STRESZCZENIE Niniejsza praca badawcza wskazuje na fitosanitarny charakter gryki zwyczajnej Fagopyrum sagittatum. Dowodzi istnienia w jej tkankach związków allelopatycznych, (m. in. metodycznie wyizolowanej rutyny) oraz ich inhibicyjnego wpływu na wzrost i rozwój perzu właściwego Agropyron repens. Materiał badawczy składał się z 10 prób, w tym 4 doświadczalnych, 4 kontrolnych oraz 2 zapasowych, którymi uzupełniano nasiona wypadające. Po upływie 14 dni od daty rozpoczęcia obserwacji analizie poddano długości pędów gatunku testowego Agropyron repens. Na podstawie obliczeń i pewnych założeń stwierdzono, iż perz rosnący w podłożu po siewkach Fagopyrum sagittatum wykazuje ujemne reakcje przyrostowe, tzn. przyrasta w stopniu ograniczonym bądź wcale. Wyniki badań nie dowodzą związku pomiędzy tempem przyrostu akceptora a jego zagęszczeniem w szalce oraz zagęszczeniem rośliny donora. Biorąc jednak pod uwagę czas trwania obserwacji oraz fakt, że proces wydzielania allelozwiązków przebiega intensywniej u roślin młodych można przypuszczać, iż ujemne reakcje przyrostowe Agropyron repens miały związek z wiekiem donora. (Doświadczenie przeprowadzono na dwutygodniowych siewkach.) Z zielonej masy Fagopyrum sagittatum wyizolowano metodycznie jeden z allelozwiązków- rutynę, która wpłynęła hamująco na wzrost Agropyron repens. WSTĘP Zjawisko allelopatii może być podyktowane przez szereg czynników, takich jak: promieniowanie słoneczne, różnice temperaturowe i wilgotnościowe, dostęp do składników odżywczych, działalność edafonu i entomofauny oraz stosowanie środków ochrony roślin.[1] Często mylone jest jednak ze zjawiskiem konkurencji. Allelopatia nie ogranicza dostępu do zasobów, a jedynie oddziałuje na roślinę poprzez uwalniane substancje chemiczne. W celu rozpoznania i odróżnienia jej od konkurencji można wykorzystać model density-dependent phytotoxity. Zakłada się w nim, że intensywność oddziaływania uwalnianych do podłoża allelozwiązków jest zależna od zagęszczenia roślin akceptorów. Im mniejsze ich zagęszczenie tym większą ilość allelopatyn pobiorą. Przy większym zagęszczeniu dawka docierających fitotoksyn jest relatywnie mniejsza. Przypuszcza się więc, że skoro w przypadku małego zagęszczenia roślin konkurencja między nimi jest niemożliwa, to zmniejszenie bądź zahamowanie ich wzrostu może dowodzić wpływów allelopatycznych.[2] Efektywne wykorzystanie zjawiska allelopatii w rolnictwie pozwoliłoby na ograniczenie stosowania chemicznych zabiegów odchwaszczających. Właściwie dobrany, konkurencyjny wobec chwastów gatunek mógłby skutecznie wyprzeć używane współcześnie herbicydy syntetyczne. Obecnie za bogate źródło allelopatyn uważa się resztki roślinne, pozostawione na polu w celu zwiększenia ilości węgla organicznego lub poprawy warunków wilgotnościowych gleby. Doświadczalnie udowodniono m.in., że pozostałości donora Secale cereale poprzez zacienianie redukują kiełkowanie i wzrost niepożądanych gatunków, obniżają temperaturę gleby oraz łagodzą dzienne wahania temperatury powietrza. [1] Celem niniejszej pracy badawczej jest wykazanie właściwości allelopatycznych gryki zwyczajnej Fagopyrum sagittatum na podstawie interakcji zachodzących między nią a perzem właściwym Agropyron repens. Doświadczalnie sprawdza się czy jej obecność wpływa na wzrost gatunku testowego. Czynnikiem potwierdzającym otrzymane wyniki, tj. herbicydowość gryki jest metodyczna izolacja z jej masy zielonej rutyny - glikozydu, wywołującego u wielu roślin silną aktywność allelopatyczną. Wg dostępnych badań, m.in.
K. Dzidzica i wsp. na temat zawartości wybranych związków przeciwutleniających rutyna w gryce uchodzi za substancję dominującą zarówno pod względem ilości, jak i aktywności biologicznej.[3] MATERIAŁ I METODY Badanie oddziaływania gryki zwyczajnej Fagopyrum Sagittatum na wzrost perzu właściwego Agropyron repens Badania przeprowadzono w warunkach domowych. Czas trwania obserwacji wyniósł 14 dni (nie obejmował 7- dniowego doświadczenia na zdolność do wykiełkowania nasion Fagopyrum sagittatum). Materiał doświadczalny składał się z 1 kilograma nasion gryki zwyczajnej Fagopyrum sagittatum oraz 120 sztuk kłączy perzu właściwego Agropyron repens. Kłącza zostały odpowiednio spreparowane i ujednolicone pod względem długości tak, że długość początkowa każdej sztuki była równa 1 centymetr. Nasiona Fagopyrum sagittatum zakupiono bez świadectwa kwalifikacji. Były wyczyszczone, nie zaprawione do siewu, o niesprawdzonej zdolności do wykiełkowania. Ich wilgotność wynosiła 14%. Zdolność kiełkowania, czyli procent nasion kiełkujących w czasie określono metodą doświadczalną. Po uśrednieniu otrzymanych wartości wynik końcowy oszacowano na 89%. Badania prowadzono w warunkach oświetlenia naturalnego. Temperatura powietrza w pomieszczeniu mieściła się w granicach 23-25 0 C. Nasiona Fagopyrum sagittatum umieszczano w szalkach Petriego na trzech warstwach ligniny, regularnie zwilżanych wodą destylowaną. Po skiełkowaniu rośliny rozwijały się przez okres jednego tygodnia. (Nasiona wypadające uzupełniano zapasowymi z 2 prób rezerwowych, w których gatunek Fagopyrum sagittatum rozwijał się w identycznych warunkach oraz tym samym okresie.) W tym czasie uwalniały do podłoża odpowiednie dla siebie związki chemiczne. Po upływie 7 dni młode siewki gryki zwyczajnej usuwano, natomiast w ich miejsce na ligninie umieszczano kłącza perzu właściwego. Obserwacja jego reakcji na substancje zawarte w podłożu trwała kolejne 7 dni. W celu sprawdzenia, czy reakcje przyrostowe gatunku testowego uzależnione będą także od jego zagęszczenia w szalce oraz od stężenia roślin donorów materiał doświadczalny podzielono w sumie na 4 próby: 1. 30 nasion Fagopyrum sagittatum po 20 sztuk kłączy Agropyron repens 2. 15 nasion Fagopyrum sagittatum po 20 sztuk kłączy Agropyron repens 3. 30 nasion Fagopyrum sagittatum po 10 sztuk kłączy Agropyron repens 4. 15 nasion Fagopyrum sagittatum po 10 sztuk kłączy Agropyron repens Każdej próbie doświadczalnej odpowiadała próba kontrolna, która składała się z określonej liczby kłączy Agropyron repens (10 lub 20 sztuk). Dzięki niej porównano wzrost gatunku testowego Agropyron repens w obecności substancji uwolnionych przez Fagopyrum sagittatum i w środowisku wolnym. Przyrosty długości pędów mierzono za pomocą suwmiarki. Otrzymane wartości uśredniono (obliczono odchylenie standardowe). W próbach kontrolnych zdarzały się kłącza wypadające. (Kłącza wykazują wolniejsze tempo adaptacji do warunków podłoża aniżeli nasiona).nie uzupełniano ich jak w przypadku wypadających nasion Fagopyrum sagittatum. Doświadczenie wykonano w dwóch powtórzeniach. 2
Metodyczne oznaczanie zawartości rutyny w gryce zwyczajnej Fagopyrum sagittatum Przed oznaczeniem zawartości rutyny w Fagopyrum sagittatum zważono dwutygodniowe siewki z czterech prób doświadczalnych i zanotowano ich masę. Próby zalano 20 ml chloroformu, a następnie umieszczono w aparacie Soxleta na 2 godziny w celu usunięcia chlorofilu, olejków eterycznych, żywic i innych związków. Chloroform odlano, natomiast próby suszono w temperaturze 75 0 C przez 0,5 godziny, później także w eksykatorze. W celu wyekstrahowania rutyny próbki siewek Fagopyrum sagittatum wraz z ligniną, na której kiełkowały umieszczono w kolbach i zalano 80ml 96% metanolu. Uzyskany ekstrakt przelano do 100- mililitrowych kolbek i dopełniono do kreski (zrobiono wyciąg metanolowy). Dla obliczenia zawartości rutyny w próbie na podstawie odczytu ze spektrofotometru wykonano krzywą wzorcową. W tym celu naważkę rutyny 0,05g rozpuszczono w metanolu. Z takiego rozwoju rutyny pobierano do 4 probówek odpowiednio 0,25; 0,5; 1,0 i 1,5 ml roztworu. Do każdej probówki dodano 2 ml 22,5% HCl, intensywnie wstrząsano kolbę, po czym szybko ją oziębiono przez 1 min polewając kolbę bieżącą wodą. Zaraz po ochłodzeniu dodano 0,5 ml 0,5% azotynu srebra ( w celu zwiększenia czułości reakcji) i mierzono ekstynkcję światła na spektrofotometrze. Na podstawie odczytów ekstynkcji światła program komputerowy sprzężony ze spektrofotometrem wyznaczył krzywą wzorcową, z której obliczył zawartość rutyny w badanych próbach (siewki gryki + ekstrakt z ligniny).[4] WYNIKI 1. W próbach doświadczalnych nr I, II, III i IV stwierdzono minimalny przyrost pędów gatunku Agropyron repens, mieszczący się w granicy 0,1 0,6 centymetrów. W obserwowanych przez taki sam okres czasu próbach kontrolnych odnotowano przyrosty pędów na długość ±3 centymetrów. Tab. 1. Porównanie długości pędów gatunku Agropyron repens przy długości początkowej jego kłączy równej 1cm Uśrednione wartości przyrostów pędów gatunku Agropyron repens l[cm] Nr próby I II III IV Próba doświadczalna 0,23 0,26 0,15 0,11 Próba kontrolna 2,91 2,89 3,15 3,01 2. Badania nad zjawiskiem allelopatii były równolegle prowadzone w dwóch wariantach. Poza pierwszym omówionym w pracy wykonano badanie wazonowe w warunkach zbliżonych do naturalnych (środowiska życia gryki zwyczajnej i perzu właściwego). Wariant ten posłużył wyłącznie jako wstępna obserwacja, gdyż z uwagi na rodzaj podłoża nie można było wykluczyć interakcji glebowych i mikrobiologicznych. Obserwacje przebiegały podobnie jak w przypadku pierwszego zestawu doświadczalnego, z tą różnicą, że nasiona Fagopyrum 3
sagittatum, a następnie kłącza Agropyron repens umieszczano w plastikowej kuwecie wypełnionej ziemią kwiatową uniwersalną. (Powierzchnia kuwety: 0,24m 2, pojemność 30l.) Co więcej siewki Fagopyrum sagittatum nie były usuwane z kuwety, a kłącza perzu były sadzone rzędowo w ich obecności. Doświadczenie wykonano w dwóch powtórzeniach. Czas trwania obserwacji wynosił 2 tygodnie. Po ich upływie zauważono, że w kuwecie doświadczalnej wykiełkowała i urosła na wysokość ±16cm tylko gryka zwyczajna. U perzu właściwego nie zanotowano przyrostu długości pędów. W kuwecie kontrolnej perz właściwy, bez udziału gryki zwyczajnej wzrósł na wysokość ±20cm. Ryc. 1. Przyrost długości pędu Agropyron repens/ badanie wazonowe próba kontrolna Ryc. 2. Wzrost i rozwój Fagopyrum sagittatum, brak reakcji przyrostowej Agropyron repens/ badanie wazonowe- próba doświadczalna 3. Z dwutygodniowych siewek Fagopyrum sagittatum wyizolowano substancję o charakterze allelozwiązku rutynę. Tab. 2. Zawartość rutyny w siewkach Fagopyrum sagittatum i ligninie, na której wykiełkowały Próba Zawartość rutyny (wariant doświadczenia) Kontrolna (lignina bez Fagopyrum sagittatum) w mg/kg s.m.* 15 siewek Fagopyrum sagittatum 251 0 30 siewek Fagopyrum sagittatum 460 * s.m.- sucha masa 4. Próbki z siewkami gryki (i ligniną) zawierały duże ilości rutyny, która wpłynęła hamująco na rozwój Agropyron repens. Przy 15 siewkach Fagopyrum sagittatum kłącza Agropyron repens wykształcały początkowo bardzo nieliczne korzonki 4
włośnikowe, które jednak zamierały. Przy próbach z 30 siewkami Fagopyrum sagittatum, a jednocześnie większej koncentracji rutyny, nie stwierdzono pojawiania się korzonków włośnikowych Agropyron repens. Ryc. 3. Związki chemiczne uwalniane przez siewki Fagopyrum sagittatum do podłoża (wśród nich wyizolowana rutyna) DYSKUSJA Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na istnienie w tkankach gryki zwyczajnej Fagopyrum sagittatum związków allelopatycznych. Przypuszczalnie ich obecność spowodowała inhibicję kłączy gatunku testowego Agropyron repens. Potwierdzeniem dla słuszności mojej hipotezy jest metodyczne wyizolowanie z Fagopyrum sagittatum rutyny. Z łodyg badanego przeze mnie gatunku już wcześniej wyizolowano także alkaloidy i kwasy fenolowe. W przypadku obu allelozwiązków udowodniono 50% inhibicję siewek Lactuca sativa oraz zahamowanie wzrostu łodyg i korzeni u m.in. Lolium multiflorum i Amaranthus palmeri. Ograniczający wpływ pozostałości resztek roślinnych krewnej gryki zwyczajnej - Fagopyrum esculentum na kiełkowanie innych gatunków opisywał także Kumar.[1] Wiek donora miał minimalne znaczenie ze względu na czas, w jakim prowadzono obserwacje. Być może wartości przyrostów pędów w próbach kontrolnych były bliskie zeru, gdyż uważa się, że proces wydzielania allelopatyn przebiega najintensywniej u roślin młodych.[5] Badane siewki miały zaledwie 2 tygodnie. Po upływie 4 lub 6 tygodni wartości przyrostów mogłyby być większe, choć badania H. Lipińskiej wskazywały na to, że allelopatyny 4- tygodniowych siewek Poa pratensis miały mniejszy hamujący wpływ na kiełkowanie nasion Phleum pratense aniżeli dwutygodniowych. Podobne spostrzeżenie odnotowano w przypadku nasion Phleum Pratense oraz dwu i cztero- tygodniowych siewek Lolium perenne. [2] O tym, że faza rozwojowa roślin wpływa na ich potencjał allelopatyczny pisali również Stochmal i wsp. Ich badania wykazały, że kwasy hydroksamowe występują w bardzo młodych, zaledwie sześciu- siedmiodniowych siewkach żyta odmiany Dańkowskie Złote. Po upływie dwunastu dni w tych samych siewkach znajdują się już tylko ich śladowe ilości. [5] Wśród czynników warunkujących intensywność wydzielania związków allelopatycznych oprócz w/w istnieje szereg innych. Na potencjał allelopatyczny roślin donorów może wpływać stres termiczny, wodny i środowiskowy, niedobór składników mineralnych w podłożu itd. Istnieje wiele badań potwierdzających herbicydowość allelozwiązków, tj. możliwość wykorzystania ich jako naturalnej metody odchwaszczającej. Obecnie poszukuje się 5
gatunków zbóż o jak najmniejszej podatności na działanie fitotoksyn, tak, by można było zastosować je do wyhodowania odmian całkowicie uodpornionych na obecność chwastów. Prawdopodobnie alternatywą dla herbicydów w walce z niepożądanymi gatunkami roślin rolniczych będą odmiany owsa, kukurydzy, sorga, kostrzewy i jęczmienia. W Meksyku dynia odchwaszcza np. pola fasoli i kukurydzy. W Polsce od dawna do tego celu wykorzystuje się grykę lub gorczycę. Równie efektywne, a przy tym o wiele bardziej konkurencyjne w stosunku do chwastów są zasiewy mieszane (jedno- lub wielogatunkowe). W porównaniu do upraw monogatunkowych charakteryzują się jeszcze lepszą zdolnością przystosowawczą, a także efektywniejszym wykorzystaniem przestrzeni i zasobów środowiska. [5] Zjawisko allelopatii jest powszechne w praktyce rolniczej od stosunkowo dawna. Człowiek stosuje zmianowanie, uprawę z wsiewką, nawozi roślinę ekstraktem z innej. Choć wszystkie te czynności postrzega się za proste i oczywiste, mało kto, wie, że podstawą obserwowanych między roślinami interakcji jest działanie allelozwiązków. Współczesna biotechnologia pracuje nad wykorzystaniem allelopatin do walki biologicznej z chwastami. Zwiększa efektywność i skuteczność tego zjawiska dzięki dość obszernej wiedzy na temat mechanizmu jego działania. Badanie potencjału allelopatycznego u wybranych gatunków umożliwi izolację odpowiednich związków, a następnie konstrukcję na ich bazie naturalnych herbicydów. Spośród poznanych dotychczas allelopatyn jako środek chwastobójczy mogą być zastosowane np. laktony seskwiterpenów obecne w tkankach słonecznika. Przypuszczalnie badany gatunek gryka zwyczajna, dzięki wysokiemu potencjałowi allelopatycznemu może także być wykorzystana do syntezy herbicydów lub konstruowania transgenicznych roślin uprawnych zdolnych do produkcji allelozwiązków. [6] PIŚMIENNICTWO 1. Kaczmarek S. (2009) Wykorzystanie potencjału allelopatycznego roślin w wybranych uprawach rolniczych Postępy w Ochronie Roślin 49(3), 1503:1505 2. Lipińska H. (2006) Allelopatyczne działanie wybranych gatunków traw na kiełkowanie nasion Phleum pratense w zależności od ich zagęszczenia - ACTA AGROBOTANICA, 18,22 3. Dziedzic K., Drożdżyńska A., Górecka D., Czaczyk K. (2009) Zawartość wybranych związków przeciwutleniających w gryce i produktach powstałych podczas jej przerobu Żywność. Technologia. Jakość 6(67), 82 4. Żurakowski M., W. Prądzyński, A. Wójcik (1990) Metodyka zmodyfikowana na podstawie metodyki Borkowskiej i Czyszewskiej zamieszczonej w: Materiały do ćwiczeń z technologii leśnych produktów ubocznych, AR, Poznań 5. Parylak D., Zawieja J., Jędruszczak M., Stupnicka-Rodzynkiewicz E., Dąbkowska T., Snarska K. (2006) Wykorzystanie zasiewów mieszanych, właściwości odmian lub zjawiska allelopatii w ograniczaniu zachwaszczenia- Postępy w Ochronie Roślin 46(1),39,42, 34 6. Gniazdowska A. (2007) Biotechnologia szansą dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów- Prace przeglądowe, 46 6