Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w obrębie jamy ustnej i gardła*

Czas. Stomat., 2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w obrębie jamy ustnej i gardła* Human Papillomavirus (HPV) infections in the oral cavity and the throat Małgorzata Więcławska 1, Andrzej Kukwa 1, Magdalena Malejczyk 2, Sławomir Majewski 2, Krystyna Borowicz 3 Z Kliniki Otolaryngologii Oddziału Stomatologii AM w Warszawie 1 Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. A. Kukwa Z Kliniki Dermatologii i Wenerologii AM w Warszawie 2 Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. M. Błaszczyk-Kostanecka Z Zakładu Patomorfologii Szpitala Czerniakowskiego w Warszawie 3 Kierownik Zakładu: lek. med. K. Filipowicz Streszczenie Celem pracy było zbadanie częstości współistnienia zakażenia wirusem HPV w chorobach nowotworowych i nienowotworowych jamy ustnej oraz gardła za pomocą badań histopatologicznych i testów wirusologicznych. Materiał badawczy stanowiło 56 chorych, u których stwierdzono cechy histologiczne zakażenia HPV w jamie ustnej i gardle. Badanie histopatologiczne było badaniem wstępnym kwalifikującym do tej grupy badawczej. Czas obserwacji badanych chorych wynosił od 1 do 8 lat. Zgodność rozpoznania zakażenia HPV w obrazach morfologicznych z testami wirusologicznymi wynosiła około 63%. Zwraca uwagę częste występowanie onkogennego typu wirusa HPV16 w chorobach rozrostowo-zapalnych migdałków podniebiennych bez cech złośliwości nowotworowej. Stwierdzenie obecności HPV metodami morfologicznymi i wykrycie HPV o wysokim ryzyku złośliwości za pomocą testów wirusologicznych u chorych bez cech rozrostu nowotworowego ma istotne znaczenie dla profilaktyki przeciwnowotworowej. Summary The aim of this study was to assess the incidence of HPV infections in neoplastic and non-neoplastic diseases in the oropharyngeal region. The research findings are based on histopathological studies supported by viral tests. A total of fifty-six patients who manifested HPV infection in the oropharyngeal region were selected on the basis of histopathological examination. The patients were monitored for a period of 1 to 8 years. HPV infection was confirmed in both morphological examination and by viral tests in 63% of cases. The study demonstrated the high incidence of oncogenic HPV type infection with HPV16 in inflammatory hyperplasia of faucial tonsils but without oncogenic characteristics. Confirming the presence of HPV with morphological examination and detecting HPV bearing high oncogenic risk by means of viral tests in nonneoplastic patients is vital in cancer prevention. HASŁA INDEKSOWE: wirus brodawczaka ludzkiego, rak jamy ustnej i gardła, koilocyt, atypia koilocytarna, test Hybrid Capture, test PCR KEYWORDS: papillomavirus, oral and oropharynx cancer, koilocyt, koilocytic atypia, Hybrid Capture test, PCR test *Badania opisane w rozprawie przeprowadzono w Klinice Otolaryngologii, IS AM w Warszawie (kierownik: prof. dr hab. med. Andrzej Kukwa), w Pracowni Patomorfologii Szpitala Czerniakowskiego oraz w Pracowni Immunologii Kliniki Dermatologii i Wenerologii Akademii Medycznej w Warszawie. Praca powstała dzięki wsparciu finansowemu Fundacji im. Prof. Bochenka Postępy w Otolaryngologii i leczeniu głuchoty, działającą przy Klinice Otolaryngologii Akademii Medycznej w Warszawie oraz Komitetu Badań Naukowych (grant nr 4 PO5B 110 17). 689

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., Wstęp Od kilkunastu lat wzrasta zainteresowanie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV Human Papillomavirus). Taksonomia wirusów od czerwca 2001 roku nie zawiera już rodziny Papovaviridae. Obecnie wirusy brodawczaka ludzkiego zaliczane są do rodziny Papillomaviridae rodzaju Papillomavirus. Do chwili obecnej dokładnie poznano budowę ponad 100 typów wirusa HPV i podzielono je umownie na: typy o wysokim, średnim i niskim stopniu ryzyka onkogennego. Przekonywujące dowody na jego onkogenne właściwości napływają z wielu, niezależnych źródeł. Można dziś uznać, że interakcja pomiędzy komórką nabłonkową a zakażającym ją wirusem brodawczaka stanowi dobry model dla badań nad karcinogenezą. Wyniki wieloośrodkowych badań potwierdzają, że zakażenia pewnymi typami wirusa HPV, a w szczególności typem 16 i 18 współistnieją z rakiem szyjki macicy w 80-100% przypadków (23, 26, 34). Potwierdzono również, że jest możliwa tansmisja oro-genitalna zakażenia. Łatwe i częste okazuje się przenoszenie zakażenia HPV drogą płciową lub w okresie okołoporodowym od zakażonej matki (24) nawet, gdy w chwili porodu zakażenie matki jest bezobjawowe (zakażenie utajone) lub w tym okresie całkowicie nie stwierdza się obecności wirusa HPV (5). Okazuje się, że do zakażenia płodu może dojść w każdym okresie ciąży i brak obecności wirusa w kanale rodnym w czasie porodu nie daje gwarancji bezpieczeństwa. Cesarskie cięcie również nie zabezpiecza przed zakażeniem, bowiem wielokrotnie stwierdzano obecność cząstek wirusa w płynie owodniowym, przy czym u wielu noworodków znaleziono cząstki innych typów wirusów, odmiennych niż te w kanale rodnym matki w chwili porodu (5). Fenomen ten tłumaczy się możliwością wcześniejszej implantacji wirusa do trofoblastu drogą wstępującą, np. z kłykcin podczas stosunku płciowego. Na przestrzeni czasu może dochodzić do migracji wirusa do płynu owodniowego, skąd dostaje się on do górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego noworodka, podczas gdy w tym czasie może dojść do samoograniczenia się zakażenia w obrębie kanału rodnego matki. Do tej pory uważano, że do zakażenia może dojść jedynie na drodze bezpośredniego kontaktu. Ponadto można przypuszczać, że obecność wirusa w organizmie płodu wzbudza zjawisko tolerancji, co może tłumaczyć słabą obronność gospodarza wobec tego patogenu po uzyskaniu samodzielności tj. po urodzeniu (31). Istnieją epidemiologiczne dowody potwierdzające wirusową etiologię, która ma związek z zachowaniami seksualnymi. Zaobserwowano wyraźną korelację pomiędzy częstością raka jamy ustnej i raka szyjki macicy (24). Co więcej wiele badań wykazało zwiększone ryzyko rozwoju raka jamy ustnej i gardła u chorych na raka szyjki macicy (7). Natomiast w przypadku raków głowy i szyi u kobiet odnotowano 13 razy częstsze niż przeciętnie występowanie atypii komórek nabłonka szyjki macicy (14). Te dane popierają tezę o istnieniu wspólnego etiologicznego czynnika dla raków górnego odcinka przewodu pokarmowego i oddechowego oraz raków w obrębie narządu rodnego, przy czym infekcja HPV jest tu najbardziej prawdopodobnym jego składnikiem. Klasycznie wyróżnia się trzy rodzaje infekcji HPV, przyjmując za kryterium podziału stopień możliwości jej rozpoznania. Infekcja kliniczna (jawna) charakteryzuje się najczęściej obecnością widocznych okiem nieuzbrojonym egzofitycznych tworów brodawkowatych. Za infekcję subkliniczną uznaje się stan, w którym pomimo nieobecności zmian makroskopowych oraz braku objawów subiektywnych, udaje się stwierdzić patologię nabłonkową, charakterystyczną dla HPV na podstawie badania cytologicznego i histopatologicznego (2) lub molekularnych testów wirusologicznych (11, 12, 13, 31). W przeciwieństwie do dwóch powyższych typów, infekcja utajona (latentna) jest najczęstszą formą zakażenia nie tylko nie wywołuje dole- 690

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego gliwości i nie powoduje powstania zmian makroskopowych, także nie wpływa na mikroskopową morfologię zajętego nabłonka. Ustalenie rozpoznania dla infekcji latentnej może być postawione jedynie na podstawie pozytywnego wyniku molekularnych badań wirusologicznych. Istnienie infekcji latentnej tłumaczy się brakiem ekspresji niektórych genów wirusa HPV, co ogranicza ilość kluczowych jego białek. Wówczas nie dochodzi do cyklu replikacyjnego, dlatego ilość DNA wirusa w zakażonych tkankach jest niewielka, rozmieszczona głównie w warstwie przypodstawnej nabłonka, przy czym wirus nie kończy swojego cyklu dojrzewania oraz nie jest zdolny do pełnej reprodukcji (31, 34). Ponadto podkreśla się rolę prawidłowej odporności komórkowej w utajonych infekcjach (15, 21, 33, 34). Ograniczony do nabłonka płaskiego tropizm wirusa HPV tłumaczy, dlaczego obecność zakażenia często przewlekła, nie wywołuje dostatecznie silnej odpowiedzi immunologicznej dopuszczając do przetrwania zakażenia często przez długi czas. Tłumaczy się to obwodowym położeniem nabłonka oraz brakiem naczyń krwionośnych w stanie fizjologii, wobec tego dotarcie komórek odpornościowych w pierwszej fazie zakażenia jest możliwe tylko na zasadzie przesięku (2, 31). W związku z tym, że w infekcjach utajonych rezerwuarem dla wirusa jest warstwa rozrodcza nabłonka, wymazy i popłuczyny z błony śluzowej mogą nie ujawniać jego obecności, w przeciwieństwie do objawowego zakażenia, gdzie wykrycie wirusa w wymazie lub popłuczynach może świadczyć o tym, że jest on aktywny, dojrzewa i ulega złuszczeniu wraz z warstwą powierzchowną błony śluzowej. Jednakże przy ocenie morfologicznej należy pamiętać o tym, że częstą zmianą towarzyszącą zakażeniu HPV jest rogowacenie prawdziwe i rzekome, zaś w przypadku nasilenia tych zmian badanie cytologiczne może nie ujawniać cech morfologicznych zakażenia wirusem, ponieważ w obrazach widoczne będą tylko łuski rogowe (2, 11, 12, 13, 31). Intrygująca obserwacja dotyczy występowania zakażenia wirusem HPV niskiego ryzyka (typ 6, 11 i rzadziej typ 2, 4, 7) w raku górnych dróg oddechowych i to również w przypadkach bez współistnienia brodawczaka. Obecność wirusów: HPV 6 lub 11 została potwierdzona przez Flissa (6) w jądrach komórek guza metodą PCR w 7 z 17 brodawczakowatych raków jamy ustnej. Jednak do tej pory w przypadku wirusów niskiego ryzyka nie udała się indukcja immortalizacji komórek nabłonka, która prowadziłaby do złośliwej transformacji nowotworowej. Wydaje się, że infekcje HPV wirusem niskiego ryzyka mogą przyczyniać się do kancerogenezy jedynie w połączeniu z narażeniem na inne, zewnętrzne czynniki ryzyka jak nikotyna i alkohol. Uwzględniając wpływ egzogennych kofaktorów, rolę wirusa niskiego ryzyka ocenia jako synergistyczną (25, 27). Niektórzy badacze zarejestrowali jednak zjawisko integracji genomu wirusa HPV6 w raku migdałków, co dotychczas wydawało się cechą wirusów grupy zwiększonego ryzyka (27). Ustalono lokalizację miejsca integracji z genomem gospodarza: był to chromosom 10q24. Rola połączenia wirusa niskiego ryzyka z genomem gospodarza być może jest sposobem na przetrwanie wirusa w komórkach rakowych gospodarza i dochodzi do takich połączeń znacznie rzadziej niż w przypadku wirusów HPV wysokiego ryzyka. Integrację z genomem gospodarza badał również Venuti (28) u chorych z rakiem głowy i szyi, którą stwierdził dla wirusa HPV6 aż w 20% przypadków. Dla porównania integrację HPV 16 stwierdzał w 43% spośród wszystkich pozytywnych testów HPV DNA. Badania epidemiologiczne dowodzą niezbicie, że zakażenie onkogennymi typami wirusa (najczęściej HPV16) ma znaczący wpływ na wzrost ryzyka zachorowania na raka w obrębie głowy i szyi. W badaniach wymazów z jamy ustnej u mężczyzn z grupy kontrolnej na obecność HPV wykazano, że u chorych z typem wirusa 6 i 16 pojawia się zwiększone ryzyko wystąpienia raka jamy ustnej: 2,9 raza dla wirusa HPV6 i 691

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., 6,2 raza dla wirusa HPV16 (17). Powyższe dane potwierdzają, że wykazujący tropizm do komórek nabłonka płaskiego wirus HPV, znany jako czynnik sprawczy raka szyjki macicy może również odgrywać rolę w etiologii raków płaskonabłonkowych głowy i szyi. Obecność HPV DNA w guzach wspiera tę hipotezę (1, 2, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32). Badania molekularne dostarczają głównych danych dotyczących roli i mechanizmów działania onkogenego wirusa (1, 3, 4, 8, 16, 17, 25, 27, 28, 32, 34). Bezpośrednie dowody aktywności wirusa pod postacią obecności transkryptów mrna E6 i mrnae7 oraz wykrycie cząstek wirusa w stanie zintegrowanym z genomem gospodarza świadczą o zaangażowaniu wirusa w procesie kancerogenezy i wykrywane były najczęściej w tkance migdałkowej (18, 25, 27, 32). Integracja wirusów wysokiego ryzyka zachodzi w miejscu genu E2 wirusa, doprowadza to do jego rozerwania i przez to do unieczynnienia. Gen E2 jest supresorem genów E6 i E7 wirusa HPV wysokiego ryzyka onkogennego. To zdarzenie wyzwala potencjał dla aktywności genów onkogennych wirusa E7 i E6, a sama integracja jest dowodem na aktywność wirusa w transformacji nowotworowej. Ekspresja E6 w rejonie głowy i szyi najsilniej wykazywana jest w tkance migdałkowej. Obecność transkryptów potwierdzono także w tkance limfatycznej węzłów przerzutowych (24, 27), a w jednym przypadku w węźle chłonnym, nawet wówczas, kiedy w guzie pierwotnym nie stwierdzono obecności wirusa HPV (24). Poprzez ekspresję E6 i E7 wirus przestraja ważne mechanizmy, takie jak cykl komórkowy i drogę apoptozy. Białko E6 specyficznie inaktywuje dziewiczy typ białka P53, a E7 inaktywuje białko Rb. Tą drogą typy wysokiego ryzyka onkogennego poprzez działanie E6 degradują białko P53. Jest to alternatywna droga do klasycznej mutacji w celu pokonania genu p53. Teorię biologicznych mechanizmów wspiera odkrycie, że mutacje genu p53 trudno jest spotkać w raku szyjki macicy (22). Badania nad ekspresją E6\E7 w rakach głowy i szyi potwierdzają, że zarówno E6 oraz E7 włączają się w karcinogenezę górnego odcinka przewodu pokarmowego i układu oddechowego (8, 16, 17, 25, 27, 32). Ekspresję genów wirusa E6 i E7 udało się potwierdzić jedynie u części pacjentów w nabłonku górnych dróg oddechowych zakażonym wirusem HPV np. w tkance migdałkowej w około 40%.Nadal nie możemy wykluczyć możliwości, że w niektórych przypadkach, kiedy E6 mrna jest negatywne możliwe, że do zainicjowania onkogenezy doszło wcześniej według zasady: uderzenie i bieg (hit and run). Ponadto stymulowana wirusem degradacja genu p53 może być zastępowana przez mutacyjne zdarzenia podczas procesu złośliwienia (27). Należy się liczyć z faktem, że istnieje liczba mutacji nieznanych do tej pory, które uszkadzają aparat genetyczny gospodarza. W ostatnim czasie udało się wyhodować linie komórkowe wywodzące się z raka jamy ustnej i gardła. Stwierdzano obecność transkryptów HPV 16,33 E6 i E7 w hodowlach klonalnych z komórek rakowych migdałka. Linie komórkowe hodowane z komórek raka jamy ustnej, zawierających HPV 18 poddawano działaniu swoistych przeciwciał, uzyskując zahamowanie ich wzrostu. W innych badaniach udowodniono, że po połączeniu DNA wirusa z genomem komórki rakowej z dna jamy ustnej, obecność wirusa w hodowli była w stanie zintegrowanym (25). Ponadto w sposób doświadczalny potwierdzono zdolność do immortalizacji komórek nabłonka górnych dróg oddechowych po transfekcji HPV18. Wykazano przy tym znaczną aktywność telomerazy oraz obecność w komórkach transkryptów E6 i E7. Komórki nabłonka oddechowego mogą być immortalizowane przez pełną konstrukcję wirusa, choć region E6 i E7 jest wystarczający do ich immortalizacji. Ostatnie doniesienia oparte na badaniach genetycznych nowotworów głowy i szyi dowodzą, że mechanizm kancerogenezy różni się znacznie w przypadku raka płaskonabłonkowego ze 692

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego współistnieniem aktywnej infekcji HPV od przypadków, w których nie stwierdza się wirusa (3, 4, 8, 16). Model genetyczny komórek w raku bez aktywnej infekcji wykazuje istotne zmiany w pewnych chromosomach: 3p, 9p, 17 p we wczesnych etapach kancerogenezy. Wiąże się to ze zjawiskiem utraty heterozygotyczności (LOHloss of heterozygosity). Heterozygotyczność w tym znaczeniu oznacza występowanie pary alleli, w których jeden zawiera gen zmutowany, a drugi prawidłowy. W procesie kancerogenezy niestabilność genetyczna powoduje losową utratę jednego z alleli. Jeżeli wypada allel zawierający gen prawidłowy, który mógł naprawić nieprawidłową ekspresję zmutowanego genu to metabolizm komórki zostanie zakłócony. W ww. chromosomach położone są geny supresorowe transformacji nowotworowej kolejno są to geny: FHIT, 16p i p53, biorące udział we wczesnych etapach kancerogenezy w fazie inicjacji. W przypadku zakażenia HPV stwierdza się niski poziom LOH w wyżej wymienionych chromosomach, a co za tym idzie niższe prawdopodobieństwo wystąpienia zmian w ich obrębie. I tak wytłumaczono dlaczego w przypadku guzów HPV(-) stwierdza się często mutacje genu p53, a w guzach HPV (+) aktywność prawidłowego białka genu p53 (zwanego białkiem dzikim) zostaje zablokowana w innym mechanizmie niż mutacja: mianowicie poprzez związanie go przez białko E6 wirusa. Skutek obu mechanizmów kancerogenezy jest w rezultacie podobny w obu białko p53 nie funkcjonuje. Trwają intensywne badania nad pozostałymi genami kontrolującymi wzrost i różnicowanie komórek. Inną intrygującą obserwację poczyniono porównując palaczy i niepalących. Mianowicie stwierdzono, że częstość LOH w chromosomach 6p, 8p, 9p i 14q nie różni się u palaczy i niepalących oraz zaobserwowano o 33% mniej LOH w chromosomach 3p, 4q i 11q u niepalących niż u palaczy (3). Zmiany w wyżej wymienionych chromosomach mają wpływ na kolejne etapy złożonego i wieloczynnikowego procesu kancerogenezy. Przebieg zakażenia HPV Transkrypcja i replikacja wirusa związana jest z dojrzewaniem komórek w nabłonku wielowarstwowym płaskim, do którego HPV wykazuje tropizm. Czynnikami zapoczątkowującymi mogą być urazy lub mikrourazy nabłonków skóry i błon śluzowych ułatwiające przenikanie wirusa wgłąb do komórek rozrodczych warstwy podstawnej. Podobnie uraz operacyjny stwarza dogodne warunki do przetrwania i rozsiewu wirusa (31). Głębiej dzielące się komórki ujawniają aktywność genów wczesnych (E) HPV. Tworzy się zatem genom pozbawiony kapsydu stąd na tym poziomie nie dochodzi do utworzenia w pełni wykształconego wirusa. Ekspresja genu L ujawnia się w dojrzałych komórkach, blisko powierzchni. Tak więc dojrzewanie wirusa zachodzi niejako łącznie z dojrzewaniem komórki. Pomimo, że w warstwach powierzchownych komórki nie dzielą się, to powierzchowne usytuowanie sprzyja łatwemu rozsiewowi wirusa, przez to jest ułatwione pozyskanie materiału do badań (31). Okres inkubacji może wahać się od kilku do kilkunastu miesięcy (najczęściej 1-8 miesięcy), aktywny wzrost HPV zajmuje 3-6 miesięcy i w tym okresie rozpoczyna się kształtowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza, która w rezultacie decyduje o klinicznej remisji lub o przejściu w stan przewlekły zakażenia. Możliwe jest też nosicielstwo bezobjawowe. Przewlekły stan zakażenia HPV przy masowej replikacji wirusa HPV (do wartości 1 wirus na komórkę lub więcej) u ludzi powyżej 35 roku życia stanowi ryzyko onkogenne i powinno skłaniać do szczególnej obserwacji i czujności onkologicznej. Okres dzielący pierwotne zakażenie od stwierdzenia inwazyjnej postaci raka może wahać się od 5 do 40 lat. Stąd przypuszcza się, że jest to czas potrzebny do nałożenia się wielu czynników kancerogennych, by wywołać efekt ostatecznej transformacji nowotworowej. 693

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., Kryteria morfologiczne zakażenia HPV Leopold G. Koss w 1956 roku po raz pierwszy opisał nietypową strukturę zakażonych komórek wprowadzając pojęcie koilocytozy i atypii koilocytarnej, choć opisywane obrazy początkowo nie łączono z infekcją wirusową. Zmianom makroskopowym wywołanym zakażeniem, Meisels w 1976 roku nadał nazwę kłykcin (2). W obrazie mikroskopu świetlnego istnieją pewne stałe cechy morfologiczne infekcji HPV. W jądrach zakażonych komórek nabłonka płaskiego wirus namnaża się, a w ich cytoplazmie występują zmiany zwyrodnieniowe, którym towarzyszy glikogenoliza. Glikogen jest zużywany jako materiał energetyczny dla rozwoju wirusa. Wiąże się z tym charakterystyczne, nieregularne przejaśnienie okołojądrowe tzw. halo. To w związku z tym przejaśnieniem komórka ma wygląd dziurawy i została nazwana koilocytem; koilos po grecku dziura (ryc. 1). Wokół owego przejaśnienia okołojądrowego powstaje również kwasochłonne zagęszczenie ektoplazmy, spowodowane zepchnięciem substrukturalnych składników cytoplazmy na obwód. Granica pomiędzy tym przejaśnieniem i obwodowym zagęszczeniem cytoplazmy przybiera formę falistą. Samo jądro komórkowe jest również morfologicznie zmienione: jest ono przeważnie małe, zniekształcone, często kanciaste o nieprawidłowej barwliwości (ryc. 2, 3). Masywne występowanie koilocytów w połączeniu z bogatym unaczynieniem określa się mianem koilocytosis florida. Koilocytosis florida współistnieje najczęściej z typami nieonkogennymi (najczęściej HPV6 i 11). W pewnej liczbie przypadków zakażeniu HPV towarzyszą obrazy klasycznej dysplazji. Ryc. 2. Skupisko koilocytów w brodawczaku. Poszerzone granice międzykomórkowe. Zaznaczona morfologia typowego koilocyta. Ryc. 3. Skupisko koilocytów w nabłonku nowotworowym. Rak języka i dna jamy ustnej in situ. Ryc. 1. Liczne koilocyty w nabłonku nienowotworowym. Poza koilocytami klasycznymi występują inne postacie zmian, związane z pojęciem atypii koilocytarnej. Manifestują się one powiększeniem i nieregularnością jąder, często ich wielopłatowością, nadmierną barwliwością i drobnoziarnistością chromatyny jądrowej (są to tzw. komórki bu- 694

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego kietowe). Towarzyszy temu zaburzenie warstwowości nabłonka, utrata mostków międzykomórkowych i proces mitozy w górnych jego warstwach. Przykłady koilocytów atypowych w obrazie mikroskopowym przedstawiono na ryc. 4 i 5. Ryc. 4. Koilocyty atypowe w nabłonku nowotworowym. Rak języka i dna jamy ustnej. Ze względu na synergizm nabłonka płaskiego szyjki macicy z nabłonkiem płaskim innych narządów, określenie kłykcin i rozrostu kłykcinowego można stosować do różnych okolic, ale w rejonie należącym do otolaryngologa przyjęła się nazwa rozrostu brodawkowatego lub brodawczaka. Potwierdzenie atypii koilocytarnej wskazuje z dużym prawdopodobieństwem na zakażenie onkogennymi typami HPV, najczęściej HPV16 (31). Jednakże, nie każde zakażenie typem onkogennym wirusa HPV16, nawet z towarzyszącą atypią koilocytarną w obrazach histopatologicznych prowadzi do transformacji nowotworowej. Wobec tego częste pobieranie wycinków i ich mikroskopowa ocena w tych przypadkach jest niezbędna. Pomimo tak znacznego rozwoju technik biologii molekularnej nadal pozostaje podstawową metodą profilaktyki przeciwnowotworowej (2, 11, 12, 13, 29, 30, 31). Dlatego głównym celem pracy jest ocena morfologicznych oznak zakażenia HPV i zmian zachodzących w zakażonej komórce u chorych leczonych w Klinice Otolaryngologii IS AM z rozpoznaniem raka płaskonabłonkowego, brodawczaka, a także u pacjentów z rozpoznaniem chorób nienowotworowych w rejonie jamy ustnej i gardła u chorych obu płci. Ponadto celem było wykonanie badań molekularnych dla ustalenia częstości występowania onkogennego i nieonkogennego typu wirusa HPV w tej lokalizacji. Materiał i metody Ryc. 5. Forma bukietowatego koilocyta w nabłonku nowotworowym.rak języka i dna jamy ustnej. W piśmiennictwie rozważany był bardzo istotny problem współistnienia atypii koilocytarnej z dysplazją i rakiem płaskonabłonkowym. Kłykciny atypowe stanowią grupę wysokiego ryzyka onkogennego. Wymagają szczególnej uwagi klinicysty i histopatologa, ponieważ około 9,1% z nich (2) przechodzi w bardziej zaawansowane etapy śródnabłonkowej neoplazji, prowadzącej do rozwoju raka. Ogółem materiał badawczy obejmował 155 chorych leczonych w Klinice Otolaryngologii Akademii Medycznej Oddziału Stomatologii Szpitala Czerniakowskiego w Warszawie, u których stwierdzano różnie nasilone morfologiczne cechy infekcji HPV o różnej lokalizacji w obrębie głowy i szyi (10, 11, 12, 13, 29, 30, 31). Dla realizacji postawionych założeń przedstawianej pracy analizie poddano grupę 56 chorych spośród wyżej wymienionych pacjentów, u których zaznaczały się histopatologiczne cechy infekcji HPV w rejonie jamy ustnej i gardła. U 695

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., części tych chorych wykonano molekularne testy wirusologiczne i następnie dokonywano oceny wzajemnej korelacji wyników badań histopatologicznych z wynikami testów wirusologicznych. Byli to chorzy z rozpoznaniem raka i innych procesów rozrostowych, ale także pacjenci ze stanami zapalnymi. Badana grupa chorych wybrana była spośród pacjentów Kliniki Otolaryngologii AM IS Szpitala Czerniakowskiego w Warszawie, leczonych w latach 1995-2003. Rozpoznanie ustalano na podstawie badania histopatologicznego materiału z tkanek, które w procesie leczenia usuwano chirurgicznie. Do badania kontrolnego pobierano tkankę z loży pooperacyjnej. Ocenę histopatologiczną prowadzono w Zakładzie Patomorfologii Szpitala Czerniakowskiego, zawsze dokonywaną przez tego samego specjalistę patomorfologa. W naszym przypadku każdy materiał operacyjny był badany w seryjnych skrawkach. W analizie uwzględniano: płeć, dane rozpoznania histopatologicznego a wśród nich: stany zapalne przewlekłe, brodawczaki, raki płaskonabłonkowe w stopniu zróżnicowania GI-GII oraz raki w stopniu zróżnicowania GIII, histopatologiczne oznaki zakażenia HPV; podzielono materiał badawczy na trzy grupy według nasilenia morfologicznych objawów zakażenia rozpatrywano kolejno: pojedyncze, rozproszone koilocyty, koilocytozę i atypię koilocytarną. U 30 pacjentów wykonano molekularne testy wirusologiczne, wycinki pobierano śródoperacyjnie bezpośrednio ze zmiany chorobowej. Ogółem wykonano 49 testów wirusologicznych w lokalizacji jamy ustnej i gardła w przebiegu leczenia. Test wirusologiczny oznaczany metodą Hybrid Capture wykonywany był na obecność wirusów onkogennych, bez oznaczania typu HPV lub metodą PCR na obecność typu 6 HPV o tzw. niskim ryzyku onkogennym oraz test PCR na obecność typu 16 HPV o tzw. wysokim ryzyku onkogennym. Wyniki Częstość występowania zakażenia HPV w obrębie jamy ustnej i gardła na tle innych lokalizacji narządowych Zakażenie wirusem HPV u 155 chorych najczęściej potwierdzono w obrębie krtani u 78 chorych, co stanowiło 50,3%, następnie w obrębie gardła u 40 chorych, co stanowiło 25,8% i w obrębie jamy ustnej u 16 chorych, co stanowiło 10,3% (tab. I). Rzadsze lokalizacje to: jama nosa u 11 chorych, co stanowiło 7,1%, część szyjna przełyku: u 7 chorych, co stanowiło 4,5% oraz szyja: u 3 chorych, co stanowiło 1,9%. W gardle na 40 badanych chorych u ponad połowy (26/40) lokalizacja obejmowała migdałki podniebienne, a w pojedynczych przypadkach migdałek gardłowy i językowy. T a b e l a I. Częstość występowania różnych lokalizacji narządowych Z rozp. hist-pat zakażeń HPV Bez cech hist-pat zakażenia HPV n % ± błąd n % ± błąd Jama ustna 16 10,3 ± 2,4 1 20,0 ± 17,9 Gardło 40 25,8 ± 3,5 2 40,0 ± 21,9 Krtań 78 50,3 ± 4,0 0 0,0 ± 17,9 Nos 11 7,1 ± 2,1 2 40,0 ± 21,9 Przełyk 7 4,5 ± 1,7 0 0,0 ± 17,9 Szyja 3 1,9 ± 1,1 0 0,0 ± 17,9 Ogółem 155 100,0 5 100,0 696

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego Częstość rozpoznań histopatologicznych u chorych z histopatologicznie potwierdzoną infekcją HPV w obrębie jamy ustnej i gardła W rejonie jamy ustnej i gardła w badaniu histopatologicznym potwierdzono oznaki infekcji HPV u 56 chorych Częstość rozpoznań histopatologicznych w tych lokalizacjach przedstawiono w tabeli II. U pacjentów leczonych w klinice ze współistniejącym zakażeniem HPV, wśród chorych ze zmianami rozrostowymi w jamie ustnej, u 50% występowały one na podłożu zapalenia, a u pozostałych 50% były to zmiany nowotworowe w stadium zróżnicowania histopatologicznego G I, G II i GIII (50%). W obrębie gardła cechy przewlekłego zapalenia występowały u chorych w 65%, z rozpoznaniem raka w 25%, a brodawczaka w 10%. Ocena morfologiczna intensywności zakażenia HPV dla lokalizacji jamy ustnej i gardła Oceniano intensywność zakażenia HPV w badaniu histopatologicznym u 56 osób z rozpoznaniem chorób nowotworowych i nienowotworowych. Materiał podzielono na 3 grupy uwzględniając poszczególne stadia procesu: grupa preparatów z pojedynczymi koilocytami, koilocytoza wyraźnie zaznaczona i wyrażona oraz zmiany z wyraźnymi cechami atypii koilocytarnej. W rejonie jamy ustnej i gardła najczęściej stwierdzano obecność koilocytów wynosiła ona około 70% dla obu lokalizacji. Występowanie wirusów w lokalizacji jamy ustnej i gardła Na rycinie 6 zilustrowano graficznie wyniki testów wirusologicznych wykonanych przed leczeniem u chorych z oznakami morfologicznymi zakażenia HPV w rejonie jamy ustnej i gardła. Typ 6 wirusa wykrywano najrzadziej w gardle 18%, przy 50% wykrywalności w obrębie jamy ustnej. Typ onkogenny wykrywano z jednakową częstością, około 50% w obu lokalizacjach narządowych. Zwraca uwagę wysoki poziom onkogennego typu wirusa w gardle, czyli w lokalizacji o najwyższej częstości stanów zapalnych (tab II, ryc. 6). Ryc. 6. Wyniki testów wirusologicznych w rejonie jamy ustnej i gardła. T a b e l a I I. Zróżnicowanie częstości występowania rozpoznań histopatologicznych w obrębie jamy ustnej i gardła Stany zapalne Brodawczaki GI-GII GIII N (100%) n % ± błąd n % ± błąd n % ± błąd n % ± błąd Jama ustna 8 50,0 ± 12,5 0 0,0 ± 6,1 7 43,8 ± 12,4 1 6,2 ± 6,1 16 Gardło 26 65,0 ± 7,5 4 10,0 ± 4,7 3 7,5 ± 4,2 7 17,5 ± 6,0 40 T a b e l a I I I. Morfologiczna ocena zakażenia dla lokalizacji w jamie ustnej i gardle Pojedyncze Koilocytoza Atypia koilocytarna N (100%) n % ± błąd n % ± błąd n % ± błąd Jama ustna 1 5,9 ± 5,7 12 70,6 ± 11,1 3 17,7 ± 9,2 16 Gardło 8 19,1 ± 6,1 29 69,1 ± 7,1 3 7,1 ± 4,0 40 697

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., Płeć chorych zakażonych HPV a lokalizacja narządowa choroby Na rycinie 7 zawarto rozkład danych dotyczących częstości występowania morfologicznych oznak zakażenia wirusem HPV w lokalizacjach narządowych: jamy ustnej i gardła. Ogółem wśród grupy badanych 56 chorych było 35 kobiet i 21 mężczyzn. U kobiet w 41,7% obecność zakażenia stwierdzono w obrębie gardła. W jamie ustnej cechy zakażenia HPV stwierdzano częściej u kobiet niż u mężczyzn. Ryc. 7. Zakażenie HPV w jamie ustnej i gardle u pacjentów obu płci. Omówienie i dyskusja W obrębie jamy ustnej i gardła obecność niektórych typów wirusów stwierdza się w zmianach rozrostowych łagodnych oraz w rakach płaskonabłonkowych tych okolic. W brodawczakach najczęściej występują typy HPV 6 i 11, w rakach zaś typy HPV 16 i 18. Dość często zakażenie wirusem HPV przybiera formę tzw. infekcji utajonej u pacjentów bez manifestacji klinicznej choroby. Wówczas wirus pozostaje niejako w symbiozie z komórką gospodarza, ale stan taki może dynamicznie zmieniać się na przestrzeni czasu. Mianowicie wirus może zostać wyeliminowany, ale infekcja często ma charakter nawrotowy, może również przybierać formę czynną, gdy dla swojego przetrwania wirus w rabunkowy sposób korzysta z materiału genetycznego gospodarza. Wówczas mamy do czynienia z tzw. przetrwałym masywnym zakażeniem (za takie przyjęło się uważać zakażenie o częstości przynajmniej 1 kopii wirusa na 1 komórkę), które może przeistaczać się w aktywną swoją formę z zagrożeniem przemiany nowotworowej komórek nabłonka płaskiego, zwłaszcza gdy występuje po 35 roku życia. Niezwykle ważnym wydaje się być potwierdzenie przejścia przewlekłego zakażenia HPV w stan aktywny. Według najnowszych badań aktywne zakażenia na ogół wiążą się z obecnością transkryptów E6 i E7 mrna HPV, które to odgrywają zasadniczą rolę w procesie transformacji nowotworowej. Stwierdzenie ich obecności jest bezpośrednim dowodem na aktywność wirusa w organizmie. Podobnie potwierdzeniem tego faktu jest test integracji genomu wirusa z genomem gospodarza. Przeprowadzenie tych badań jest możliwe, choć metody te są drogie i skomplikowane, nie mogą więc być stosowane na skalę masową jako test przesiewowy dla uchwycenia momentu bezpośredniego zagrożenia transformacją nowotworową komórki. Nieodzowna pozostaje skrupulatna ocena histopatologiczna dla wykrycia stanu pobudzenia i zaktywowania zakażonych tkanek oraz pierwszych oznak niepokoju komórkowego i tkankowego. Stwierdzenie atypii koilocytarnej oraz obecności typu wirusa HPV o dużym ryzyku onkogennym zobowiązuje jednocześnie do systematycznej obserwacji i czujności onkologicznej. Wiąże się to z okresowym pobieraniem materiału tkankowego do badań histopatologicznych, z których można wnioskować o dynamice przebiegu zakażenia HPV i jego nasileniu. Poszukiwano także morfologicznych oznak zakażenia wirusem HPV w utkaniu nowotworowym Znamiona infekcji w postaci koilocytów i komórek bukietowych (komórki z jądrami wielopłatowymi) występowały w dojrzałych postaciach raka płaskonabłonkowego, natomiast w mało dojrzałych formach nacieku nowotworowego były niemożliwe do identyfikacji. Obecnie uważa się, że zakażenie wirusem HPV inicjuje ciąg wydarzeń destabilizujących 698

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego cykl komórkowy i od tej chwili aktywna rola wirusa nie jest już wymagana do realizacji procesu onkogenezy. Z innych obserwacji w tym i własnych wynika, iż należałoby się zastanowić nad interpretacją braku cech morfologicznych infekcji HPV w materiale tkanki nowotworowej, przy obecności takich cech w okolicznym nabłonku nienowotworowym. Znamiona infekcji HPV mogą zanikać wśród mechanizmów destabilizacji komórkowej w procesie kancerogenezy oraz w wyniku niedojrzałości (zmiany metabolizmu) komórki nowotworowej w stosunku do dojrzałego keratynocyta. Jak wiadomo namnażanie wirusa odbywa się w dojrzałych komórkach nabłonka płaskiego. Taka komórka jest niezbędna, by doszło do zakończenia procesu formowania wirusa. Nowopowstała tkanka przy udziale wirusa w stadium GIII wykazuje cechy mniejszego zróżnicowania nie stanowi też dobrego podłoża dla jego rozwoju, a tym samym cechy infekcji mogą w niej stopniowo zanikać. Poza tym, genom wirusa wtapia się w genom komórki gospodarza, stanowiąc jego składową, nawet staje się jej integralną częścią. Opracowując zebrany materiał zadano sobie pytanie: czy na podstawie morfologicznego obrazu koilocytów można określić typ wirusa: czy jest on onkogenny czy nieonkogenny? Badania histopatologiczne dotyczyły obecności koilocytów w nabłonku niezmienionym nowotworowo oraz w tkance nowotworowej. Obecność zakażonych komórek obserwowano najczęściej w nabłonku bez zmian nowotworowych, w sąsiedztwie nacieku nowotworowego. Wówczas oceniano ilościowo i jakościowo obecność koilocytów: jako liczne lub pojedyncze, rozproszone lub w skupiskach; jak również ich charakter: klasyczny, spokojny lub z cechami atypii. Pozwalało to na sklasyfikowanie infekcji typami nieonkogennymi lub typami wysokiego ryzyka onkogennego. Jak wykazała korelacja z badaniami molekularnymi nie zawsze morfologiczny obraz koilocytów odpowiadał właściwym typom wirusa. Ogólnie jednak można powiedzieć, że: a) atypia koilocytarna wskazuje z dużym prawdopodobieństwem na zakażenie onkogennymi typami HPV (w naszym materiale był to HPV16), b) koilocytosis florida współistnieje najprawdopodobniej z typem nieonkogennym (HPV6). Natomiast występowanie różnej liczby koilocytów bez wyraźnych cech atypii, niekiedy w niewielkich skupiskach nie pozwala przewidywać, jaki typ wirusa mógł być za to odpowiedzialny. Na szczególną uwagę zasługują badania zmian nienowotworowych w obrębie gardła, zwłaszcza tkanki migdałków podniebiennych, usuwanych z powodu tonsilitis chronica a w których morfologicznie znajdowano oznaki zakażenia HPV, o niewielkim nasileniu i bez cech atypii koilocytarnej. Wśród 16 przypadków testy wirusologiczne w 8 wskazywały na typ16 HPV. Sytuacje tego typu stwarzają wiele niejasności, mogą też mieć swoje implikacje w profilaktyce onkologicznej i są związane z pojęciem subclinical infection. Wielu autorów potwierdza, że niektóre lokalizacje są najczęstsze dla zakażenia wirusem HPV. Za szczególnie uprzywilejowane wymienia się migdałki podniebienne; w następnej kolejności: jamę ustną i krtań (18, 25, 27, 32). McKaig (17) najczęściej cząstki wirusa znajdował w komórkach nabłonka jamy ustnej, następnie gardła i krtani. W naszym materiale w rejonie jamy ustnej i gardła u 56 chorych stwierdzono różnie nasilone oznaki histopatologiczne zakażenia HPV. Badania wirusologiczne wykonaliśmy u 30 spośród tych pacjentów. U 19 pacjentów potwierdziliśmy obecność wirusa: u 14 chorych był to typ onkogenny, u 5 typ nieonkogenny. Najczęstszą lokalizacją narządową były u kobiet migdałki podniebienne. Przy wysokim odsetku występowania stanów zapalnych (65%) w tej lokalizacji (tab. II), również częściej potwierdzano wirusa HPV typ 16! w 50% przypadków, przy 18,8% wykrywalności wirusa typu 6 HPV (tab. II). U wszystkich pacjentów występowanie HPV16 w gardle dotyczyło migdałków podnie- 699

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., biennych i w jednym przypadku migdałka językowego. U 19 chorych, u których stwierdzano obecność wirusa HPV przed leczeniem wykonano również test wirusologiczny po leczeniu. Po radykalnym leczeniu: najczęściej chirurgicznym lub skojarzonym z laseroterapią i leczeniem napromienianiem rozrostach złośliwych do eliminacji wirusa po leczeniu dochodziło jedynie w 50% przypadków. W obrębie gardła wyraźnie częściej spotykano infekcję typem 16 w porównaniu z typem 6. Analiza statystyczna wykazała, że potwierdzenie obecności typów wirusów 6 i 16 jest niezależne, dlatego wolno rozpatrywać je oddzielnie nawet w przypadkach, kiedy w badaniach molekularnych stwierdza się infekcję obu typami. Nadal nie jest rozstrzygniętą kwestia: czy lokalizacja zmian może decydować o możliwości wniknięcia wirusa do nabłonka?. W dużej mierze zależy to od indywidualnych uwarunkowań. Natomiast w naszym rozumieniu sama lokalizacja nie ma wpływu na morfologiczne obrazy zakażenia HPV, takie jak koilocytoza czy atypia koilocytarna w postaci ogniskowej lub rozlanej. Zależy to od typu wirusa i innych znamion, a znacznie mniej od samej lokalizacji (11, 12, 13, 29, 30, 31). Z danych z piśmiennictwa wynika, że najczęstszym typem wirusa HPV w obrębie górnych dróg oddechowych jest typ 16HPV, zaliczany do grupy zwiększonego ryzyka onkogennego. Dominacja występowania typu 16 HPV w jamie ustnej, gardle i krtani jest obserwowana przez zdecydowaną większość badaczy (1, 2, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32). Wymienione typy HPV choć stanowią grupę dominującą to w badaniach tkanek w obrębie głowy i szyi potwierdzano obecność innych typów wirusów HPV, jak: 1, 2, 3, 4, 8-10, 13, 30, 57 (17). Hoffman (9) w swoim materiale opartym głównie na występowaniu wirusa w obrębie migdałków podniebiennych i jamy ustnej wykazał dodatkowo obecność wirusów HPV typu 45, a Snijders (25) HPV 31 i 33 w materiale z tej samej lokalizacji. Wnioski 1. Wobec braku testów przesiewowych stwierdzających moment uaktywnienia się przetrwałej infekcji wirusowej, badanie histopatologiczne spełnia szczególną rolę w rozpoznawaniu zakażenia HPV i upoważnia do stosowania jej jako metody diagnostycznej pierwszej selekcji z możliwością oceny stopnia nasilenia zakażenia i jego dynamiki. Obecnie jest metodą obowiązującą dla rozstrzygania o postępowaniu terapeutycznym. 2. Morfologiczne cechy zakażenia HPV w rejonie gardła i jamy ustnej stwierdzano częściej u kobiet niż u mężczyzn. Najczęstszą lokalizacją zakażenia były migdałki podniebienne. 3. Stwierdzenie obecności zakażenia HPV metodami morfologicznymi oraz potwierdzenie obecności HPV o wysokim ryzyku złośliwości za pomocą testów wirusologicznych u chorych bez cech rozrostu nowotworowego ma znaczenie dla profilaktyki przeciwnowotworowej i jest zagadnieniem do dalszych badań i dyskusji. 4. Nadal pozostaje niewyjaśnionym: czy dodatnie testy wirusologiczne wyprzedzają morfologiczne oznaki procesu nowotworowego lub też, czy istnieją nieznane dotąd mechanizmy (poza barierą immunologiczną) powodujące opóźnienie morfologicznych oznak działania onkogennego i okresową zmienność jego aktywności. Piśmiennictwo 1. Andl T., Kahn T., Pfuhl A., Nicola T., Erber R., Conradt C., Klein W., Helbig M., Dietz A., Weidauer H., Bosh F. X.: Etiological involvement of oncogenic human papillomavirus in tonsillar sąuamous celi carcinomas lacking retinoblastoma celi cycle control. Cancer Res., 1998, 58, 1, 5-13. 2. Borowicz K., Walczak L.: Patomorfologia zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego. Human Papilloma Virus (HPV) szyjki macicy i sromu. Pat. Pol., 1990, 41, 43- -51. 3. Braakhuis B. J. M.,Snijders P. J. F., Keune W. J. H., Meijer Ch. J. L., Ruijter-Schippers M. J., Leemans C. R., Brakenhoff R. H.: Genetic Patterns in Head and Neck Cancers That Contain or lack Transcriptionally Active Human Papillomavirus. J. National Cancer Institute, 2004, 96, 13, 998-1006. 700

2005, LVIII, 10 Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego 4. Dark J. H.: A causal role for human papillomavirus in head and neck cancer. Lancet., 2004, 363, 1488-1499. 5. Favre M., Majewski S., De Jesus N., Maleczyk M., Orth G., Jabłońska S: A possible vertical transmissionof human papillomavirus genotypes associated with epidermodysplasia verruciformis. J. Invest. Dermatol., 1998, 11, 2, 333-336. 6. Fliss D. M., Noble-Topham S. E., McLachlin M., Freeman J. L., Noyek A. M., van Nostrand A. W., Hartwick R. W.: Laryngeal verrucous carcinoma: a clinicopathologic study and detection of human papillomavirus using polymerase chain reaction. Laryngoscope., 1994, 104, 2, 146-152. 7. Frisch M., Biggar R. J.: Etiological parallel between tonsillar and anogenital sąuamous-cell carcinomas. Lancet., 1999, 354, 1442-1443. 8. Habeck M.: New data confirm that HPV can cause oropharyngeal cancer. Mol. Med. Today., 2000, 6, 8, 297-299. 9. Hoffmann M., Kahn T., Mahnke Ch. G., Goeroegh T., Lippert B. M., Werner J. A.: Prevalence of human papillomavirus in sąuamous celi carcinoma of the head and neck determined by Polymerase Chain Reaction and Southern Błot Hybridization: proposal for optimized diagnostic reąuirements. Acta Otolaryngol., 1998, 118, 138-144. 10. Kukwa A., Sujkowska U., Wójtowicz P., Dudziec K., Tulibacki M., Więcławska M.: Monitorowanie pacjenta z brodawczakiem odwróconym nosa. Otolaryngol. Pol., 1995, XLIX, 20, 172-175. 11. Kukwa A., Więcławska M., Borowicz K., Walczak L.: Obraz infekcji HPV w nowotworach górnych dróg oddechowych. Nowa Medycyna., 1997, 18, 17-20. 12. Kukwa A., Więcławska M., Borowicz K., Walczak L.: Współzależność wirusa HPV z nowotworami jamy ustnej, gardła i krtani. Gazeta Stomatologiczna., 1997, 2, 5, 14-15. 13. Kukwa A., Więcławska M., Borowicz K., Walczak L.: Wstępne obserwacje dotyczące współistnienia wirusów HPV z nowotworami j. ustnej, gardła i krtani. W: Postępy w rozpoznawaniu i leczeniu chorób górnych dróg oddechowych o podłożu immunologicznym. Pod redakcją A. Ligęziński, D. Jurkiewicz. Wydawnictwo Urban & Partner., 1999, 13-22. 14. N. K. Lee, D. B. Ritter, A. E. Gross: Head and neck sąuamous celi carcinomas associated with human papillomaviruses and an increased incidence of cervical pathology. Otolaryngol. Head and Neck Surg., 1988, 99, 296-301. 15. Malejczyk M.: Rola czynnika martwicy nowotworu w regulacji wzrostu nowotworów związanych z wirusami brodawczaka ludzkiego. Praca doktorska. 1994. 16. Mao L., Hong W. K.: How Does Human Papillomavirus Contribute to Head and Neck Cancer Development? J. National Cancer Institute., 2004, 96, 13, 978-980. -17. McKaig R. G., Baric R. S., Olshan A. F: Human papillomaviruses and head and neck cancer: epidemiology and molecular biology. Basic Science Review., 1998, 5, 250-265. 18. Mellin H., Friesland S., Lewensohn R., Dalianis T.,.Munck-Wikland E.: Human papillomavirus (HPV) DNA in tonsillar cancer: clinical correlates, risk of relapse, and survival Int., J. Cancer., 2000, 89, 3, 300-304. 19. Niv A., Sion-Vardi N., Gatot A., Nash M., Fliss D. M.: Identification and typing of human papillomavirus (HPV) in squamous celi carcinoma of the orał cavity and oropharynx. J. Laryngol. Otol., 2000, 114, 1, 41-46. 20. Ostwald C., Muller P., Barten M., Rutsatz K., Sonnenburg M., Milde-Langosch K., Loning T.: Human papillomavirus DNA in orał squamous celi carcinomas and normal mucosa. J. Oral Pathol. Med., 1994, 23, 220-225. 21. Papenhausen P. R., Kukwa A., Croft C. B., Borowiecki B., Silver C., Emeson E. E.: Cellular immunity in patients with epidermoid cancer of the head and neck. Laryngoscope, 1979, 89, 538-549. 22. Scheffner M., Werness B. A., Huibregtse J. M, Levine A. J., Howley P. M: The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes degradation of p53. Celi, 1990, 63, 1129-1136. 23. Schiffman M. H, Brinton L. A.: The epidemiology of cervical carcinogenesis. Cancer., 1995, 76, 1888-1901. -24. Smith E. M, Hoffinan H. T, Summersgill K. S., Kirchner H. L., Turek L. P., Haugen T. H.: Human papillomavirus and risk of orał cancer.laryngoscope., 1998, 108, 7, 1098-1103. 25. Snijders P. J. F., Steenbergen R. D. M., Meijer C. HJ. L. M., Walbboomers J. M. M.: Role of human papillomaviruses in cancer of the respiratory and upper digestive tract. Clin. Dermatology., 1997, 15, 415-425. 26. Syrjanen K., Syrjanen S.: Epidemiology of human papilloma virus infections and genital neoplasia. Scand. J. Infect. Dis., 1990, 69, 7-17. 27. Van Houten V. M. M., Snijders P. J. F., van den Brekel M. W. M., Kummer J. A., Meijer C. HJ., van Leeuwen B., Denkers F., Smeele L. E., Snów G. B., Brakenhoff R. H.: Biological evidence that Human Papillomaviruses are etiologically involved in a subgroup of head and neck squamous celi carcinomas. Int. J. Cancer., 2001, 93, 232 235. 28. Venuti A., Manni V., Morello R., De Marco F.,.Marzetti- Fmarcante M. L: Phisical state and expression of human papillomavirus in laryngeal carcinoma and sur- 701

M. Więcławska i in. Czas. Stomat., rounding normal mucosa. J. Med. Virol., 2000, 60, 4, 396-402. 29. Więcławska M.: Rola zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w chorobach jamy ustnej, gardła i krtani. Streszczenie pracy doktorskiej. Medycyna Dydaktyka Wychowanie, 2004, 4, 24-25. 30. Więcławska M.: Rola zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w chorobach jamy ustnej, gardła i krtani. Streszczenie pracy doktorskiej. Otolaryngol. Pol., 2004, 5, 1039-1041. 31. Więcławska M.: Rola zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w chorobach jamy ustnej, gardła i krtani. Praca doktorska. 2003. 32. Wilczynski S. P, Lin B. T., Xie Y., Paz I. B.: Detection of human papillomavirus DNA and onkoprotein overexpression are assiociated with distinct morphological patterns of tonsillar squamous celi carcinoma. Am J. Pathol., 1998, 152, 145-156. 33. Zawisza E., Kukwa A., Borowiecki B., Papenhausen P., Makowska W.: Odporność komórkowa w procesach nowotworowych górnych dróg oddechowych. Pol. Tyg. Lek., 1979, 34, 1948-1951. 34. Zur- Hausen H.: Papillomavirus in human cancer. Proc. Assoc. Am Physicians., 1999, 11, 6, 581-587. Otrzymano: dnia 21.IV.2005 r. Adres autorów: 03-789 Warszawa, ul. Stępińska 19/25. 702