MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 241-254 Stanisław Kałużewski, Waldemar Rastawicki Serologiczna diagnostyka objawowych zakażeń wywoływanych w Polsce w latach 1970-2010 przez Mycoplasma pneumoniae Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Przedmiotem badań była próba retrospektywnej analizy wiarygodności serologicznej diagnostyki mykoplazmozy w następstwie wprowadzenia w Polsce metody ELISA w miejsce klasycznych metod diagnostycznych, jak odczyn wiązania dopełniacza i odczyn immunoelektroprecypitacji. Analizą objęto wyniki badań przeprowadzonych w latach 1970-2010 u ponad 300 tysięcy osób z zakażeniami układu oddechowego. Mycoplasma pneumoniae należy do bakteryjnych, etiologicznych czynników zapalenia płuc, charakteryzującego się epidemicznym występowaniem co 3 do 5 lat, sezonowym nasilaniem zachorowań w okresie jesienno-zimowym oraz dotyczącym głównie dzieci i młodzieży w wieku od 3 do 16 lat (1,32). Objawowe oraz skąpoobjawowe zakażenia stanowią zaledwie 20% ogółu przypadków zakażeń tymi bakteriami (6). W sytuacjach rodzinnych kontaktów z chorym na mykoplazmozę około 40% osób może przechodzić zakażenie bezobjawowo a wśród rekrutów wojskowych i osób pozostających w innych zamkniętych środowiskach, w długotrwałym bliskim kontakcie z chorym, odsetek osób zakażonych może sięgać nawet 70% (32). Gnarpe i wsp. (8) w 1992 r. izolowali M. pneumoniae od 13,5% zdrowych ochotników, natomiast w wyniku badań częstości nosicielstwa M. pneumoniae przeprowadzonych w 1993 r. w USA, w epidemicznym okresie występowania zakażeń dodatni wynik posiewu uzyskano u 10% zdrowych żołnierzy (6). W serodiagnostyce mykoplazmozy napotyka się szereg trudności w interpretowaniu wyników większości dotychczas wykorzystywanych metod wykrywania przeciwciał swoistych wyłącznie dla M. pneumoniae. Głównie należy się liczyć ze zjawiskiem molekularnej mimikry między glikolipidowymi antygenami M. pneumoniae a związkami obecnymi w tkankach człowieka i poinfekcyjnym stymulowaniem procesu autoimmunizacji dla takich substancji i narządów jak: keratyna, fibrynogen, mózg, wątroba, trzustka, nerki, mięśnie gładkie i płuca (5, 7, 32). Już w 1981 r Pőnka i wsp. (19) zauważyli, ze serologiczna odpowiedź na glikolipidowy antygen M. pneumoniae nie powinna być przyjmowana jako dowód aktywnego zakażenia mykoplazmowego, a raczej jako następstwo uprzednio przebytego zakażenia, skutkującego powikłaniami poza układem oddechowym.
242 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 U 25% osób z potwierdzonym zakażeniem M. pneumoniae może dojść do pozapłucnych powikłań w różnym okresie choroby, u dzieci zazwyczaj po dwóch tygodniach od wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego, co z reguły wiąże się z długotrwałym utrzymywaniem się wysokiego poziomu przeciwciał klasy IgG. Częstość rozpoznawania powikłań ma charakter retrospektywny, ponieważ następuje w okresie znacznego wzrostu poziomu przeciwciał dla M. pneumoniae następującego między uzyskaniem pierwszej próbki surowicy podczas ostrej fazy choroby a próbki pobranej w okresie rekonwalescencji (7). Przeciwciała klasy IgM, z reguły przyjmowane jako dowód ostrego okresu mykoplazmozy, pojawiają się dwa tygodnie wcześniej niż IgG (32). Wykrycie przeciwciał IgM ma znacznie większe znaczenie w diagnostyce mykoplazmozy u dzieci niż u dorosłych, gdyż mogą oni nie wytwarzać IgM w następstwie zakażenia, najczęściej będącego reinfekcją. Na znaczną odrębność immunologicznej odpowiedzi humoralnej na antygeny M. pneumoniae dzieci do 5 lat, a więc najczęściej po raz pierwszy zapadających na mykoplazmozę, świadczą wyniki oznaczania podklas IgG. Badania te wykazały całkowity brak odpowiedzi w podklasie IgG2 u dzieci, przy ich dominacji u osób powyżej 20 roku życia (28). Lepszym sygnałem aktualnego zakażenia M. pneumoniae może być wykrycie surowiczych przeciwciał klasy IgA, niezależnie od wieku chorych. Pojawiają się one szybciej w przebiegu choroby i szybciej obniża się ich poziom niż przeciwciał klasy IgM i IgG (28). W diagnostyce mykoplazmozy trudno jest uznać za złoty standard wyniki uzyskiwane techniką PCR bez dobrego rozeznania skali nosicielstwa zarazka w populacji zdrowych osób, tak w okresach endemicznego jak i epidemicznego występowania zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae (32). Dlatego też wydaje się, że izolacja zarazka drogą czasochłonnej hodowli, jak i wykrycie wysoce czułymi technikami biologii molekularnej DNA swoistego dla M. pneumoniae (np. RT-PCR), przy prawdopodobnie znacznym, ale słabo udokumentowanym rozpowszechnieniem nosicielstwa zarazka w populacji zdrowych osób, nie zastąpią wyniku badania serologicznego wykazującego w przebiegu choroby narastanie poziomu swoistych przeciwciał dla białkowych antygenów M. pneumoniae, uprawniającego lekarza do podjęcia etiotropowej antybiotykoterapii. Czterdzieści lat wykonywania laboratoryjnej diagnostyki mykoplazmozy w Zakładzie Bakteriologii PZH i większości stacji sanitarno-epidemiologicznych upoważnia do podjęcia próby udzielenia odpowiedzi na pytanie, czy i w jakim stopniu odstąpienie od posługiwania się klasycznymi, serologicznymi metodami diagnostycznymi wpłynęło w Polsce na wiarygodność wyników laboratoryjnej diagnostyki zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem retrospektywnej analizy były wyniki badań przeprowadzonych w Pracowni Mycoplasma Zakładu Bakteriologii PZH w latach 1970-1987 oraz nadsyłane w latach 1985-2010 z serologicznych pracowni stacji sanitarno-epidemiologicznych kwartalne, zbiorcze zestawienia wyników badań diagnostycznych w kierunku zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae. Zestawienia te zawierały liczbę osób i próbek materiału od nich uzyskanego oraz liczbę osób z dodatnim wynikiem badania.
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 243 Z chwilą, gdy pracownie odstępowały od wykonywania badań odczynem wiązania dopełniacza (OWD) wprowadzając w jego miejsce test ELISA, w Polsce głównie zestaw firmy Virotech, zakres dostarczanych do PZH informacji ulegał zmianie. Otrzymywano wówczas sumaryczne, kwartalne dane o liczbie osób i próbek materiału oraz liczbie osób z dodatnim wynikiem badania z rozróżnieniem sytuacji w których wykryto diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał wyłącznie klasy IgM lub IgM + IgG, bądź tylko klasy IgG. W przypadku badań wykonywanych w Pracowni Mycoplasma PZH równolegle dwoma odczynami (OWD i OIEP), szczegółowej analizie poddano wyniki oznaczeń poziomu przeciwciał przeprowadzonych w latach 1970-1987 w 17.637 próbkach surowicy, pochodzących od 5.824 osób. Próbki materiału dostarczano łącznie ze specjalnie opracowanym w PZH załącznikiem zawierającym następujące informacje: nazwisko i imię pacjenta, wiek, miejsce zamieszkania, rozpoznanie kliniczne, datę zachorowania, numer historii choroby (w przypadku pacjentów hospitalizowanych), dane o podawanych antybiotykach w ciągu 48 godzin poprzedzających pobranie materiału, datę pobrania materiału, nazwę i adres zakładu przysyłającego materiał oraz podpis z pieczątką lekarza zlecającego badanie. Ogółem w latach 1970-2010 zebrano dane z terenu całego kraju dotyczące wyników oznaczania poziomu przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae u 312.917 osób. Odczyn wiązania dopełniacza. OWD wykonywano z homogenizowaną ultradźwiękami zawiesiną komórek M. pneumoniae szczepu FH. Preparaty antygenu różnych serii w użytkowym rozcieńczeniu zawierały od 50 do 83 µg/ml białka mykoplazmowego. Przygotowywano je w Pracowni Mycoplasma PZH, tak dla potrzeb własnych jak i poczynając od 1985 roku, dla potrzeb serologicznych pracowni stacji sanitarno-epidemiologicznych. Metodykę przygotowywania antygenu, kontrolnej surowicy odpornościowej oraz wykonania odczynu na płytkach metapleksowych opisano uprzednio (11, 15) Oznaczenia wykonywano z surowicami rozcieńczonymi od 1:5 do 1:2560, przyjmując za końcowy punkt reakcji hemolizę 50% krwinek. Jako wynik diagnostycznie znamienny przyjęto miano 60, przy jednorazowym badaniu lub czterokrotny wzrost miana przeciwciał przy badaniu kolejnych próbek krwi pobieranej w odstępach 7-10 dni. Odczyn immunoelektroprecypitacji. OIEP wykonywano zgodnie z metodyką opisaną uprzednio, przy użyciu komórkowego antygenu uzyskiwanego ze szczepu FH M. pneumoniae. Preparat antygenu w użytkowym rozcieńczeniu o zawartości białka 1 mg/ ml wprowadzano do zagłębień w żelu agarozowym o pojemności 30 µl. Próbki surowicy w rozcieńczeniach od 1:2 do 1:128 wprowadzano do zagłębień o pojemności 50 µl. Wyniki testu odczytywano po 30-45 minutach od zakończenia elektroforezy trwającej 60 minut, przy natężeniu prądu 90 ma i napięciu 120 V. Jako dodatni wynik testu przyjmowano wystąpienie jednego prążka precypitatu z surowicą w rozcieńczeniu 1:2 lub większym. Przydatność OIEP do diagnostyki mykoplazmozy oceniano w Pracowni Mycoplasma PZH kilkakrotnie, porównując wyniki uzyskiwane tym testem z wynikami innych testów, w tym ELISA. Wyniki tych ocen publikowane w latach 1978-1996 dostarczyły dowodów wysokiej przydatności OIEP do wczesnej diagnostyki mykoplazmozy, szczególnie u dzieci (12, 14, 16, 22, 24). Odczyn ELISA. Badania wykonywano zgodnie z instrukcjami dostarczanymi do komercyjnych zestawów diagnostycznych, przyjmując podane w nich wytyczne dotyczące interpretacji wyników. W większości laboratoriów stacji sanitarno-epidemiologicznych (ponad 85%) posługiwano się zestawami produkcji firmy Virotech, oznaczając poziom przeciwciał klas IgM i IgG, wyjątkowo również klasy IgA.
244 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Serologiczną diagnostykę mykoplazmozy przy użyciu antygenów swoistych dla M. pneumoniae, zapoczątkowaną w Pracowni Mycoplasma Zakładu Bakteriologii PZH w 1969 roku, wykorzystywano dla potrzeb klinicystów w szerszym zakresie dopiero od listopada 1970 r. gdy w dwóch klinikach Akademii Medycznej w Warszawie Diagnostyki i Terapii Chorób Dzieci hospitalizowano blisko czterokrotnie więcej dzieci z zapaleniem płuc niż w odpowiednich okresach lat 1967-1969. O sięgnięciu po serodiagnostykę mykoplazmozy zadecydowały przypadki zapalenia płuc o odmiennym od dotychczas obserwowanego zespole objawów klinicznych i obrazie radiologicznym (34). Wykazanie mykoplazmowej etiologii tych zachorowań w jesienno-zimowym okresie lat 1970/71 dało początek regularnej diagnostyce zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae prowadzonej w Zakładzie Bakteriologii PZH, a od 1985 r. włączonej również do usługowej działalności laboratoriów stacji sanitarno-epidemiologicznych. Zachorowania występujące w jesienno-zimowym okresie lat 1970/71 były pierwszą w Polsce udokumentowaną falą epidemicznego występowania zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae (13, 34). W latach 1970-2010 serologicznemu badaniu w kierunku zakażeń M. pneumoniae poddano próbki surowicy pochodzące od blisko 313 tysięcy osób z ostrymi schorzeniami układu oddechowego, głównie zapaleniem płuc. Relacje między liczbami osób od których pochodziły próbki materiału w poszczególnych latach a liczbami osób z dodatnim wynikiem badania ilustruje rycina 1. W latach 1992-2002 było to ponad 10.000 osób rocznie a w okresie 1994-1997 ponad 30.000, z wyraźnie zaznaczonymi okresami epidemicznego wzrostu liczby objawowych zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae. Kolejne fale epidemicznego nasilenia mykoplazmozy, po okresie 1970/71 przypadły na lata 1975/76, 1980/81, 1985/86, 1992/93 oraz 2006/07 (Ryc. 2). Epidemiczne okresy 1975/76 i 1992/93 poprzedzone były okresami niskiej zapadalności ogólnej, liczonej na 100.000 100000 10000 Liczba osób (log) 1000 100 Osoby badane 10 Osoby z dodatnim wynikiem badania 1 1985 1990 1995 2000 2005 2010 Rycina 1. Liczba osób badanych w latach 1985-2010 w kierunku zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae oraz liczba osób z wynikiem dodatnim w badaniach serologicznych.
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 245 40 Osetek wyników dodatnich 35 30 25 20 15 10 5 0 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 Rycina 2. Odsetek osób z serologicznie potwierdzonym zakażeniem wywołanym przez M. pneumoniae w latach 1970-2010. Odsetek osób z dodatnim wynikiem testu ELISA 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 IgM lub IgM+IgG Wyłącznie IgG 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Rycina 3. Udział przeciwciał klasy IgM oraz IgM + IgG, lub tylko klasy IgG, jako wyłącznej podstawy dodatniego wyniku testu ELISA w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae w latach 2000-2010 przy jednorazowym pobraniu krwi od 35621 chorych osób. mieszkańców, szczególnie w latach 1987-1990, wynoszącej od 0,2 do 0,5 i odnotowanym w ciągu kolejnych dwóch lat, szybkim jej wzrostem dochodzącym w latach 1993-1996 do poziomu 16,8, utrzymującego się przez cztery kolejne lata, bez uprzednio obserwowanych w Polsce okresów zacisza międzyepidemicznego (Ryc. 2 i 4). Poczynając od 2000 r. odnotowano występowanie zmian w stosunku do uprzednio obserwowanego w Polsce sezonowego nasilania się częstości objawowych zakażeń M. pneumoniae diagnozowanych na podstawie wyników badań serologicznych. W poprzednich publikacjach z lat 1998 i 2003 dotyczących występowania mykoplazmozy w Polsce odnotowywano zmiany, nie podejmując prób wyjaśniania ich przyczyn (25, 26, 27). Zmiany w częstości epidemicznego występowania mykoplazmozy, jak i endemicznych okresów odnotowywano również w innych krajach. W Danii, po epidemicznej fali zachorowań z lat 2004/2005 utrzymywała się przez dwa lata stosunkowa wysoka zapadalność, po czym w latach 2008-2009 uzyskiwano jedynie 3% dodatnich wyników, by w październiku 2010 r. odnotować początek kolejnego okresu epidemicznego (20). W Anglii i Walii, podobnie jak
246 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 14 12 IgM lub IgG+IgM wyłącznie IgG Odsetek wyników dodatnich. 10 8 6 4 2 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Rycina 4. Częstość występowania serologicznie potwierdzonych przypadków mykoplazmozy w poszczególnych kwartałach w latach 2000-2010 w Polsce. w Danii, ostatnia fala epidemicznego występowania mykoplazmozy przypadła na okres od października 2010 do stycznia 2011 roku (2). W Polsce jedną z przyczyn tego typu zmian mogło być stopniowe wprowadzanie, w miejsce dotychczas wykonywanego OWD testu ELISA, jako mniej pracochłonnego i umożliwiającego określenie poziomu przeciwciał w poszczególnych klasach immunoglobulin. Ułatwiało to serologicznym pracowniom uzyskiwanie akredytacji uprawniającej do świadczenia usług diagnostycznych. Przyjęcie diagnostycznej procedury na podstawie instrukcji producenta komercyjnego zestawu diagnostycznego zwalniało laboratorium ubiegające się o akredytację od przeprowadzania we własnym zakresie pracochłonnego procesu walidacji testu diagnostycznego i dostosowania interpretacji wyników do epidemiologicznej specyfiki kraju i wieku osób, u których głównie wykonuje się badanie. Z porównania danych przedstawionych w tabelach I i III wynika, że w 2000 r. z ogólnej liczby próbek surowicy pochodzących od 14.133 osób (Tabela I), u 1610 chorych (Tabela II) badanie wykonano testem ELISA (11,4%), podczas gdy w 2006 r. udział wyników uzyskanych tym testem wzrósł do 78,6%. Udział wyników dodatnich, wykazywanych wyłącznie na podstawie wykrycia przeciwciał klasy IgG wzrastał poczynając od 8,8% w 2000 roku do 61,7% w roku 2008 (Tabela II). Tak więc, nie przestrzegając przyjętej w serodiagnostyce jako optymalna zasady wykazywania dynamiki przeciwciał w trakcie procesu chorobowego, przyjęto w 2008 roku u 61,7% badanych osób jednorazowe wykrycie poziomu przeciwciał klasy IgG równego, lub powyżej poziomu odcięcia (cut off) określonego przez producenta zestawu diagnostycznego za dodatni wynik mogący stanowić podstawę rozpoznania mykoplazmozy. Jak wynika z publikacji Talkington i wsp. (29) oceniających przydatność 8 komercyjnych zestawów ELISA, przeciwciała klasy IgG wykrywane u 73-82% ozdrowieńców są pozostałością po przebytym zakażeniu (29). W latach 1970-1987 dwukrotne badanie poziomu przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae zlecano u 30-40% osób podejrzanych o mykoplazmozę układu oddechowego. W latach 1988-1995 wykonywano je dwukrotnie u około 10% chorych osób a poczynając od 1996
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 247 Tabela I. Wyniki serologicznych badań wykonanych OWD lub testem ELISA w kierunku zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae, przeprowadzonych w latach 1985-2010 w stacjach sanitarno-epidemiologicznych i Pracowni Mycoplasma Zakładu Bakteriologii PZH, w zestawieniu z zapadalnością na mykoplazmozę. Rok Liczba osób Zbada- -nych Odsetek osób z wynikiem dodatnim Zapada- -lność na 100 tys. osób Rok Liczba osób Z wyni- -kiem dodatnim Zbada- -nych Z wyni- -kiem dodatnim Odsetek osób z wynikiem dodatnim Zapada- -lność na 100 tys. osób 1985 8957 3050 34,1 8,1 1998 28555 4749 16,6 12,3 1986 12720 1978 15,6 5,2 1999 15060 2436 16,2 6,3 1987 6512 194 3,0 0,5 2000 14133 2283 16,2 5,9 1988 4230 90 2,1 0,2 2001 14894 2433 16,3 6,3 1989 3785 94 2,5 0,2 2002 10852 1519 14,0 4,0 1990 4289 98 2,3 0,3 2003 4965 379 7,6 1,0 1991 5779 560 9,7 1,5 2004 6672 500 7,5 1,3 1992 16372 3588 21,9 9,3 2005 4078 575 14,1 1,5 1993 20770 4784 23,0 12,4 2006 7248 1021 14,1 2,7 1994 32689 6029 18,4 15,6 2007 5834 1010 17,3 2,7 1995 32237 6231 19,3 16,2 2008 5266 486 9,2 1,3 1996 32301 6500 20,1 16,8 2009 3374 335 9,9 0,9 1997 30540 3768 12,3 9,8 2010 2467 216 8,8 0,6 Tabela II. Udział przeciwciał klasy IgM, IgM+IgG lub IgG jako wyłącznej podstawy dodatniego wyniku testu ELISA w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae przeprowadzonej w latach 2000-2010 przy jednorazowym pobraniu krwi od 35621 osób. Liczba osób Przeciwciała wykryto: Wyłącznie w klasie W klasach IgM i Wyłącznie w klasie Z wynikiem do- Rok Zbadanych Liczba Liczba IgM IgG IgG datnim Odsetek* Odsetek* Liczba Odsetek* osób osób osób 2000 1610 548 86 15,8 414 75,5 48 8,8 2001 2392 756 208 27,5 442 58,5 106 14,0 2002 2029 591 133 22,5 341 57,7 117 19,8 2003 1715 303 109 36,0 84 27,7 110 36,3 2004 2691 533 218 40,9 65 12,2 250 46,9 2005 2652 583 176 30,2 188 32,2 219 37,6 2006 5728 1244 357 28,7 450 36,2 437 35,2 2007 5697 1555 480 30,9 480 30,9 595 38,3 2008 5266 1269 288 22,7 198 15,6 783 61,7 2009 3374 662 245 37,0 90 13,6 327 49,4 2010 2467 433 160 37,0 56 12,9 217 50,1 Ogółem 35621 8477 2460 29,0 2808 33,1 3209 37,9 * Odsetki wyliczano od ogólnej liczby osób z wynikiem badania wydanym przez laboratorium jako dodatni, diagnostycznie znamienny dla zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae
248 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 Tabela III. Wyniki równoległego wykrywania odczynem wiązania dopełniacza (OWD) i immunoelektroprecypitacji (OIEP) przeciwciał dla M. pneumoniae i hospitalizowanych dzieci z zapaleniem płuc lub podejrzeniem zapalenia płuc. Rok Kwartał Liczba (odsetek) wyników: Liczba zbadanych OWD + OWD + OWD - próbek surowicy OIEP + OIEP - OIEP + I 1104 143 (13,0) 32 (2,9) 61 (5,5) 1975-1983 II 916 71 (7,8) 27 (2,9) 47 (5,1) III 566 73 (12,9) 13 (2,3) 37 (6,5) 1245 195 (15,7) 18 (1,4) 51 (4,1) I 75 - - - 1984 II 101 - - - III 54 - - - 178 6 (3,4) - 4 (2,2) I 215 9 (4,2) 2 (0,9) 3 (1,4) 1985 II 188 14 (7,4) 1 (0,5) 2 (1,1) III 223 66 (30,0) 5 (2,2) 8 (3,6) 2203 761 (34,5) 55 (2,5) 160 (7,3) I 920 146 (23,5) 47 (5,1) 81 (8,8) 1986 II 569 66 (11,6) 21 (3,7) 12 (2,1) III 140 3 (2,1) 3 (2,1) 12 (4,2) 271 3 (1,1) 3 (1,1) 12 (4,2) I 157 6 (3,8) - 10 (6,4) 1987 II 127-1 (0,8) 5 (3,9) III 71 - - 3 (4,2) 143 2 (1,4) 1 (0,7) 21 (14,7) Ogółem 9466 1564 (16,5) 229 (2,4) 521 (5,5) do 2010 roku u 1-4% pacjentów, co mogło znacznie ograniczać wiarygodność wyników serologicznych badań diagnostycznych. Mykoplazmozę przebiegającą pod postacią ostrej infekcji układu oddechowego, najczęściej jako zapalenie płuc, rozpoznawano głównie u dzieci w wieku od 2 do 10 lat, u których prawdopodobnie mógł to być pierwotny kontakt z M. pneumoniae. W związku z tym można było w początkowym okresie objawowego zakażenia oczekiwać pojawienia się głównie przeciwciał klasy IgM. Dysponując dokumentacją wyników badań z okresu, w którym w Pracowni Mycoplasma PZH posługiwano się równolegle dwoma odczynami (OWD i OIEP), z których jeden OIEP umożliwiał szybkie wykrycie przeciwciał klasy IgM (12), zestawiono w Tabeli III wyniki badania w latach 1975-1987 9.466 próbek surowicy krwi uzyskanych od hospitalizowanych dzieci z zapaleniem płuc lub górnych dróg oddechowych. W tabeli tej wyeksponowano głównie wyniki z lat 1984-1987, tj. z epidemicznego, jesienno-zimowego okresu lat 1985/86 i międzyepidemicznych okresów przypadających na lata 1984 i 1987. W okresie epidemicznego wzrostu liczby zachorowań zbadano 3.915 próbek surowicy uzyskując dodatni wynik, przy przyjęciu jako punkt odcięcia miano 60 w OWD i 2 w OIEP, w 1039 przypadkach, co stanowiło 26,5% ogółu zbadanych próbek.
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 249 Tabela. Wyniki równoległego oznaczania testem OWD i OIEP poziomu przeciwciał dla M. pneumoniae w wybranej grupie chorych hospitalizowanych z zapaleniem płuc. L.p. Inicjały i wiek chorego Początek choroby 1 T.S., 3 lata 11.04.1976 2 A.S., 3 lata 15.02.1976 3 A.K., 8 lat 01.11.1975 4 G.M., 14 lat 05.10.1975 5 J.Z., 14 lat 12.10.1975 6 M.G., 16 lat 05.01.1976 7 M.L., 15 lat 01.02.1976 8 A.L., 16 lat 19.02.1976 9 E.G., 16 lat 30.01.1976 10 D.W., 7 lat 08.04.1976 11 K.S., 9 lat 16.11.1975 Data pobrania Miano: próbki krwi OWD OIEP 16.04.1976 15 2 27.04.1976 240 8 20.02.1976 30-03.03.1976 1920 8 05.11.1975 7,5-15.11.1975 120 4 09.10.1975 10-31.10.1975 960 8 17.10.1975 15-29.10.1975 1920 16 14.01.1976 20-29.01.1976 640 16 26.02.1976 480 16 09.02.1976 30 2 16.02.1976 960 32 15.03.1976 1280 16 23.02.1976 - - 01.03.1976 120 4 15.03.1976 1920 16 13.02.1976 240 32 26.02.1976 960 8 24.04.1976 1920 32 30.04.1976 480 8 02.12.1975 960 b.d. 15.12.1975 160 8 05.01.1976 120 4 22.03.1976 120 2 Przeciwciała w mianie <60 w OWD wykryto w 128 próbkach przy ujemnym wyniku OIEP, natomiast dodatni wynik OIEP uzyskano z 261 próbkami przy ujemnym wyniku OWD. Zamieszczone w tabeli wyniki badań kolejnych próbek krwi, pobranych od tych samych chorych, wskazują na celowość informowania lekarzy o wykryciu przeciwciał w mianie niższym od przyjmowanego za diagnostycznie znamienne wraz z komentarzem, że byłoby wskazane wykonanie ponownego badania po upływie 7-10 dni. Taki sposób postępowania, naszym zdaniem, umożliwiał zleceniodawcom badań uzyskanie wglądu w ograniczoną przydatność wyniku jednorazowego badania, szczególnie w początkowym okresie choroby. W tabeli na uwagę zasługują dwa przypadki, nr 9 w którym czterokrotnemu wzrostowi miana przeciwciał wykrytych w OWD towarzyszył czterokrotny spadek miana w OIEP, oraz przypadek nr 11, w którym przeciwciała wykrywane w OWD utrzymywały się przez 14 tygodni powyżej poziomu odcięcia, przy czterokrotnym spadku miana w OIEP. Przykłady wyników podane w tabeli wskazują, że uzyskanie w jednym lub obu odczynach wyniku
250 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 Tabela V. Dodatnie wyniki OIEP uzyskane z próbkami surowicy, w których wykazano odczynem wiązania dopełniacza poziom przeciwciał poniżej miana przyjmowanego za diagnostycznie znamienny dla zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae. Miano Miano OWD Liczba (odsetek) OIEP 40 30 20 15 10 7,5 5 <5 próbek 32 - - - - 1 - - - 1 (0,2) 16 1-2 - - - - 1 4 (0,8) 8 5 6 4 5 - - - 3 23 (4,4) 4 16 29 17 22 4 7 3 22 120 (23,0) 2 36 100 36 55 33 18 20 75 373 (71,6) Liczba (odsetek) próbek 58 (11,1) 135 (26,0) 59 (11,3) 82 (15,7) 38 (7,3) 25 (4,8) 23 (4,4) 101 (19,4) 521 (100,0) Tabela VI. Przypadki mykoplazmozy potwierdzane dodatnim wynikiem OWD lub ELISA w latach 2003-2009 w zestawieniu z liczbą osób zgłoszonych i hospitalizowanych w tym samym czasie z powodu zakażenia o etiologii M. pneumoniae. Rok Zbadanych próbek surowicy Liczba Zachorowania zgłoszone jako mykoplazmoza Odsetek Odsetek Liczba osób z osób ho- osób dodatnim spitalizo- chorych* wynikiem -wanych* Laboratoriów wykonujących badania Zbadanych osób Osób z wynikiem dodatnim (odsetek) 1 2 3 4 5 6 7 8 2003 22 5379 5354 549 (10,3) 32 5,8 71,9 2004 20 6216 6114 638 (10,4) 98 15,4 86,7 2005 13 4133 4130 720 (17,4) 302 42,0 95,5 2006 19 6617 6513 1719 (26,4) 577 33,6 89,1 2007 18 7009 6967 2068 (29,7) 1215 58,8 87,8 2008 19 5441 5404 1241 (11,0) 595 48,0 76,1 * Dane zaczerpnięte z biuletynów Zakładu Epidemiologii PZH Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce za lata 2003-2008 poniżej przyjętej wartości cut off po powtórnym badaniu dostarcza danych nie budzących zastrzeżeń co do praktycznej przydatności dwukrotnego badania serologicznego. Relacje między wysokością miana przeciwciał wykrywanych w OWD poniżej poziomu odcięcia a dodatnim wynikiem OIEP przedstawiono w tabeli V. Z zestawienia tego wynika, że dodatni wynik OIEP w 19,4% próbek uzyskano z surowicami, w których jeszcze nie wykrywano przeciwciał OWD. Dane te mogą być potwierdzeniem już wcześniej opublikowanego spostrzeżenia, że przeciwciała klasy IgM można wykryć w początkowym okresie choroby o kilka dni wcześniej odczynem OIEP niż OWD (12). Na podstawie wyników co najmniej dwukrotnego badania próbek surowicy pochodzących od 251 dzieci z zapaleniem płuc, w 80% przypadków hospitalizowanych, stwierdzono, że wynik pierwszego badania umożliwił potwierdzenie mykoplazmowej etiologii u 65 chorych (25,9%), natomiast po powtórnym badaniu dodatni wynik uzyskano u 122 (48,6%) chorych.
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 251 Powyższe własne obserwacje nie odbiegają od spostrzeżeń Talkington i wsp. z 2004 r., którzy w początkowym okresie infekcji przeciwciała klasy IgM wykrywali u 27% chorych, natomiast powtórne badanie po upływie 2 tygodni od początku choroby pozwalało je wykryć u 88% osób (29). Waits i Talkington w publikacji z 2004 r. uważają, że czterokrotny wzrost miana przeciwciał między ostrym okresem choroby a okresem rekonwalescencji jest nadal niezbędny do zdiagnozowania aktualnego zakażenia mykoplazmowego (31, 32). Przyjmowanie jednorazowo uzyskanego wyniku wykrycia IgG na poziomie równym lub wyższym od cut off, zalecanego przez producenta zestawu diagnostycznego jako laboratoryjnego potwierdzenia ostrej fazy objawowego zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae może być rozpatrywane jako błąd w sztuce medycznej (5, 31). Częstość wykrywania i wysoki poziom przeciwciał klasy IgG po upływie kilkunastu miesięcy od wystąpienia epidemicznego wzrostu zachorowań zacierał w ostatnich latach w Polsce rzeczywisty obraz sezonowości i epidemicznego charakteru występowania objawowych zakażeń układu oddechowego wywoływanych przez M. pneumoniae (Ryc. 3 i 4) W latach 2003-2008 z mocy ustawowego obowiązku, zgłaszano do rejestru chorób zakaźnych zachorowania wywołane przez M. pneumoniae. Efektywność realizacji tego obowiązku przez kolejnych 6 lat przedstawiała się różnie (Tabela VI) jednak z oficjalnych danych (kolumny 6-8), w znacznym stopniu różniących się od informacji bezpośrednio nadsyłanych z terenowych laboratoriów (kolumny 2-5) wynika, że 72 do 95% zgłoszonych przypadków mykoplazmozy dotyczyło hospitalizowanych chorych. Na podstawie wyników badań laboratoryjnych w 2007 r. spośród 6967 osób u 2068 uzyskano wynik dodatni (29,7%), natomiast do oficjalnego rejestru zgłoszono 1215 przypadków, hospitalizując 87,8% chorych. Mykoplazmoza tradycyjnie rozpoznawana jako ostre zakażenie układu oddechowego przebiegające głównie pod postacią zapalenia płuc, coraz częściej staje się przedmiotem zainteresowania klinicystów wskazujących na wielopostaciowość powikłań będących następstwem zbyt późno lub nierozpoznawalnych zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae (5,7,18,32). Od czasu izolacji na podłożach sztucznych M. pneumoniae w 1962 i jednoznacznego wykazania ważnej roli tej bakterii w patologii człowieka upłynęło 50 lat. Sądząc z wniosków wypływających z lektury licznych publikacji dotyczących efektywności serodiagnostyki zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae, nie opracowano jednego, powszechnie akceptowanego testu, swoistego, czułego i szybkiego, którego wyniki mogłyby stanowić podstawę podejmowania racjonalnej, etiotropowej antybiotykoterapii we wczesnym okresie objawowych zakażeń M. pneumoniae. Według opinii Hammerschlag brak niezawodnego i szybkiego testu do wykrywania zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae prowadzi do nie zawsze uprawnionej empirycznej terapii tych zakażeń (9). Wskazują na to również znaczne rozbieżności w ocenie praktycznej przydatności do tego celu rożnych komercyjnych testów oraz przyjmowanie przez użytkowników tych testów skrajnie różnych kryteriów uzyskiwanych wyników oznaczeń. Szczególnym przykładem może być aglutynacyjny test Soredia-Myco II, gdzie przyjmowane wartości cut off wahają się od miana 40 do 640 (1,3,4,10,30,33). Wydaje się, że niezbędne jest dalsze doskonalenie szybkich metod laboratoryjnej diagnostyki mykoplazmozy, przy konsekwentnym eliminowaniu glikolipidów z używanych do tego celu preparatów antygenowych, przy wykorzystywaniu wyłącznie białek mykoplazmowych, szczególnie przydatnych w testach służących wykrywaniu swoistych
252 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 przeciwciał pojawiających się we wczesnym okresie choroby, zwłaszcza u dzieci (17,23). Niezmiernie istotne, w przypadku użycia testu ELISA jest równoległe oznaczanie poziomu przeciwciał w klasie IgA, IgG i IgM oraz ostrożność w akceptowaniu wysokości poziomu cut off proponowanego przez producentów komercyjnych zestawów. Retrospektywna analiza wyników badań przeprowadzonych w Pracowni Mycoplasma PZH w latach 1970-1987 w zestawieniu z wynikami jednorazowych oznaczeń powszechnie wykonywanych w Polsce po 2003 r. testem ELISA wskazuje, że warto byłoby ponownie sięgnąć po test OIEP umożliwiający wykrywanie wyłącznie przeciwciał klasy IgM w początkowym okresie pierwotnego zakażenia i śledzenie dynamiki swoistych przeciwciał w przebiegu choroby. Na wysoką swoistość i diagnostyczną przydatność OIEP wskazują również publikacje z lat 1995 i 1996. Wynika z nich, że porównanie średniego poziomu przeciwciał dla M. pneumoniae wykrywanych OWD i ELISA wykazuje wprost proporcjonalną zależność między przyrostem miana IgM a wzrostem poziomu przeciwciał wykrywanych OIEP. Indeks IgM/IgG poniżej wartości 1 (0,8) wykazano jedynie dla surowic z ujemnym wynikiem OIEP, podczas gdy przy wartości indeksu 1,5-3,1 miano OIEP wynosiło od 2 do 32. Na 303 próbki surowicy o mianie przeciwciał w OIEP 2 w 295 (97,4%) próbkach wykryto odczynem ELISA przeciwciała klasy IgM w mianie przyjętym za diagnostycznie znamienne. Według Rastawickiego przyjęta w poprzednich badaniach dla OIEP wartość 2 jako diagnostycznie znamienna jest w pełni miarodajna (21,22). Warunkiem wykorzystania tego testu, przy obecnych możliwościach biologii molekularnej byłaby handlowa dostępność preparatów wybranych mykoplazmowych białek dostosowanych do tego typu testu. S. Kałużewski, W. Rastawicki Serodiagnosis of clinical infections caused by Mycoplasma pneumoniae in Poland in 1970-2010 SUMMARY The aim of the study was evaluation of the reliability of serodiagnosis of mycoplasmosis in Poland after replaced of classical assays, as complement fixation test (CFT) and immunoelectroprecipitation test (IEPT), by the ELISA method. The data were obtained from National Public Health Institute in Warsaw (NPHI), which receives quarterly reports of serologically confirmed infection from Sanitary and Epidemiological Stations through the country. Previously, from the 1970 to 1999 the serodiagnosis in Poland was performed only by uniform CFT using the same M. pneumoniae FH antigen prepared at the Mycoplasma Laboratory of NPHI. The first data of M. pneumoniae serological investigation performed by commercial ELISA, mainly Virotech, which gradually replaced the CFT, were obtained in 2000. In the studied period 1970-2010 a total of over 300 thousand patients with respiratory tract infections (85% were children below 18 years old) were tested. During these studies five epidemics of mycoplasmosis were noted in Poland before 2000. However, after introduction of ELISA for serodiagnosis this characteristic distinct difference in epidemic and endemic occurrence of M. pneumoniae infections have not been seen. In our opinion it may be caused by changes in the epidemiological pattern of M. pneumoniae infections in Poland as well as, paradoxical, by the decrease of sensitivity and specificity of serological investigation performed by ELISA since 2000. First of all, for the economical reasons 98% of the patients were tested by ELISA only once, secondly, the mycoplasmosis in many laboratories was confirmed only on the basis of the presence of IgG antibodies. The results of
Nr 3 Serodiagnostyka M. pneumoniae w Polsce 253 our analysis showed also usefulness in the serodiagnosis of mycoplasmosis, mainly during the first 2 weeks of the disease, of IEPT, which detect only specific IgM antibodies to M. pneumoniae antigens. PIŚMIENNICTWO 1. Byung Wook Eun, Nam Hee Kim, Eun Hwa Choi, Hoan Jong Lee. Mycoplasma pneumoniae in Korean children: The epidemiology of pneumonia over an 18-year period. J Infect 2008; 56:326-31. 2. Chalker VJ, Stocki T, Mentasti M i inni. Increased incidence of Mycoplasma pneumoniae infection in England and Wales in 2010: multilocus variable number tandem repeat analysis of macrolide susceptibility. Euro Surveill 2011; 16(19):pii=19865. 3. Chan PWK, Lum LCS, Ngeow YF, Yasim MY. Mycoplasma pneumoniae infection in Malaysian children admitted with community acquired pneumonia. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2001; 32:397-401. 4. Chien-Min Kung, Hai-Lung Wang. Seroprevalence of Mycoplasma pneumoniae in healthy adolescents in Taiwan. Jpn J Infect Dis 2007; 60: 352-4. 5. Christie LJ, Honarmand S, Talkington DF i inni. Pediatric encephalitis: What is the role of Mycoplasma pneumoniae? Pediatrics 2007; 120:305-14. 6. Foy HM. Infections caused by Mycoplasma pneumoniae and possible carrier state in different population of patients. Clin Infect Dis 1993; 17/Suppl.1/:s 37-46. 7. Foy HM, Nolan CM, Allan ID. Epidemiologic aspects of M. pneumoniae disease complications: A review. Yale J Biol Med 1983; 56:469-73. 8. Gnarpe J, Lundback A, Sundelof B, Gnarpe H. Prevalence of Mycoplasma pneumoniae in subjectively healthy individuals. Scand J Infect Dis 1992; 24: 161-4. 9. Hammerschlag MR. Mycoplasma pneumoniae infections. Infect Dis 2001; 14:181-6. 10. Jinho Yu, Young Yoo, Do Kyun Kim i inni. Distribution of antibody titer Mycoplasma pneumoniae in Korean children in 2000-2003. J Korean Med Sci 2005; 20:542-7. 11. Kałużewski S. Ocena przydatności wybranych testów serologicznych w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez Mycoplasma pneumoniae. I. Antygen do odczynu wiązania dopełniacza. Med Dośw Mikrobiol 1972; 24:333-42. 12. Kałużewski S. Serologiczny obraz w zakażeniach wywołanych u ludzi przez Mycoplasma pneumoniae.. Odczyn immunoelektroprecypitacji. Med Dośw Mikrobiol 1978; 30: 107-18. 13. Kałużewski S, Rajtar-Leontiew Z, Ceglecka-Tomaszewska K i inni. Epidemiczny aspekt zapaleń płuc wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Ped Pol 1971; 46:1341-7. 14. Kałużewski S, Zaleska M. Ocena przydatności odczynu immunoelektroprecypitacji (OIEP) do rutynowej diagnostyki zakażeń wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Med Dośw Mikrobiol 1981; 33:219-31. 15. Kałużewski S, Zaleska M. Odczyn wiązania dopełniacza w zastosowaniu do badań diagnostycznych. Wyd. Metod. PZH, Warszawa 2988: 1-13. 16. Kałużewski S, Jagielski M, Zaleska M. Ocena przydatności OWD o OIEP w diagnostyce epidemicznie występujących zakażeń wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Med Dośw Mikrobiol 1992; 44:161-5. 17. Kałużewski S, Rastawicki W, Namysł E. Ocena efektywności diagnostyki testem ELISA zakażeń wywoływanych przez Mycoplasma pneumoniae w Polsce w latach 2006-2008. Med Dośw Mikrobiol 2009: 61: 183-90. 18. Kleemola M, Kayhty H. Increase on titer of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in patients with purulent meningitis. J Infect Dis 1982; 146:284-8.
254 S. Kałużewski, W. Rastawicki Nr 3 19. Pönka A, Pönka T, Sarna S, Penttinen K. Questionable specificity of lipid antigen in the Mycoplasma pneumoniae complement fixation test in patients with extrapulmonary manifestations. J Infect 1981; 3:332-8. 20. Rasmussen JN, Voldstedlung M, Andresen RL i inni. Increased incidence of Mycoplasma pneumoniae infections detected by laboratory based surveillance in Denmark in 2010. Euro Surveill 2010; 15(45):pii=19708. 21. Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na antygeny Mycoplasma pneumoniae. I. Występowanie i poziom mykoplazmowych przeciwciał u osób klinicznie zdrowych. Med Dośw Mikrobiol 1995; 47:35-53. 22. Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na antygeny Mycoplasma pneumoniae. III. Odczyn ELISA, wiązania dopełniacza i immunoelektroprecypitacji w diagnostyce mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 1995; 47:77-88. 23. Rastawicki W. Ocena przydatności odczynu western-immunoblotting do badania humoralnej odpowiedzi na antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi. Med Dośw Mikrobiol 1996; 48: 39-48. 24. Rastawicki W, Jagielski M. Enzyme-linked immunosorbent assay, complement fixation test and immunoelectroprecipitation test in the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections comparative analysis. Zbl Bakt 1996; 283:477-84. 25. Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M. Occurrence of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections in Poland in 1970-1995. Eur J Epidemiol 1998; 14:37-40. 26. Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M, Gierczyński R. Epidemiology of Mycoplasma pneumoniae infections in Poland: 28 years of surveillance in Warsaw, 1970-1997. Eurosurveillance 1998: 3:99-100. 27. Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M, Gierczyński R. Changes in the epidemiological pattern of Mycoplasma pneumoniae infections in Poland. Eur J Epidemiol 2003; 18:1163-4. 28. Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Występowanie przeciwciał dla antygenów Mycoplasma pneumoniae w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61:375-9. 29. Talkington DF, Scott S, Falkon MT i inni. Analysis of eight commercial enzyme immunoassay tests for detection of antibodies do Mycoplasma pneumoniae in human serum. Clin Diagn Lab Immunol 2004; 11:862-7. 30. Templeton KE, Scheltinga SA, Graffelman AW i inni. Comparison and evaluation of Real-time PCR, Real-time Nucleic Acid Sequence-based Amplification, conventional PCR and serology for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 2003; 41:4366-71. 31. Waites KB. New concepts of Mycoplasma pneumoniae infections in children. Pediatr Pulmonol 2003; 36:267-78. 32. Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen. Clin Microbiol Rev 2004; 17:697-728. 33. Yamazaki T, Narita M, Sasaki N i inni. Comparison of PCR for sputum samples obtained by induced cough and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections in children. Clin Vacc Immunol 2006; 13:708-10. 34. Żeligowska J, Ostojska J, Rajtar-Leontiew i inni. Zapalenie płuc u dzieci wywołane przez Mycoplasma pneumoniae. Ped Pol 1971; 46:1333-40. Otrzymano: 19 VIII 2011 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie