Streszczenie Przedstawiona praca doktorska dotyczy mobilizacji komórek macierzystych do uszkodzonej tkanki mięśniowej. Opisane w niej badania koncentrowały się na opracowaniu metod prowadzących do zwiększenia zdolności zarówno endogennych jak i egzogennych, tj. przeszczepianych komórek macierzystych do udziału w regeneracji mięśni szkieletowych myszy. Dotyczyły także poznania mechanizmów molekularnych, jakie towarzyszą zarówno migracji jak i różnicowaniu tych komórek. Mięśnie szkieletowe, obok tkanek budujących skórę, są jedną z tkanek najbardziej narażonych na urazy. Z tego powodu ich prawidłowa regeneracja jest niezmiernie istotna dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Mięśnie szkieletowe składają się z wielojądrzastych włókien mięśniowych, które mają zdolność do kurczenia się, co stanowi podstawę ich funkcjonowania. W odpowiedzi na uraz uszkodzone włókna mięśniowe zostają usunięte przez napływające makrofagi, a następnie zastąpione przez nowe włókna [1]. Nowe włókna mięśniowe powstają dzięki fuzji jednojądrzastych komórek, które tworzą najpierw wielojądrzaste miotuby, dojrzewające następnie we włókna mięśniowe posiadające setki jąder komórkowych. W przypadku regeneracji mięśni kluczowe są więc komórki progenitorowe zdolne do różnicowania miogenicznego i fuzji, a co za tym idzie odtwarzania nowych włókien mięśniowych. W warunkach fizjologicznych pulę takich komórek tworzą komórki satelitowe, czyli komórki macierzyste mięśni szkieletowych, z których w wyniku podziałów komórkowych powstają zdolne do fuzji mioblasty [2]. Zapewniają one bardzo wydajną regenerację. Jednak w przypadku rozległych uszkodzeń, procesu starzenia, cukrzycy, nowotworów, a także chorób mięśniowych, np. dystrofii, naprawa tkanki nie przebiega prawidłowo. Konsekwencją nieprawidłowej regeneracji może być utrata funkcjonalności mięśni i ich zwiększona podatność na ponowne uszkodzenia [3]. Jedną z potencjalnych form wspomagania regeneracji mięśni szkieletowych mogłaby być terapia komórkowa polegająca na mobilizacji własnych komórek macierzystych lub na podawaniu pacjentowi egzogennych komórek macierzystych - izolowanych z tkanek pacjenta lub dawcy [4]. Komórki takie powinny mieć zdolność do uczestniczenia w odtwarzaniu włókien mięśniowych. Jedną z największych przeszkód w skutecznym zastosowaniu komórek macierzystych we wspomaganiu regeneracji mięśni szkieletowych jest ograniczona zdolność tych komórek do migracji w obrębie uszkodzonego mięśnia. Podanie komórek, które nie są zdolne do migracji skutkuje ich wyłącznie lokalnym udziałem w rekonstrukcji, a to nie wpływa na poprawę funkcjonowania mięśnia [5, 6]. Istnieje wiele populacji komórek macierzystych, które mogłyby zostać wykorzystane do wspomagania regeneracji. W prowadzonych przeze mnie badaniach, analizowałem trzy rodzaje takich komórek - pluripotencjalne zarodkowe komórki macierzyste (ESC, ang. Embryonic Stem Cells), multipotencjalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC, ang. Bone Marrow Stem Cells) oraz komórki satelitowe, czyli unipotencjalne komórki macierzyste mięśni szkieletowych. Wybór ten był podyktowany różnicami w potencjale miogenicznym tych komórek, czyli możliwością różnicowania w mioblasty i włókna mięśniowe, a także różnicami w ich zdolności do migracji i zasiedlania uszkodzonych mięśni szkieletowych [7, 8, 9]. W moich badaniach analizowałem rolę cytokiny Sdf-1 (ang. Stromal derived factor - 1) w mobilizacji komórek macierzystych zdolnych do uczestniczenia w regeneracji mięśni szkieletowych. W warunkach fizjologicznych cytokina ta jest produkowana w tkance w odpowiedzi na hipoksję, czyli obniżone stężenie tlenu, będące konsekwencją uszkodzenia. Jest ona chemoatraktantem dla komórek mających na swojej powierzchni receptor Cxcr4 7
(Cxcr4+). Receptor ten eksprymują komórki układu odpornościowego oraz wiele typów komórek macierzystych [10]. W prowadzonych badaniach postawiłem hipotezę, że mobilizowane przez Sdf-1 do regenerującego mięśnia endogenne i egzogenne komórki macierzyste mogą uczestniczyć w rekonstrukcji uszkodzonej tkanki. Aby zweryfikować powyższą hipotezę analizowałem regenerację mięśni myszy pozbawionych funkcjonalnych alleli genu Pax7 (Pax7-/-). Myszy Pax7-/- charakteryzuje złożony fenotyp, jednak z punktu widzenia prowadzonych przeze mnie doświadczeń najistotniejsze jest to, że ich mięśnie cechuje prawie całkowity brak komórek satelitowych. Dzięki temu mogłem analizować regenerację zachodzącą przy istotnym niedoborze komórek, które w warunkach fizjologicznych odpowiedzialne są za odbudowę tej tkanki. W trakcie prowadzonych doświadczeń podawałem myszom podskórnie cytokinę G-CSF (ang. Granulocyte Colony Stymulating Factor) powodującą uwolnienie ze szpiku kostnego do krwioobiegu komórek macierzystych. Następnie uszkadzałem mięśnie szkieletowe, do których po dobie podawałem roztwór chemokiny Sdf-1, która stymuluje napływ komórek z receptorem Cxcr4, m.in. komórek macierzystych szpiku kostnego. Wykazałem, że Sdf-1 mobilizuje do uszkodzonego mięśnia komórki Cxcr4+ syntetyzujące dodatkowo marker CD34, a więc komórki macierzyste ze szpiku kostnego. Wykazałem, że efektem podawania Sdf-1 i mobilizacji komórek jest wzrost masy zrekonstruowanego mięśnia z jednoczesnym zmniejszeniem stopnia jego zwłóknienia - czyli ograniczenie powstawania tkanki łącznej. Wyniki te udowodniły, że zastosowanie G-CSF i Sdf-1 może stanowić skuteczny sposób na wspomaganie regeneracji mięśni szkieletowych w przypadkach niedoboru komórek satelitowych. Fuzja komórek jest obok migracji kluczowym procesem zachodzącym podczas regeneracji mięśni szkieletowych. Przebiega ona z udziałem transbłonowych białek adhezyjnych. Postawiłem hipotezę, że zmiany w poziomie tych białek mogą przekładać się na zdolność komórek macierzystych do migracji i fuzji z mioblastami. Wykazałem, że Sdf-1 zwiększa poziom białka adhezyjnego CD9 w ESC i BMSC. Udowodniłem również, że mechanizm wzrostu poziomu CD9 w odpowiedzi na Sdf-1 jest zależny od pobudzenia receptora Cxcr4. Aby sprawdzić, czy wzrost poziomu CD9 wpływa na zdolność do fuzji badanych komórek z komórkami mięśniowymi, przeprowadziłem hodowlę mieszaną, w trakcie której hodowałem mioblasty z badanymi komórkami tj. BMSC bądź ESC. Analizowałem komórki kontrolne oraz takie, które uprzednio traktowałem Sdf-1. Mioblasty fuzjując ze sobą tworzą wielojądrowe miotuby. Jeżeli badane komórki mają zdolność do fuzji to wspólnie z mioblastami będą tworzyć hybrydowe miotuby. Częstość, z jaką powstają takie miotuby odzwierciedla potencjał badanych komórek do uczestniczenia w regeneracji mięśni szkieletowych. Wykazałem, że Sdf- 1 zwiększa zdolność BMSC do uczestniczenia w tworzeniu hybrydowych miotub. Analiza ESC wykazała natomiast, że komórki te mają bardzo ograniczoną zdolność do tworzenia hybrydowych miotub, jednak stymulacja Sdf-1 wpływa na ich zdolność migracji. Pod wpływem Sdf-1 migrują one lepiej w hodowli i zamiast formować agregaty (jak ma to miejsce w hodowli kontrolnej) lokalizują się wzdłuż miotub powstających z mioblastów. Wiedząc, że Sdf-1 wpływa na komórki macierzyste zarówno in vivo jak i in vitro stymulując ich migrację i fuzję postawiłem hipotezę, że Sdf-1 aktywuje wewnątrzkomórkowe ścieżki sygnalizacyjne związane z tymi procesami. Badałem również rolę receptorów dla Sdf-1, czyli Cxcr4 i Cxcr7 w omówionych procesach. W tym celu hodowałem in vitro mysie ESC, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste izolowane z galarety Whartona (MSC, 8
ang. Mesenchymal Stem Cells) i mioblasty pierwotne uzyskane z komórek satelitowych izolowanych z mięśni szkieletowych myszy. Aby sprawdzić, który z receptorów: Cxcr4 czy Cxcr7, jest zaangażowany w odpowiedź komórki na traktowanie Sdf-1 wykorzystałem technikę sirna pozwalającą wyciszyć ekspresję badanych receptorów. Wykazałem, że zarówno ESC, MSC jak i mioblasty pierwotne migrują w gradiencie Sdf-1 w sposób zależny wyłącznie od receptora Cxcr4. Ponadto stymulacja Sdf-1 powoduje wzrost aktywności GTPaz Rac-1 oraz Cdc42, a więc czynników odpowiedzialnych za rearanżację cytoszkieletu aktynowego uczestniczącego w migracji komórek. Efekt ten jest również zależny wyłącznie od receptora Cxcr4. Wykazałem także, że stymulacja badanych komórek za pośrednictwem zarówno receptora Cxcr4 jak i Cxcr7 powoduje wzrost poziomu ufosforylowanej, a więc aktywnej, formy kinazy płytek przylegania (FAK, ang. Focal Adhesion Kinase). Aktywna forma FAK jest odpowiedzialna za tworzenie płytek przylegania, struktur niezbędnych w trakcie migracji komórek [Figura 1]. Analiza wykonana techniką mikromacierzy pozwoliła mi na określenie zmian w transkryptomie ESC: kontrolnych, stymulowanych Sdf-1 oraz poddanych wyciszeniu ekspresji receptorów Cxcr4 bądź Cxcr7. Wykazałem, że w ESC przekazywanie sygnału z udziałem receptora Cxcr4 wpływa na ekspresję i aktywność białek związanych przede wszystkim z migracją i adhezją, podczas gdy Cxcr7 reguluje ekspresję białek cytoszkieletowych (np. aktyny). Figura 1. Sdf-1 aktywuje migrację komórek poprzez: Zwiększenie aktywności GTPaz Rac1 oraz Cdc42. Jest to mechanizm zależny od receptora Cxcr4. Sdf-1 działając poprzez receptory Cxcr4 oraz Cxcr7 zwiększa również aktywność kinazy płytek przylegania (FAK). W kolejnym etapie doświadczeń określiłem jak zmiany indukowane przez Sdf-1 wpływają na zdolność komórek do zasiedlania uszkodzonych mięśni i udział w ich rekonstrukcji. Mioblasty pierwotne oraz ESC stymulowane Sdf-1 i/lub takie, w których wyciszyłem ekspresję receptora Cxcr4 lub Cxcr7, przeszczepiałem do regenerującego mięśnia szkieletowego. Wykazałem, że ESC mają bardzo ograniczoną zdolność do zasiedlania mięśnia, jednak stymulacja Sdf-1 powoduje wydajniejszą migrację tych komórek wzdłuż włókien mięśniowych. Mioblasty podane do regenerującego mięśnia są zdolne do uczestniczenia w regeneracji, stymulacja Sdf-1 zwiększa tę zdolność, podczas gdy wyciszenie ekspresji receptora Cxcr4 istotnie ją ogranicza. Obniżony poziom receptora Cxcr7 nie wpływa na zdolność mioblastów do zasiedlania regenerującego mięśnia. 9
Podsumowując, wyniki dotychczas opublikowanych badań wskazują na możliwość potencjalnego wykorzystania Sdf-1 do wspomagania regeneracji mięśni szkieletowych, zarówno w przypadku mobilizacji komórek endogennych, jak i po przeszczepianiu komórek. Mechanizm działania Sdf-1 opiera się przede wszystkim na stymulacji migracji komórek, co wykazałem zarówno w układzie in vitro jak i in vivo. Po drugie Sdf-1 promuje fuzję komórek macierzystych z komórkami mięśni szkieletowych za pośrednictwem białka adhezyjnego CD9. Zatem, podanie Sdf-1 do regenerującego mięśnia szkieletowego poprawia jego regenerację, głównie za sprawą zwiększenia udziału komórek macierzystych w odtwarzaniu nowych włókien mięśniowych [Figura 2] Figura 2. Regeneracja mięśni szkieletowych. Poza komórkami satelitowymi, z których powstają mioblasty, również inne endogenne i egzogenne komórki macierzyste wykazują zdolność do uczestniczenia w regeneracji mięśnia. Chemokina Sdf-1 tworzy gradient, który mobilizuje komórki macierzyste do regenerującego mięśnia, przez co zwiększa ich zdolność do współtworzenia nowych włókien mięśniowych. 10
1. Rigamonti, E., et al., Macrophage plasticity in skeletal muscle repair. Biomed Res Int, 2014. 2014: p. 560629. 2. Relaix, F. and P.S. Zammit, Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development, 2012. 139(16): p. 2845-56. 3. Serrano, A.L., et al., Cellular and molecular mechanisms regulating fibrosis in skeletal muscle repair and disease. Curr Top Dev Biol, 2011. 96: p. 167-201. 4. Tedesco, F.S., et al., Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J Clin Invest, 2010. 120(1): p. 11-9. 5. Price, F.D., K. Kuroda, and M.A. Rudnicki, Stem cell based therapies to treat muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta, 2007. 1772(2): p. 272-83. 6. Skuk, D., M. Goulet, and J.P. Tremblay, Use of repeating dispensers to increase the efficiency of the intramuscular myogenic cell injection procedure. Cell Transplant, 2006. 15(7): p. 659-63. 7. Archacka, K., et al., Competence of in vitro cultured mouse embryonic stem cells for myogenic differentiation and fusion with myoblasts. Stem Cells Dev, 2014. 23(20): p. 2455-68. 8. Grabowska, I., et al., Restricted myogenic potential of mesenchymal stromal cells isolated from umbilical cord. Cell Transplant, 2012. 21(8): p. 1711-26. 9. Ferrari, G., et al., Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science, 1998. 279(5356): p. 1528-30. 10. Ceradini, D.J., et al., Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat Med, 2004. 10(8): p. 858-64. 11