QUANTA Lite SLA 708775 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

QUANTA Lite SLA 708775 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM SLA (rozpuszczalny antygen wątrobowy) jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko SLA klasy IgG w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał przeciwko SLA można wykorzystać wraz z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy stanów charakteryzujących się podwyższonym poziomem przeciwciał przeciwko SLA, włączając w to autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH). Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) jest przewlekłą, heterogeniczną postępującą chorobą zapalną wątroby o nieznanej etiologii. 1-6 Diagnoza jest często trudna ponieważ nie istnieje jeden test diagnostyczny przeznaczony do wykrywania AIH, a występujące u pacjentów objawy mogą być bardzo różnorodne. 1-6 Diagnoza obejmuje ocenę wyników badań klinicznych, laboratoryjnych i histologicznych jak również wykluczenie innych przyczyn przewlekłego zapalenia wątroby. 1-6 Diagnoza jest szczególnie trudna u pacjentów z kryptogennym zapaleniem wątroby, czyli takich, u których występuje niezdefiniowane przewlekłe zapalenie wątroby bez przeciwciał przeciwko markerom wirusowym lub konwencjonalnym markerom autoimmunologicznym. 1-2 Aby zapobiec ciężkiemu uszkodzeniu wątroby niezbędna jest wczesna diagnoza AIH i zastosowanie terapii immunosupresyjnej. Niestety brak pewności diagnostycznej w ustalaniu diagnozy spowodować może opóźnienie leczenia i dalszy rozwój choroby. 7-8 Wszystkich pacjentów z AIH można ogólnie podzielić na dwie kategorie, zależnie od tego, czy występują u nich autoprzeciwciała czy nie. 1-6,9,10 AIH typu 1 (nazywane również klasycznym zapaleniem wątroby, przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby, plazmatycznokomórkowym zapaleniem wątroby lub autoimmunologicznym przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby) jest powszechniejszym typem AIH. AIH- 1 charakteryzuje się występowaniem przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim ASMA (skierowanych zarówno przeciwko komponentom aktynowym jak i nieaktynowym) oraz cytoplazmatycznych i okołojądrowych przeciwciał przeciwneutrofilowych. 1,4,6 AIH typu 2 charakteryzuje się obecnością przeciwciał przeciwko mikrosomom wątrobowym/nerkowym (LKM-1) skierowanych głównie przeciwko cytochromowi P4502D6 i antygenowi cytosolowemu wątroby (LC-1). 4,6,11 W pacjentów z AIH-1 nie wykrywa się przeciwciał przeciwko LKM-1 i LC-1. W roku 1987 zidentyfikowano przeciwciała przeciwko cytosolowemu rozpuszczalnemu antygenowi wątrobowemu (SLA) u 23 pacjentów z chronicznym zapaleniem wątroby, u których nie wykrywano przeciwciał przeciwko HbsAg, ANA i LKM-1. 12 U niektórych pacjentów z AIH wykryto również przeciwciała skierowane przeciwko innemu rozpuszczalnemu cytosolowemu białku wątrobowemu, nazywanemu antygenem wątrobowo-trzustkowym (LP). 12 Obecnie wiadomo, że przeciwciała przeciwko SLA i LP rozpoznają ten sam antygen. 13 SLA to białko o masie około 50 kda z 99% homologią względem związanego z trna białka supresorowego UGA, które może brać udział w metabolizmie selenocysteiny. 14-15 Chociaż podejrzewano, że głównym celem aktywności przeciwciał przeciwko SLA jest cytokeratyna 8, cytokeratyna 18 i S-transferaza glutationowa to późniejsze badania tego nie potwierdziły 14,16-19. Chociaż jedynie u około 12-30% pacjentów z AIH występują przeciwciała przeciwko SLA, to ich obecność jest prawie w 100% swoista dla AIH. 8,10,14,19-20 Ocenia się, że u 70-80% pacjentów z AIH występują przeciwciała przeciwko ANA i/lub ASMA, a u niewielkiego odsetka z nich występują przeciwciała przeciwko LKM-1. U około 10-30% pacjentów z klinicznymi objawami AIH nie występuje istotne miano przeciwciał przeciwko któremukolwiek z tych markerów. 1,2,7,12 W chwili obecnej jedynym wskaźnikiem AIH u tych pacjentów jest ich odpowiedź na leczenie przeciwzapalne. 1,2 Przeciwciała przeciwko SLA wykryto u 14-20% pacjentów z kryptogennym zapaleniem wątroby. 13,19,20 Z tego też względu test na obecność SLA może wspomóc ustalenie diagnozy AIH i przyczynić się do spowolnienia postępu choroby spowodowanego opóźnionym leczeniem. Niezbędne jest dokładne rozpoznanie AIH gdyż sposób leczenia AIH i wirusowego zapalenia wątroby bardzo się różni. Leczenie immunosupresyjne stosowane w terapii AIH może być szkodliwe w przypadku infekcji wirusowej a leczenie interferonem może spowodować pogorszenie AIH. 21 Rozważano wyróżnienie trzeciego typu AIH, głównie w oparciu o występowanie przeciwciał przeciwko SLA, lecz prawdopodobnie nie jest to konieczne 4,6,9,19 Wydaje się, że istnieje podobieństwo między pacjentami wykazującymi obecność przeciwciał przeciwko SLA a pacjentami z AIH-1 nie wykazującymi takich przeciwciał, w odniesieniu do większości objawów klinicznych, histologicznych i laboratoryjnych. 9,10,19 Jednakże u pacjentów z przeciwciałami przeciwko SLA istnieje związek z HLA DR3 i może występować u nich skłonność do nawrotu choroby po odstawieniu kortykosteroidów. 22 Różne formy AIH, w których pacjenci wykazują objawy charakterystyczne dla AIH i pierwotnej żółciowej marskości wątroby (PBC) lub głównego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych (PSC) nazywane są często zespołami nakładania. Zespoły te, wraz z autoimmunologicznym zapaleniem dróg żółciowych (AIC), który to termin zaproponowano dla opisania stanu o objawach przypominających PBC, lecz bez przeciwciał przeciwko mitochondriom (AMA) 1-3,5 mogą stanowić problem diagnostyczny i leczniczy. 1

Zasada badania Częściowo oczyszczony zrekombinowany ludzki antygen SLA pełnej długości wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego natywnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając obecnym przeciwciałom przeciwko SLA związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta częściowo oczyszczonym rekombinowanym antygenem SLA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu SLA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu SLA ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu SLA ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny. 23 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 2

4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu SLA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3

3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności SLA z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200 300 µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2. 5. Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu SLA ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu SLA ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu SLA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. 24 4

Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna Wartość próbki = kontrola testu SLA ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbki uznaje się za dające wynik negatywny (negatywny pod względem przeciwciała IgG przeciwko SLA), niejednoznaczny lub pozytywny (wykryte zostaje przeciwciało IgG przeciwko SLA ) w oparciu o poniższą tabelę. Negatywny Niejednoznaczna Pozytywna 0,0-20,0 jednostek 20,1-24,9 jednostki 25 jednostek Przed przedstawieniem wyników niejednoznaczne próbki powinny zostać przebadane ponownie. 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko SLA i sugeruje możliwość wystąpienia autoimmunologicznego zapalenia wątroby. 2. Próbka z niejednoznacznym poziomem przeciwciał przeciwko IgG SLA nie może być oznaczona pod kątem statusu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 3. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko SLA, lub że ich poziom jest poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 4. W przypadku próbek o gęstości optycznej przewyższającej zakres odczytu czytnika płytek, można je zaraportować jako takie, których najwyższą mierzalną wartość gęstości optycznej dzieli się przez gęstość optyczną kontroli słabo pozytywnej i mnoży przez 25, lub można je rozcieńczyć, przebadać ponownie i wyliczyć pożądaną wartość. Przybliżony zakres liniowy tego badania mieści się w zakresie od 9 do 125 jednostek. 5. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały stwierdzenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu testu INOVA QUANTA Lite SLA ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko SLA uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Niewykrycie przeciwciał przeciwko SLA nie wyklucza autoimmunologicznego zapalenia wątroby. 2. Negatywny wynik na obecność przeciwciał przeciwko SLA nie wyklucza obecności przeciwciał przeciwko SLA, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 3. Wynik pozytywny świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko ludzkiemu zrekombinowanemu SLA i nie koniecznie może wskazywać na autoimmunologiczne zapalenie wątroby. 4. Zdiagnozowanie autoimmunologicznego zapalenia wątroby wymaga zebrania dokumentacji dotyczącej danych demograficznych pacjenta, manifestacji klinicznej oraz innych badań diagnostycznych. 5. Dane literaturowe sugerują, że przeciwciała przeciwko SLA nie są charakterystyczne dla AIH-2. 10 Chociaż trzy próbki dla AIH-2 przedstawione w części pt. Specyficzna charakterystyka wyników poniżej dały wynik negatywny, to liczba ta nie jest dostatecznie duża, aby korzystając z tego testu potwierdzić brak przeciwciał przeciwko SLA w próbkach od pacjentów z AIH-2. 6. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 5

Spodziewane wartości Według szacunków przeciętna roczna zapadalność na AIH wynosi 1,9 przypadków/100,000 w populacji kaukaskiej w Europy Zachodniej i Ameryce Północnej i 0,08-0,015 przypadków/100,000 w Japonii. 25,27 Częstość występowania w populacji norweskiej oszacowano na 16,9/100,000. 26 Choroba ta występuje najczęściej u kobiet, przy czym stosunek chorych kobiet do mężczyzn wynosi 4:1. Szczyt zachorowań na tę chorobę pojawia się w wieku 15-30 lat, chociaż choroba ta pojawia się w każdym wieku. 1-5 Normalny zakres Grupę 131 bezobjawowych osób zdrowych zbadano za pomocą testu QUANTA Lite SLA ELISA na obecność przeciwciał przeciwko SLA. Grupa ta obejmowała 91 mężczyzn i 40 kobiet. Nie wykryto różnic w średnich wartościach uzyskanych dla kobiet i mężczyzn. Zakres wiekowy wynosił od 5 do 69 lat (mediana=33). Swoistość badania dla badanej grupy wyniosła 100% (131/131). Wartość średnia dla tej populacji wynosiła 2,0 jednostki, a największa wartość wynosiła 5,8 jednostki. Specyficzna charakterystyka wyników Pacjenci z AIH i chorobą wątroby Próbki od pacjentów z AIH i innymi chorobami wątroby badano na miejscu (ślepa próba) i w laboratoriach zewnętrznych, posługując się testem QUANTA Lite SLA ELISA. Wiek pacjentów mieścił się w zakresie od 13 do 82 lat a stosunek mężczyzn do kobiet wynosił około 3,5. Wyniki uzyskane dla różnych grup połączono i podsumowano poniżej. Grupa kliniczna: n= SLA+ % SLA+ AIH-1 289 34 11,8 zachodzenie AIH-1/PBC (Primary Biliary Cirrhosis, pierwotna żółciowa marskość wątroby) 20 11 55 AIH-2 3 0 0 Kryptogenne zapalenie wątroby 9 4 44,4 Autoimmunologiczne zapalenie dróg żółciowych 8 1 12,5 AIH-1/PSC 4 1 25 Polekowe autoimmunologiczne zapalenie wątroby 2 0 0 Pierwotna żółciowa marskość wątroby 15 0 0 Pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych (PSC) 7 0 0 PBC/PSC 19 0 0 Inne niewirusowe choroby wątroby 10 0 0 Wirusowe zapalenie wątroby typu B (B, C lub D) 8 0 0 Wirusowe zapalenie wątroby typu C 37 0 0 Wirusowe zapalenie wątroby typu C/D 1 0 0 Czułość testu wyłącznie dla AIH-1 34/289 = 11,8% Czułość testu dla wariantów AIH-1 i AIH-1 (zachodzenie): 51/330 = 15,4% Swoistość (choroba wątroby inna niż AIH): 73/73 = 100% Swoistość (dla grupy osób zdrowych i cierpiących na chorobę wątroby inną niż AIH): 204/204 = 100% Badanie reaktywności krzyżowej Surowice pochodzące od 70 pacjentów z różnymi przeciwciałami charakterystycznymi dla chorób autoimmunologicznych lub zapalnych badano na reaktywność krzyżową z zastosowaniem testu QUANTA Lite TM SLA ELISA. Przebadano 10 próbek z przeciwciałami przeciwko ludzkiemu wirusowi opryszczki 6, 6 - z przeciwciałami przeciwko riketsji, 10 - z przeciwciałami przeciwko wirusowi cytomegalii, 3 - z przeciwciałami przeciwko błonie podstawowej kłębuszków nerkowych, 3 - z przeciwciałami przeciwjądrowymi, 3 - z przeciwciałami tocznia rumieniowatego układowego, 3 - z przeciwciałami przeciwko mitochondriom, 3 - z przeciwciałami przeciwko komórkom ściennym żołądka, 3 - z przeciwciałami przeciwko LKM-1, 26 - z przeciwciałami przeciwko cytokeratynie 8 lub 18. Żadna z próbek nie dała pozytywnego wyniku na obecność przeciwciał przeciwko SLA. 6

Precyzja i powtarzalność Wewnątrztestową wydajność testu QUANTA Lite SLA ELISA oceniono przeprowadzając siedmiokrotnie badanie 6 próbek. Poniżej zostały przedstawione wyniki. Wyniki w ramach badania dla testu QUANTA Lite TM SLA ELISA Próbka A Próbka B Próbka C Próbka D Próbka E Próbka F Jednostki średnie 72,6 46,2 27,6 13,5 9,7 2,0 SD 1,4 1,9 1,4 0,4 0,2 0,1 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 7,2 Zmienność pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając dwukrotnie badanie panelu 5 próbek i kontroli z zestawu 2 razy dziennie przez 3 dni. Podsumowanie tych wyników przedstawiono poniżej. Wyniki pomiędzy badaniami dla testu QUANTA Lite TM SLA ELISA Próbka A Próbka B Próbka C Próbka D Próbka E Jednostki średnie 78,5 48,5 29,0 13,6 9,5 SD 1,8 1,1 0,9 0,5 0,4 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 Piśmiennictwo 1. Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1996;334(14):897-903. 2. Krawitt EL. Can you recognize autoimmune hepatitis? Postgrad Med. 1998;104(2):145-149, 152. 3. Alvarez F, Berg PA, Bianchi FB, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(5):929-938. 4. Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;32(1 Suppl):181-197. 5. Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges. Gastroenterology. 2001;120(6):1502-1517. 6. Czaja AJ, Homburger HA. Autoantibodies in liver disease. Gastroenterology. 2001;120(1):239-249. 7. Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1995 Oct 12;333(15):1004-1005. 8. Kanzler S, Weidemann C, Gerken G, Lohr HF, Galle PR, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Clinical significance of autoantibodies to soluble liver antigen in autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(4):635-640. 9. McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut. 1998;42:599-602. 10. Ballot E, Homberg JC, Johanet C. Antibodies to soluble liver antigen: an additional marker in type 1 auto-immune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):208-215. 11. Lapierre P, Hajoui O, Homberg JC, Alvarez F. Formiminotransferase cyclodeaminase is an organspecific autoantigen recognized by sera of patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1999 Mar;116(3):643-649. 12. Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Buschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet. 1987;1:292-294. 13. Stechemesser E, Klein R, Berg PA. Characterization and clinical relevance of liver-pancreas antibodies in autoimmune hepatitis. Hepatology. 1993;18(1):1-9. 14. Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet. 2000 29;355(9214):1510-1515. 15. Costa M, Rodriguez-Sanchez JL, Czaja AJ, Gelpi C. Isolation and characterization of cdna encoding the antigenic protein of the human trnp(ser)sec complex recognized by autoantibodies from patients with type-1 autoimmune hepatitis. Clin Exp Immunol. 2000;121(2):364-374. 16. Wachter B, Kyriatsoulis A, Lohse AW, Gerken G, Meyer zum Buschenfelde KH, Manns MP. Characterization of liver cytokeratin as a major target antigen of anti-sla antibodies. J Hepatol. 1990;11(2):232-239. 17. Wesierska-Gadek J, Grimm R, Hitchman E, Penner E. Members of the glutathione S-transferase gene family are antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998 Feb;114(2):329-335. 18. Klein R, Berg PA. Glutathione S-transferase as a major autoantigen in anti-sla-positive autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998;116(4):1015-1016. 19. Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen: specific marker of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):326-328. 20. Czaja AJ, Carpenter HA, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology. 1993;105(5):1522-1528. 21. Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H, Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P4502D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alphainterferon treatment. J. Hepatol. 1999;30(3):366-375. 22. Czaja AJ, Donaldson PT, Lohse AW. Antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas and HLA risk factors for type 1 autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97:413-419. 23. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 7

24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1991. Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol.11(6). 25. Nishioka M, Morshed SA, Parveen S, Kono K, Matsuoka H, Manns MP. Antibodies to P450IID6, SLA, PDH-E2 and BCKD-E2 in Japanese patients with chronic hepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 1997;12(12):862-868. 26. Boberg KM, Aadland E, Jahnsen J, Raknerud N, Stiris M, Bell H. Incidence and prevalence of primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and autoimmune hepatitis in a Norwegian population. Scand J Gastroenterol. 1998;33(1):99-103. 27. Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of selected autoimmune diseases in the United States. Clin Immunol Immunopathol. 1997; 84(3):223-243. QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628775POL Sierpień 2011 Wersja 0 8