3R PROLOG ZASADY ZASTĄPIENIA, OGRANICZENIA I UDOSKONALENIA METODY ALTERNATYWNE Ból i cierpienie są złe, bez względu na rasę, płeć czy gatunek istoty, która cierpi. Peter Singer, Etyka praktyczna 1979 Monika Mikulska Pol LASA SGGW w Warszawie ARYSTOTELIZM Na sytuacji zwierząt na wiele wieków zaciążył pogląd Arystotelesa ARYSTOTELIZM hierarchia bytów: 1. Bóg najwyższa istota. 2. Aniołowie czyste inteligencje. 3. Człowiek byt z ducha i ciała. 4. Zwierzęta byty jedynie cielesne. 5. Rośliny materia żywa. BRAK DUSZY 6. Materia martwa kamienie, metale itp. Średniowiecze W kulturze zachodniej poglądy Arystotelesa okazały się zwycięskie - współgrały z chrześcijańską koncepcją hierarchii bytów. W chrześcijaństwie - koncepcja hierarchii bytów przejęta przez św. Tomasza z Akwinu od Arystotelesa. Tomasz z Akwinu, głosił, że złe traktowanie zwierząt jest złem, grzechem, powinniśmy kochać zwierzęta w imię miłości: miłości do Boga i bliźnich. 1
Rene Descartes (Kartezjusz -1596-1650) Powstanie ruchów antywiwisekcyjnych Traktował zwierzęta, i ogólnie ciało, jako "materialną maszynę - mechanicyzm. Sprowadził zwierzęta do roli automatów (automata), które nie czują bólu ani cierpienia, nie mają też świadomości - do tego bowiem potrzebna byłaby dusza, której nie mają (gdy zadaje im się ból jedynie automatycznie reagują na bodziec zewnętrzny). Poglądy Kartezjusza aż do XX wieku wywierały ogromny wpływ na traktowanie zwierząt przez ludzi. 1824 powstanie RSPCA - Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals Jest to najstarsza i największa organizacja chroniąca zwierzęta na świecie. W 1875 roku, został założony pierwszy ruch społeczny zajmujący się ochroną zwierząt doświadczalnych, z konkretnym celem wyeliminowania doświadczeń na zwierzętach: Victoria Street Society for the Protection of Animals Liable to Vivisection (później znany jako the National Anti-Vivisection Society). 1876 Parlament brytyjski: pierwsza na świecie ustawa regulująca zasady eksperymentów na zwierzętach: przeciwdziałanie okrucieństwu rejestracja laboratoriów udzielanie badaczom zezwoleń obowiązek prowadzenia rejestru badan XX w. triumf medycyny Pod koniec XIX i na początku XX wieku czasy gwałtownego rozwoju dla medycyny i rozwoju farmakologii: dzięki wielu skutecznym metodom diagnostyki, leczenia i zapobiegania chorobom oraz nowym, coraz skuteczniejszym i bezpieczniejszym lekom ludzie docenili słuszność eksperymentów na zwierzętach. Równocześnie, m. in. dzięki naciskom opinii publicznej i ruchom antywiwisekcyjnym, naukowcy starali się unikać cierpienia zwierząt w wyniku doświadczeń, choć nie we wszystkich krajach pojawił się taki trend. Zaczęto w eksperymentach wykorzystywać gryzonie, stworzono pierwsze hodowle zwierząt laboratoryjnych, na których teraz wykonywano doświadczenia jako na modelu innych zwierząt lub modelu człowieka. 2
XX wiek Etyczne traktowanie zwierząt 1975 Peter Singer: Wyzwolenie Zwierząt (Animal Liberation): - stała się ona swego rodzaju biblią obrońców praw zwierząt. Normy etyczne powinny odnosić się do wszystkich istot odczuwających cierpienie - nie ma dobrych powodów pozwalających ludziom na używanie zwierząt do zaspokajania swoich potrzeb. Tom Regan autor książek nt. filozofii praw zwierząt, które stały się jednym z głównych źródeł inspiracji ruchu wyzwolenia zwierząt. Twierdzi w nich, że zwierzęta niebędące ludźmi mają prawa moralne. Etyka dobrostanu zajmuje się działaniem człowieka w odniesieniu do zwierząt 1. Etyczne obowiązek moralny eksperymentatora. 2. Praktyczne ze względów naukowych zbędny ból, cierpienie i stres wpływają na wynik eksperymentu. 3. Prawne ustawa z dnia 15 stycznia 2015r. o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych naciski opinii publicznej (przeciwników doświadczeń na zwierzętach) wzrost świadomości naukowców co do potrzeby poprawy jakości badań i wiarygodności wyników doświadczeń wysokie koszty badań pogłębienie wiedzy z zakresu wymagań fizycznych i behawioralnych zwierząt ZASADA 3R została po raz pierwszy zdefiniowana przez Williama Russella i Rexa Burcha w 1959: 3
Metody alternatywne ZREDUKOWAĆ zmniejszenie liczby zwierząt w eksperymencie ZASTĄPIĆ zwierząt innym modelem badawczym ULEPSZYĆ udoskonalenie protokołu badawczego 3Z zredukowanie, zastąpienie, złagodzenie Badaniami alternatywnymi w odniesieniu do badań eksperymentalnych na zwierzętach określa się takie metody badawcze, które w równym stopniu, co osiągniecie zasadniczego celu eksperymentu, uwzględniają przestrzeganie zasad humanitarnego postepowania ze zwierzętami pojęcie metody alternatywne : metody spełniające wszystkie lub którakolwiek z zasad 3R zaproponowanych przez Russella i Burcha w 1959 USTAWA z dnia 15 stycznia 2015 r. o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych USTAWA z dnia 15 stycznia 2015 r. o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych Art. 5. 1. Wykonywanie procedur jest dopuszczalne tylko wtedy, gdy: 1) nie można zastosować metody badawczej zapewniającej osiągnięcie celów określonych w art. 3 bez wykorzystania zwierząt (zasada zastąpienia); 2) liczba wykorzystywanych w nich zwierząt została ograniczona do poziomu niezbędnego do osiągnięcia celów określonych w art. 3 (zasada ograniczenia); 3) wykorzystywane zwierzęta są utrzymywane w warunkach odpowiednich dla ich gatunku, a metody badawcze zastosowane w procedurach zostały wybrane tak, aby ograniczały do minimum albo eliminowały ból, cierpienie, dystres lub możliwość trwałego uszkodzenia organizmu tych zwierząt (zasada udoskonalenia). Art. 5. 2 2. Niedopuszczalne jest wykonanie procedury jeżeli wiąże się ona z dotkliwym bólem, cierpieniem lub dystresem, który może mieć długotrwały charakter i nie można go załagodzić. 3. Niedopuszczalne jest wykonanie procedury w celu otrzymania danych, które zostały uzyskane w innych niż Rzeczpospolita Polska państwach członkowskich Unii Europejskiej w wyniku wykonania procedur uznawanych przez prawodawstwo Unii Europejskiej, w szczególności w zakresie pasz, produktów biobójczych, produktów leczniczych, substancji chemicznych, środków ochrony roślin, wyrobów medycznych lub żywności, chyba że potwierdzenie tych danych jest niezbędne, aby wykorzystać je do badań mających na celu ochronę zdrowia publicznego, bezpieczeństwa lub środowiska naturalnego. 4
Redukcja Redukcja liczby zwierząt: ograniczenie liczby zwierząt całkowite ich wyeliminowanie (jednocześnie replacement) Opracowanie statystyczne minimalnych grup w zależności od rodzaju doświadczenia Używanie nowoczesnych i sprawdzonych metod badawczych; badania pilotażowe Dzielenie się wiedzą i zasobami - unikanie powtórzeń (legislacja!) Liczba gatunków w badaniu i dobór właściwego stada/szczepu/płci, wieku etc Hodowla zwierząt laboratoryjnych pod konkretne zamówienia Praca ze sprawdzonym i dobrze przeszkolonym personelem/obsługą w zwierzętarni minimalizacja strat Redukcja liczby zwierząt w badaniach toksyczności: Dawniej: Badanie toksyczności ostrej polegało na wyznaczeniu medialnej dawki śmiertelnej (DL50) dla danej substancji: statystycznie obliczonej pojedynczej dawki substancji, co do której oczekuje się, że spowoduje śmierć 50% zwierząt. Badanie toksyczności ostrej droga doustną (kryterium smierć): Metoda klasyczna Lichtfielda i Wilcoxona, 1949 6 grup po 10 zwierząt plus kontrola zabicie ~30 osobników; OECD 401: Modyfikowana metoda klasyczna, 1987, wycofana w 2001 r. 4 grupy po 6 zwierząt plus kontrola zabicie ~12 osobników; Obecnie: Test Nr 420 - nie wymaga zabicia zwierzęcia Testy nr 423 i 425 3 zwierzęta zabite Zastąpienie Zastąpienie Zastąpienie całkowite lub częściowe! 1. bazy danych i analiza danych archiwalnych oraz symulacje komputerowe in silico 2. badanie zależności struktura aktywność 3. modelowanie toksokinetyczne 4. metody in vitro i ex vivo 5. organ on chips 6. druk 3D, fantomy 7. eksperymenty na bezkręgowcach/na kręgowcach we wczesnej fazie rozwoju 8. eksperymenty na ludziach/tkankach 9. BAZA PRÓBEK http://www.bazaprobek.pl/ wybór zwierzęcia o słabiej wyrażonej wrażliwości, świadomości i inteligencji Modele wykorzystujące błony kosmówkowo-omoczniowe zarodka kurzego (działanie drażniące na oko) Drosophila ( choroba Alzhaimera) Dictyostelium (padaczka, zaburzenia dwubiegunowe) Caenorhabditis elegans (neurodegeneracja) test Ames a bakteryjny ( mutageneza) ekotoksyczność eksperymenty na ludziach/ ludzkich tkankach - nieinwazyjne obrazowanie -testy wydolnościowe -badania żywieniowe -terapia bólu -ADME, badania kinetyczne bardzo niskie dawki leków -dawstwo tkanek i narządów fantomy i symulatory medyczne zastąpienie w dydaktyce 5
Zastąpienie zastąpienie całkowite lub częściowe: cały projekt badawczy jeden etap projektu pojedyncze doświadczenie pojedyncze czynności Zastąpienie Dotychczas opracowano następujące metody alternatywne całkowicie zastępujące (3R: replacement) wykorzystanie zwierząt: - właściwości żrące i drażniące skórę, - przenikanie przez skórę, - fototoksyczność, - mutagenność. Opracowano także kilka metod alternatywnych częściowo zastępujących wykorzystanie zwierząt (3R: reduction, refinement): - toksyczność ostra drogą pokarmową, - właściwości uczulające skórę. Natomiast dla kilku bardzo istotnych właściwości toksykologicznych nie zostały dotychczas opracowane metody alternatywne. Są to: - toksyczność dawki powtarzanej (czyli długotrwałe działanie toksyczne na organizm), w tym rakotwórczość i szkodliwy wpływ na rozrodczość, - toksykokinetyka (zachowanie substancji w organizmie). 11 marca 2013 6
Metoda alternatywna musi być wiarygodna! ECVAM Główny problem metod alternatywnych: ekstrapolacja danych!!! musi być ustalona relacja miedzy istniejącymi, sprawdzonymi metodami a nową metodą W przypadku badan in vitro: Ekstrapolacja in vitro in vivo Metody alternatywne musza być walidowane i prawnie usankcjonowane proces, w przebiegu którego ustala się istotność i pewność metody dla poszczególnych wyznaczonych celów Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM) - 1992 24 procedury naukowo zwalidowane 14 procedur zaakceptowanych prawnie https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu doskonalenie postepowania w celu zmniejszenia stresu i bólu odczuwanego przez zwierzęta: doskonalenie planowania i przeprowadzania badań doskonalenie metod hodowli i utrzymania zwierząt doświadczalnych. ma bezpośredni wpływ na pozostałe R - podnoszenie kwalifikacji (szkolenia!), doskonalenie umiejętności, eliminowanie błędów; - redukcja stresu - sztuka obserwacji! warunki życia i ochrona zdrowia zwierząt doświadczalnych; minimalizacja stresu otoczenie, zagęszczenie, stres manipulacyjny, - relacje eksperymentator zwierzęta; handling; wyszkolenie do współpracy z eksperymentatorem i obsługą; empatia dla zwierząt; - relacje eksperymentator hodowca - opiekunowie zwierząt; - stosowanie odpowiednich środków eliminujących ból i stres: ocena prawdopodobnego bólu związanego z badaniem i długości jego trwania; długość eksperymentu w stosunku do długości życia zwierzęcia; przygotowanie odpowiednich instrumentów i narzędzi medycznych do operacji chirurgicznych, dobór odpowiednich anestetyków, przyzwyczajanie zwierząt do technik eksperymentalnych, stosowanie humanitarnych punktów końcowych; - warunki doświadczenia tylko zgodne z referencjami dla danego gatunku, np. wielkości/objętości pobieranych tkanek, podawanych substancji. 7
Dobrostan zwierząt (ang. animal welfare) stan zdrowia fizycznego i psychicznego osiągany w warunkach pełnej harmonii ustroju w jego środowisku. Ogólnie odnosi się do jakości życia z perspektywy pojedynczego zwierzęcia. ZDROWIE PSYCHICZNE Dobrostan: warunki życia zwierząt hodowlanych i doświadczalnych: zgodne z wymogami, wzbogacenia środowiska. grupowanie zwierząt: stabilne, zgodne grupy klatki: wielkość, wysokość, wyposażenie, podłoże warunki środowiska (światło, wilgotność, temperatura) minimalizacja bodźców (hałas) z otoczenia Handling od najwcześniejszego okresu życia Prawidłowe warunki i organizacja transportu ZDROWIE FIZYCZNE NATURALNE (???) WARUNKI ŻYCIA UDOSKONALENIE METODY przykłady Telemetria - także prowadzi do redukcji ilości używanych zwierząt oraz redukcji bólu i cierpienia Bioluminescencja - technika obrazowania opracowana w Stanford University. Opiera się na genetycznym zmodyfikowaniu badanych komórek - wprowadza się do nich gen kodujący lucyferazę, dzięki któremu one i ich potomstwo świecą. Tak zmienione komórki (np.nowotworowe) wprowadza się do organizmu, a specjalistyczna aparatura rejestrująca fotony pozwala śledzić proces ich namnażania się pod wpływem różnych środków chemicznych lub farmaceutyków i to na długo, zanim rozwinie się wyczuwalny guz. Taka procedura eliminuje ból i cierpienie i można ją wykorzystywać do badania początkowych stadiów wielu różnych chorób. 8
Skale mimki - właściwie przeprowadzona adopcja; - prawidłowo zaplanowane uśmiercanie i stosowanie protokołu wcześniejszego humanitarnego zakończenia procedury. Humane Endpoint - protokół - precyzyjnie opracowany zespół objawów/markerów - możliwość szybkiej konsultacji z lekarzem weterynarii Źródło: https://www.nc3rs.org.uk/grimacescales Gdzie szukać informacji: KONFLIKT POMIĘDZY REDUKCĄ I UDOSKONALENIEM W niektórych projektach może dojść do konfliktu pomiędzy tymi zasadami, tj. w sytuacji kiedy możemy zredukować liczbę zwierząt w doświadczeniu kosztem zwiększenia szkody wyrządzonej innym zwierzętom. Taka sytuacja powinna być rozważana bardzo ostrożnie. Ogólnie rzecz biorąc, zmniejszenie cierpienia poszczególnych zwierząt uważa się za ważniejsze niż zmniejszenie ogólnej liczby zwierząt w doświadczeniu. http://www.mousebehavior.org http://www.nc3rs.org.uk/our-resources/housing-and-husbandry/rodents http://www.nc3rs.org.uk/grimacescales http://www.procedureswithcare.org.uk http://www.ahwla.org.uk/site/tutorials/bva/bva02-introduction.html http://3rs.ccac.ca/en/ 9
KOMPROMIS Podsumowanie 1. Prowadzenie badań najwyższej jakości w tym doskonalenie modeli i narzędzi 2. Zapewnienie solidności i powtarzalności wyników doświadczeń 3. Poprawa projektowania doświadczeń z użyciem zwierząt: sondaże wykazują, że dzięki wprowadzeniu zasady 3R do praktyki badawczej rośnie poparcie społeczne dla badań z wykorzystaniem zwierząt Cel ostateczny: zaniechanie doświadczeń W sytuacji gdy przeprowadzenie badań na zwierzętach okazuje się być niezbędne i niemożliwe do zastąpienia, prawodawstwo i odpowiedzialność moralna nakłada na eksperymentatora wymogi, zgodnie z którymi należy zmniejszyć do minimum niepokój, stres i cierpienie doświadczane przez zwierzęta oraz działać z troską o ich dobrostan. Podsumowanie Wdrażanie zasady 3R jest szeroko akceptowane jako pragmatyczne podejście do problemów etyki i dobrostanu zwierząt laboratoryjnych oraz wartości badań prowadzonych na zwierzętach. 10