PLATELIA Aspergillus IgG 1 płytka 96 62783 WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO ASPERGILLUS W SUROWICY LUB OSOCZU KRWI LUDZKIEJ METODĄ IMMUNOENZYMATYCZNĄ 881123 2013/11 1- ZASTOSOWANIE Platelia Aspergillus IgG jest pośrednim, mikropłytkowym testem enzymatycznym, przeznaczonym do wykrywania przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej. 2- WSKAZANIA DO STOSOWANIA Platelia Aspergillus IgG jest testem, który pod warunkiem interpretacji w oparciu o kliniczny i terapeutyczny kontekst przypadku chorego, oraz pod warunkiem wykonywania równolegle z innymi technikami diagnostycznymi, na przykład badaniami radiologicznymi, cytologicznymi, immunologicznymi i mykologicznymi, może być wykorzystywany jako pomoc w diagnostyce chorób wywołanych przez szczepy Aspergillus. 3- ZNACZENIE KLINICZNE Szereg chronicznych zakażeń wywołanych przez szczepy Aspergillus, może występować u pacjentów immunokompetentnych a ich diagnozowanie jest częstokroć okazuje się utrudnione. Proces sensytyzacji na pleśń leży u podstaw takich schorzeń alergicznych, jak astma czy alergiczna aspergiloza oskrzelowopłucna (ABPA), będąca najbardziej zaostrzoną postacią kliniczną zakażenia 4, 8. Populację podwyższonego ryzyka ABPA stanowią pacjenci cierpiący na mukowiscydozę, w związku z czym, są oni poddawani regularnemu monitoringowi diagnostycznemu w kierunku ABPA 1, 2. Wśród pacjentów narażonych na masowe wdychanie zarodników grzyba można napotkać przypadki zewnątrzpochodnego zapalenia pęcherzyków płucnych; najbardziej znanymi postaciami tej choroby są tzw. płuco hodowcy ptaków i płuco farmera. Najczęstszą niealergiczną chorobą przewlekłą jest grzybniak kropidlakowy (aspergilloma), będący wynikiem kolonizacji uprzednio powstałych jam płucnych (gruźlica, rozedma, sarkoidoza, rak płuca) przez grzybnię tworzącą kulę grzybniaka 4, 6, 10. W kontekście innych chorób niealergogennych, szczególnie ciężką, progresywną i śmiertelną postacią aspergilozy jest przewlekła martwicza aspergiloza płuc. Przy tak zróżnicowanych przejawach klinicznych, o podłożu alergicznym i niealergicznym, rozpoznanie aspergilozy jest często trudne. Dzieje się tak dlatego, że oznaki kliniczne mogą wskazywać na inne schorzenia o podłożu grzybiczym, bakteryjnym, wirusowym, a nawet nowotworowym. Badania radiologiczne, dające charakterystyczny obraz w przypadku grzybniaka kropidlakowego, są zdecydowanie mniej charakterystyczne w przypadku innych postaci aspergilozy, gdzie badanie kliniczne i radiologiczne stanowi jedynie element procedury diagnostycznej. Do potwierdzenia rozpoznania konieczne jest oznaczenie parametrów biologicznych, w szczególności zaś wykonanie badań serologicznych 5. W związku z tym, u pacjentów narażonych na grzybniaka kropidlakowego - infekcję ciężką, a jednocześnie często niemą klinicznie, właściwe jest wykonywanie monitoringowych badań serologicznych. Stwierdzane bez wątpliwości rozpoznanie ABPA opiera się na pięciu kryteriach, obejmujących również wykrywanie metodami serologicznymi przeciwciał skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus 13. Test Platelia Aspergillus IgG, będący testem wykrywającym immunoglobuliny klasy G skierowane przeciwko rekombinowanemu, oczyszczonemu antygenowi Aspergillus, jest narzędziem pomocniczym w diagnostyce opisanych powyżej, przewlekłych postaci aspergilozy, występujących u pacjentów immunokompetentnych 3. Ponadto, donoszono w ostatnim czasie o obecności przeciwciał skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus u pacjentów ze schorzeniami onkohematologicznymi, przed włączeniem leczenia immunosupresyjnego, przy przeszczepach szpiku kostnego. Omawiane badania sugerują wykonywanie testów wykrywających kolonizację szczepami Aspergillus podczas przyjmowania do szpitala lub przed wykonaniem przeszczepu w przypadku pacjentów, którzy znajdą się w grupie podwyższonego ryzyka inwazyjnej aspergilozy po włączeniu leczenia immunosupresyjnego. 4- ZASADA TESTU Platelia Aspergillus IgG jest pośrednim, dwuetapowym, mikropłytkowym testem immunoenzymatycznym, przeznaczonym do wykrywania przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej. Próbki rozcieńczonej surowicy lub osocza nanosi się do studzienek mikropłytki, opłaszczonych oczyszczonym, rekombinowanym antygenem Aspergillus 7. Po inkubacji w temperaturze 37 C, paski ze studzienkami przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Do każdego dołka mikropłytki dodaje się koniugat (znakowane peroksydazą, mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiej IgG), po czym płytkę poddaje się inkubacji w temperaturze 37 C. 1
W pochodzącej od człowieka próbce, w przypadku obecności skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG, tworzy się kompleks: Ag Aspergillus - ludzkie IgG anty- Aspergillus - mysie przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG/peroksydaza. Paski płytki przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Ujawnienie ewentualnie utworzonych kompleksów odbywa się poprzez dodanie chromogenu zawierającego substrat dla peroksydazy i inkubację w temperaturze pokojowej. Reakcję enzymatyczną przerywa się poprzez dodanie 1N kwasu siarkowego. Gęstość optyczną odczytuje się przy użyciu spektrofotometru o nastawie 450/620 nm. 5- ODCZYNNIKI Odczynniki dostarczane są w ilości wystarczającej do wykonania 96 oznaczeń lub maksimum 9 serii testów. Warunki przechowywania i termin ważności odczynników są podane na opakowaniu zewnętrznym. Przed użyciem należy pozwolić wszystkim odczynnikom na osiągnięcie temperatury pokojowej (+18-30 C). Bezpośrednio po użyciu wszystkie odczynniki należy ponownie doprowadzić do temperatury +2-8 C. Niezużyte paski należy włożyć do oryginalnej torebki i starannie zamknąć torebkę. Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. R1 R2 Oznaczenie Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 10 R4b Calibrator 20 R4c Calibrator 40 R4d Calibrator 80 R6 R7a R7b R9 R10 Conjugate Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Stopping Solution Rodzaj odczynnika Mikropłytka: - 96 studzienek (12 pasków po 8 studzienek każdy), opłaszczonych oczyszczonym rekombinowanym antygenem Aspergillus. Stężony bufor do płukania płytek (20x): - bufor Tris-NaCl (ph 7,4) - 2% Tween 20 - Środek konserwujący: 0,04% ProClin 300 Roztwór kalibracyjny 0 AU/ml (gotowy do użycia): - Bufor Tris-NaCl niezawierający przeciwciał klasy IgG anty- Aspergillus - Środek konserwujący: 0,15% ProClin 300 Roztwór kalibracyjny 10 AU/ml (gotowy do użycia): - Surowica krwi ludzkiej zawierająca przeciwciała anty- Aspergillus - Środek konserwujący: 0,15% ProClin 300 Roztwór kalibracyjny 20 AU/ml (gotowy do użycia): - Surowica krwi ludzkiej zawierająca przeciwciała anty- Aspergillus - Środek konserwujący: 0,15% ProClin 300 Roztwór kalibracyjny 40 AU/ml (gotowy do użycia): - Surowica krwi ludzkiej zawierająca przeciwciała anty- Aspergillus - Środek konserwujący: 0,15% ProClin 300 Roztwór kalibracyjny 80 AU/ml (gotowy do użycia): - Surowica krwi ludzkiej zawierająca przeciwciała any- Aspergillus - Środek konserwujący: 0,15% ProClin 300 Koniugat (gotowy do użycia) - Mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiej IgG, znakowane peroksydazą - Czerwień fenolowa - Środek konserwujący: 0,3% ProClin 300 Roztwór rozcieńczalnika do próbek 1 (gotowy do użycia): - bufor Tris-NaCl, - 0.1% Tween 20, - Czerwień fenolowa, - Środek konserwujący: 0,151% ProClin 300 Roztwór rozcieńczalnika do próbek 2 (gotowy do użycia): - bufor Tris-NaCl, - 0.1% Tween 20, - Purpura bromokrezolowa - Środek konserwujący: 0,151% ProClin 300 Roztwór chromogenu TMB (gotowy do użycia) - Roztwór 3,3,5,5 -tetramemetylobenzydyny (< 0,1%), H2O2 (<1.0%) Roztwór do przerywania reakcji enzymatycznej (gotowy do użycia): - 1N roztwór kwasu siarkowego Liczba sztuk/ilość 1 1 x 70 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml 6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 1. Produkt przeznaczony wyłącznie do diagnostyki in vitro. 2. Produkt przeznaczony wyłącznie do stosowania przez osoby wykwalifikowane. 3. Nie zaleca się wykonywania oznaczenia na próbkach innych niż próbki surowicy lub osocza krwi ludzkiej. 2
4. Roztwory kalibracyjne R4a, R4b, R4c i R4d zostały przygotowane z surowicy krwi ludzkiej, dającej negatywny wynik w posiadających znak CE testach na obecność przeciwciał skierowanych przeciwko wirusom HIV-1, HIV-2 i HCV, a także przeciwciał przeciwko antygenowi powierzchniowemu HBs. Niemniej jednak, z wszystkimi odczynnikami należy postępować tak, jak gdyby mogły być źródłem zakażenia. Wszystkie testy należy wykonywać zgodnie z normami OSHA dotyczącymi patogenów przenoszonych drogą krwi, zaleceniami dla drugiego poziomu bio-bezpieczeństwa (bio-safety level 2) lub innymi przyjętymi praktykami zachowania bezpieczeństwa biologicznego. 5. Należy mieć na sobie odzież ochronną obejmującą fartuch laboratoryjny, ochronę oczu i twarzy oraz rękawiczki jednorazowe (zalecane są syntetyczne rękawiczki bezlateksowe) oraz posługiwać się odczynnikami z zestawu i próbkami pochodzącymi od pacjenta zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GPL). Po wykonaniu testu należy dokładnie umyć ręce. 6. Nie pipetować ustami. 7. W pomieszczeniach, w których dokonywane są operacje na próbkach lub odczynnikach nie należy palić tytoniu, pić napojów, ani spożywać posiłków. 8. Należy unikać rozchlapywania próbek lub roztworów. 9. Powierzchnie zanieczyszczone nie zawierającymi kwasów cieczami skażonymi, należy uważnie oczyścić przy użyciu skutecznego środka dezynfekującego. Nadającymi się do użycia środkami dezynfekującymi są między innymi rozcieńczona do 10% woda Javel a (0,5% roztwór podchlorynu sodu), etanol 70% lub 0,5% Wescodyne Plus. Materiały użyte przy czyszczeniu należy usuwać do specjalnego pojemnika na odpady skażone. UWAGA: Roztworów zawierających podchloryn sodu nie należy nigdy umieszczać w sterylizatorach parowych. 10. W przypadku, gdy cieczą skażającą jest roztwór kwasu, zanieczyszczone powierzchnie należy przetrzeć lub zobojętnić wodorowęglanem sodu, a następnie przemyć i osuszyć; w przypadku, gdy ciecz skażająca zawiera materiał niebezpieczny biologicznie, powierzchnię należy przemyć chemicznym środkiem dezynfekującym. 11. Wszystkie próbki i odczynniki wykorzystywane do testu należy usuwać tak, jak gdyby mogły być źródłem zakażenia. Niebezpieczne odpady chemiczne i biologiczne należy usuwać zgodnie z obowiązującymi przepisami. 12. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej www.bio-rad.com. 7- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH, MOGĄ DAWAĆ FAŁSZYWIE POZYTYWNE WYNIKI W ZWIĄZKU Z ZANIECZYSZCZENIEM GRZYBICZYM I(LUB) BAKTERYJNYM. 2. Nie używać zestawu ani pojedynczych odczynników po terminie ważności. 3. Nie mieszać ani nie łączyć odczynników z pudełek o różnych numerach seryjnych w ramach tej samej serii testów. UWAGA Produkty innych serii niż seria z danego pudełka można stosować w przypadku buforu do płukania (R2, oznaczonego* zielonym symbolem 20x), chromogenu (R9, oznaczonego* turkusowoniebieskim symbolem TMB) oraz roztworu do przerywania reakcji enzymatycznej (R10, oznaczonego* czerwonym symbolem 1N), pod warunkiem stosowania w ramach serii testów odczynników dokładnie odpowiadających jednej i tej samej serii produkcyjnej. UWAGA: Roztworu do mycia płytek (R2, oznaczonego* zielonym symbolem 20x) nie wolno mieszać z roztworem do mycia (R2, oznaczonym* niebieskim symbolem 10x) z zestawów odczynników firmy Bio-Rad. * na etykiecie fiolki 3. Przed użyciem odczynnika należy odczekać 30 minut, aż osiągnie on temperaturę pokojową (+18 do +30 C). 4. O ile to możliwe, należy stosować wyposażenie jednorazowego użytku. Jeśli nie jest to możliwe, należy używać szklanych pojemników, dokładnie umytych i przepłukanych wodą destylowaną. 5. Sprawdzić dokładność pipet i poprawność działania wykorzystywanego instrumentarium. 6. Ostrożnie przygotować odczynnik R2, uważając, by uniknąć jakiegokolwiek zanieczyszczenia. 7. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność jakichkolwiek metali lub jonów metali. W związku z tym, roztwory zawierające koniugat lub substrat dla peroksydazy nie powinny wchodzić w kontakt z żadnymi metalowymi przedmiotami. 8. Przy pipetowaniu roztworów kalibracyjnych i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczenia należy do każdego dołka używać nowej końcówki pipety. 9. Aby zapewnić odpowiednie płukanie dołków należy wykonać zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że każde z zagłębień jest całkowicie napełniane, a następnie całkowicie opróżniane. Mycie płytek należy wykonywać w płuczce do mikropłytek. 10. Nie pozwolić na wyschnięcie mikropłytki pomiędzy zakończeniem cyklu mycia a dodaniem odczynników. 11. Nie używać tej samej butelki do roztworów koniugatu i wywoływacza. 12. Podczas przechowywania lub inkubacji, unikać wystawiania roztworów chromogenu lub wywoływacza na działanie silnego światła. Nie pozwalać na kontakt roztworów chromogenu z substancjami utleniającymi. 13. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia wskazuje, że odczynnik nie nadaje się do użycia i należy go wymienić. 14. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu do przerywania reakcji enzymatycznej z substancjami utleniającymi, metalami lub jonami metali. 15. Nie zwracać nadmiaru niezużytego koniugatu do oryginalnej fiolki. 3
8- PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Mikropłytka (R1) Każda ramka z 12 paskami zapakowana jest w oddzielną torebkę. Przy użyciu nożyczek rozciąć torebkę tuż poniżej złączenia. Otworzyć torebkę i wyjąć ramkę. Ramkę z niewykorzystanymi paskami odłożyć z powrotem do torebki. Dokładnie zamknąć torebkę i umieścić w temperaturze +2-8 C. Po otwarciu pakowanej próżniowo torebki, paski przechowywane w oryginalnej torebce w temperaturze +2-8 C zachowują trwałość przez okres 8 tygodni. Sprawdzić, czy w torebce nadal znajduje się środek pochłaniający wilgoć. Bufor do płukania (R2) Przygotować bufor do płukania, dwudziestokrotnie rozcieńczając stężony roztwór wodą destylowaną: 50 ml R2 wymieszać z 950 ml wody destylowanej. (Zabezpieczyć 650 ml rozcieńczonego buforu do płukania na całą płytkę 12 pasków, plus objętość martwą stosowanej płuczki). Po rozcieńczeniu, roztwór do płukania można przechowywać w temperaturze +2-30 C przez 14 dni. Po otwarciu stężonego roztworu przechowywanego w temperaturze +2-30 C, zachowuje on trwałość do terminu ważności umieszczonego na etykiecie (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń). Roztwór kalibracyjny 0 (R3), roztwór kalibracyjny 10 (R4a), roztwór kalibracyjny 20 (R4b); roztwór kalibracyjny 40 (R4c), roztwór kalibracyjny 80 (R4d): Roztwory kalibracyjne są gotowe do użycia. Po otwarciu, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C zachowują trwałość przez 8 tygodni (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń). Koniugat (R6), rozcieńczalnik do próbek 1 (R7a), rozcieńczalnik do próbek 2 (R7b), roztwór chromogenu TMB (R9): Odczynniki są gotowe do użycia. Po otwarciu, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C zachowują trwałość przez 8 tygodni (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń). Roztwór przerywający reakcję enzymatyczną (R10): Odczynnik jest gotowy do użycia. Po otwarciu odczynnika przechowywanego w temperaturze +2-8 C, zachowuje on trwałość do terminu ważności umieszczonego na etykiecie (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń). 9- PRÓBKI 1. Zalecanymi typami próbek są surowica lub osocze ludzkie pobierane na antykoagulant (EDTA, heparyna lub cytrynian). 2. Przy pobieraniu, przetwarzaniu i przechowywaniu próbek krwi należy stosować się do poniższych wskazówek: Próbkę krwi pobrać zgodnie z przyjętą praktyką. W przypadku próbki surowicy należy przed odwirowaniem pozwolić na pełne wykrzepienie. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu oddzielić surowicę lub osocze i umieścić w zamkniętej probówce. Jeśli test ma być wykonany w ciągu 4 dni, próbki przechowuje się w temperaturze +2-8 C. Jeśli test ma zostać wykonany później niż w ciągu 4 dni, próbki zamraża się w temperaturze -20 C (albo -80 C). Cyklu zamrażania/rozmrażania nie należy wykonywać więcej niż pięć razy. Po rozmrożeniu a przed wykonaniem testu, próbki powinny zostać dokładnie zhomogenizowane (przy użyciu mieszadła Vortex). 3. Na wyniki testu nie ma wpływu obecność w próbce 90 g/l albuminy lub 100 mg/l niezwiązanej bilirubiny, lipemia na poziomie zawartości równoważnika trioleiny (trójglicerydu) 36 g/l lub zhemolizowanie próbki na poziomie zawartości hemoglobiny 10 g/l. 4. Próbek nie należy ogrzewać. 10- PROCEDURA Wyposażenie dostarczone w zestawie Patrz rozdział ODCZYNNIKI Wymagane wyposażenie, nie dostarczone w zestawie 1. Wyjałowiona woda destylowana lub demineralizowana do rozcieńczania stężonego roztworu do mycia. 2. Bibuła chłonna. 3. 3, Rękawiczki jednorazowego użytku. 4. Okulary ochronne. 5. Podchloryn sodu (woda Javel a) i wodorowęglan sodu. 6. Pipety lub pipety wielokanałowe, automatyczne lub półautomatyczne, nastawne lub o stałej pojemności, pozwalające na odmierzenie i zadanie objętości od 10 μl do 1000 μl, 1 ml, 2 ml i 10 ml. 7. Cylindry miarowe o pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. 8. Probówki jednorazowego użytku. 9. Pojemnik na odpady skażone. 10. Mieszadło Vortex. 11. Inkubator do mikropłytek pozwalający na nastawienie temperatury 37 C ± 1 C (*). 12. Półautomatyczna lub automatyczna myjka do mikropłytek (*). 4
13. Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*). (*) Prosimy o kontakt w sprawie informacji na temat urządzeń posiadających walidację naszego działu technicznego. Procedura wykonywania testu immunoenzymatycznego (EIA) Należy przestrzegać podanego protokołu. Należy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: - Przed użyciem należy pozwolić na osiągnięcie przez odczynniki temperatury pokojowej (18-30 C) w ciągu co najmniej 30 minut. - W każdej serii oznaczeń należy używać wszystkich roztworów kalibracyjnych. Postępować zgodnie z poniższymi punktami: 1. Dokładnie rozplanować rozmieszczenie i oznakowanie roztworów kalibracyjnych i próbek pochodzących od pacjentów. 2. Przed nałożeniem wstępnie rozcieńczyć badane próbki: w stosunku 1/20, tj. mieszając 10 μl surowicy / osocza ze 190 μl rozcieńczalnika do próbek 1 (R7a). Wstępne rozcieńczenie próbek daje czerwone zabarwienie roztworu. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z torebki ochronnej. Odłożyć nieużywane paski do torebki ochronnej i zamknąć torebkę. 4. Nanieść po 190 μl rozcieńczalnika do próbek 2 (R7b) w dołkach przeznaczonych na badane próbki, a następnie dodać po 10 μl wstępnie rozcieńczonych w stosunku 1/20 próbek, delikatnie mieszając poprzez dwu-trzykrotne zassanie. NB: Na tym etapie procedury możliwe jest sprawdzenie dodania próbek, ponieważ po dodaniu 10 μl wstępnie rozcieńczonych próbek, dołki zawierające próbki przyjmą szary kolor. Zagłębienia nie zawierające próbek będą miały kolor niebieskofioletowy. 5. Nanieść gotowe do użycia roztwory kalibracyjne w ilości 200 μl na zagłębienie zgodnie z poniższym planem: - A1: Roztwór kalibracyjny 0 (R3) - B1: Roztwór kalibracyjny 10 AU/ml (R4a) - C1: Roztwór kalibracyjny 20 AU/ml (R4b) - D1: Roztwór kalibracyjny 40 AU/ml (R4c) - E1: Roztwór kalibracyjny 80 AU/ml (R4d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. 7. Natychmiast poddać mikropłytkę inkubacji w temperaturze 37 C (± 1 C) w suchym inkubatorze do mikropłytek przez 60 ± 5 minut. 8. Przygotować rozcieńczony roztwór do płukania (patrz rozdział 8). 9. Zdjąć folię samoprzylepną. Zassać zawartość każdego dołka do pojemnika (zawierającego podchloryn sodu) na odpady skażone. 10. Wypłukać mikropłytkę 4 razy w płuczce do mikropłytek (przy użyciu 800 μl rozcieńczonego roztworu do mycia). Po ostatnim myciu odwrócić płytkę do góry dnem i delikatnie opukać nad chłonną bibułą w celu usunięcia pozostałości cieczy. 11. Przed użyciem fiolki R6 zhomogenizować jej zawartość, odwracając ją do góry dnem. W przypadku stosowania pipet wielokanałowych należy pobrać jedynie objętość konieczna do wykonania serii: użyć objętość 3,5 ml na dwa paski po 8 zagłębień, 12. Nanieść po 200 μl koniugatu R6 do każdego dołka. 13. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. 14. Poddać mikropłytkę inkubacji w temperaturze 37 C (± 1 C) w suchym inkubatorze do mikropłytek przez 60 ± 5 minut. 15. Zdjąć folię samoprzylepną. Zassać zawartość każdego dołka do pojemnika (zawierającego podchloryn sodu) na odpady skażone. 16. Wypłukać mikropłytkę 4 razy w płuczce do mikropłytek (przy użyciu 800 μl rozcieńczonego roztworu do mycia). Po ostatnim myciu odwrócić płytkę do góry dnem i delikatnie opukać nad chłonną bibułą w celu usunięcia pozostałości cieczy. 17. Unikając jasnego światła, szybko nanieść po 200 μl chromogenu TMB (R9) do każdego dołka. 18. Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej (+18-30 C), w ciemności, przez 30 ± 5 minut. Przy tym etapie inkubacji nie należy stosować folii samoprzylepnej. 19. Dodać po 100 μl roztworu przerywającego reakcję (R10) do każdego dołka, w tej samej kolejności i w tym samym rytmie, co przy dodawaniu roztworu substratu. Dobrze wymieszać. 20. Dokładnie wytrzeć spód każdej mikropłytki. 21. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy długości fali 450 nm (filtr odniesienia 620 nm) przed upływem 30 minut od dodania roztworu przerywającego reakcję (przed odczytaniem gęstości optycznej paski muszą być zawsze przechowywane z daleka od źródeł światła). 22. Przed przepisaniem wyników sprawdzić zgodność pomiędzy wydrukiem z czytnika a planem rozkładu próbek na mikropłytce. 5
11-KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WALIDACJI TESTU) Dla każdej mikropłytki i każdego cyklu należy uwzględnić wszystkie kalibratory i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu weryfikacji testu należy spełnić następujące kryteria: Gęstość optyczna (OD): OD R4a > 0,200 Stosunki gęstości optycznych: OD R4a / OD R3 > 3,00 OD R4b / OD R4a > 1,20 OD R4b / OD R4a > 1,20 OD R4d / OD R4c > 1,00 12-INTERPRETACJA WYNIKÓW Wykreślanie krzywej wzorcowej Krzywą wzorcową wyznacza się w oparciu o 5 punktów granicznych dla zakresów stężeń (punktów kalibracyjnych) 0, 10, 20, 40 i 80 AU/ml. Wykreślić krzywą wzorcową [OD = funkcja (AU/ml)] poprzez odnotowanie wartości OD dla roztworów kalibracyjnych R3, R4a, R4b, R4c i R4d na osi rzędnych (osi Y), a następnie odpowiadających im stężeń wyrażonych w AU/ml na osi odciętych (osi X). Wykreślić linię łączącą poszczególne punkty graniczne dla zakresów stężeń. Oznaczenie stężenia skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG (AU/ml) w badanych próbkach Stężenie skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG, wyrażone w AU/ml, można wyznaczyć dla każdej próbki z krzywej wykreślonej zgodnie z opisem w rozdziale 12. Interpretacja wyników Próbki o stężeniach niższych niż 5 AU/ml (C < 5) uważane są za "ujemne" pod względem obecności skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. Próbki o stężeniach pomiędzy 5 a 10 AU/ml (5 C < 10) uważane są za "pośrednie" pod względem obecności skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. Próbki o stężeniach wyższych lub równych niż 10 AU/ml (C 10) uważane są za "dodatnie" pod względem obecności skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG Punkty graniczne zakresów stężeń wykorzystywane przy wyznaczaniu krzywej kalibracyjnej nie pozwalają na precyzyjne oznaczenie stężeń wyższych niż 80 AU/ml. W przypadku zamiaru bardziej precyzyjnego oznaczenia miana próbek o wysokim wyniku dodatnim należy wykonać test ponownie, przeprowadzając dodatkowe wstępne rozcieńczenie próbki przy użyciu rozcieńczalnika R7a: - Dla próbek o mianie > 80 AU/ml i OD < 3,000: najpierw wstępnie rozcieńczyć 1/5 próbki w R7a. - Dla próbek o mianie > 80 AU/ml i OD 3,000: najpierw wstępnie rozcieńczyć 1/60 próbki w R7a. Po wstępnym rozcieńczeniu postępować zgodnie z procedurą opisana w rozdziale 10 (początkowe rozcieńczenie w stosunku 1/20 w R7a, a następnie w stosunku 1/20 w R7b). Miano próbki o wysokim wyniku dodatnim zostanie obliczone poprzez pomnożenie miana uzyskanego w pomiarze o współczynnik pierwszego wstępnego rozcieńczenia (tj.: 5 lub 60, w zależności od zastosowanego wstępnego rozcieńczenia). Wynik "pośredni powinno się potwierdzić zbadaniem kolejnej próbki, pobranej od pacjenta po upływie 2-3 tygodni od dnia testu o wyniku pośrednim. W przypadku serologicznego monitorowania pacjenta, w celu wykrycia znaczących różnic w mianach skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG, zalecamy wykonanie testów wszystkich próbek danego pacjenta w tej samej serii. 13- OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Wynik negatywny nie wyklucza rozpoznania aspergilozy. Rozpoznanie aspergilozy można stwierdzić jedynie po zbadaniu wyników klinicznych, terapeutycznych, badań radiologicznych, bezpośrednich badań mykologicznych i serologicznych, zawsze zachowując ostrożność przy interpretacji wyników elementów badań wykonywanych oddzielnie. 2. U immunokompetentnych pacjentów z podejrzeniem aspergilozy, próbka pobrana na wczesnym etapie rozwoju zakażenia szczepem Aspergillus może dać negatywny wynik testu na obecność skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. W związku z tym zaleca się ponowne wykonanie testu przy użyciu próbki pobranej po upływie dwóch lub trzech tygodni. 3. Opisana procedura i interpretacja wyników testu Platelia Aspergillus IgG musi być w przypadku badania próbek na obecność skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG poddana monitorowaniu. Użytkownikom zestawu zalecamy uważne przeczytanie przed wykonaniem testu dołączonej ulotki. Protokołu należy przestrzegać szczególnie dokładnie w przypadku pipetowania próbek i odczynników, mycia mikropłytek oraz dotrzymywania czasów inkubacji. 4. W przypadku, gdy próbki i odczynniki nie zostaną dodane zgodnie z opisem zamieszczonym w ulotce, możliwe jest uzyskanie wyniku fałszywie ujemnego. W przypadku błędu w wykonaniu procedury należy zbadać nową próbkę pobraną od tego samego pacjenta. 6
5. W przypadku, gdy zawartość jednego dołka zostanie przelana do innego dołka w wyniku niedbałego posługiwania się mikropłytką lub złej techniki pipetowania przy dodawaniu odczynników, może dojść do skażenia zagłębień zawierających próbki pacjentów negatywnych próbkami pochodzącymi od pacjentów pozytywnych. 6. Nie badano wiarygodności wyników testu Platelia Aspergillus IgG dla próbek surowicy lub osocza krwi noworodków lub pacjentów pediatrycznych. 7. Nie badano wiarygodności wyników testu Platelia Aspergillus IgG w przypadku ręcznego odczytu i(lub) wzrokowej oceny wyników. 14- SPODZIEWANE WARTOŚCI Badanie prewalencji przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus IgG przy użyciu testu Platelia Aspergillus IgG poddano ocenie z wykorzystaniem panelu 129 próbek pochodzących od 64 francuskich pacjentów cierpiących na mukowiscydozę i należących do grupy ryzyka zakażeń szczepami Aspergillus. Spośród 129 próbek, 53 dały wynik dodatni, zaś 12 wynik pośredni, co dało częstość przypadków zakażeń 53/129 = 41,1% [95% CI: 32,5-50,1%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 65/129 = 50,4% [95% CI: 41,4-59,3%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie. W odniesieniu do 64 badanych pacjentów, 29 charakteryzowało się co najmniej jedną próbką o wyniku dodatnim, zaś pięciu charakteryzowało się co najmniej jedną próbką o wyniku pośrednim przy braku wyników dodatnich, co dało częstość przypadków zakażeń 29/64 = 45,3% [95% CI: 32,8-58,3%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 34/64 = 53,1% [95% CI: 40,2-65,7%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie. 15- CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA A. Badania odtwtarzalności Precyzja wewnątrztestowa (powtarzalność): W ramach oceny powtarzalności wewnątrztestowej wykonano 32-krotne badanie serii składającej się z próbki ujemnej i pięciu próbek dodatnich. Oznaczano miano każdej próbki, wyrażane w AU/ml. Wartość średnia miana, odchylenie standardowe (SD) i współczynnik zmienności (CV%) dla każdej próbki zostały podane w poniższej tabeli: Precyzja wewnątrztestowa (powtarzalność): N=332 Próbka ujemna niskim wyniku dodatnim nr 1 niskim wyniku dodatnim nr 2 niskim wyniku dodatnim nr 3 średnio wysokim wyniku dodatnim wysokim wyniku dodatnim Średnia 2,44 9,31 10,31 13,64 31,69 43,10 (AU/ml) SD 0,067 0,320 0,218 0,387 0,939 1,546 CV % 2,7% 3,4% 2,1% 2,8% 3,0% 3,6% Precyzja międzytestowa (odtwtarzalność): W ramach oceny odtwarzalności międzytestowej każdą z sześciu próbek (jedną ujemną i pięć dodatnich) poddawano dwukrotnemu badaniu w dwóch seriach każdego dnia przez okres 20 dni. Oznaczano miano każdej dodatniej próbki, wyrażone w AU/ml. Wynik próbki ujemnej wyrażano w postaci stosunku wartości. Wartości średnie stężeń lub stosunków odczytów, odchylenia standardowe (SD) i współczynniki zmienności (CV%) dla każdej próbki zostały podane w poniższej tabeli: Precyzja międzytestowa (odtwtarzalność): N=80 Próbka ujemna niskim wyniku dodatnim nr 1 niskim wyniku dodatnim nr 2 niskim wyniku dodatnim nr 3 średnio wysokim wyniku dodatnim wysokim wyniku dodatnim Średnia 1,88 3,60 6,99 12,34 32,49 51,65 (AU/ml) SD 0,26 0,46 0,92 1,49 5,25 7,65 CV % 13,8% 12,8% 13,1% 12,1% 16,2% 14,8% B. Reaktywność krzyżowa Czynnik patologiczny Liczba zbadanych próbek Liczba próbek o wynikach dodatnich Przeciwciała skierowane przeciwko szczepom Candida 54 2* Przeciwciała skierowane przeciwko dsdna 10 0 Przeciwciała przeciwjądrowe wynik dodatni 10 0 Szpiczak IgG 10 0 Toksoplazma IgG 10 0 Ludzkie przeciwciała przeciwmysie 12 0 HIV 10 0 Czynnik reumatoidalny 10 0 * Obie próbki surowicy o dodatnim wyniku potwierdzono przy użyciu dostępnego handlowo zestawu do wykrywania przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus. 7
C. Liniowość Zakres liniowości dynamicznej wyników testu Platelia Aspergillus IgG określono w badaniach rozcieńczeń próbek dodatnich na zakres od 2 do 80 UA/ml. D. Badania kliniczne Wyniki testu Platelia Aspergillus IgG poddawano ocenie w dwóch ośrodkach z wykorzystaniem 499 próbek pochodzących od 329 pacjentów. CZUŁOŚĆ Czułość metody oznaczano z wykorzystaniem panelu 277 próbek z dwóch ośrodków we Francji, składającego się z: 129 próbek surowicy od 64 pacjentów cierpiących na mukowiscydozę i znajdujących się w grupie wysokiego ryzyka alergicznej aspergilozy oskrzelowo-płucnej(abpa), badanych w ośrodku 1. 148 próbek surowicy od 43 pacjentów z ciężką postacią przewlekłej aspergilozy, badanych w ośrodku 2. Wyniki uzyskane w Ośrodku 1 W poniższej tabeli przedstawiono podsumowanie wyników uzyskanych w ośrodku 1 dla populacji pacjentów cierpiących na mukowiscydozę, u których rozpoznano ABPA na podstawie danych klinicznych obejmujących wyniki badania całkowitego poziomu przeciwciał IgE, elektrosynerezy w kierunku Aspergillus, wykrywania antygenów Aspergillus oraz wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG przy użyciu handlowo dostępnego testu immunoenzymatycznego innego niż Platelia Aspergillus IgG. Pacjentów podzielono na 4 kategorie: brak ABPA, przebyta ABPA, podejrzenie ABPA i potwierdzona ABPA 9, 11. Brak ABPA nie wykluczał jednakże obecności innych chorób wywołanych obecnością szczepów Aspergillus 12. Status pacjenta w odniesieniu do wyniku badania w kierunku organizmów Aspergillus przy użyciu techniki elektrosynerezy lub testu Platelia Aspergillus IgG uznawano za dodatni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała dodatni wynik przy użyciu danej metody. W przeciwnym wypadku, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała wynik pośredni, oraz za ujemny, kiedy wszystkie próbki pochodzące od pacjenta dawały wynik ujemny. Kategorie pacjentów 49 pacjentów z brakiem ABPA 5 pacjentów z przebytą ABPA 4 pacjentów z podejrzeniem ABPA 6 pacjentów z potwierdzoną ABPA Wyniki elektrosynerezy Status Liczba pacjentów Wyniki testu Platelia Aspergillus IgG Status pacjentów Dodatni (%) (pacjenci Dodatni (%) (pacjenci o Dodatni Pośredni Ujemny o statusie pośrednim statusie pośrednim traktowani jak pacjenci traktowani jak pacjenci o statusie ujemnym) o statusie dodatnim) 7/40 (17.5%) 11/40 (27.5%) 95% CI [7,3-32,8%] 95% CI [14,6-43,9%] 8/9 9/9 (88,9%)* 5/5 5/5 Ujemny 40 7 (1) 4 (2) 29 Dodatni 9 8 1 0 Ujemny 5 5 (3) 0 0 Dodatni 0 - - - - - Ujemny 2 2 (4) 0 0 2/2 2/2 Dodatni 2 2 0 0 2/2 2/2 (100,0%) (100,0%) Ujemny 3 2 (5) 0 1 2/3 2/3 (66,7%)* (66,7%)* Dodatni 3 3 0 0 3/3 3/3 1): 57% (4/7) dodatnich wyników w teście Platelia Aspergillus IgG dawało dodatni wynik przy użyciu innego dostępnego handlowo zestawu immunoenzymatycznego przeznaczonego do wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. 2): 100% (4/4) pośrednich wyników w teście Platelia Aspergillus IgG dawało ujemny wynik przy użyciu innego dostępnego handlowo zestawu immunoenzymatycznego przeznaczonego do wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. 3): 100% (5/5) dodatnich wyników w teście Platelia Aspergillus IgG dawało dodatni wynik przy użyciu innego dostępnego handlowo zestawu immunoenzymatycznego przeznaczonego do wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. 4): 100% (2/2) dodatnich wyników w teście Platelia Aspergillus IgG dawało dodatni wynik przy użyciu innego dostępnego handlowo zestawu immunoenzymatycznego przeznaczonego do wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. 5): 100% (2/2) dodatnich wyników w teście Platelia Aspergillus IgG dawało dodatni wynik przy użyciu innego dostępnego handlowo zestawu immunoenzymatycznego przeznaczonego do wykrywania skierowanych przeciwko szczepom Aspergillus przeciwciał klasy IgG. * : Ze względu na niewystarczający rozmiar próby niemożliwe było obliczenie 95-procentowego przedziału ufności. 8
Wyniki uzyskane w Ośrodku 2 W poniższej tabeli przedstawiono podsumowanie wyników uzyskanych w próbie pacjentów cierpiących na ciężką postać przewlekłej aspergilozy, wybranej na podstawie odpowiednich wyników obrazowania płuc, dodatnich wyników posiewów w kierunku obecności szczepów Aspergillus w odkrztuszanej plwocinie, oraz dodatnich względem rodzaju Aspergillus wyników testów immunoenzymatycznych z wykorzystaniem immunoelektroforezy (IEP). Wyniki dla poszczególnych próbek Kategorie pacjentów Ciężka postać przewlekłej aspergilozy Wyniki testu IEP Status Liczba pacjentów Wyniki testu Platelia Aspergillus IgG Status pacjentów Dodatni (%) (pacjenci Dodatni (%) (pacjenci Dodatni Pośredni Ujemny o statusie pośrednim o statusie pośrednim traktowani jak traktowani jak pacjenci pacjenci o statusie o statusie dodatnim) ujemnym) 96,3% 99,1% 95% CI [90,8-99,0] 95% CI [95,0-100] 68,2% 86,4% 95% CI [45,1-86,1] 95% CI [65,1-97,1] Dodatni 109 105 3 1 Pośredni 22 15 4 3 Ujemny 17 6 5 6 35,3% 95% CI [14,2-61,7] 64,7% 95% [38,5-85,8] Wyniki dla poszczególnych pacjentów Status pacjenta w odniesieniu do wyniku badania w kierunku organizmów Aspergillus przy użyciu immunoelektroforezy lub testu Platelia Aspergillus uznawano za dodatni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała dodatni wynik przy użyciu danej metody. W przeciwnym wypadku, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała wynik pośredni, oraz za ujemny, kiedy wszystkie próbki pochodzące od pacjenta dawały wynik ujemny. Kategorie pacjentów Ciężka postać przewlekłej aspergilozy Wyniki testu IEP Wyniki testu Platelia Aspergillus IgG Status Liczba Status pacjentów Dodatni (%) (pacjenci pacjentów o statusie pośrednim Dodatni Pośredni Ujemny traktowani jak pacjenci o statusie ujemnym) 95,0% Dodatni 40 38 1 1 95% CI [83,1-99,4] Dodatni (%) (pacjenci o statusie pośrednim traktowani jak pacjenci o statusie dodatnim) 97,5% 95% Cl [86,8-99,00] Ujemny 3 1 1 1 33,3%* 66,7%* * : Ze względu na niewystarczający rozmiar próby niemożliwe było obliczenie 95-procentowego przedziału ufności. SWOISTOŚĆ Swoistość testu wyznaczono przy użyciu panelu 222 próbek pochodzących od 222 pacjentów hospitalizowanych w ośrodku 1 (200 próbek) i w ośrodku 2 (22 próbki), którzy nie wykazywali objawów zakażenia szczepami rodzaju Aspergillus. Populacja badana / ośrodek Liczba próbek Ujemny Pośredni Dodatni Swoistość (pacjenci z wynikiem pośrednim traktowani jak pacjenci z wynikiem ujemnym) Ośrodek 1 200 199 1 0 99,5% 95% CI [97,2-100,0%] Ośrodek 2 22 22 0 0 100% 95% CI [84,6-100,0%] Razem 222 221 1 0 99,6% 95% CI [97,5-100,0%] Swoistość (pacjenci z wynikiem pośrednim traktowani jak pacjenci z wynikiem dodatnim) 100% 95% CI [98,2-100,0%] 100% 95% CI [84,6-100,0%] 100% 95% CI [98,3-100,0%] 16. KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkowane odczynniki wytwarzane są zgodnie z naszym Systemem Jakości, począwszy od etapu odbioru surowców aż do etapu wprowadzenia gotowego produktu na rynek. Każda partia jest poddawana kontroli jakości i zwalniana do wprowadzenia na rynek po spełnieniu określonych z góry kryteriów dopuszczenia. Firma Bio-Rad przechowuje dokumentację produkcyjną i kontrolną każdej wyprodukowanej partii. 9
17. BIBLIOGRAFIA 1. Agarwal, R. 2009. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p 805-826. 2. Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A. 2009. Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North India. Mycoses 24. 3. Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F. 2002. Follow-up of anti- Aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p156-162. 4. Denning, D. W. 2001. Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2): p25-31. 5. Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., Frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C. 2008. Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p36-42. 6. Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P. 2007. Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p451-456. 7. Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P. 2006. Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and infectious disease 55: p. 279-291. 8. Schubert, M. S. 2009. Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p1-7. 9. Shah, A. 2008. Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p117-128 10. Shah, R., Vaideeswar, P., Pandit, S. P. 2008. Pathology of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p342-345. 11. Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M. 2009. Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p37 42 12. Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B. 2005. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p1004-1013. 13. Virnig, C., Bush, R. K. 2007. Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p67-71. 10
11
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881123 www.bio-rad.com 12