TLC1 IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą jest ciecz, zaś faza nieruchoma umieszczona jest na płaszczyźnie, to mówimy o chromatografii cienkowarstwowej. Identyfikacja substancji sprowadza się do porównania wartości współczynników opóźnienia R F wzorca i próbki badanej. W tym celu wykonuje się chromatogram dla roztworów wzorcowych rozdzielanych substancji o stężeniach zbliżonych do zakładanego w próbce badanej. Wartość R F plamek substancji otrzymanych z roztworu badanego powinna odpowiadać R F plamek otrzymanych z odpowiednich roztworów wzorcowych. Składniki analizowanej w ćwiczeniu próbki nie są barwne, należy więc przeprowadzić ich wizualizację. Chromatogram wywołuje się spryskując go w pierwszej kolejności roztworem AgNO 3, a następnie roztworem K 2CrO 4. Ćwiczenie ma na celu zapoznanie studenta z metodą chromatografii cienkowarstwowej (z ang. Thin Layer Chromatography - TLC) oraz rozdzielenie mieszaniny halogenków i ich identyfikację. Odczynniki roztwór amoniaku (1+3), aceton do HPLC, n-butanol do HPLC, roztwory wrozcowe KCl, KBr i KI o stężeniu 0.1 mol/l, roztwory AgNO 3 i K 2CrO 4 o stężeniu 0.1 mol/l, badana mieszanina halogenków. Aparatura i sprzęt laboratoryjny zlewka pojemności 25 ml pipeta o pojemniści 1 ml pipeta o pojemniści 2 ml pipeta o pojemności 5 ml płytka aluminiowa pokryta celulozą komora chromatograficzna spryskiwacz TLC automatyczny aplikator Linomat 5 2 szt.
Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie płytki chromatograficznej: UWAGA: PODCZAS PRACY Z PŁYTKĄ CHROMATOGRAFICZNĄ NALEŻY UWAŻAĆ ABY NIE USZKODZIĆ POWIERZCHNI SORBENTU. - z aluminiowego arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 5x5 cm; - umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności przyciąć ją; - w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany chromatogram. 2. Przygotowanie fazy ruchomei i komory chromatograficznej: - przygotowanie fazy ruchomej: do zlewki o pojemności 25 ml odmierzyć amoniak, aceton i n-butanol w stosunku objętościowym 0.8 : 2.6 : 0.8. Roztwór dobrze wymieszać; - ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną; - przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na aplikację roztworów). 3. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora - aplikację roztworów wzorcowych KCl, KBr i KI o objętości 0.5 μl oraz próbki badanej o objętości 0.2 μl przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5. 4. Rozwijanie chrmatogramu: - płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia chromatogramu, - obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza. 5. Wizualizacja chromatogramu: - do jednej butelki spryskiwacza wlać roztwór AgNO 3, a do drugiej K 2CrO 4. Dokręcić butelki do korpusu spryskiwaczy; - spryskać płytkę roztworem AgNO 3, lekko podsuszyć, a następnie roztworem K 2CrO 4; - płytkę dobrze osuszyć i zaznaczyć ołówkiem uwidocznione plamki.
Opracowanie wyników 1. Wyznaczyć wartość współczynników R f R f = A/B gdzie: R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od lini startu do czoła fazy ruchomej B), gdzie B w tym przypadku wynosi 8 cm. 2. Zinterpretować otrzymane wyniki.
TLC2 ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH ANTICOL Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie dehydrogenazy aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej szkodliwej substancji - kwasu octowego. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty spożywcze zawierające niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo nieprzyjemne reakcje: pulsujący ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu. Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku wzorca. W tym celu mierzy się pole powierzchni pików otrzymanych z plam odpowiadających roztworowi nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości wzorca do próbki badanej. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej. 30 pole powierzchni piku 25 20 15 10 5 0-2 -1 0 1 2 masa dodanego wzorca [mg] Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji. Odczynniki Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(cuso 4)=0.5 mol/l Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram) Metanol, cz.d.a. Preparat farmaceutyczny ANTICOL disulfiramum 500 mg - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne, Warszawa Aparatura i sprzęt laboratoryjny Kolby miarowe pojemności 10 ml Kolby miarowe pojemności 5 ml Kolbki plastikowe o pojemności 1,5 ml Zlewka o pojemności 25 ml Lejki Pipeta o pojemności 2 ml 2 szt. 4 szt. 4 szt. 2 szt. 2 szt.
Pipeta automatyczna nastawna pojemności 5000 l Pipeta automatyczna nastawna pojemności 0,1-1 l Naczynka wagowe Moździerz Łopatka Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60 Suszarka fryzjerska Komora chromatograficzna Spryskiwacz TLC 2 szt. Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie roztworów. - ROZTWÓR LEKU ANTICOL (L) - w moździerzu rozetrzeć jedną tabletkę preparatu farmaceutycznego. Odważyć 80 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 10 ml. Dodać około 5 ml metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski. - ROZTWÓR WZORCOWY ESPERALU (W) - odważyć 60 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 10 ml, rozpuścić w około 5 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do kreski. - do 4 kolbek o pojemności 5 ml przenieść po 500 l roztworu leku (L), a następnie odpowiednio 0, 500, 1000, 1500 l roztworu wzorca esperalu (W). Kolbki uzupełnić metanolem do kreski. 2. Przygotowanie płytki chromatograficznej. - z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach 5x5 cm - umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności przyciąć ją; - w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany chromatogram. 3. Przygotowanie fazy ruchomej i komory chromatograficznej - do zlewki o pojemności 25 ml przenieść 2 ml metanolu oraz 2 ml wody. Całość wymieszać i napełnić komorę chromtograficzną. - ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną; - przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na aplikację roztworów). 4. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora - aplikację 0.5 μl roztworów przygotowanych zgodnie z pktem 2c przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5.
5. Rozwijanie chrmatogramu: - płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia chromatogramu, - obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza. 6. Wizualizacja chromatogramu - wysuszona płytkę ustawić w komorze spryskującej i spryskać ją za pomocą spryskiwacza roztworem siarczanu (VI) miedzi (II). Suszyć płytkę w suszarce w temperaturze 150 0 C przez ok. 5 min. 7. Skanowanie płytki. a) Otwieramy program Centrum Obsługi HP. b) Następnie klikamy przycisk ->Skanuj obraz w tym momencie komputer sam uruchomi skaner i na monitorze wyświetli się skanowany obraz. c) Zaznaczamy skanowany obszar (płytkę) poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy obszaru aktywnego (Rys. 1). Rys. 1. d) Naciskamy lewym przyciskiem myszy -> Akceptuj e) Komputer zapisze zeskanowaną płytkę w folderze domyślnym -> D:\(data)\plytka(nr).jpg 7. Otrzymywanie chromatogramu pikowego za pomocą programu TLSee a) uruchamiamy program TLSee korzystając ikony -> znajdującej się na Pulpicie b) z menu File wybieramy opcję New Experiment -> Without calibration (Rys. 2) co powoduje otwarcie zakładki wyboru zeskanowanego obrazu płytki (Rys. 3).
Rys. 2. c) w wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę i wybieramy ścieżkę dostępu zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). (Rys. 3.). Rys. 3. d) lewym przyciskiem myszy aktywujemy zakładkę Plate (u dołu aktywnego okna) i suwaczkami (na Rys. 4. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca przeciągając je lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości. Rys. 4. e) poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (w pasku na górze) zaznaczonej na Rys. 4 aktywujemy funkcję Fixed Band. Najeżdżamy myszką na obraz płytki i zaznaczamy tzw. pasmo, czyli drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż do linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (Rys. 5.). Postępujemy tak dla wszystkich otrzymanych plamek.
Rys. 5. f) klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles (Rys. 4). Pojawia się chromatogram pikowy (Rys. 6). Zakładka Lane 1 odpowiadający ścieżce 1, Lane 2 ścieżce 2 itd. By poruszać się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas zakładkę. Rys. 6. g) W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy je zintegrować. Poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony aktywujemy funkcję Band Integration (Rys. 6.). h) trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałkę wzdłuż podstawy piku zaznaczając pole jego integracji (Rys. 6). Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane 1, Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość R f (Peak R f) oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików. i) sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości R f oraz pola powierzchni każdego z otrzymanych pików. j) zamykamy program bez zapisywania otrzymanych wyników.
Opracowanie wyników ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia R f każdej z plamek. R f a b gdzie: R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej b. 2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal? ANALIZA ILOŚCIOWA 1. Sporządzić wykres jak na rysunku we wstępnie zaznaczając na osi x punkt określony jako m x, w odległości 20 mm na prawo punkt opowiadający pierwszemu dodatkowi czyli 0.6 mg, dalej w odległości 40 mm od mx i 60 mm od m x punkty odpowiadające dodaniu do próbki badanej kolejnym wzorcom (1.2, 1.8 mg) 2. Przez otrzymane punkty poprowadzić prostą i znaleźć jej przecięcie z osią x. Odcinek osi x od przecięcia z osią x do punktu m x odpowiada zawartości esperalu w kolbce. Jeśli skorzysta się z programu EXCEL to wyznaczyć równanie prostej i zleźć punkt x odpowiadający y=0. 3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce, wiedząc że 1 tabletka ma masę 672 mg. Wyciągnąć wnioski.
INSTRUKCJA OBSŁUGI AUTOMATYCZNEGO APLIKATORA TLC LINOMAT 5 1. Załadowanie płytki TLC (Rys. 1) - przesunąć, znajdującą się z prawej strony dźwignię stolika ( 1 ) do góry i w tylne położenie dla obniżenia płyty stolika; - mieścić płytkę TLC ( 2 ) w lewym górnym rogu stolika w taki sposób aby stykała się z tylną krawędzią i dwoma kołkami pozycjonującymi ( 3 ); - zabezpieczyć położenie płytki za pomocą listwy ( 4 ); - przemieścić uważnie dźwignię stolika ( 1 ) w poprzednie położenie. Kierowanie dźwignią powinno odbywać się w taki sposób aby uniknąć zbyt szybkiego unoszenia się ruchomej płaszczyzny stolika. Rys. 1 2. Odkręcić butlę z azotem. 3. Włączyć aplikator przyciskiem O/I umieszczonym na lewym boku obudowy (świeci się dioda POWER ON). Aplikator będzie teraz spełniać następujące funkcje kontrolne: - inicjowanie napędu płyty. - inicjowanie napędu strzykawki. Jeśli uruchomienie się powiodło na ekranie pojawi się napis: ** Linomat 5 ** Instrument ready 3. Wprowadzanie parametrów metody. - w celu wybrania metody nacisnąć przycisk RUN: zostanie wyświetlona metoda, która w ostatnim okresie czasu była najczęściej używana. Przy pomocy klawiszy i można wybrać inną przechowywaną metodę. - w celu zmiany parametrów dla wybranej metody nacisnąć przycisk DIALOG: przy pomocy klawiszy i wybrać grupę parametrów, które chcemy zmienić. Aby zmienić parametry z danej grupy nacisnąć ENTER. - dostępne są następujące grupy parametrów: wybór kolejnego parametru, który ma być zmieniony następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER, a wybrany parametr zmienia się przy pomocy klawiszy i. Zatwierdzenie i jednocześnie przejście do kolejnego parametru następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER.
GLOBALS parametr syringe volume objętość strzykawki dosage speed prędkość dozowania predosage volume objętość wstępnego dozowania wartość 100 µl 25 µl/s 0.2 µl PARAMETERS plate size wielkość płytki number of tracks ilość ścieżek number of samples ilość próbek band length szerokość plamki first position X pozycja X track distance odległość między plamkami app. position Y pozycja Y 10x10cm 4 4 0 mm 10 mm 10 mm 10 mm track No. numer ścieżki kolejno: 1, 2, 3, 4 TRACK ASSIGNMENT dozowana objętość 0.5 µl ID próbki kolejno: 1, 2, 3, 4 SAVE METHOD save as? method No.... zapisz jako? metoda nr... metoda 5 UWAGA! Po zapisaniu metody naciśnięcie kolejne przycisku ENTER powoduje rozpoczęcie procedury aplikacji
Aplikacja badanych roztworów na płytkę 2. Napełnienie strzykawki dozującej 1 trzykrotnie przemyć strzykawkę wodą dejonizowaną 2 trzykrotnie strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę 3 napełnić strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę w objętości przynajmniej takiej jak jest wyświetlana na wyświetlaczu; Kroki 2-3 powtórzyć dla wszystkich roztworów, które mają być aplikowane. Po zakończeniu aplikacji wszystkich roztworów przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem. 3. Umieszczanie napełnionej strzykawki dozującej w aplikatorze (Rys. 2) - upewnić się czy płyta jest w odpowiednim położeniu i poziome ramię wieżyczki znajduje się w górnym położeniu; - przy pomocy lewej ręki przesunąć ramię dźwigni ( 1 ) w lewo i pozostawić w tym położeniu; - ostrożnie przełożyć strzykawkę przez uchwyt strzykawki ( 2 ) i ostrożnie obniżać aż do oparcia strzykawki w głowicy rozpylającej ( 3 ). Rys. 2. 4. Rozpoczęcie aplikacji próbki - nacisnąć przycisk ENTER co spowoduje inicjację napędu strzykawki i ustawienie stolika. - nacisnąć ponownie przycisk ENTER: Napęd strzykawki będzie teraz wykonywać automatyczne wypuszczanie ustalonej objętości wstępnego dozowania, a następnie nastąpi aplikacja pierwszej próbki. - po aplikacji pierwszej próbki napęd strzykawki i stolik powrócą automatycznie do pozycji wstępnego dozowania. - napełnić strzykawkę kolejnym dozowanym roztworem i postępując analogicznie jak w przypadku pierwszej próbki zaaplikować go na płytkę. - całą procedurę powtórzyć dla wszystkich roztworów. 5. Zakończenie aplikacji - wyłączyć aplikator przyciskiem O/I i zakręcić butlę z gazem; - przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem.