Sesja referatowa 1 OSIĄGNIĘCIA NAUK PODSTAWOWYCH I STOSOWANYCH W HODOWLI JAKOŚCIOWEJ ROŚLIN UPRAWNYCH

Sesja referatowa 1 OSIĄGNIĘCIA NAUK PODSTAWOWYCH I STOSOWANYCH W HODOWLI JAKOŚCIOWEJ ROŚLIN UPRAWNYCH Prowadzący: dr Zdzisław Paszkiewicz

XII OGÓLNOPOLSKA KONFERENCJA NAUKOWA ZAKOPANE 2015 Nauka dla hodowli i nasiennictwa roślin uprawnych Zakopane, 2 6 luty 2015 Intensywność fioletowego zabarwienia kwiatów jest regulowana przez loci na chromosomie V genomu ziemniaka Jadwiga Śliwka, Marta Brylińska, Henryka Jakuczun, Iwona Wasilewicz-Flis, Dorota Sołtys- Kalina, Danuta Strzelczyk-Żyta, Katarzyna Szajko, Waldemar Marczewski Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy Instytut Badawczy, Młochów; j.sliwka@ihar.edu.pl W udomowieniu roślin dużą rolę odegrała selekcja trwająca wiele pokoleń, przynosząc poprawę plonu i cech jakościowych. Rośliny szczególnie przydatne człowiekowi, dzięki ludziom zwiększyły swoje zasięgi geograficzne, często rozprzestrzeniając się wszędzie tam, gdzie klimat pozwalał na ich uprawę. Dobrym przykładem takiej rośliny jest ziemniak (Solanum tuberosum L.), który pochodzi z Ameryki Południowej, a obecnie codziennie gości na stołach około 1 mld ludzi na całym świecie. Selekcja i migracje, w których często bierze udział zaledwie kilka genotypów rośliny, przyczyniają się do zawężenia puli genetycznej danej rośliny uprawnej. To zjawisko może hamować postęp hodowli, bądź nawet uniemożliwiać uzyskanie roślin o pewnych korzystnych cechach, gdyż w zawężonej puli genetycznej allele warunkujące te cechy w pożądanym nasileniu mogą być rzadkie lub nieobecne. Hodowcy sięgają więc do dzikich gatunków spokrewnionych z gatunkami uprawnymi w poszukiwaniu nowych cennych genów i alleli. Następnie, w procesie krzyżowania wstecznego te cenne nowe geny i allele są wprowadzane do rośliny uprawnej, czemu także towarzyszy wprowadzenie alleli niekorzystnych lub obojętnych z punktu widzenia człowieka. Taką neutralną cechą jest barwa kwiatów ziemniaka. Ziemniak początkowo był uprawiany w Europie w charakterze rośliny ozdobnej, jednak obecnie znajduje on zastosowanie wyłącznie jako roślina jadalna, w przetwórstwie i przemyśle. Genetyczne podłoże barwy kwiatów ziemniaka jest dobrze poznane. Kwiaty ziemniaka nie są białe, jeśli posiada on dominujący allel F w locus na chromosomie X oraz przynajmniej jeden dominujący allel w loci P lub D, które odpowiadają za zdolność ziemniaka do syntezy barwników antocyjanowych (van Eck i in. 1993; van Eck i in. 1994). Zabarwienie płatków korony ziemniaka ma zakres od barwy niebieskiej, warunkowanej 39

40 Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli przez locus P położony na chromosomie XI do czerwonej warunkowanej przez locus D z chromosomu II, przy czym różne allele i różne ich kombinacje w tych dwóch loci odpowiadają za zabarwienie w rozmaitych odcieniach fioletu (van Eck i in. 1993; van Eck i in. 1994). W locus D znanym także jako R jest kodowany enzym: reduktaza dihydroflawonolu (Zhang i in. 2009a), zaś w locus P hydroksylaza flawonoidowa 3, 5 (Jung i in. 2005). Celem prezentowanej pracy jest określenie podłoża genetycznego barwy kwiatów w dwóch populacjach ziemniaka, w których wprowadzono cenne cechy z dzikich gatunków ziemniaka: odporność na Phytophthora infestans, patogena powodującego zarazę ziemniaka oraz wysoką zawartość skrobi. Wraz z tymi cechami zostały przeniesione allele dzikich gatunków wpływające na zabarwienie kwiatów. W obydwu populacjach segregowała fioletowa barwa kwiatów, przy czym występowała ona u poszczególnych osobników potomnych w różnym nasileniu. Ten właśnie aspekt intensywność fioletowej barwy kwiatów został zmapowany na chromosomie V genomu ziemniaka. Materiał badawczy stanowiły dwie populacje diploidalnego ziemniaka. Populacja 12-3 (N = 167) powstała ze skrzyżowania diploidalnych klonów ziemniaka DG 00-683 (kwiaty białe) i DG 08-28/13 (kwiaty ciemno fioletowe) i posłużyła także do mapowania loci wpływających na zawartość skrobi w bulwach (dane niepublikowane). Źródłem nowych alleli zawartości skrobi było w populacji 12-3 w dużej mierze S. chacoense, które charakteryzuje się białymi kwiatami. Gatunek ten w genomach form rodzicielskich teoretycznie stanowił 28 (DG 00-683) i 11% (DG 08-28/13). Fioletowe zabarwienie kwiatów w tym potomstwie może pochodzić z niewielkiej obecności S. phureja i S. verrucosum w formach rodzicielskich. Druga populacja, 12-4, powstała ze skrzyżowania formy dihaploidalnej (dh) uzyskanej z odmiany Balbina (kwiaty białe) oraz odpornego na P. infestans klonu DG 99-10/36 (kwiaty jasno fioletowe) wyselekcjonowanego z populacji S. ruiz-ceballosii (VIR 7370). Populacja 12-4 liczyła 342 osobniki, z których część pod nazwą populacji 05-18 posłużyła wcześniej do mapowania genu odporności Rpi-rzc1 na zarazę ziemniaka. Gen ten został zlokalizowany na chromosomie X, w pobliżu locus F (Śliwka i in. 2012). Barwę kwiatów oceniono wizualnie w skali 1-4, gdzie 1 oznacza kwiaty o białych płatkach korony, zaś oceny 2-4 kwiaty fioletowe o narastającej intensywności zabarwienia. Skala ta jest skalą względną, tj. ocena 4 oznacza w każdej populacji najciemniejszy fiolet z obserwowanych, jednak w populacji 12-3 był to kolor wyraźnie jaśniejszy niż w populacji 12-4. Oceny prowadzono w sezonach wegetacyjnych 2012-2014. Do mapowania wykorzystane zostały markery Diversity Array Technology (DArT), których zmienność analizowano w Diversity Array Pty Ltd. Canberra, Australia. Dla obydwu populacji zostały skonstruowane mapy genetyczne, przy czym, w przypadku populacji 12-4 do konstrukcji mapy zostało użyte 114 osobników (Śliwka i in. 2012). Konstrukcja map została

Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli wykonana z użyciem programu JoinMap 4 (van Ooijen 2006), analiza loci cech ilościowych (QTL) z użyciem programu MapQTL 6 (van Ooijen 2009), według wcześniej opisanej procedury (Śliwka i in. 2012). Markery PCR specyficzne dla sekwencji C2_At1g14790 (Śliwka i in. 2012), chi i chs (Zhang i in. 2009b) amplifikowano według wcześniej opisanych procedur, przy czym w populacji 12-4 produkty PCR chi i chs były trawione w celu ujawnienia polimorfizmu odpowiednio: Tru1I i EcoRI. W populacji 12-3 91 osobników posiadało kwiaty białe, 76 fioletowe, co jest rozkładem nieodbiegającym istotnie od rozkładu 1: 1 (χ 2 = 1,35; p = 0,25). Podobnie w populacji 12-4, liczebność osobników o kwiatach białych wynosiła 166, fioletowych 176 (1: 1: χ 2 = 0,29; p = 0,59). Takie rozkłady wskazywały w obu populacjach na działanie pojedynczego genu warunkującego barwę kwiatów (biały/fiolet), o układzie alleli ff Ff w formach rodzicielskich. Analiza QTL populacji 12-3 i podzbioru 114 osobników populacji 12-4 oraz programu MapQTL 6 (mapowanie interwałowe) potwierdziła bardzo silny wpływ locus F z chromosomu X (van Eck i in. 1993; Śliwka i in. 2012) na to, czy kwiaty są fioletowe. W populacji 12-3 wpływ locus F był istotny na poziomie LOD = 67,3 R 2 = 84,4%, a w populacji 12-4 na poziomie LOD = 24,7 R 2 = 65,8%. Aby zidentyfikować loci wpływające na intensywność barwy kwiatów wykonano ograniczone mapowanie wielu QTL (restricted Multi-QTL Mapping, rmqm) używając locus F, jako ko-faktora. W ten sposób wykryto kilka loci o istotnym wpływie na intensywność barwy kwiatów, m. in. QTL na chromosomie V, któremu można przypisać 2,3% (LOD = 5,7) zmienności tej cechy w populacji 12-3 oraz 5,9% (LOD = 4,3) w podzbiorze populacji 12-4. Na chromosomie V w innych badaniach został zidentyfikowany QTL wpływający na intensywność antocyjanowego zabarwienia, jednak nie kwiatów, ale bulw ziemniaka (Zhang i in. 2009b). Z pracy tej zaczerpnięto dwa markery PCR specyficzne dla sekwencji enzymów zaangażowanych w syntezę antocyjanów: izomerazy (chi) i syntazy (chs) chalkonu. Zmienność tych markerów PCR oraz markera C2_At1g14790 przeanalizowano w populacji 12-3, N = 167 i 12-4, N = 342. Wszystkie trzy markery wykazywały istotny związek z intensywnością zabarwienia fioletowych kwiatów, co potwierdzono testem t-studenta. Częstości alleli wszystkich markerów w grupach osobników różniących się intensywnością zabarwienia (jasno fioletowe, fioletowe, ciemno fioletowe) w populacji 12-3 odbiegały od stosunku 1:1, ale w populacji 12-4 obserwowano to zjawisko jedynie w grupach jasno fioletowe i ciemno fioletowe. Uzyskane dane posłużą do opracowania modelu genetycznego kontroli intensywności zabarwienia kwiatów przez loci z chromosomu V genomu ziemniaka. LITERATURA Jung CS, Griffiths HM, De Jong DM, Cheng S, Bodis M, De Jong WS. 2005. The potato P locus codes for flavonoid 3, 5 -hydroxylase. Theor Appl Genet 110:269-275 Śliwka J, Jakuczun H, Chmielarz M, Hara-Skrzypiec A, Tomczyńska I, Kilian A, Zimnoch- 41

Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli Guzowska E. 2012. Late blight resistance gene from Solanum ruiz-ceballosii is located on potato chromosome X and linked to violet flower colour. BMC Genet 13 (1):11 Van Eck HJ, Jacobs JME, van Dijk J, Stiekema WJ, Jacobsen E. 1993. Identification and mapping of three flower colour loci of potato (S. tuberosum L.) by RFLP analysis. Theor Appl Genet 86:295-300 Van Eck HJ, Jacobs JME, van den Berg PMMM, Stiekema WJ, Jacobsen E. 1994. The inheritance of anthocyanin pigmentation in potato (Solanum tuberosum L.) and mapping of tuber skin colour loci using RFLPs. Heredity 73:410-421 Van Ooijen JW. 2006 JoinMap 4, Software for the calculation of the genetic linkage maps in experimental populations. Kyazma B.V., Wageningen, Netherlands Van Ooijen JW. 2009. MapQTL 6, software for mapping of quantitative trait loci in experimental populations of diploid species. Kyazma B.V., Wageningen, Netherlands Zhang Y, Cheng S, De Jong D, Griffiths H, Halitschke R, De Jong W. 2009a. The potato R locus codes for dihydroflavonol 4-reductase. Theor Appl Genet 119:931-937 Zhang Y, Jung CS, De Jong WS. 2009b. Genetic analysis of pigmented tuber flesh in potato. Theor Appl Genet 119:143-150 42

XII OGÓLNOPOLSKA KONFERENCJA NAUKOWA ZAKOPANE 2015 Nauka dla hodowli i nasiennictwa roślin uprawnych Zakopane, 2 6 luty 2015 Określenie efektu heterozji pszenżyta ozimego Grażyna Podolska 1, Jerzy Grabiński 1, Bogusława Jaskiewicz 1, Zofia Banaszek 2, Mirosław Pojmaj 2, Henryk Woś 3 1 Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa Państwowy Instytut Badawczy, Poznań; 2 Danko Hodowla Roślin, spółka z o.o.; 3 Hodowla Roślin Strzelce spółka z o.o.; aga@iung.pulawy.pl Najważniejszym celem hodowli jest otrzymanie odmian cenniejszych od form wyjściowych pod względem poziomu plonowania i cech jakościowych. Wzrost poziomu plonowania wynika z poprawy odporności na stresy biotyczne i abiotyczne, lepszego wykorzystania składników pokarmowych, poprawę głównych elementów plonowana: MTZ, liczby ziaren w kłosie, liczby kłosów na jednostce powierzchni. Poza postępem w wielkości poziomu plonowania nowe odmiany charakteryzują się korzystniejszymi cechami wartości odżywczej, technologicznej czy paszowej. Dużym postępem hodowlanym zarówno w Polsce jak i na Świecie było wykorzystanie efektu heterozji i wytworzenie odmian mieszańcowych żyta. W ostatnich latach rozpoczęto prace nad wykorzystaniem efektu heterozji przy hodowli odmian pszenżyta. Najkorzystniejszym dla przyszłych odbiorców materiału siewnego, jest przewaga cech mieszańców nad cechami odmian populacyjnych. Jednym z kluczowych zagadnień dla produkcji hybrydów i wprowadzenia ich do powszechnej uprawy jest określenie wielkości heterozji, o której jest bardzo niewiele informacji dotyczącej pszenżyta. Zakłada się, że ujawnienie efektu heterozji będzie możliwe tylko w warunkach specyficznej technologii produkcji opracowanej dla odmian heterozyjnych. Dlatego w Zakładzie Uprawy Roślin Zbożowych IUNG-PIB prowadzono doświadczenia obejmujące reakcję odmian heterozyjnych na: niedobór wody w glebie (doświadczenie w hali wegetacyjnej), warunki glebowe (uwzględniono 8 różnych typów gleb zaliczonych do 7 kompleksów rolniczej przydatności gleb), gęstość siewu (ilość wysiewu 240 z m 2 i 360 z m 2 ), nawożenia azotem (obiekt kontrolny, 60, 120, 180 kg N ha -1 ). W każdym doświadczeniu linie pszenżyta mieszańcowego porównywano z odmianami populacyjnym. Badania mające na celu określenie wpływu nawożenia azotem na plonowanie prowadzono w RZD Kępa gospodarstwo Osiny w latach 2013/2014. W badaniach uwzględniono linie mieszańcowe hodowli Danko: 43

Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli DAST 22/11 F1, CM 12/10 F1, SM 4/11 porównywano je z odmianami mieszańcowymi: Palermo, Wiarus. Średnio z obiektów poziom plonowania wynosił: DAST 22/11 9,4 t ha -1, CM 12/10 F1 11,3 t ha -1, SM 4/11 9,96 t ha -1, Palermo 9,8 t ha -1, Wiarus 11,2 t ha -1. Stwierdzono różną reakcję porównywanych linii na ilość zastosowanego azotu. Linia DAST 22/11, plonowała najwyżej w przypadku aplikacji 60 kg N ha -1, natomiast linie CM 12/10 F1i SM 4/11 plonowały podobnie na każdym z badanych obiektów. Zatem można wstępnie stwierdzić, że badane linie mieszańcowe nie wymagają stosowania dużych dawek azotu. 44

XII OGÓLNOPOLSKA KONFERENCJA NAUKOWA ZAKOPANE 2015 Nauka dla hodowli i nasiennictwa roślin uprawnych Zakopane, 2 6 luty 2015 Rodzaje odporności ziemniaka Solanum tuberosum L. na suszę glebową Dominika Boguszewska-Mańkowska 1, Barbara Zagdańska 2 1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin O/Jadwisin, Zakład Agronomii Ziemniaka; 2 SGGW Warszawa, Wydział Rolnictwa i Biologii, Katedra Biochemii; d.boguszewska-mankowska@ihar.edu.pl Rośliny wykształciły różne strategie reagowania na suszę, wśród których podstawowe są dwie strategie: unikania suszy i tolerowania suszy (Levitt, 1980). Tolerancja suszy to zdolność rośliny do utrzymania wzrostu i funkcji życiowych w obliczu deficytów wody powodowanych suszą. Rośliny tolerujące suszę na drodze unikania odwodnienia potrafią utrzymywać dodatni bilans wodny oraz niwelować okresowe niedobory wody. Główne mechanizmy odpowiedzialne za unikanie odwodnienia polegają na dostosowaniu gospodarki wodnej rośliny do wzrastającego deficytu wody w środowisku. Odbywa się to poprzez ograniczenie transpiracji (zamykanie szparek, zwiększenie grubości kutykuli, pokrycie liści kutnerem, ograniczenie rozmiarów lub redukcja liści, odwracalne pofałdowanie lub zwinięcie liści, zrzucanie liści), sprawne pobieranie wody na drodze dostosowań osmotycznych (akumulacja osmoprotektantów) oraz dobrze rozwinięty system korzeniowy, jak też wydajne przewodzenie wody do pędu (Zagdańska, 1997; Chaves, 2003). Wiele gatunków roślin użytkowanych rolniczo posiada mechanizmy unikania i tolerancyjności suszy. Strategie te nie wykluczają się wzajemnie, a rośliny mogą połączyć różne rodzaje odpowiedzi (Ludlow i in., 1990). Jednak mechanizmy adaptacyjne/aklimatyzacyjne mają pewne wady. Ucieczka przed suszą poprzez skrócenie okresu wegetacji prowadzi do zmniejszenia plonów. Unikanie suszy poprzez zmniejszenie strat wody wskutek zamknięcia aparatów szparkowych i zmniejszenie powierzchni liści może prowadzić do ograniczenia produktywności fotosyntezy powodując zmniejszenie produkcji asymilatów i w konsekwencji straty plonowania. Zwiększone stężenia osmoprotektantów odpowiedzialne za dopasowanie osmotyczne może skutkować dodatkową stratą energii wymaganej do osmoregulacji. Kolejnym przykładem może być zmniejszenie powierzchni liści, hamowanie wzrostu rośliny, co również skutkuje obniżeniem plonowania. Dlatego też, dostosowanie roślin do stresu powinno 45

46 Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli odzwierciedlać równowagę między unikaniem i tolerancją przy zachowaniu odpowiedniej wydajności w postaci plonu (Blum, 1988; Starck i in, 1995). Odporność rośliny na niekorzystne warunki środowiska (w tym suszy glebowej) według kryteriów rolniczych, to zdolność rośliny do utrzymania możliwie najwyższego plonu, przy zachowaniu jego wysokiej jakości. Większość roślin użytkowych jest uprawiana w suboptymalnym środowisku, w którym realizacja pełnego potencjału genetycznego warunkującego wzrost i możliwości reprodukcyjne organizmu nie jest osiągana (Atkinson i Urwin, 2012). Abiotyczne czynniki środowiska takie jak wysoka lub niska temperatura, susza, zasolenie czy dostępność składników pokarmowych są odpowiedzialne za co najmniej 50% obniżenie plonowania roślin uprawnych (Atkinson i Urwin, 2012). Zgodnie z raportami Systemu Monitoringu Suszy Rolniczej w Polsce (http://www.susza.iung.pulawy.pl/) latach 1983 2002 ilość opadów w trakcie wegetacji ziemniaka osiągnęła optimum tylko w pięciu z 20 badanych lat (Boguszewska, 2006), a straty plonu z tego powodu na terenie Polski wahały się w granicach 7-45% (Chmura, 2009). Klasyczna hodowla roślin wykorzystująca istniejącą zmienność genetyczną ma duży wkład w podwyższanie odporności roślin. Jednakże zdolność roślin do unikania/ tolerowania stresu lub jego skutków jest cechą ilościową, co znacznie utrudnia proces hodowlany. Zastosowanie metod genetyki molekularnej umożliwia izolację poszczególnych genów i możliwość ich testowania w nowym genetycznym kontekście. Izolacja i analiza genów roślinnych stała się standardową techniką, a metodologia otrzymywania roślin transgenicznych jest obecnie dostępna dla wielu roślin uprawnych. Dlatego inżynieria genetyczna dysponuje sporym potencjałem mogącym szybko zwiększyć tolerancję roślin na niekorzystne czynniki środowiska. Techniki kontrolowanych modyfikacji genetycznych do niedawna pozwalały na tworzenie roślin transgenicznych tylko z jednym obcym genem. Dlatego najczęściej modyfikowanymi cechami były: tolerancja na herbicydy (57%), odporność na choroby wirusowe (15%), odporność na szkodniki owadzie (15%) i jakość produktów roślinnych np. zmiana w składzie aminokwasowym białek, zmiana spektrum lipidów w kierunku zwiększenia nienasyconych kwasów tłuszczowych, zmiana proporcji cukrów do skrobi itp. Pierwszym spektakularnym sukcesem polegającym na wprowadzeniu trzech genów umożliwiających syntezę prowitaminy A w endospermie ryżu (Ye i in. 2000) było otrzymanie tzw. złotego ryżu. Nie oznacza to wszakże, że nie próbuje się badać możliwości otrzymania roślin o podwyższonej odporności na niekorzystne czynniki środowiska poprzez transformację roślin genami odpowiedzialnymi za syntezę i akumulację osmolitów, specyficznych białek, enzymów wprowadzających podwójne wiązania do kwasów tłuszczowych czy chroniących przed reaktywnymi formami tlenu. Co więcej, dokonał się olbrzymi postęp w rozumieniu metabolizmu roślin w stresowych warunkach środowiska, mimo to metody inżynierii genetycznej mogą być zastosowane do pożądanych cech na

Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli poziomie metabolicznym rośliny. Tak, więc adaptacja biochemiczna istotnie leży w możliwościach inżynierii genetycznej, podczas gdy znajomość procesów integracyjnych w roślinie jest na tyle niekompletna, że nie istnieją jeszcze możliwości przewidywania wpływu zmiany określonej cechy na roślinę, a tym samym na wielkość plonu. Mimo że ziemniak jest uznawany za roślinę wrażliwą na suszę glebową w każdej fazie swojego wzrostu i rozwoju to przeprowadzone badania wykazały, że w obrębie tego gatunku istnieje duża zmienność pod względem zdolności do tolerowania suszy w fazie tuberyzacji (Boguszewska- Mańkowska, Rozprawa doktorska 2014). Badania te umożliwiły wybranie odmian o skrajnej tolerancyjności na suszę zgodnie z przyjętym agronomicznym kryterium (plon bulw) oceny tej cechy. Z fizjologicznego punktu widzenia odmiana Tajfun, zdolna do utrzymania wyższego plonu bulw w porównaniu z odmianą wrażliwą Cekin, posiadała lepiej rozwiniętą zdolność do unikania odwodnienia o czym świadczy wyższa zawartość wody w liściach (mierzona jako RWC) będąca wynikiem lepiej rozwiniętych zabezpieczeń antytranspiracyjnych liścia. Wyższa gęstość trichomów i aparatów szparkowych po dolnej stronie blaszki liściowej, umożliwiła prowadzenie intensywniejszej fotosyntezy w stosunku do transpiracji, bardziej efektywne wykorzystanie wody (WUE) do wzrostu oraz kierowanie większej ilości bieżących asymilatów do bulw. Utrzymanie wyższego plonu bulw było także możliwe dzięki niższemu ograniczeniu powierzchni asymilacyjnej liści odmiany odpornej oraz jej zdolności do przywracania aktywności po ponownym uwodnieniu roślin ocenianej w 9-stopniowej skali regeneracji. Susza glebowa nie spowodowała też istotnych deformacji kształtu ani spękań bulw odmiany odpornej. Podobnie jakość bulw w zbiorze końcowym odmiany odpornej, oceniona na podstawie zawartości węglowodanów (skrobia, sacharoza, cukry redukujące) i azotanów ulegała nieznacznemu pogorszeniu, a zawartość skrobi i witaminy C pozostawała na poziomie roślin kontrolnych. Odmiana odporna na suszę charakteryzowała się także wyższą zdolnością do tolerowania odwodnienia, o czym świadczą zmiany w aktywności i obrazie elektroforetycznym enzymów antyoksydacyjnych (SOD, CAT, GPOX, APX i PPO), które w dużej mierze zależały od badanego organu (liście, korzenie i bulwy) porównywanych odmian. Obserwowane zmiany aktywności peroksydazy gwajakolowej w liściach pod wpływem deficytu wody potwierdzają wcześniej przeprowadzone obserwacje (Boguszewska i in. 2010), że enzym ten może być dobrym wskaźnikiem stopnia tolerancyjności odmian ziemniaka na suszę. Najważniejszym enzymem zaangażowanym w usuwanie RTF u ziemniaka jest dysmutaza ponadtlenkowa (SOD). Zwiększenie jej aktywności obserwuje się zarówno w bulwach jak i liściach oraz korzeniach, ale dopiero po 20-dniowej suszy u odmiany odpornej. Natomiast obniżanie aktywności katalazy w bulwach i brak zmian aktywności tego enzymu w liściach odmiany wrażliwej, mimo 47

48 Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli zwiększonej aktywności SOD może przyczyniać się do powstawania stresu oksydacyjnego, a tym samym do wrażliwości tej odmiany. Przeprowadzone badania wyraźnie wskazują jednak na ilościowy, a nie jakościowy charakter zmian indukowanych deficytem wody. Porównawcza analiza proteomów odmian różniących się tolerancyjnością na odwodnienie wykazała mniejszą ilość markerów białkowych w liściach i bulwach odmiany wrażliwej na suszę. Wydaje się, że odmiana odporna reagowała bardziej dynamicznie na niedobór wody. W przypadku bulw ziemniaka odmiany wrażliwej na suszę glebową (Cekin) cztery białka były syntezowane de novo, a w bulwach odmiany odpornej (Tajfun) wytypowano sześć białek o zwiększonej ekspresji. W bulwach obydwu odmian większość zidentyfikowanych białek to cytosolowe, małe białka opiekuńcze (shsp), ale także inhibitor proteinazy aspartylowej w odmianie Cekin oraz inhibitor proteazy serynowej w odmianie Tajfun. Mimo zwiększonej ekspresji białek enzymatycznych odpowiedzialnych za intensywną fotosyntezę (białko CP24 10A wiążące chlorofil a-b) oraz przeciwdziałających nagromadzaniu RTF (Fe-SOD, glioksyliaza, reduktaza sulfotlenku metioniny i anhydraza węglanowa) w liściach odmiany wrażliwej nie zapobiegły one ani obniżeniu fotosyntezy, ani stresowi oksydacyjnemu. Natomiast zwiększona ekspresja białek odpowiedzialnych za ich syntezę (czynnik inicjujący translację 5A-2; prekursor białka opiekuńczego, syntetaza S- adenozylometioniny), wiązanie kwasów nukleinowych (białko wiążące RNA bogate w glicynę-1a; przypuszczalnie białko podobne do wiążącego RNA bogate w glicynę) oraz za mechanizmy obronne (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego) w liściach odmiany odpornej wydaje się być skutecznym mechanizmem w tolerowaniu odwodnienia. Otrzymane wyniki zdają się potwierdzać sugestię wysuniętą przez Bluma (2011), że mechanizm unikania odwodnienia jest główną i wysoce pożądaną strategią odporności roślin użytkowanych rolniczo na suszę glebową. Dzięki tej strategii rośliny potrafią zatrzymać wodę i tym samym turgor tkanek, a także efektywnie wykorzystać wodę do wzrostu i do tworzenia plonu. W przypadku gdy ta strategia zawodzi, rośliny potrafiące uruchamiać strategię tolerowania odwodnienia zaczynają mieć przewagę w swoim środowisku, ale z punktu widzenia przedłużenia gatunku, a nie ekonomicznie opłacalnego plonu. Prostymi wskaźnikami mogącymi ułatwić proces selekcji roślin o zwiększonej zdolności do unikania odwodnienia mogą być takie wskaźniki jak gęstość aparatów szparkowych. Aktywność peroksydazy gwajakolowej mogłaby być wskaźnikiem ułatwiającym proces selekcji roślin o zwiększonej tolerancyjności na suszę glebową (Boguszewska i in., 2010). LITERATURA Atkinson N. J, Urwin P. E. (2012) J. Exp. Bot.; 63(10): 3523-3543. Blum A. (1988) Plant Breeding for Stress Environments. CRS Press. Blum A. (2011). Funct. Plant Biol. 38(10): 753-757.

XII OGÓLNOPOLSKA KONFERENCJA NAUKOWA ZAKOPANE 2015 Nauka dla hodowli i nasiennictwa roślin uprawnych Zakopane, 2 6 luty 2015 Mapowanie porównawcze głównych genów kontrolujących przywracanie męskiej płodności żyta z cytoplazmami sterylizującymi C i Pampa Stefan Stojałowski 1, Monika Hanek 2, Magdalena Góralska 1, Marta Orłowska 1, Beata Myśków 1 1 Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, ul. Słowackiego 17, 71-434 Szczecin; 2 Poznańska Hodowla Roślin Sp. z o.o. - Pion Hodowli Roślin, Oddział Wiatrowo, Wiatrowo 16, 62-100 Wągrowiec; sstojalowski@zut.edu.pl Pierwsze odmiany mieszańcowe żyta zarejestrowano w Niemczech w połowie lat osiemdziesiątych XX wieku. Dziesięć lat później trafiły one również do Polski. Od tego czasu ich znaczenie systematycznie rośnie. Produkcja nasienna odmian mieszańcowych oparta jest o systemy cytoplazmatycznej męskiej sterylności (CMS). Rosnąca popularność tych odmian wpływa więc na ograniczenie naturalnej zmienności genetycznej, która występuje w obrębie genomów cytoplazmatycznych w tradycyjnych odmianach populacyjnych. W hodowli żyta dominuje wykorzystanie cytoplazmy sterylizującej Pampa (CMS-P), ale prowadzone są również prace z użyciem innych źródeł CMS, dzięki czemu w przyszłości możliwe będzie uniknięcie całkowitego ujednolicenia cytoplazm w plantacjach żyta. Jedną z cytoplazm, która może stanowić w hodowli alternatywę dla CMS-Pampa jest cytoplazma C (CMS-C). Zarówno CMS-P, jak i CMS-C charakteryzują się złożonymi mechanizmami przywracania płodności przez geny jądrowe (tzw. restorery). Jak dotąd nie udało się tych mechanizmów poznać w pełni, ale wiadomym jest, że przywracanie płodności uwarunkowane jest przez kilka genów o zróżnicowanej sile działania. Od około dziesięciu lat wiadomo, że najefektywniejsze restorery dla obu badanych źródeł CMS znajdują się na długim ramieniu chromosomu 4R. Celem prowadzonych badań było stworzenie wysoko-zagęszczonych map genetycznych obejmujących obszar występowania głównych genów restorerowych dla CMS-C (Rfc1) i CMS- Pampa (Rfp1) i na ich podstawie porównanie lokalizacji obu badanych genów. Materiał badawczy wytworzono w wyniku kilkuletnich prac hodowlanych. Męskosterylna linia wsobna 544C z cytoplazmą C została 49

Sesja referatowa 1 Osiągnięcia nauk podstawowych i stosowanych w hodowli skrzyżowana z efektywnie przywracającą płodność linią Ot0-20. Następnie wykonano serię krzyżowań wstecznych wypierających przez pięć kolejnych sezonów pyłek z płodnych roślin mieszańcowych wykorzystywano do zapylania męskosterylnej linii matecznej 544C. W pokoleniu BC 5 kilka płodnych roślin poddano samozapyleniu i otrzymano populację mapującą BC 5 F 2, która poddana została ocenie fenotypowej. Podobny schemat postępowania zastosowano przy tworzeniu populacji mapującej z cytoplazmą Pampa, z tą różnicą, że funkcję męskosterylnej linii (powracającego partnera w krzyżowaniach wstecznych) pełniła linia wsobna 541P, a źródłem genów przywracających płodność była losowo wybrana pojedyncza roślina z populacji IRAN IX (udostępnionej przez prof. H.H. Geigera). Populacja otrzymana po skrzyżowaniu linii 541P z rośliną IRAN IX również była poddana ocenie fenotypowej w pokoleniu BC 5 F 2. Oceny płodności w obu populacjach mapujących wykonywano wzrokowo na dobrze rozkrzewionych roślinach stosując skalę bonitacyjną Geigera i Morgensterna (1975). Poprawność oceny weryfikowano oceniając zawiązywanie ziaren pod izolatorami z tomofanu, które przed kwitnieniem zakładano na kłosy wszystkich roślin. Z obu populacji liczących powyżej 800 roślin każda, wybrano po 90 osobników, z których połowa reprezentowała formy w pełni męskosterylne, a połowa silnie męskopłodne. DNA wybranych roślin wyizolowano z liści pobranych na początku strzelania w źdźbło. W badaniach wykorzystano markery oparte o metodę PCR (głównie SCAR), oraz markery DArT (otrzymywane metodą mikromacierzową), a także zastosowano metodę GBS (ang. Genotyping by Sequencing), opartą o wykorzystanie technik NGS - sekwencjonowania nowej generacji (ang. Next Generation Sequencing). Metoda ta pozwala na uzyskanie w nowej generacji sekwenatorach DNA danych, które po analizie bioinformatycznej służą do genotypowania roślin generując duże ilości markerów molekularnych, głównie z kategorii SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism). Analizy GBS zostały zlecone w firmie Diversity Arrays Technology w Australii. Mapowanie genetyczne przeprowadzono przy użyciu programu JoinMap 3.0. Uzyskano wysoko-zagęszczone mapy genetyczne obejmujące fragmenty chromosomu 4RL. Na podstawie markerów występujących jednocześnie na obu mapach porównano lokalizację genów Rfc1 i Rfp1 i stwierdzono ich bardzo bliskie sąsiedztwo. Wstępnie oceniono też potencjalną przydatność znajdujących się w tym obszarze markerów SCAR do prac selekcyjnych. Prace wykonano w ramach badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej finansowanych przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi 50