Dr hab. Jolanta Król Katedra Towaro znawstwa i Przetwórstwa Suowców Zwierzęcych Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Mi]eny Kilichowskiej pt.: "Analiza wpbrwu po]imorfizmu wybranych genów na wydajność mleczną oraz zawartość bialka w mleku krów" wykonanej pod kierunkiem dr hab. inł Marii Bogdzlńskiej, profiesor nadzw. UTP w Bydgosbczy Promotor pomocniczy: dr inż. Bogna Kowaliszyn Przedłożona do oceny praca, pod względem fomalnym została przygotowana zgodnie z zasadami przyjętymi dla tego typu opracowań, z podziałem na odpowiednie rozdziały i podrozdziały. Kolejne rozdziały stanowią logiczną całość, są opracowane przejrzyście, umożliwiając czytelnikowi zapoznanie się z założeniami pracy. Rozprawa liczy w sumie 88 stron tekstu, na które składają się: wstęp połączony z celem pracy - 2 strony, przegląd literatuy - 18 stron, materiał i metody -5 stron, wyniki i dyskusja -37 stron, podsumowanie i wnioski -2 strony, bibliografia -13 stron, streszczenia w języku polskim i angielskim -4 strony. Uważam jednak, że obecny tytuł pracy Analiza wpływu polimorfizmu wybranych genów na wydajność mleczną oraz zawartość białka w mleku krów" nie jest w pełni zgodny z zakresem badań w niej przeprowadzonych. Zdaniem recenzenta powinien on brzmieć: Analiza wpływu polimorfizmu wybranych genów na wydajność mleczną oraz zawartość podstawowych składników w mleku". Nowoczesna hodowla coraz częściej sięga po najnowsze możliwości oceny produkcyjności zwierząt. Badania genetyczne pozwalają na określenie korzystnych genotypów w obrębie interesujących nas cech, czego konsekwencją jest wzmożona selekcja zwierząt prowadząca do bardziej efektywnej hodowli. Od wielu lat prowadzone są badania nad ustaleniem zależności między obecnością różnych markerów genetycznych a cechami produkcyjnymi zwierząt. W hodowli bydła szczególną uwagę zwrócono na geny białek mleka. Wyniki badań dotyczące polimorfizmu genów kodujących białka mleka coraz częściej 1
wprowadza się do pracy hodowlanej jako dodatkowe parametry selekcyjne. Dotyczy to przede wszystkim wariantów genetycznych kappa-kazeiny (CASK) i beta-laktoglobuliny (BLG) oraz ich wpływu na zawartość białka. Wiele stacji zajmujących się inseminacją bydła mlecznego, zarówno w Europie, jak i w Ameryce Północnej, zamieszcza już określony genotyp CASK i BLG w katalogach handlowych jako molekulamy marker genetyczny. Imymi genami kandydującymi, które cieszą się coraz większym zainteresowaniem są geny hormonu wzrostu i prolaktyny. W przyszłości mogą zostać uwzględnione w programach hodowlanych bydła mlecznego i przełożyć się na korzyści ekonomiczne dla producentów mleka. W związku z tym analiza genetycznego potencjału produkcyjnego cech użytkowych krów utrzymywanych w województwie kujawsko-pomorskim, a szczególnie składu pozyskiwanego od nich mleka, jest ze wszech miar wskazana i potrzebna. Wprowadzeniem do pracy jest Wstęp", w którym Doktorantka przedstawiła ogólne informacje uzasadniające celowość podjętych badań. Uważam, iż przedstawiona przez Autorkę tematyka jest zasadna, nawiązująca do aktualnych problemów praktycznych. Celem badań było określenie wpływu polimorfizmu genów białek mleka (BLG i CASK) oraz hormonów płata przedniego przysadki mózgowej (hormonu wzrostu i prolaktyny) na wydajność mleczną oraz zawartość podstawowych składników (białka i tłuszczu) w mleku krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej utrzymywanych na terenie województwa kujawskopomorskiego. Brakuje jednak w celu pracy uwzględnienia kolejnej laktacji oraz systemu utrzymania zwierząt. Przegląd piśmiennictwa ocenianej pracy jest poprawny. Doktorantka dokonała analizy istniejącego stanu wiedzy w zakresie tematyki rozprawy w oparciu o piśmiennictwo, zarówno krajowe, jak również zagraniczne (łącznie 151 pozycji). Uważam jednak, iż nie wykorzystała w wystarczającym stopniu pozycji najbardziej aktualnych z tego zakresu. Kolejny rozdział to Materiał i metody", w którym Autorka dokładnie opisała sposób przeprowadzenia badań molekulamych, w tym izolację genomowego DNA, reakcję łańcuchową polimerazy, reakcję PCR-RFLP dla czterech genów, tj. BLG, CASK, hormonu wzrostu i prolaktyny. Genotypy BLG oznaczono metodą PCR-RFLP według metodyki Badoli i wsp. [2003], CASK według Riaz i wsp. [2008], homonu wzrostu - Moravćikova i Trakowicka [2012], a prolaktyny -Li i wsp. [2006]. Materiał biologiczny stanowiła krew pobrana z żyły jarzmowej od 299 krów rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej odmiany czamo-białej. Zwierzęta pochodziły z dwóch stad, w jednym z nich krowy (149 sztuk) utrzymywane były w systemie wolnostanowiskowym z dostępem do wybiegu, w drugim (150 sztuk) -w systemie alkierzowym. Moim zdaniem 2
brakuje dokładniejszego opisu obu stad zwierząt, głównie odnośnie stosowanego systemu żywienia. Dane dotyczące wydajności dobowej oraz składu mleka analizowanych krów uzyskano, jak podaje Doktorantka, z dokumentacji hodowlanej prowadzonej przez gospodarstwa utrzymujące stada. Zapewne jest to dokumentacja prowadzona przez Polską Federację Hodowców Bydła i Producentów Mleka? W jaki sposób Doktorantka przeprowadziła standaryzację zgromadzonych danych dla 305-dniowej laktacji? - Zgromadzone dane zestandaryzowano dla 305-dniowej laktacji". Dodatkowo brakuje infomacji z jakiego okresu pochodziły analizowane dane. Wyniki opracowano statystycznie wykorzystując program STATISTICA, w oparciu o jednoczymikową (ANOVA) i wieloczymikową analizę wariancji (MANOVA) w układzie dwuczynnikowym. Do oceny zgodności rozkładów z rozkładem nomalnym zastosowano test Kołmogorowa-Smimowa. Wyniki badań zostały zaprezentowane w postaci 41 tabel i 16 wykresów. Uważam jednak, że w wielu przypadkach zbędne było powielanie tych samych wyników w formie tabelarycznej i graficznej. Przy opracowaniu tabel niepotrzebnie je rozdrobniono, m.in. tabele dotyczące wydajności mlecznej, zawartości suchej masy, białka i tłuszczu (tabele 10 i 11,13 i 13a, 19 i 19a;, 26 i 26 a, 30 i 30a), czy tabele przedstawiające oddzielnie wartości średnie i odchylenia standardowe (17 i 17a, 20 i 20a, 22 i 22a, 28 i 28a, 31 i 31a). Wyniki wydajności i składu chemicznego mleka dla każdego analizowanego genu oraz wyniki średnie i odchylenie standardowe powinny być prezentowane w jednej tabeli, gdyż takie rozdrobnienie tabel nie sprzyja klarowności i utrudnia czytanie pracy. Dodatkowo w tabelach przedstawiających charakterystykę badanych stad krów (tabela 10 i 11 ) Autorka podała jedynie wartości średnie, brakuje odchylenia standardowego. Pewnyin uchybieniem jest również nie umieszczenie w tabelach liczebności prób w poszczególnych grupach doświadczalnych. Doktorantka w tabelach oraz w trakcie omawiania wyników posługuje się niewłaściwym określeniem systemu utrzymania krów system wolnowybiegowy", właściwszym określeniem j est system wolnostanowiskowy". Autorka omawiając wyniki badań wykorzystuje również naprzemiemie różne nazwy systemów (alkierzowy, wolnostanowiskowy, wolnowybiegowy, wolny wybieg), co nie zawsze odpowiada wynikom prezentowanym w tabelach. Zastanawiam się czy jest to błąd redakcyjny czy nieznajomość tematu. Bardzo proszę, zatem Doktorantkę o wyj aśnienie różnić pomiędzy analizowanymi systemami utrzymania zwierząt. Przedstawione przez Autorkę wyniki zostały przedyskutowane w oparciu o prace oryginalne, zarówno autorów krajowych, jak i zagranicznych w rozdziale zatytułowanym 3
Wyniki i dyskusja". Oceniając treść tego rozdziału stwierdzam, Że mgr inż. Milena Kilichowska bardzo dojrzale potrafi porównać wyniki swoich badań z wynikami opublikowanymi przez innych autorów, co zasługuje na podkreślenie. W trakcie lektuy pracy zauważyłam jednak pewne rozbieżności w interpretacji analizy statystycznej między tćkstem a opisem wykresów. Doktorantka opisując istotne różnice (bez podania poziomu istotności) odnosi się do poszczególnych wykresów, na których nie ma zaznaczonych istotności. W wyniku przeprowadzonych badań Autorka potwierdziła, Że obecność allelu 8 CASK związana była z reguły z niższą wydajnością krów, przy jednocześnie wyższej zawartości suchej masy i białka w mleku. Obecność allelu A BLG była związana z wyższą wydajnością mleka oraz niższą zawartością składników suchej masy. Jednak nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy genotypem a analizowanymi parametrami. Istotne różnice wynikały z zastosowania różnych systemów utrzymania zwierząt. W przypadku BLG, w obrębie alkierzowego systemu utrzymania, Doktorantka stwierdziła istotne różnice pomiędzy genotypami a wydajnością mleczną, zawartością białka i tłuszczu. Istotne różnice wykazano również między genotypami prolaktyny a zawartością tłuszczu w mleku. Najwyższą zawartość tego składnika zanotowano u osobników o genotypie AA. Należy zaznaczyć, Że polimorfizm genu prolaktyny określono jedynie dla stada utrzymywanego alkierzowo. Stąd moje pytanie: Dlaczego dla prolaktyny nie przeprowadzono badań, tak jak w przypadku pozostałych genów, wśród zwierząt utrzymywanych w systemie wolnostanowiskowm? Wartość pracy mierzy się głównie konkluzją wyrażoną w formie wniosków końcowych. Oceniana praca zakończona jest rozdziałem Podsumowanie i wnioski", który zawiera 6 punktów. W pierwszych 5 punktach podano najważniejsze stwierdzenia wynikające z przeprowadzonych badań, jednakże należałoby się zastanowić, czy są one prawidłowo opracowane. Czy informacje na temat najatrakcyjniejszego konsumencko mleka" wskazują na zrealizowanie celu głównego pracy. Jakie mleko Doktorantka przyjęła za wzorzec przy ocenie jego atrakcyjności dla konsumenta? Z kolei punkt 6 można potraktować jako pewną wskazówkę odnoszącą się do dalszego doskonalenia zwierząt skierowaną przede wszystkim do hodowców, jak również przemysłu mleczarskiego. Jednak czy stwierdzenie o idealnej krowie" nie jest na wyrost, biorąc pod uwagę, że Doktorantka przeprowadziła badania na niewielkiej populacj i. Z obowiązku recenzenta pragnę również zwrócić uwagę na inne niedociągnięcia zauważone w pracy : 4
- W Rozdziele 2 niepotrzebnie zamieszczono pkt. 2.1.2. Porównanie ras krów mlecznych" - przecież to nie było tematem pracy. - Niezręczne sforinułowano tytuł podrozdziału Analiza wpływu polimorfizmu kappa kazeinymeta-laktoglobulinymorinonu wzrostu/prolaktyny na zawartość białka i tłuszczu w mleku oraz suchej masy" (strony: 41, 50, 60, 66) proponuję zastąpić... na zawartość suchej masy, w tym białka i tłuszczu". - Łączne pisanie nazwy białka betalaktoglobulina", powinno być beta-laktoglobulina. Uważam dodatkowo, że Doktorantka powima używać międzynarodowego nazewnictwa genów, co jest powszechnie przyjęte. - Wykresy 3 i 4 umieszczone na stronach 39 i 40 to te same wykresy. - Brakuje omówienia w tekście wyników przedstawionych w tabeli l3a. - Błędnyopispodfot. 4. - Drobne błędy redakcyjne, np. str. 55, 67, 70 zaznaczono w ocenianym egzemplarzu Pracy. Wykazane w recenzji uwagi nie obniżają w sposób znaczący wartości pracy i mogą być w większości przypadków skorygowane przy przygotowywaniu pracy do publikacji. Wniosek końcowy Podsumowując stwierdzam, że dysertacja doktorska mgr inż. Mi]eny Ki]ichowskiej pt. Analiza wpbrwu polimorfizmu wybranych genów na wydajność mleczną oraz zawartość bialka w mleku krów" spelnia wszystkie kryteria stawiane tego rodzaju pracom naukowym określone w art. 13. Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytu]e w zakresie sztuki z dnia 14 marca 2003 roku (Dz. U. Nr 65, poz. 595) z późniejszymi zmianami i może być podstawą do nadania stopnia naukowego doktora w dziedzinie nauk rolniczych w dyscyplinie zootechnika. W związku z powyższym przedkladam Wysokiej Radzie Wydzialu Hodow]i i Bio]ogii Zwierząt Uniwersytetu Techno]ogicznolprzyrodniczego w Bydgoszczy wniosek o dopuszczenie Pani mgr inż. Mi]eny Kilichowskiej do da]szych etapów przewodu doktorskiego. Lublin, 5 grudnia 2017 r. 5