasie tych badań oporność na wankomycynę w przypadku E. faecium notowano u 6,3% szczepów w 1993 roku, 20,0% w 1995 roku i 24,0% w 1998 roku a liczba szczepów VRE E. faecalis była poniżej 3,0% w latach 1990-1996, osiągając wartość 5,0% w 1998 roku (14). Szczepy VRE, poddane analizie w niniejszej pracy, wykazywały także oporność na teikoplaninę w 2009 roku odsetek tych szczepów wynosił 56,3% świadczącą o znaczącym udziale szczepów o fenotypie VanA. Badane izolaty wykazywały oporność na penicylinę, ampicylinę, rifampicynę, ciprofloksacynę i chloramfenikol. Odnotowano spadek odsetka szczepów opornych na streptomycynę i niższy odsetek opornych na gentamicynę w dwóch ostatnich latach badań. Jedynymi aktywnymi antybiotykami były linezolid i chinupristyna/dalfopristyna (oprócz jednego szczepu izolowanego w 2009 roku). Podobne tendencje lekowrażliwości występują u szczepów VRE izolowanych w innych ośrodkach (3, 6, 16, 17). Enterokoki, jako składnik mikroflory fizjologicznej dolnego odcinka układu pokarmowego, były izolowane głównie z kału lub wymazu z odbytu. W większości przypadków ich obecność potwierdza nosicielstwo szczepów VRE. Izolacje z moczu prawdopodobnie były wynikiem zakażenia endogennego. Jednak szczepy VRE jako bakterie oporne na glikopeptydy mogą stanowić także czynnik etiologiczny zakażeń krwi, tkanek miękkich, jamy brzusznej (1). Pochodzenia izolowanych szczepów VRE zależnie od kliniki, w których leczeni byli chorzy wskazuje na obecność czynników predysponujących do nosicielstwa i zakażeń szczepami VRE. Byli to przede wszystkim chorzy po zabiegach chirurgicznych, z chorobami nowotworowymi i leczeni hematologicznie.

356 S. Kożuszko, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 4 PODSUMOWANIE 1. Wśród szczepów Enterococcus sp. izolowanych w latach 2005-2009 stwierdzono znaczący wzrost liczby izolacji szczepów VRE. 2. Występowanie oporności enterokoków na wankomycynę wiązało się z opornością na inne antybiotyki: penicyliny, aminoglikozydy, ciprofloksacynę, chloramfenikol i rifampicynę. Linezolid oraz chinupristyna/dalfopristyna były jedynymi aktywnymi antybiotykami wobec badanych szczepów VRE. 3. Próbki materiału pochodzące od chorych leczonych w Klinice Chirurgii Dziecięcej oraz Klinice Pediatrii Hematologii i Onkologii stanowiły główne źródło izolatów VRE. S. Kożuszko, T. Bogiel, E. Gospodarek VANCOMYCIN-RESISTANT ENTEROCOCCUS SPP. STRAINS SUMMARY The aim of our study was to evaluate a frequency of isolation and susceptibility to antibiotics of vancomycin-resistant enterococci isolated between 2005 and the first half of the 2009 from patients of University Hospital of dr A. Jurasz Collegium Medicum of L. Rydygier in Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University in Toruń. Study shows increasing frequency of VRE isolation from two in 2005, 8 in 2006, 30 in 2007 to 79 in 2008 and 40 in the first half of 2009 year. Among all isolated VRE strains E. faecium definitely predominated (75,0-90,0% in 2006-2009). The majority of strains were obtained from patients of the Pediatrics, Hematology and Oncology Clinic (43,4%) and Pediatric Surgery Clinic (41,5%). VRE strains were mainly isolated from digestive tract (79,9%). The isolates demonstrated frequently resistance to penicillin, ampicillin, ciprofloxacin, rifampicin and chloramphenicol. Percentage of VRE strain resistant to aminoglycosides decreased during the last four years of study. Over 56% of VRE isolates showed resistance to teicoplanin. Linezolid and quinupristindalfopristin were the only drugs presenting activity against isolated VRE strains. PIŚMIENNICTWO 1. Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 686-707. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Perfomance standards for antimicrobial susceptibility testing. Eighteenth informational supplement (M100-S18). CLSI Wayne, Pa 2008. 3. Ergani-Ozcan A, Nass T, Baysan BO i inni. Nosocomial outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in a paediatric unit at Turkish university hospital. J Antimicrob Chemother 2008; 62: 1033-9. 4. Gossens H, Jabes D, Rossi R i inni. European survey of vancomycin-resistant enterococci in at-risk hospital wards and in vitro susceptibility testing of ramoplanin against these isolates. J Antimicrob Chemother 2003; 51 Supl. 3: iii5-12. 5. Kawalec M, Gniadkowski M, Hryniewicz W. Outbreak of vancomycin-resistant enterococci in a hospital in Gdańsk, Poland, due to horizontal transfer of different Tn1546-like transposon variants and clonal spread of several strains. J Clin Microbiol 2000; 38: 3317-22.

Nr 4 Oporność enterokoków na wankomycynę 357 6. Kawalec M, Gniadkowski M, Kędzierska J i inni. Selection of a teicoplanin-resistant Enterococcus faecium mutant during an outbreak caused by Vancomycin-resistant enterococci with the VanB phenotype. J Clin Microbiol 2001; 39: 4274-82. 7. Kawalec M, Gniadkowski M, Zaleska M i inni. Outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium of the phenotype VanB in a hospital in Warsaw, Poland: probable transmission of the resistance determinants into an endemic vancomycin-susceptible strain. J Clin Microbiol 2001; 39: 1781-7. 8. Kawalec M, Pietras Z, Daniłowicz E i inni. Clonal structure of Enterococcus faecalis isolated from polish hospitals: characterization of epidemic clones. J Clin Microbiol 2007; 45: 147-53. 9. Kuch A, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Oznaczanie wrażliwości Enterococcus spp. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Warszawa 2009. 10. Młynarczyk G, Grzybowska W, Młynarczyk A i inni. Occurrence of glycopeptide-resistant enterococci in transplant medicine internal wards in 2001-2005. Transplant Proc 2007; 39: 2886-9. 11. Mundy LM, Sam DF, Gilmore M. Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 513-22. 12. Murray BE. Vancomycin-resistant Enterococci. Am J Med 1997; 102: 284-93. 13. Patel R. Clinical impact of vancomycin-resistant enterococci.. J Antimicrob Chemother 2003; 51 Supl. 3: iii13-21. 14. Reacher MH, Shah A, Livermore DM i inni. Bacteraemia and antibiotic resistance of its pathogens reported in England and Wales between 1990 and 1998: trend analysis. B M J 2000; 320: 213-6. 15. Ruoff KL, de la Maza L, Murtagh MJ i inni. Species identities of enterococci isolated from clinical specimens. J Clin Microbiol 1990; 28: 435-7. 16. Schouten MA, Voss A, Hoogkamp-Korstanje JAA. Antimicrobial susceptibility patterns of enterococci causing infections in Europe. The European Study group. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 2542-6. 17. Stampone L, del Grosso M, Boccia D i Pantosti A. Clonal spread of a vancomycin-resistant Enterococcus faecium strain among bloodstream-infecting isolates in Italy. J Clin Microbiol 2005; 43: 1575-80. 18. Tenover FC, Weigel LM, Appelbaum PC i inni. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from a patient in Pennsylvania. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 275-80. 19. Werner G, Coque TM, Hammerum AM i inni. Emergence and spread of vancomycin resistance among enterococci in Europe. Euro Surveill 2008; 13: pii=19046. Otrzymano: 9 X 2009 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu