Komórka i jej składniki 1
Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Najważniejsze rodzaje komórek stosowanych w biotechnologii przemysłowej Komórki prokariotyczne: aminokwasów, białek 1. Bakterie gramdodatnie i gramujemne producenci kwasów, alkoholi, - w tym promieniowce producenci antybiotyków Komórki eukariotyczne 2. Grzyby drożdże grzyby pleśniowe producenci etanolu i białek producenci białek i antybiotyków, i niektórych związków prostych 3. Komórki zwierzęce - komórki owadzie, CHO, BHK producenci białek
Komórki bakteryjne Morfologia komórek bakteryjnych
Prokariotyczna komórka bakteryjna
Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznej Składnik Skład molekularny Funkcja biologiczna Ściana komórkowa, wici i rzęski Błona komórkowa, mezosom Polisacharydy usieciowane peptydami, otoczone lipopolisacharydami Biwarstwa lipidowo (40%) -białkowa (60%); mezosom to wpuklenie błony Ochrona przed stresem osmotycznym i mechanicznym, Ruch (wici), adhezja i koniugacja (rzęski) Selektywnie przepuszczalna bariera umożliwiająca transport składników pokarmowych i metabolitów Obszar jądrowy Rybosomy Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych Kompleksy RNA (65%) i białek (35%) Genom. Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej Miejsce biosyntezy białek Cytoplazma Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych
Komórki bakteryjne są otoczone ścianą komórkową Uproszczone struktury osłon zewnętrznych komórek bakteryjnych
Bakteryjna ściana komórkowa i jej biosynteza to miejsca działania ważnych antybiotyków Antybiotyki beta-laktamowe Peptydoglikan Liza komórki bakteryjnej Wankomycyna
Promieniowce (Actinomycetales)
Eukariotyczna komórka zwierzęca
Eukariotyczna komórka roślinna
Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Skład i funkcja biologiczna organeli komórki eukariotycznej Organela Skład molekularny Funkcja biologiczna Błona komórkowa Biwarstwa lipidowo (50%) -białkowa (50%); Selektywna bariera transportowa; komunikacja międzykomórkowa Jądro Siateczka środplazmatyczna z rybosomami Aparat Golgiego Mitochondria Lizosomy (zwierzęta) Peroksysomy (zw.) lub glioksysomy (rośliny) Chloroplasty (rośliny) Cytoplazma Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych + RNA Zespoły błon lipidowo-białkowych + rybosomy j.w. + polisacharydy Otoczone podwójną błoną, zawierają enzymy, DNA i RNA Pęcherzyki zawierające enzymy hydrolityczne Pęcherzyki zawierające katalazę i inne enzymy utleniające Otoczone podwójną błoną, zawierają białka, lipidy, chlorofil, RNA, DNA i rybosomy Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne, cytoskeleton Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej i transkrypcji Miejsce biosyntezy białek Miejsce wydzielania odpadów komórkowych i obróbki białek Miejsce części reakcji katabolicznych i syntezy ATP Metabolizm materiałów pobranych na drodze endocytozy Miejsce reakcji katabolicznych, w których powstaje H 2 O 2 Miejsce fotosyntezy Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych oraz struktura nadająca kształt komórce
Jądro komórkowe Obraz komórek HeLa z jądrami komórkowymi zaznaczonymi barwnikiem Hoechst
Mitochondrium Obraz w mikroskopie elektronowym mitochondriów komórek pęcherzyków płucnych
Siateczka śródplazmatyczna retikulum endoplazmatyczne 1- jądro; 2 por jądrowy; 3 szorstkie RE; 4 gładkie RE; 5 rybosom; 6 białko transportowane w RE; 7 pęcherzyk transportowy; 8 aparat Golgiego (AG); 9 strona cis AG; 10 strona trans AG; 11 cysterna AG Obraz w mikroskopie elektronowym retikulum endoplazmatycznego
Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Rybosomy Rybosomy prokariotyczne: 30S + 50S 70S Rybosomy eukariotyczne: 40S + 60S 80S Wizualizacja struktury rybosomu Katalityczny rdzeń rybosomu Struktura zbudowany jestrybosomu z rrna
Grzyby w biotechnologii Grzyby są organizmami heterotroficznymi pasożyty lub saprofity Przykłady ról grzybów w środowisku: - dekompozycja martwej tkanki biologicznej (np. degradacja składników drewna) - czynniki chorobotwórcze rośliny (ponad 5 000 chorób), zwierzęta - Mycorrhizae symbioza z korzeniami roślin W biotechnologii - procesy fermentacyjne, wytwarzanie antybiotyków producenci białek terapeutycznych
Drożdże Budowa komórki drożdżowej Obraz komórek drożdży w skaningowym mikroskopie elektronowym Morfologia drożdży
chityna mannoproteiny Struktura grzybowej ściany komórkowej
GRZYBY Zygomycetes grzyby pleśniowe, sprzężniaki Grzybnia zbudowana z niepodzielnego mycelium. Rozmnażanie płciowe poprzez zarodniki zwane zygosporami lub bezpłciowe poprzez spory w sporangium. Mucor racemous Aspergillus fumigatus Ascomycetes workowce Grzyby jednokomórkowe lub tworzące grzybnię w postaci podzielnych strzępek. Rozmnażanie płciowe poprzez askospory lub bezpłciowe przez konidia. Do tej klasy należą m.in. Neurospra, Penicillium. Penicillium chrysogenum
Basidomycetes podstawczaki Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Rozmnażanie płciowe poprzez basidospory lub bezpłciowe poprzez konidia. Do tej klasy należą grzyby kapeluszowe. Amanita phalloides Deuteromycetes grzyby niedoskonałe Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Cecha charakterystyczna brak rozmnażania płciowego. Candida albicans
Grzyby pleśniowe Aspergillus nidulans
Grzyby - rozmnażanie
Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów (antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe (antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie, hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym. - wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych; - połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie - zastosowanie medyczne około 150 Potencjalne dalsze możliwości: - z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000 - z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000 - bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne
Biofarmaceutyki białkowe Systemy ekspresyjne: Komórki ludzkie gen zmodyfikowany w obszarze promotora CHO Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika chińskiego) BHK baby hamster kidney (komórki nerki chomika) Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica Drożdże S. cerevisiae, Pichia pastoris Bakterie E. coli, Bacillus spp. Transgeniczne rośliny i zwierzęta
The purpose of micro-organism is......to make another micro-organism Cel procesu biotechnologicznego: 1) jak najwięcej komórek drobnoustrojów w jak najkrótszym czasie... lub 2) jak najwięcej pożądanego produktu Przypadek 2) sprzeczny z życiowym celem drobnoustroju
Metabolizm = anabolizm + katabolizm Procesy anaboliczne endoergiczne i redukcyjne Procesy kataboliczne egzoergiczne i utleniające
Bilans masowy utleniania glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych
Metabolizm kluczowe cząsteczki A + B + ATP AB + ADP + P i A + B + ATP AB + AMP + PP i A + ATP A-P + ADP
Etapy katabolizmu
Główne szlaki kataboliczne jako źródła prekursorów dla biosyntezy składników biomakromolekuł Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Katabolizm
W warunkach beztlenowych w mięśniu pirogronian jest przekształcany w mleczan Obecność dodatkowej reakcji umożliwia regenerację NAD + Cykl Corich Mleczan powstający w pracującym mięśniu ulega w wątrobie przekształceniu w glukozę
Przekształcenie pirogronianu w etanol w komórkach drożdży w warunkach fermentacji alkoholowej
Produkty metabolizmu beztlenowego w różnych drobnoustrojach Reakcje prowadzące do odtworzenia NADH są zaznaczone jako R
Regulacja metabolizmu drobnoustrojów Zasady podstawowe 1. Równowaga pomiędzy procesami wytwarzającymi i zużywającymi metabolity pośrednie 2. Energetyczne sprzężenie metabolizmu bilansowanie zysku reakcji katabolicznych z sumą potrzeb energetycznych komórki
Etapy ekspresji genu
Regulacja ekspresji genu przez białka regulatorowe
Główne mechanizmy regulacji transkrypcji genów kodujących enzymy metabolizmu podstawowego Katabolizm: indukcja substratowa Substrat lub jego metabolit działa jako induktor lub efektor pozytywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu danego substratu -represja kataboliczna Łatwiej przyswajalne źródło węgla lub efektor syntezowany w komórce w jego obecności działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu trudniej przyswajalnego źródła węgla -represja azotowa j.w., ale dotyczy szlaku przyswajania źródła azotu. Dotyczy także białek transportowych Anabolizm: - represja końcowym produktem szlaku końcowy produkt szlaku działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Dotyczy szlaku biosyntezy -atenuacja mechanizm specyficzny dla drobnoustrojów prokariotycznych
Diauksja dwufazowość wzrostu drobnoustrojów w obecności dwóch źródeł węgla Produkcja penicyliny przez Penicillum chrysogenum
Inne mechanizmy regulacji metabolizmu podstawowego Regulacja aktywności enzymów 1. Enzymy regulatorowe regulacja allosteryczna 2. Kowalencyjna modyfikacja enzymów 3. Kompleksy wieloenzymowe Regulacja transportu metabolitów 1. Transport białek przez błony 2. Regulacja ilości i aktywności białek transportowych (permeaz)
Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów alkaloidy fenazyny pirydyny aminocukry flawonoidy pirole aminoglikozydy fosfoglikolipidy pirony aminokwasy ftalaldehydy poliacetyleny antocyjaniny glikozydy polieny ansamycyny hydroksyloaminy polietery antrachinony laktony polikwasy antracykliny makrolidy polipeptydy chinoliny naftochinony polisacharydy chinolinony nitryle salicylany chinony nukleozydy steroidy depsipeptydy peptydy tetracykliny
Przemiany peryferyjne a przemiany centralne
Idiolity są syntezowane w idiofazie
Koncepcje wyjaśniające przyczyny biosyntezy idiolitów 1. Uzyskanie przewagi w danym środowisku 2. Przystosowanie się do zmieniających się warunków środowiska dzięki dodatkowym szlakom metabolicznym 3. Utrzymanie stanu równowagi ze otoczeniem, gdy normalny wzrost nie jest możliwy 4. Wynik rozregulowania metabolizmu. Nadprodukcja idiolitów rodzajem wentyla dla niezbilansowanych przemian 5. Obszar wolnej gry ewolucyjnej poza zakresem ścisłych reguł selekcji eliminujących zmiany niekorzystne dla organizmu. Niektóre z idiolitów znajdują w końcu zastosowanie w metabolizmie producenta
Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych 1. Szlak poliketydowy 2. Polimeryzacja jednostek izoprenoidowych 3. Nierybosomalna synteza peptydów 4. Mieszana biosynteza poliketydów i peptydów 5. Biosynteza aminoglikozydów oraz amino- i peptydylonukleozydów Fazy biosyntezy metabolitów wtórnych 1. Biosynteza i aktywacja prekursorów 2. Oligomeryzacja 3. Modyfikacja 4. Kondensacja składników 5. Modyfikacje końcowe 6. Ukierunkowany eksport
Szlak poliketydowy biogeneza niektórych antybiotyków
Regulacja biosyntezy idiolitów MECHANIZMY KONTROLI BIOSYNTEZY IDIOLITÓW - indukcja substratowa; - indukcja powodowana przez regulatory metaboliczne; - represja i hamowanie kataboliczne; - regulacja związkami azotu; - regulacja fosforanowa i energetyczna; - hamowanie w sprzężeniu zwrotnym zarówno przez metabolity podstawowe jak i specyficzne; - regulacja z udziałem pierwiastków śladowych; - regulacja tlenowa; - regulacja innymi czynnikami, takimi jak temperatura lub ph
Regulacja biosyntezy idiolitów 1. Biosynteza cefalosporyny C w C. acremonium obecność w podłożu DL-cysteiny lub DL-norleucyny 2. Biosynteza alkaloidów sporyszu przez grzyby Clavicepsis DL-tryptofan Indukcja substratowa Warunek induktor dodawany w fazie wzrostu, a nie w fazie produkcji
Regulacja biosyntezy idiolitów Regulacja fosforanowa Zasada ogólna niskie stężenie fosforanu stymuluje biosyntezę idiolitów
Inżynieria metaboliczna szczepów przemysłowych Producenci metabolitów pierwotnych: - wprowadzenie zmian umożliwiających nadprodukcję - maksymalizacja nadprodukcji - zmiany umożliwiające pozakomórkowe wydzielanie produktu Producenci metabolitów wtórnych: - maksymalizacja wydajności produktu -możliwość wytwarzania produktów innych niż naturalny
Cechy szczepu wysokowydajnego maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe
Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów optymalizacja warunków wzrostu
Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE) Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego MUTANTY REGULATOROWE -mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym powodująca stałą derepresję biosyntezy; -mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość na działanie inhibitora allosterycznego
Cel uzyskanie nadprodukcji związku G Możliwość osiągnięcia celu: Mutant auksotroficzny wobec związku F
Biosynteza kwasu cytrynowego Cykl Krebsa
Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger Aktywność fosfofruktokinazy I, kluczowego enzymu regulatorowego glikolizy jest hamowana przez ATP i cytrynian Efekt Pasteura U drobnoustrojów względnie anaerobowych, wydajność biomasy jest dużo większa w obecności tlenu, który hamuje fermentację alkoholową. Mechanizm: hamowanie glikolizy przez ATP i cytrynian Efekt Crabtree W hodowlach tlenowych następuje częściowe hamowanie oddychania przy bardzo dużych stężeniach glukozy
Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger Droga alternatywna funkcjonuje w warunkach niskiego stężenia fosforanów I silnego napowietrzania
Jakie warunki należy spełnić, aby możliwa była wysoko wydajna produkcja kwasu cytrynowego? 1. Wysoko wydajny szczep Aspergillus niger - obecność alternatywnego łańcucha oddechowego - mutant regulatorowy PFK-I niewrażliwa na hamowanie przez cytrynian 2. Odpowiednie warunki hodowli -skład pożywki: wysokie stężenie cukru; niskie stężenie jonów Fe(II) i Mn(II; niskie ph, około 2); niskie stężenie fosforanów - bardzo intensywne napowietrzanie
Hybrydyzacja fuzja protoplastów Przykłady zastosowania: Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów; Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów kodujących wytwarzanie penicyliny G); Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych. Rekombinant posiadał kombinację cech korzystnych; wydajność o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.