Biotechnologiczne opatrunki i żywe substytuty skóry - przegląd i współczesne możliwości zastosowania

Transkrypt

1 Biotechnologiczne opatrunki i żywe substytuty skóry - przegląd i współczesne możliwości zastosowania Biotechnological dressings and living skin substitutes - review and current abilities to apply Kazimierz Cieślik, Wojciech Witkowski, Justyna Dr u kał a, Agnieszka Wal i górska, Jacek Puchała K. Cieślik (^), A. Waligórska, Oddział Leczenia Oparzeń i Chirurgii Plastycznej Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. L. Rydygiera, Osiedle Złotej Jesieni 1, Kraków, Tel.: 012 / , Fax: 012 / , kazimierz.cieslik@wp.pl J. Drukała, Kliniczny Oddział Chirurgii Plastycznej, Rekonstrukcyjnej i Leczenia Oparzeń, Centralny Szpital Kliniczny MON w Warszawie Wojskowego Instytutu Medycznego, ul. Szaserów 128, Warszawa W. Witkowski, Zakład Biologii Komórki, Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Gronostajowa 7, Kraków J. Puchała, Oddział Chirurgii Plastycznej, Rekonstrukcyjnej i Oparzeń oraz Chirurgii Ogólnej Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Wielicka 265, Kraków Wpłynęło: ; Zaakceptowano: Streszczenie Postęp w dziedzinie biotechnologii pozwala na łączenie żywych komórek tkanki łącznej i naskórka z rusztowaniem złożonym z kolagenu lub materiału syntetycznego. Różnorodne sposoby dotychczasowych rozwiązań konstrukcyjnych świadczą o potrzebie dalszych poszukiwań. Kryteriami oceny są: długi czas oraz łatwość przechowywania komórki, uniknięcie ryzyka przenoszenia zakażeń, proste przygotowanie i nanoszenie na ranę, wysoki wskaźnik przyjęcia na rany przewlekle gojące się, zredukowanie liczby etapów potrzebnych do całkowitego zagojenia rany oraz niski koszt. Niniejsza praca stanowi przegląd współcześnie dostępnych opatrunków, które pozytywnie przeszły próby laboratoryjne, posiadają atesty dopuszczające do stosowania w klinice oraz są produkowane na skalę przemysłową. Oznacza to, że w miarę wzrostu zapotrzebowania klinicznego, możliwe będzie zwiększenie produkcji, a tym samym obniżenie kosztów wytwarzania. Ponadto, omówiono współczesne doniesienia o kierunkach rozwoju badań nad stworzeniem idealnego biotechnologicznego opatrunku oraz żywego substytutu skóry. Słowa kluczowe leczenie ran opatrunek biotechnologiczny żywy substytut skóry Abstract Progress in the field of biotechnology allows combining living cells of connective tissue and epidermis with structure consisted of collagen and a syntetic materiał. Many kinds of biotechnological dressings that were invented so far imply the need of further study. Good dressing should have such para-meters: long term durability, easy to storę, safe (do not transmit infectious diseaeses), easy to prepare and easy to apply to the wounds. This dressing should be accepted to chronić wounds, reduce stages to complete healing of the wounds and be cheap. This paper is a review of dressings that are accepted and accesible currently in clinic. When the demand for these dressings in clinic will be growing the production of the dressings will rise and costs will decrease. We also present new directions in development of studies for perfect biotechnological dressings and living skin substitutes. Key words biotechnological dressing living skin substitute wound healing Wstęp U dorosłego człowieka skóra obejmuje około 1/10 ogólnej masy ciała. Spełnia ona funkcję bariery chroniącej przed utratą płynów, ważnych dla utrzymania homeostazy ustrojowej. Jest też barierą dla urazów mechanicznych lub termicznych, jak również zaporą dla szkodliwych czynników zewnętrznych, np. patogenów biologicznych i chemicznych. Ubytki skóry powodowane mogą być oparzeniem, owrzodzeniem pożylakowym, stopą cukrzycową lub ostrymi urazami. Często stwarza to sytuacje zagrażające życiu. Inżynieria tkankowa stanowi alternatywę dla autogennych przeszczepów tkankowych z innych obszarów nieuszkodzonej skóry,

2 jak również dla allogennych przeszczepów skóry,które są obarczone licznymi ograniczeniami, a zwłaszcza ryzykiem przeniesienia zakażenia. Dotyczy to szczególnie ran oparzeniowych. W miarę poznawania patofizjologii choroby oparzeniowej, postępu w anestezjologii i intensywnej terapii oraz doskonalenia metod zwalczania zakażeń, coraz więcej chorych wymaga stosowania przeszczepów skóry. Najczęściej dotyczy to pacjentów z ranami pełnej grubości skóry, sięgającymi ponad 70% całkowitej powierzchni ciała (CPC). Takie olbrzymie rany są trudne do pokrywania klasycznymi metodami, ponieważ miejsca, z których pobrano przeszczepy są w trakcie gojenia. Stosowane powszechnie przeszczepy allo- i heterogenne mogą być jedynie opatrunkami biologicznymi, które odraczają wprowadzenie innych metod gojenia dużych ran [7,8]. Ostatnio coraz więcej wysiłku poświęca się rozwojowi technik produkcji i zastosowania tzw. żywych substytutów skóry" (żss). Ideą, jaka przyświeca tym poszukiwaniom, jest odwrócenie obecnej sytuacji tak, aby nie chory czekał na skórę, ale hodowana skóra na chorego [7,32]. Niniejsza praca podejmuje próbę przedstawienia sposobu rozwoju doświadczeń własnych, aktualnego stanu wiedzy i technicznych możliwości wytworzenia oraz klinicznego zastosowania komórek nabłonkowych, hodowanych w dużych ilościach in vitro, dla umożliwienia rekonstrukcji trójwymiarowej skóry, w celu zagojenia tzw. trudnych" ran [2 4,6,43,44,48,49,56,66,67]. Wprowadzenie Historia leczenia oparzeń i zamykania ran z wykorzystaniem skóry jako opatrunku sięga początków XIX wieku. Pierwsze próby miały charakter eksperymentów i kończyły się niepowodzeniami. Dały jednak początek dalszym poszukiwaniom lepszych, skuteczniejszych metod zamykania ran oparzeniowych, pourazowych i troficznych. W XX wieku zaczęto wykonywać przeszczepy allogenne, tj. pochodzące od innych osobników tego samego gatunku. Obserwowano początkowe przyjmowanie się przeszczepu, a później jego stopniowe odrzucanie przez organizm biorcy. W latach 50-tych prowadzono szerokie badania na temat alloprzeszczepów tkankowych. Allografty zostały wówczas wprowadzone jako rutynowe postępowanie w leczeniu oparzeń w celu zapewnienia czasowego opatrunku. Stosowano je także jako zabezpieczenie mechaniczne dla rozległych siatkowanych autoprzeszczepów [17]. W tzw. chińskiej metodzie leczenia oparzeń stosuje się z powodzeniem rozległe alloprzeszczepy, w których wycina się otwory na zasadzie szachownicy. Następnie umieszcza się w nich drobne fragmenty skóry własnej chorego. Obserwowano przyjmowanie się obu rodzajów przeszczepów, brak wczesnej reakcji odrzucania alloprzeszczepów oraz stopniowe zastępowanie alloprzeszczepów rozrastającymi się autoprzeszczepami. Poważnymi ograniczeniami w stosowaniu alloprzeszczepów jest nie tylko immunologiczna reakcja odrzucania, ale i możliwość przenoszenia chorób wirusowych od dawcy. W 1975 roku po raz pierwszy Green opisał seryjną subkulturę ludzkich keratynocytów. Kliniczne zastosowanie tego odkrycia stało się możliwe przez wykorzystanie hodowanych komórek w postaci arkuszy nabłonkowych. Gallico w 1981 roku zastosował i opisał jako pierwszy wyhodowane, autogenne nabłonki do leczenia rozległych oparzeń III stopnia. Udoskonalanie metod hodowli fibroblastów w macierzy kolagenowej wprowadzili Bell (1983) i Burkę (1987) [14]. W 1987 roku, podczas Konferencji Panelowej Narodowej Fundacji Naukowej Bioinżynierii w Waszyngtonie, ustalono definicję skóry stworzonej metodą inżynierii tkankowej jako: zastosowanie zasad i metod inżynierii i nauk biologicznych w celu odkrycia biologicznego substytutu dla odtworzenia, utrzymania lub polepszenia funkcji". Obecnie nie ma istotnej różnicy pomiędzy opatrunkiem na ranie a substytutem skóry. Ogólnie, materiały z polimerów syntetycznych, czy sztucznie połączone z komponentami biologicznymi, są określane jako opatrunki na ranę, a materiały, które zawierają macierz białkową połączoną z tworzywami sztucznymi oraz macierz białkową z komórkami są uważane za substytuty skóry [54]. Współczesne techniki hodowli tkankowej pozwalają namnożyć komórki nabłonkowe z małych płatków skóry do arkuszyktóre umożliwiają zamykanie dużych ran. Dotyczy to zwłaszcza chorych z oparzeniami pełnej grubości skóry, o rozmiarach przekraczających 70% całkowitej powierzchni ciała. Szansą na utrzymanie pacjenta przy życiu i przyspieszenia leczenia jest stosowanie hodowanych, autologicznych komórek nabłonkowych [16]. Seryjne hodowle pozwalają na powiększenie populacji komórkowej tak, że w przeciągu miesiąca z płatka skóry o powierzchni około 2 cm 2 można wyhodować naskórek o powierzchni dorosłego człowieka [27]. Chociaż najważniejszą zaletą jest uzyskanie materiału o dużej powierzchni z małego wycinka zdrowej skóry pobranej od pacjenta, to wadą jest zbyt długi czas oczekiwania. Jest to szczególnie ważne przy leczeniu rozległych i głębokich oparzeń. Nawet przy stosowaniu opatrunku biologicznego w postaci allogennych przeszczepów skóry, oczekiwanie prowadzi często do wyniszczenia chorego i zakażenia rany oparzeniowej, co zagraża życiu pacjenta. Straty obejmują koszty przedłużonego leczenia chorego oraz utraconych hodowanych żywych substytutów skóry (żss) [7,8]. Doświadczeń ia własne Odpowiedzią na zapotrzebowanie przyspieszenia gojenia ran oparzeniowych i trudno gojących się ran podudzi, było wykorzystanie rutynowo prowadzonych w Zakładzie Biologii Komórki Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego hodowli keratynocytów i fibroblastów skóry ludzkiej (Ryc. 1). Już od wielu lat, w tym zakładzie prowadzone są prace badawcze wykorzystujące takie hodowle do celów badań podstawowych (oddziaływań komórek nowotworowych z prawidłowymi w tzw. kokulturach, wpływu patogenów, np.

3 Ryc. 1. A - masowa hodowla keratynocytów w materiale własnym; B - powiększony obraz komórki nabłonkowej. Ryc. 2. Przykład zastosowania autogennych hodowanych keratynocytów u chorej cierpiącej przez 25 lat z powodu pozakrzepowego owrzodzenia podudzia. A - owrzodzenie wstępnie oczyszczone z martwych tkanek i patogennych bakterii; B - moment napylania na ranę hodowanych autogennych keratynocytów zawieszonych w kleju fibrynowym; C - pierwszy opatrunek. Widoczne są wysepki świeżo namnożonego naskórka; D - wygląd okolicy rany w odległym okresie od zagojenia. grzybów na cytoszkielet zakażonych komórek, wpływu anestetyków na cytoszkielet, itd.). Dzięki funduszom przekazanym przez Komitet Badań Naukowych możliwe było także zorganizowanie i wyposażenie w specjalistyczny sprzęt Pracowni Inżynierii Komórkowej i Tkankowej w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym im. L. Rydygiera w Krakowie, w której prowadzi się hodowle komórek skóry od pacjentów. Wydajność zakładanych hodowli z transplantów skóry wynosi ponad 90%. Zwiększenie liczby komórek powyżej 10 6 trwa około dwóch tygodni. Dla celów badań podstawowych nie jest potrzebne uzyskiwanie tak dużych ilości materiału i dlatego po około dwóch latach badań podjęto próbę klinicznego zastosowania autogennych keratynocytów do leczenia chorych z przewlekłymi owrzodzeniami skóry. U 28 pacjentów z przewlekłymi pourazowymi i pozakrzepowymi owrzodzeniami podudzi oraz u dwóch chorych po wycięciu rozległych ran oparzeniowych pełnej grubości skóry zastosowano autogenne, hodowane komórki nabłonkowe [10].

4 Ryc. 3. Przykład zastosowania autogennych hodowanych keratynocytów u dwuletniego dziecka po oparzeniu 90% całkowitej powierzchni ciała; A - nacięcie oparzonej, martwej skóry w celu uwolnienia od ucisku; B - zamknięcie ran po usunięciu martwicy allogennymi przeszczepami skóry pełniącymi rolę opatrunku biologicznego; C - zakładanie opatrunku tiulowego na ranę po usunięciu alloprzeszczepów skóry i napyleniu autogennych, hodowanych keratynocytów zawieszonych w kleju fibrynowym; D - wynik leczenia po 14 dniach od zastosowania hodowanych komórek nabłonkowych. Materiał kliniczny Dziecięcego Centrum Oparzeniowego Instytutu Pediatrii CMUJ w Krakowie. W czasie badań testowano zarówno hodowle uwarstwionych komórek nabłonkowych, jak i zawiesiny autogennych ludzkich keratynocytów w kleju fibrynowym. Testowano również metody przygotowania rany w przewlekłych owrzodzeniach podudzi, do funkcji podłoża, dla przeszczepów hodowanych komórek nabłonkowych (Ryc. 2). Opracowano jakościowo opatrunki sprzyjające namnażaniu keratynocytów w ranie, jak również zabezpieczające przed zakażeniem rany. Wypracowana metoda przygotowania rany, nakładania mieszaniny komórek i kleju fibrynowego oraz opatrunków leczniczych pozwoliła na wytworzenie odpowiednika inkubatora komórkowego" na ciele pacjenta. Nie zaobserwowano zakażenia rany w przebiegu pooperacyjnym [14]. Obok masowych hodowli komórek dla celów terapeutycznych, prowadzi się w Pracowni badania podstawowe ściśle związane z zagadnieniem gojenia ran. Badania podłoża fibrynowego, jako macierzy dla przeszczepianych komórek wykazały, że keratynocyty ludzkie szybko rozpłaszczają się na podłożu fibrynowym,proliferują i podejmują aktywną migrację. Porównanie aktywności ruchowej keratynocytów na podłożu kolagenowym i fibrynowym wykazało, że komórki znacznie szybciej migrują po kleju fibrynowym [15]. Optymalizacja warunków hodowli komórek i postęp w gojeniu ran z użyciem zawiesiny keratynocytów w kleju fibrynowym pozwala na rozszerzenie działalności klinicznej (Ryc. 3). Zaplanowano zorganizowanie na terenie Pracowni Banku Hodowanej Skóry. Wówczas będzie możliwe bankowanie hodowanych in vitro komórek, które w dalszej kolejności mogą służyć jako przeszczepy allogeniczne oraz do rekonstrukcji trójwymiarowych substytutów skóry. Założenia ogólne żywych substytutów skóry Produkt stworzony metodami inżynierii tkankowej, łączy polimery z żywymi komórkami, dla uzyskania funkcjonalnego ekwiwalentu tkanki, tzn. substytutu skóry Składa się on z macierzy, tj. rusztowania, które jest niezbędne dla procesu gojenia. Hodowane w żelu kolagenowym fibroblasty produkują to rusztowanie nazwane substytutem skóry właściwej (dertnis), które wykorzystywane jest następnie jako podstawa do rekonstrukcji żss [20]. Ekwiwalent dermis powstaje poprzez wysianie skórnych fibroblastów do przygotowanej, trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Uwarstwienie hodowanych keratynocytów na górnej powierzchni takiej struktury daje ekwiwalent naskórka. Powyższy schemat

5 się niskimi kosztami wytwarzania i przechowywania oraz być łatwą w obsłudze i dostępną [54]. Jak widać, wymagania dotyczą wielu sprzecznych właściwości, np. kontrolowanego parowania wody i utrzymania wilgotności, budowy ułatwiającej wnikanie komórek do konstruktu, w czasie gdy kontrolowane jest wnikanie bakterii, a także odpowiednia wytrzymałość mechaniczna i elastyczność przy maksymalnej redukcji grubości materiału. Należy pamiętać o możliwości przenoszenia wirusa HIV w czasie przeszczepiania. W Stanach Zjednoczonych obowiązuje zakaz przeszczepiania keratynocytów dawcy przed uzyskaniem wyników dwóch badań, tj. w dniu pobrania materiału i po 90 dniach. Wprowadzenie testu reakcji łańcuchowej polimerazy dla kwasu nukleinowego HIV zmienia ten schemat [54]. Przemysłowo wytwarzane tzw. żywe substytuty skóry oraz ich zastosowanie kliniczne - podział i omówienie preparatów Ryc letnie dziecko leczone hodowanymi keratynocytami po oparzeniu 75% CPC. Widoczne są zaburzające rozwój zniekształcające blizny. jest modelem uproszczonym, jednak stanowi dobry punkt wyjścia do rekonstrukcji skóry [18]. Skóra wytworzona metodą inżynierii tkankowej jest konstrukcją opartą na biologii komórki. Oddziaływanie zróżnicowanych sygnałów pomiędzy komórkami kontroluje ich zachowanie. Może to mieć dwie formy: pierwsza - komórki rosną w hodowli i są wysiewane do porowatego materiału, z którego tworzony jest substytut skóry; druga - wszczepiony materiał indukuje specyficzną reakcję komórkową, taką jak regenerację tkanki in vivo, co może wzmacniać regenerację nerwu lub indukować tworzenie się nowych naczyń krwionośnych [1,19,22 24,26,29,30,37,38,40,47,53,63]. Skóra stworzona metodą inżynierii tkankowej powinna posiadać kilka podstawowych cech charakterystycznych: zawierać odpowiednią objętość wody (w zależności od rany); być łatwą w posługiwaniu się nią jako opatrunkiem oraz przy stosowaniu podstawowych technik chirurgicznych (cięcia i szycia); stanowić barierę bakteryjną; spełniać kryteria ste-rylności; zapewniać odpowiednie mechaniczne właściwości; umożliwiać przyczepność do podłoża rany (bez uszkadzania leżącej poniżej struktury); ulegać kontrolowanej biodegradacji; nie być toksyczną; nie dawać objawów antygenowości i powodować minimalną odpowiedź zapalną (w tym brak reakcji na ciało obce); powodować minimalne przykurczanie i bliznowacenie; ułatwiać angiogenezę; nie wywoływać bólu; umożliwiać wrastanie przydatków skóry; cechować Hodowane autografty naskórkowe: Epicel (Gen-zyme Tissue Repair Corporation, Cambridge, MA, USA). Jest to jeden z najstarszych materiałów. Został wytworzony w 1975 roku, ale dostępny w handlu był od 1988 roku. Jego podstawą są hodowane in vitro naskórkowe keratynocyty z użyciem warstwy odżywczej, z naświetlanych UV fibroblastów pobranych od świnki morskiej. Naskórek otrzymywano poprzez biopsje skóry, którą rozdrabniano i trypsynizowano. Zawiesinę komórek wysiewano na śmiertelnie naświetlane 3T3 - mysie fibroblasty. W dniu następnym tworzące się kolonie umieszczano na płytkach. Kiedy hodowla uzyskała odpowiedni rozwój, keratynocyty uwalniano i umieszczano na nieprzyklejalnym podłożu opatrunku gazowego. Zaletami są trwałe i szybkie zamknięcie rany, stosowanie po namnożeniu na dużych powierzchniach rany z małego pierwotnego bioptatu, szybkie zniesienie bólu oraz lepsze wyniki funkcjonalne i kosmetyczne od wolnych przeszczepów skóry (WPS). Wśród wad wymienia się konieczność wykonania zabiegu chirurgicznego pobrania fragmentu skóry; utrzymanie w dobrym stanie ogólnym i miejscowym pacjenta przez trzy tygodnie, konieczne dla hodowli; wysoki koszt; przykurcze bliznowate; niestabilne przyczepianie się do podłoża; które nie ma warstwy dermis (Ryc. 4). Wskazaniami są: oparzenia, przewlekłe owrzodzenia podudzia, epidermolysis bullosa, rana skóry po wycięciu rozległego wrodzonego znamienia barwnikowego, bielactwo, wrodzone spodziectwo, odleżyny, przeszczep rogówki. Hodowane naskórkowe alloprzeszczepy Preparaty te pochodzą od niespokrewnionych allogennych dawców, np. z noworodkowych napletków, i wymagają dalszych badań. Wspomagają one tworzenie się tkanki ziarninowej i pobudzają naskórkowanie od brzegów i od struktur przydatków skóry w podłożu powierzchownej rany, prawdopodobnie poprzez uwolnienie czynników wzrostu. Natychmiastowa do-

6 stępność oraz brak potrzeby biopsji są głównymi zaletami tej metody. Preparaty mogą być przechowywane w zamrożeniu i bankowane. Wadą jest niedostępność handlowa, nietrwałość substytutu naskórka (organizm biorcy wymienia komórki allogenne na własne) i brak zabezpieczenia przed możliwością przenoszenia chorób zakaźnych. Preparaty mogą być zastosowane w oparzeniach, przewlekłych owrzodzeniach podudzi, miejscach pobrania przeszczepów, po dermabrazji twarzy oraz w epidermolysis bullosa. «Nieożywiona, allogenna bezkomórkowa macierz skórna: Alloderm Alloderm (LifeCell, Woodlands, TX, USA) w 1992 roku dopuszczony został przez Food and Drug Administration do stosowania w klinice. Jest to bezkomórkowa macierz stworzona bezpośrednio ze świeżej skóry pobranej ze zwłok, którą preparowano w solance o dużym stężeniu, w celu usunięcia naskórka oraz kąpano w roztworach do oddzielenia struktur komórkowych. Następnie suszono, pozostawiając nie działającą immunologicznie skórną macierz z nieuszkodzonym kompleksem błony podstawnej i glikozaminoglikanami. Charakterystycznymi zaletami są: natychmiastowa dostępność, brak komórek i brak reakcji immunologicznych, poprawienie przyjmowania hodowanych alloprzeszczepów oraz nieuszkodzona warstwa podstawna skóry. Materiał ten może być liofilizowany, przechowywany w zamrożeniu lub w stężonym glicerolu. Dostarcza on matrycę z naturalną skórną porowatością w celu lepszej regeneracji. Pozwala na stosowanie cieńszych autoprzeszczepów skóry. Ryzyko przeniesienia zakażenia, potrzeba stosowania przeszczepów skóry pośredniej grubości w późniejszym okresie, jak również konieczność wykonania dwóch procedur chirurgicznych, są głównymi wadami tego preparatu. Nieożywiona, pochodzenia zwierzęcego bezkomórkowa maderz skórna :Xenoderm XenoDerm LifeCell Corp., The Woodlands, TX jest produktem wytwarzanym w oparciu o taką technologię jak Alloderm - surowcem jest skóra świni. Nieożywiona macierz pozakomórkowa złożona z kolagenu i siarczanu 6-chondroityny - Integra W 1996 roku FDA zezwoliło na stosowanie Integry (Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA) do leczenia oparzeń. Zbudowana jest ona z bydlęcego kolagenu i siarczanu 6-chondroityny, tj. glikozaminoglikanu pozyskiwanego z chrząstek rekina. Daje to warstwę dermis, którą łączy się z folią silikonową, jako jednowarstwową protezą naskórka. Główną zaletą tej macierzy jest porowatość, którą uzyskuje się w procesie zamrażania i suszenia. Rozmiar porów jest kontrolowany w czasie tworzenia kryształów lodu w obrębie macierzy podczas procesu mrożenia. Kiedy do macierzy wnika unaczynienie widoczne przez cienką folię-naskórek, zostaje ona zastąpiona cienkimi przeszczepami skóry pośred- * niej grubości. Alternatywą dla przeszczepów skóry jest pobranie od pacjenta fragmentu skóry podczas pierwszego zabiegu operacyjnego, a następnie po kilku tygodniach naniesienie wyhodowanego substytutu skóry w miejsce folii silikonowej pokrywającej Integrę [46]. Zaletą preparatu jest natychmiastowa dostępność, a ponadto umożliwienie tworzenia neodermis [5,11,12]. Nie obserwuje się odpowiedzi o charakterze zapalnym, czy typu ciała obcego [50]. Ponadto zmniejsza on przerastające bliznowacenie i przykurczanie. Zmniejsza także grubość późniejszych przeszczepów skóry [25]. Wadami preparatu jest: konieczność szkolenia przed rozpoczęciem stosowania, dość znaczny koszt, możliwość niezauważonego zakażenia, gromadzenie płynu pod spodem oraz brak rzeczywistego naskórka. Hodowane substytuty skóry Większość badań wskazuje na potrzebę wykorzystywania takich substytutów skóry, które złożone są z autogennych hodowanych ke raty nocy tów jako warstwy naskórkowej oraz kolagenu z glikozaminoglikanami, który jest substratem do zasiedlania przez autogenne fibroblasty, jako warstwy skóry właściwej. Substytut ten wytwarzany jest in vitro,a następnie przenoszony jako jeden preparat na podłoże rany. Nie jest on dostępny przemysłowo. Wymaga od trzech do czterech tygodni na hodowlę. Wskaźnik przyjęcia jest średnio około 50% i nie został powszechnie zaakceptowany jako rutynowe zastępstwo dla skóry. Żywe, allogenne fibroblasty skórne: Dermagraft Dermograft (Advanced Tissue Sciences Inc,La Jolla, CA, USA) zastępuje skórę właściwą od 1987 roku. Znalazł on zastosowanie do leczenia owrzodzeń i oparzeń. Wytwarzano go przez hodowanie ludzkich, noworodkowych fibroblastów na sieci z poliglikanów (kwas poliglicolowy lub poliglactina-910, nazwa handlowa Dexon lub Vicryl ). Fibroblasty skórne z napletków noworodkowych są wysiewane na absorbującą sieć w sterylnych woreczkach, z przepływem płynu z pożywką hodowlaną. Komórki te przyczepiają się, namnażają i rozpoczynają wytwarzanie kolagenów i czynników wzrostu. Komórki i białka kolagenowe pokrywają siatkę, tworząc dookoła tkankę łączną. Ponieważ siatka jest zbudowana z materiału biode-gradacyjnego, zanika ona w ciągu trzech do czterech tygodni. Macierz złożona z fibroblastów i kolagenu pokryta folią silikonową może być stosowana jako oddzielna jednostka lecznicza lub jako podłoże dla siatkowanych autoprzeszczepów skóry, czy też hodowanych komórek nabłonkowych. Pomimo kosztowności tych żywych allogennych fibroblastów skórnych, ich zaletami są: natychmiastowa dostępność, dobra wytrzymałość na rozrywanie, łatwość w posługiwaniu się oraz brak reakcji odrzucania.

7 Pozakomórkowa macierz z allogennych ludzkich skórnych fibroblastów:transcyte TransCyte (Smith & Nephew, Inc., Largo, Florida) - jest to drogi, stworzony w laboratorium preparat zastępujący skórę, wymagający wielokrotnego nakła dania. Noworodkowe, allogenne fibroblasty są hodo wane i namnażane na włóknach nylonowych, które są po tygodniach umieszczane na folii silikonowej. Daje to produkt o zwartej komórkowej tkance", która zawiera duże stężenie wytworzonych ludzkich białek macierzy pozakomórkowej oraz wiele czynników wzrostu. Fibroblasty są usuwane przez zamrożenie po wytworzeniu pozakomórkowej macierzy i czynników wzrostu. Może mieć zastosowanie do leczenia oparzeń, jest łatwy do przechowywania oraz natychmiastowego stosowania [33]. Żywa, dwuwarstwowa allogenna skóra: Apligraft Apligraft (Organogenesis Inc, Canton, MA, USA and Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ, USA) - dwuwarstwowy żywy ekwiwalent skóry, który opisano w piśmiennictwie jako Graftskin, został zarejestrowany przez FDA w 1998 roku. Zawiera on obie warstwy, tj. naskórek i skórę właściwą. Dermis zawiera kolagen zwierzęcy typu I, posiadający żywe ludzkie skórne fibroblasty. Pokrywająca dermis warstwa żywych ludzkich keratynocytów pochodzi z hodowanych komórek, z noworodkowych napletków i namnażanych w hodowli. W późnej fazie hodowli, na granicy faz płyn-powietrze,keratynocytom umożliwia tworzenie warstwy rogowej (stratum corneum). Ten ekwiwalent skóry posiada zdolność do samoregene-racji i po skaleczeniu w laboratorium może się goić z rekonstrukcją naskórka. Apligraft histologicznie przypomina ludzką skórę i produkuje liczne cytokiny i czynniki wzrostu, jak np. TGF-a i TGF-0, IL-I, -6, -8, - ll,interferon-ai p\igf-l orazpdgf.brakjestwnim niektórych komórek skóry, takich jak melanocyty, komórki tuczne i Langerhansa oraz przydatki skóry. Brak komórek śródbłonka wyjaśnia brak reakcji ostrego odrzucania. W celu uniemożliwienia przeniesienia chorób zakaźnych i zapewnienia bezpieczeństwa dla biorcy należy przeprowadzić wiele testów wykluczających obecność HIV, HTLV, wirusów żółtaczki, wirusa Epstein-Barr'a (EBV), wirusa cytomegalii, wirusa ludzkiego herpes-6,retrowirusa,mycoplasmy i innych. Zaletą tego preparatu jest umożliwienie natychmiastowego stosowania, unikanie rany w miejscu pobrania i związanego z tym zabiegu chirurgicznego, prostota w stosowaniu, możliwość zastosowania w praktyce ambulatoryjnej. Wadami są: wysoki koszt, krótki czas przechowywania (tylko pięć dni). Zaleca się stosowanie tego preparatu przy owrzodzeniach o różnej etiologii, jak np. necrobiosis lipoidica. Złożona, hodowana skóra: OrCel OrCei (Ortec International, Inc., New York, NY, USA) - ten skórny ekwiwalent, zawiera allogenne fibrobla- sty i keratynocyty namnożone in vitro i wysiane na przeciwne strony dwuwarstwowej macierzy z kolagenu wołowego. Macierz kolagenowa składa się z gąbki, z krzyżowo sieciowanych włókien bydlęcego kolagenu, pokrytego pepsynowanym nierozpuszczalnym kolagenem. Keratynocyty są wysiewane na nieporowaty (nierozpuszczalny) żel kolagenowy, a fibroblasty na dolną część porowatej gąbki. Następnie komórki są hodowane przez dni, a otrzymany produkt musi być natychmiast zastosowany. Ta złożona, hodowana skóra zwykle jest stosowana do leczenia recesywnie dystroficznej epidermolysis bullosa, syndaktylii, przykurczów zgięciowych palców. Jednak mało jest doniesień popierających zakres zastosowania. Świńska warstwa podśluzówkowa jelita cienkiego: Oasis Oasis (Healthpoint Ltd, San Antonio, Texas, USA) - warstwa podśluzówkowa jelita cienkiego świni, zawiera naturalną, trójwymiarową macierz pozakomórkowa, która prawdopodobnie może posłużyć jako magazyn cytokin i cząstek przytrzymujących komórki, co zapewnia podłoże do wzrostu tkankowego. Udowodniono, że struktura i skład chemiczny śluzówki jelita cienkiego zapewnia przemodelowanie tkanki łącznej. Surowicówka, mięśnie gładkie i śluzówka są usuwane. Macierz zawiera kolagen typu I, III i V; czynniki wzrostu: TGFp, FGF-2. Preparat jest dostarczany w arkuszach uwodnionych i liofilizowanych. W piśmiennictwie jest mało doniesień klinicznych. Zaletą jest natychmiastowe zastosowanie i długi okres przechowywania. Bezkomórkowa, ksenogenna macierz kolagenowa: E-Z- Derm E-Z-Derm (Brennen Medical Inc., Saint Paul, Minnesota, USA) jest czasowym substytutem skóry, który za pomocą aldehydu został krzyżowo związany (utwardzony). Dzięki temu może służyć jako bezkomórkowa macierz skórna. Dostępny jest jako opatrunek perforowany lub nie perforowany, połączony w produkcji z lnianą gazą, którą się odrzuca w chwili nakładania na ranę. Zaletą jest możliwość natychmiastowego zastosowania. Do wad zaliczamy: nieliczne doniesienia kliniczne, co uniemożliwia ocenę tolerancji i wydajności, możliwość przenoszenia chorób zakaźnych i zwiększenie wydzielania z rany. Autogenny, naskórkowy ekwiwalent skórny: EpiDex EpiDex (Modex, Geneva, Switzerland) jest autogennym naskórkowym ekwiwalentem skórnym wytwarzanym in vitro z mieszków włosowych pacjenta. Był on przeszczepiany z powodzeniem w próbach pilotażowych, jednakże konieczne są dalsze badania. W substytucie wykorzystano komórki warstwy zewnętrznej osłonki korzenia włosa w obrębie mieszka włosowego. Łatwo można izolować prekursorowe komórki dla naskórkowych keratynocytów z wyrwanych mieszków włosowych owłosionej skóry głowy, które

8 zachowują wysoki potencjał proliferacji niezależnie od wieku dawcy mieszka włosowego. Ten ekwiwalent skóry włosów jest dostępny w Europie. Laserskin (Fidia Advanced Biopolymers, Aban Termę, Italy) lub produkowany w Stanach Zjednoczonych pod nazwą VivoDerm (ER Sąuibb and Sons Inc, Princeton, NJ, USA). Laserskin jest żss, który jest głównie dostępny w Anglii, Niemczech i Włoszech. Wymaga on pobrania od pacjenta wycinka skóry do produkcji in vitro hodowanych, autogennych keratynocytów, które wysiewane są in vitro na błonę z kwasu hialu-ronowego. Jest to błona utworzona z utwardzonego, estryfikowanego kwasu hialuronowego, który następnie za pomocą lasera zostaje perforowany. Dokonane za pomocą lasera mikroperforacje pozwalają na migrację keratynocytów poprzez błonę. Kolonie komórkowe przerastają następnie całą błonę. Substytut oddziela się od płytki Petriego bez enzymatycznego trawienia. Błona taka nie wymaga odwracania i późniejszej reorientacji komórek w czasie nakładania na podłoże rany. Obecność kwasu hialuronowego ułatwia migrację komórek, ich proliferację i angio-genezę. Produkt ten nie jest odrzucany przez biorcę, ponieważ jest autogenny. Stosowany jest głównie do leczenia oparzeń i ran przewlekłych, takich jak np. owrzodzenia żylakowe. Kierunki udoskonalania dotychczasowych rozwiązań Nadal trwają badania nad opracowaniem i udoskonalaniem gotowych produktów żss do zastosowania klinicznego. Najwięcej doniesień dotyczy Integry, Apligraftu i Graftskinu. Tylko w ostatnim okresie ukazał się szereg prac o ich różnorodnym zastosowaniu. Chan i wsp. opisali nową technikę przeszczepiania przy zamykaniu ran za pomocą Integry i złożonego biokompatybilnego przeszczepu naskórkowego [9]. Wykorzystano autogenne keratynocyty na błonie pochodnej kwasu hialuronowego (z fibroblastami jako feeder layer"), która została z powodzeniem zastosowana u trzech chorych, dla wybranych procedur rekonstrukcyjnych. Naskórkowanie wystąpiło u wszystkich chorych. Fitton i wsp. opowiadają się za stosowaniem Integry w oddziale leczenia oparzeń. Podkreślają, że pomimo wysokiego wskaźnika utraty przeszczepów skóry właściwej oraz zbyt wolnego naskórkowania, stosowanie Integry ma przyszłość jako leczenie z wyboru, z uwagi na dobrą końcową funkcjonalność i estetykę [21]. Hunt i wsp. opisali leczenie Integra przerastającego bliznowacenia i przykurczy przedniej powierzchni szyi w rekonstrukcyjnej fazie chirurgii oparzeń. We wszystkich przypadkach przykurczu skóry osiągnięto bardzo dobre wyniki kosmetyczne. Średni czas obserwacji wynosił 48 miesięcy [28]. Delorme i wsp. opisali Apligraft stanowiący skórny ekwiwalent, który ma naskórek i dermis podobne do ludzkiej skóry. Jej żywe keratynocyty i fibroblasty pochodzą z bankowanych, hodowanych komórek, dostarczanych z ludzkich noworodkowych napletków. Z powodzeniem nadaje się ona do leczenia owrzodzeń żylakowych podudzi [13]. Tarlow i wsp. określili efektywność Graftskinu jako dającego szansę na zagojenie w skomplikowanych chirurgicznych ranach z ubytkami tkanek. Graft-skin - konstrukcja dwuwarstwowej żywej skóry jest efektywną chirurgiczną opcją, zarówno w leczeniu przewlekłych owrzodzeń żylakowych, jak i w prostych chirurgicznych wycięciach. Graftskin jest dobrze tolerowany przez pacjentów. Obserwowano całkowite zagojenie ran w czasie dziewięciu tygodni od zastosowania. Tarlow i wsp. podsumowują, że Graftskin jest wspaniałą możliwością leczenia trudnych chirurgicznych ran, które nie mogą być leczone innymi metodami. Przyspiesza on czas gojenia oraz zmniejsza wrażliwość na czynniki chorobotwórcze. Powinien być stosowany w ranach, w których gojenia per secundam należy szczególnie unikać [61]. Still i wsp. badali bezpieczeństwo i skuteczność stosowania dwuwarstwowej macierzy z komórkami OrCel- 1 (Ortec International, Inc., NewYork NY, USA), jako czasowego opatrunku. Oceniano przyspieszenie gojenia rany w miejscu po pobraniu wolnych przeszczepów skóry (WPS) u ciężko oparzonych chorych. Grupę kontrolną stanowili ci sami chorzy, u których te same rany, lecz w innych miejscach zamknięto klasycznymi opatrunkami z Biobrane-L (Bertek Pharmaceuticals Sugarland, TX, USA). Czas gojenia przy zastosowaniu OrCell był znacząco krótszy od czasu leczenia miejsc za pomocą Biobrane-L. Skrócenie czasu gojenia jest bardzo ważne w razie konieczności ponownego pobierania WPS do leczenia ran oparzeniowych. W podsumowaniu zwrócono uwagę, że OrCell jest dobrze tolerowany, wspomaga szybsze gojenie oraz zmniejsza bliznowacenie [58]. Veves i wsp. przeprowadzili badania nad efektywnością Graftskinu, jako żywego ekwiwalentu skóry, w leczeniu rany niezakażonej i bez niedokrwienia w przewlekłych podeszwowych owrzodzeniach,w stopie cukrzycowej. W 24 ośrodkach w Stanach Zjednoczonych, 208 pacjentów było wyrywkowo ocenianych jako grupa kontrolna, w czasie leczenia zarówno Graftskinem (112 chorych), jak i zwilżoną w soli fizjologicznej gazą (96 chorych). Stosowanie Graftskinu, oceniane po najdalej czterech tygodniach, ma wyższy wskaźnik gojenia przy porównaniu z dotychczasowo dostępnym leczeniem i nie jest połączone z jakimikolwiek objawami ubocznymi. Graftskin może być bardzo przydatny dodatkowo w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej, które jest oporne na dotychczas stosowane standardy leczenia [62]. Kierunki rozwoju leczenia ran za pomocą żywych substytutów skóry Doniesienia z pracowni badawczych dowodzą dalsze rozszerzanie wskazań i zakres stosowania żss.według Lee i wsp., inżynieria tkankowa zapewnia alter-

9 natywę dla autogennych i allogennych przeszczepów tkankowych, które są wymagane z powodu ograniczeń i ryzyka przeniesienia zakażenia [34]. Aktualnie substytuty skóry są robione z samej macierzy pozakomórkowej, głównych komórek i połączenia komórek oraz macierzy. Nowe biotechnologiczne zabiegi prowadziły do rozwoju ekwiwalentu skóry, ścisłego dopasowania do pierwotnej ludzkiej skóry w znaczeniu histologicznych i funkcjonalnych właściwości [35]. Yang i wsp. opracowali sztuczną skórę, złożoną z uwarstwionych keratynocytów i macierzy skórnej, z kolagenu typu I zawierającego fibroblasty [65]. Dla pokonania problemu rozrywania hodowli podczas szycia przeszczepu, dołączali histokompatybilną kolagenową siatkę do dna żelu. Badano optymalne zachowanie ekwiwalentów skóry, które powinno być najlepsze przy stosowaniu 3,0 mg/ml roztworu kolagenowego i dołączonej hodowli żelowej. Ta dołączona hodowla żelowa fibroblastów daje skokowy efekt zwiększenia stężenia czynnika wzrostu. Wpływa to na szybszy wzrost komórek. W opracowanej sztucznej skórze zagęszczenie keratynocytów wynosiło 10 5 komórek/cm 2. Komórki hodowano na ekwiwalencie skóry właściwej, na granicy fazy powietrze-płyn. Braye i wsp. stworzyli bank allogenicznych keratynocytów, zwracając należytą uwagę na bezpieczeństwo chorego i zabezpieczenie hodowli [7]. Uzyskali dzięki temu szybsze leczenie pacjentów cierpiących z powodu rozległych i głębokich oparzeń. Autorzy przedstawiali zalety użycia allogennych keratynocytów w pierwszej fazie leczenia u chorego z 97% CPC głębokiego oparzenia, oczekującego na autogenne hodowane keratynocyty. Czas całkowitego gojenia ran u tego chorego porównano z wynikami uzyskanymi przy stosowanu autogennych arkuszy u dwóch innych pacjentów oparzonych 80% CPC i 82% CPC. Leczenie tych dwóch pacjentów było dłuższe i powikłane. U oparzonego z 97% CPC kliniczny przebieg leczenia był krótszy i bez powikłań. Ponadto, autogenny/allogenny hodowany naskórek, daje estetycznie dobre wyniki, bez charakterystycznej siatki widocznej przy wolnych przeszczepach skóry. Mniejszy jest także dyskomfort dla chorego, związany z pobieraniem materiału od chorego do hodowli. Głębokie oparzenia III stopnia są kwalifikowane z wyboru do hodowanych nabłonków, ponieważ przez obecność skóry właściwej unika się przykurczów odpowiedzialnych za zaburzenia funkcjonalności, obserwowanych zwykle w oparzeniach III stopnia z powodu braku dermis. Z powodu wzrostu bezpieczeństwa bankowania allogennych keratynocytów, także leczenie rozległych i głębokich oparzeń II stopnia staje się bezpieczniejsze i szybsze. Lepsze są wyniki funkcjonalne i estetyczne [7,31,52,64]. Suzuki i wsp. donieśli, że w populacji wschodniej, włączając Japończyków, przerost blizny w miejscu pobrania jest częstszy aniżeli w typie kaukaskim. Dla rozwiązania problemu zaburzeń gojenia miejsca pobrania oraz braku przyjęcia przeszczepu, rozpoczęto procedurę drugiego etapu, tj. nakładano na miejsce pobrania cienki, wolny przeszczep skóry pośredniej grubości, osadzony na acelularnej dwuwarstwowej sztucznej skórze czy sztucznej skórze często właściwej. Bliznowacenie miejsca pobrania było wówczas minimalne, a dzięki temu możliwe było pobranie następnego przeszczepu skóry z tego samego miejsca [60]. Navasaria i wsp. podkreślają, że bieżące techniki hodowli tkankowej umożliwiają uzyskanie dużego arkusza nabłonka z małego kawałka skóry lub też zawiesiny hodowanych keratynocytów przydatnych do leczenia ran. Autorzy szeroko opisali bieżące metody hodowania keratynocytów, poszukiwania w pełni funkcjonalnego odtworzenia elementów skóry i perspektywy dla klinicznego rozwoju tych technologii w niedalekiej przyszłości [45,46]. Saap i wsp. stwierdzają, że hodowane substytuty skóry, które były stosowane jako uzupełniające przeszczepy w leczeniu oparzeń i przewlekłych ran są pozbawione splotu naczyniowego. Ubytek ten prowadzi do dłuższego czasu gojenia, potrzebnego dla rewaskularyzacji przyłożonego własnego przeszczepu skóry i często przyczynia się do powikłań gojenia. Modyfikacja genetyczna hodowanych ekwiwalentów skóry dla zwiększonego unaczynienia może hipotetycznie prowadzić do przyspieszenia gojenia rany. W celu weryfikacji tej hipotezy, Saap i wsp. modyfikowali genetycznie ludzkie keratynocyty poprzez transdukcje z replikacja niekompetentnych retrowirusów. Celem było przyspieszenie i zwiększenie poziomu stężenia naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (EGF), który jest specyficznym i mocnym mitogenem dla komórek śródbłonkowych. Zmodyfikowany w ten sposób, hodowany ekwiwalent skóry, wydziela znacznie więcej naczyniowego śródbłonkowego białkowego czynnika wzrostu podczas założonego czasu hodowli. Badany pod mikroskopem zmodyfikowany przeszczep skóry prezentował zwiększoną liczbę skórnych naczyń krwionośnych. Uzyskano zmniejszony czas rewaskularyzacji w porównaniu z grupą kontrolną. Zwiększone unaczynienie hodowanych substytutów skóry może przyspieszyć gojenie rany [59]. Lee opracował rekonstrukcję naskórka na deepitelizowanej dermis (RE-DED) i na zasiedlonej przez fibroblasty kolagenowej matrix (Living Skin Equivalent - LSE) [35]. Wykazał histologiczne podobieństwo do naturalnego naskórka. Jakkolwiek, znaleziono także kilka zmian, np. zmieniony wzór ekspresji zróżnicowanych markerów dla naturalnego naskórka. Na pozbawioną naskórka skórę właściwą (DED) była nakładana macierz kolagenowa, zasiedlona przez fibroblasty, a keratynocyty były hodowane na powierzchni DED na granicy faz. Nowy ekwiwalent skóry wykazywał podobną morfologię do skóry z naturalnego naskórka. Immunohistochemiczne badania ujawniły, że różnicujące markery takie jak involucrina, loricrina ifilaggrina, ale nie keratyna-1, wykazują na RE-DED podobny wzór ekspresji, charakterystyczny dla oryginalnego naskórka. Na nowym modelu hodowanej skóry znaleziono kilka fibroblastów w obrębie DED, jako wynik migracji z zasiedlonej fibroblastami macierzy kolagenowej, co naśladuje żywą skórę właściwą in vivo. Wyniki te wskazują, że nowy model wydaje się być lepszym ekwiwalentem skóry, aniżeli poprzednie.

10 Tak więc obserwacje rezultatów jego zastosowania dostarczają dowodów na to, że obecność fibroblastów zwiększa zróżnicowanie naskórkowe [34]. El Ghalbzouri i wsp. zastosowali biodegradacyjny (podzielony) kopolimer (PEGT/PBT) jako rusztowanie dla hodowanych komórek w celu stworzenia ŻSS. Grupę kontrolną stanowiły: pozbawiona naskórka skóra właściwa z fibroblastami, kolagen, fibryna i hybryda PEGT/PBT - podłoża te służyły za rusztowanie. W jednostopniowym eksperymencie na rusztowanie wysiewano hodowane keratynocyty, a następnie prowadzono hodowlę metodą na granicy faz powietrze-- płyn (A/L). W eksperymencie dwustopniowym, całkowicie zróżnicowana, hodowana błona naskórkowa była nanoszona na podłoże zasiedlone fibroblastami, a następnie hodowana na granicy faz A/L. W każdym z eksperymentalnych warunków była tworzona błona podstawna i całkowicie zróżnicowany uwarstwiony naskórek. Wnioski wynikające z eksperymentu stwierdzają, że kopolimer PEGT/PBT jest odpowiednim podłożem dla drugiego etapu, podczas gdy kolagen lub fibryna w celu zasiedlenia przez fibroblasty wymagają pierwszego etapu. W podsumowaniu, pełny ekwiwalent skóry może być tworzony zarówno z porowatego jak i nieporowatego rusztowania zasiedlonego przez fibroblasty z hodowanym zróżnicowanym naskórkiem oraz nieporowatymi zasiedlonymi przez fibroblasty substytutami skóry właściwej, za pomocą pojedynczej zawiesiny hodowanych keratynocytów oraz hodowania w środowisku na granicy faz A/L i nie zawierających zarówno egzogennych czynników wzrostu, jak i płodowej surowicy bydlęcej [19]. Jimenez i wsp. stwierdzili, że zarówno badania, jak i odkrycie tkanek i produktów wymagają wielokierunkowego podejścia do postępu na polu medycyny regeneracyjnej [29]. Obejmuje to stosowanie jednokomórkowej linii i włączenia pozakomórkowej macierzy, aby utworzyć strukturę tkankową, która pozwoli na komunikowanie się poprzez oddziaływanie zarówno pomiędzy komórkami, jak i pomiędzy komórką a macierzą. Oddziaływania te są podstawą dla zapewnienia podparcia tkankowego i funkcjonalności, poprzez uwolnienie rozmaitych cytokin i czynników wzrostu. Autorzy stwierdzają też, że jakkolwiek jest wiele uwarunkowań bezpieczeństwa i etycznych przy stosowaniu komórek macierzystych, to niekontrolowana plastyczność i potencjalna proliferacja do struktur teratokarcinogennych oraz epigenetyczna niestabilność (z odrzucaniem immunologicznym i skażeniem) decydują o zagrożeniach powstałych przy stosowaniu tego sposobu. W chwili obecnej, jedynie zróżnicowane komórki somatyczne są odpowiednie do zastosowania handlowego. Włącza w to keratynocyty i fibrolasty allogenicznego pochodzenia (Apligraft do gojenia ran; Novartis, East Hanover, NJ), własnopochodne keratynocyty (EpiDex [Modex Therapeutiąues SA, Lausanne, Switzerland] oraz Epicel [Genzyme Biosurgery, Cambridge, MA] do naprawy naskórków), a w przypadku chrząstek - chondrocyty (Carticel dla osteoarthritis; Genzyme Biosurgery). Komórki są zawieszone w macierzy, która zawiera obojętne biodegradacyjne materiały, np. kolagen czy polimer kwasu mlekowego. Stanowi to środowisko dla komórek, czynników wzrostu i małych cząsteczek koniecznych do naprawy uszkodzonych tkanek. Produkty pochodzenia komórkowego dają macierz optymalną dla wzrostu komórek ze względu na wytrzymałość mechaniczną, odpowiednią porowatość oraz połączenia międzykanalikowe. Materiały będące syntetycznymi rusztowaniami powinny zawierać czynniki wzrostu, jak również hormony białkowe, przeciwciała, antygeny oraz DNA, które są uwalniane z kontruktu w sposób kontrolowany. Ułatwia to migrację, proliferację i różnicowanie zasiedlonych komórek, a w konsekwencji odbudowanie skaleczonej tkanki. Przykładem syntetycznej macierzy, która stanowi rusztowanie dla zasiedlenia i namnażania dla ludzkich keratynocytów i fibroblastów jest podłoże z koralików krzemowych umieszczonych w fabrykowanej delikatnej sieci, którą następnie pokryto folią poliuretanową. Produkt ten przyspieszył gojenie ran skóry. Biodegradacyjne materiały,które znikają z okolicy implantowanej w czasie kontrolowanego usuwania, mogą służyć do uwolnienia różnych molekuł. Produkty oparte na kleju fibrynowym jak np. Tisseel (Baxter BioScience, Mississauga, Ontario, Canada) są stosowane jako nośniki dla komórek (keratynocytów i fibroblastów) oraz peptydów [29]. Perspektywy poszukiwania nowych metod leczenia Dotychczasowe leczenie ran za pomocą dostępnych sposobów, opartych na metodach inżynierii komórkowej, udowodniło efektywność i przyspieszenie procesów gojenia. Odpowiednie ich zastosowanie może wyleczyć nawet przewlekle nie gojące się rany. Postęp technologiczny może w przyszłości poprawić tego typu zastosowanie. Dla przykładu, bardziej wydajne techniki przechowywania komórek mogłyby przedłużyć przeżycie na półce" i uprościć warunki przechowywania. Bardziej specyficzne, uproszczone odmrażanie i płukanie przechowywanych w zamrożeniu produktów uczyni je bardziej przyjaznymi dla użytkownika. Procedury gojenia ran z zastosowaniem terapii komórkowej, czytelnie zdefiniowane i zoptymalizowane wymagają dalszych badań. Obejmuje to zarówno zagadnienia niezbędnych ilości procedur nakładania hodowanych komórek, jak i optymalnych przedziałów czasowych, nanoszenia ich na podłoże [55]. Bardziej całościowe zrozumienie mechanizmu działania terapeutycznego żss mogłoby prowadzić do jeszcze bardziej wydajnego produktu. Przykładowo, jeżeli produkcja czynnika wzrostu jest podstawą działania, to genetyczne modyfikowanie komórek w celu nadprodukcji różnych specyficznych cytokin może być wykonalne i wydajne. Już się ukazały wstępne doniesienia na ten temat. Dalsze udoskonalenia oparte o wspomniane zasady mogą prowadzić do znaczącej poprawy [36].

11 Obecnie wysiłek producentów zmierza w kierunku dalszej redukcji kosztów komórkowego żss. Celem jest leczenie tzw. trudnych" ran. Dotychczas stosowano je w przypadku niepowodzeń po innych sposobach leczenia. Gdyby jednak żss mógł być zastosowany wcześniej, tj. w wypadku stwierdzenia dużego prawdopodobieństwa spodziewanego niepowodzenia, to wówczas ogólny koszt leczenia byłby niższy. Niższy koszt mógłby zwielokrotnić obszar zastosowania, a tym samym zwiększyć wydajność metody leczenia. Może to znacząco zmienić dotychczasowe wskazania do zastosowania tych produktów [42]. Dodatkowo, w ocenie gojących się ran z zastosowaniem żss ważne są takie czynniki jak: efekt kosmetyczny, częstość nawrotów ran przewlekle gojących się, grubość i jakość funkcjonalna blizny. Obserwacje w aspekcie wymienionych efektów stosowania żss pozytywnie oceniają i promują dalszy rozwój i stosowanie tej właśnie techniki [39]. Dodatkowych badań wymaga także lepsze zdefiniowanie różnych technologii postępowania z ranami. W niektórych przypadkach korzystny efekt gojenia sugerują publikowane ostatnio doniesienia, jak np. terapia podciśnieniowa (VAC, Kinetic Concepts Inc., San Antonio, Texas), która może być wzbogacona o technikę komórkowego gojenia ran [41 ]. Publikowane wyniki sugerują bardzo dobre efekty zastosowania mieszaniny hodowanych komórek chimerycznych syngeniczno-allogenicznych, co zasługuje na dalsze badania jako potencjalnie bardziej przyspieszony i tańszy sposób, w porównaniu z hodowanymi komórkami własnymi chorego [36]. Na podstawie oceny piśmiennictwa z ostatniej dekady można stwierdzić, że dokonał się znaczny postęp w technologii hodowli komórkowych oraz żss, opartych na komórkach. Nadszedł czas kiedy na podstawie prób doświadczalnych i naukowych tworzy się zasady nowoczesnego pielęgnowania rany [51]. Z pewnością będziemy obserwować wraz z rozwojem technologii dalszy rozwój tych metod. Autorzy uważają, że obecne stosowanie biotechnologicznie wyprodukowanej skóry jest zbyt małe. Ogranicza się często do ran u chorych cierpiących z powodu bólu, jak również ran nie gojących się od wielu miesięcy, a nawet lat [44]. Pojawienie się prostszych metod wcześniejszego diagnozowania zaburzeń gojenia ran, a tym samym umożliwienie wydzielenia grupy chorych, których rany nie będą się dobrze goiły przy stosowaniu dotychczasowych metod, zwiększy liczbę kandydatów do żss. Dzięki temu poprawi się częstość ich stosowania, a tym samym obniży koszty metody [57]. Podsumowanie Hodowane in vitro komórki nabłonkowe, połączone z fibroblastami w obrębie jednego trójwymiarowego konstruktu określanego jako ŻSS, zdobywają coraz szersze zastosowanie w leczeniu oparzeń i chirurgii dzięki następującym zaletom: mogą być łatwo zastosowane w oddziale chirurgicznym, a w niektórych przypadkach przy łóżku chorego lub ambulatoryjnie; dają dobrą końcową funkcjonalność i estetykę; stosowanie komórek allogenicznych eliminuje potrzebę operacji pobierania skóry i związanego z tym bólu, a także bliznowacenia; komórki allogeniczne są łatwiejsze w stosowaniu niż hodowane konwencjonalnie autoprzeszczepy naskórkowe; połączenie komórek nabłonkowych z organiczną acellularną skórą właściwą daje dobrą wytrzymałość mechaniczną; w odpowiednich warunkach mogą być transportowane i przechowywane bez utraty korzystnych właściwości. Pragniemy wyrazić podziękowanie dla prof. Włodzimierza Korohody, kierownika Zakładu Biologii Komórki, Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, któremu zawdzięczamy realizację planów tworzenia żywego substytutu skóry oraz nadzór merytoryczny i wytrwałą pomoc przy zastosowaniu osiągnięć nauk podstawowych w klinice chirurgicznej. Piśmiennictwo 1. Akita S, Daiana T, Ishiharaa T, Fujiia T, Akino T (2004) Leukemia inhibitory factor-transfected embryonic fibroblasts and vascular endothelial growth factor successfully improve the skin substitute wound healing by increasing angiogenesis and matrix production. J Dermatol Sci 1;36: An G, Walter RJ, Nagy K (2004) Closure of abdominal wali defects using acellular dermal matrix. J Trauma 6;56: Badiavas EV, Paquette D, Carson P, Falanga V (2002) Humań chronić wounds treated with bioengineered skin: histologic evidence of host-graft interactions. J Am Acad Dermatol 4;46: Bishop JF (2004) Burn wound assessment and surgical management. Crit Care Nurs Clin North Am 1;16: Blanco NM, Edwards J, Zamboni WA (2004) Dermal substitute (Integra) for open nasal wounds. Piast Reconstr Surg 7; 113: Brem H, Kirsner RS, Falanga V (2004) Protocol for the successful treatment of venous ulcers. Am J Surg la;188(suppl.):sl S8 7. Braye F, Pascal P, Bertin-Maghit M, Colpart JJ, Tissot E, Damour O (2000) Advantages of using a bank of allogenic keratinocytes for the rapid covera-ge of extensive and deep second-degree buras. Med Biol Eng Comput 2;38: Braye FM, Stefani A, Venet E, Pieptu D, Tissot E, Damour O (2001) Grafting of large pieces of human reconstructed skin in a porcine model. Br J Piast Surg 6;54: Chan ES, Lam PK, Liew CT, Lau HC, Yen RS, King W W (2001) A new technique to resurface wounds with composite biocompatible epidermal graft and artificial skin. J Trauma 2;56: Cieślik K (2003) Wybrane zagadnienia leczenia chorego oparzonego w oddziale specjalistycznym. Twój Magazyn Medyczny 3;8:80 85