INSTYTUT GENETYKI ROŚLIN POLSKIEJ AKADEMII NAUK POZNAŃ AUTOREFERAT ZRÓŻNICOWANIE GATUNKOWE POLSKICH SZCZEPÓW TRICHODERMA

Transkrypt

1 INSTYTUT GENETYKI ROŚLIN POLSKIEJ AKADEMII NAUK UL. STRZESZYŃSKA POZNAŃ AUTOREFERAT ZRÓŻNICOWANIE GATUNKOWE POLSKICH SZCZEPÓW TRICHODERMA I ICH WŁAŚCIWOŚCI ANTAGONISTYCZNE WZGLĘDEM FITOPATOGENÓW FUSARIUM DR LIDIA BŁASZCZYK ZESPÓŁ INTERAKCJI ROŚLINA-MIKROORGANIZM ZAKŁAD GENETYKI PATOGENÓW I ODPORNOŚCI ROŚLIN POZNAŃ 2017

2 Załącznik nr 2a 1. Imię i nazwisko Lidia Błaszczyk (z d. Golka) 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. Doktor nauk rolniczych, dyscyplina agronomia ( r.); Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. Rozprawa doktorska pt.: Identyfikacja i mapowanie genów odporności na rdzę brunatną u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.), wykonana pod kierunkiem prof. dr. hab. Jerzego Chełkowskiego. Magister inżynier biotechnologii, specjalność biotechnologia roślin ( r.); Wydział Rolniczy, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego (obecnie Uniwersytet Przyrodniczy) w Poznaniu. Praca magisterska pt.: Analiza zmiennego regionu genu 16S rrna szczepów Rhizobiaceae brodawkujących łubiny, wykonana pod kierunkiem dr. Krzysztofa Pudełko w Katedrze Biochemii i Biotechnologii Wydziału Rolniczego Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego (obecnie Uniwersytetu Przyrodniczego) w Poznaniu. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych obecnie asystent w Zakładzie Genetyki Patogenów i Odporności Roślin Instytutu Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu adiunkt w Pracowni Biologii Molekularnej (od r. w Zakładzie Genetyki Patogenów i Odporności Roślin) Instytutu Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu asystent w Pracowni Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu uczestnik Studium Doktoranckiego przy Wydziale Biologii UAM w Poznaniu, doktorant w Pracowni Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego Zróżnicowanie gatunkowe polskich szczepów Trichoderma i ich właściwości antagonistyczne względem fitopatogenów Fusarium. b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa): PH1. Błaszczyk L. a, Popiel D., Chełkowski J., Koczyk G., Samuels G. J., Sobieralski K., Siwulski M. (2011). Species diversity of Trichoderma in Poland. J. Appl. Genet., 52: [IF2011 b = 1,664; MNiSW c = 20 pkt; liczba cytowań d = 29] 1

3 PH2. Błaszczyk L., Siwulski M., Sobieralski K., Frużyńska-Jóźwiak D. (2013). Diversity of Trichoderma spp. causing Pleurotus green mould diseases in Central Europe. Folia Microbiol., 58: [IF2013 = 1,145; MNiSW = 15 pkt; liczba cytowań = 3] PH3. Strakowska J., Błaszczyk L., Chełkowski J. (2014). The significance of cellulolytic enzymes produced by Trichoderma in opportunistic lifestyle of this fungus. J. Basic Microbiol., 54:S2-S13. [IF2014 = 1,823; MNiSW = 20 pkt; liczba cytowań = 7] PH4. Jeleń H., Błaszczyk L., Chełkowski J., Rogowicz K., Strakowska J. (2014). Formation of 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one (6-PAP) and other volatiles by different Trichoderma species. Mycol. Progress., 13: [IF2014 = 1,913; MNiSW = 20 pkt; liczba cytowań = 9] PH5. Błaszczyk L., Strakowska J., Chełkowski J., Gąbka-Buszek A., Kaczmarek J. (2016). Trichoderma species occurring on wood with decay symptoms in mountain forests in Central Europe: genetic and enzymatic characterization. J. Appl. Genet., 57: , DOI: /s [IF2015 = 1,929; MNiSW = 20 pkt; liczba cytowań = 0] PH6. Błaszczyk L., Basińska A., Ćwiek H, Gromadzka K, Popiel D., Stępień Ł. (2017). Suppressive effect of Trichoderma on toxigenic Fusarium species. Pol. J. Microbiol., 1: [IF2015 = 0,750; MNiSW = 15 pkt; liczba cytowań = 0] a - autor korespondencyjny b - wartość IF wg JCR dla prac opublikowanych przed 2017 rokiem podano zgodnie z rokiem ich opublikowania; w przypadku prac opublikowanych w roku 2017 podano dostępny IF z roku 2016; c - punktację MNiSW dla poszczególnych publikacji podano wg wykazu uaktualnionego w 2016 r.; d - liczba cytowań wg Web of Science Core Collection z dnia 7 kwietnia 2017 r. Sumaryczny Impact Factor: 9,224 Łączna liczba punktów MNiSW: 110 Łączna liczba cytowań wg Web of Science Core Collection: 48 Opis indywidualnego wkładu habilitanta w powstanie każdej z wieloautorskich publikacji znajduje się w Załączniku nr 3 (Wykaz opublikowanych prac naukowych oraz informacja o osiągnięciach dydaktycznych, współpracy naukowej i popularyzacji nauki). Oświadczenia współautorów określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie poszczególnych publikacji, wchodzących w skład osiągnięcia naukowego, znajdują się w Załączniku nr 4. c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Prezentowany cykl publikacji jest wynikiem badań, które koncentrowały się wokół zagadnień dotyczących występowania grzybów Trichoderma w Polsce i możliwości ich wykorzystania w biologicznej ochronie roślin przed chorobami wywoływanymi przez toksynotwórcze gatunki Fusarium. Grzyby z rodzaju Trichoderma (stadium doskonałe: Hypocrea) należą do gromady Ascomycetes, podgromady Pezizomycotina, klasy Sordariomycetes i rzędu Hypocreales. Występują we wszystkich strefach klimatycznych, a ich najczęstszym siedliskiem jest gleba i próchniejące drewno (Harman i in., 2004; Druzhinina i in., 2011). Obecność tych mikroorganizmów stwierdzono również na zawilgoconych ścianach budynków (Klein i in., 1998; Druzhinina i in., 2012), muszlach morskich (Sallenave i in., 1999), gąbkach morskich (Gal-Hemed i in., 2011), skorupiakach (Sallenave-Namont i in., 2000), czy niektórych 2

4 owadach (Sreerama i Veerabhadrappa, 1993; Yoder i in., 2008). Miejscem bytowania grzybów Trichoderma są także uprawy pieczarek (Błaszczyk i in., 2014; Strakowska i in., 2014 PH3) i boczniaków (Błaszczyk i in., 2013 PH2; Błaszczyk i in., 2014; Strakowska i in., 2014 PH3). Trzy z występujących tam gatunków są uznawane za patogeny grzybów uprawnych Trichoderma aggressivum jest czynnikiem wywołującym zieloną pleśń na pieczarce [Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach], a Trichoderma pleurotum i Trichoderma pleuroticola są czynnikami wywołującymi zieloną pleśń na boczniaku [Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.]. Pewne gatunki Trichoderma wyizolowano również z tkanek i płynów ustrojowych pobranych od pacjentów z immunosupresją, będących głównie po przeszczepach, leczeniu onkologicznym, czy chorych na AIDS (Sandoval-Denis i in., 2014). Gatunki te określane są jako oportunistyczne patogeny człowieka (Druzhinina i in., 2011). Zdolność grzybów Trichoderma do zajmowania różnych nisz ekologicznych świadczy o wysokim potencjale oportunistycznym tych grzybów, ich umiejętności przystosowywania się do różnych warunków środowiskowych i kształtowania złożonych heterotroficznych interakcji (Druzhinina i in., 2011; Strakowska i in., 2014 PH3; Błaszczyk i in., 2015 PH5). Jako saprofity glebowe, przyczyniają się do rozkładu szczątków roślinnych, drewna i kory (Kubicek, 2013; Strakowska i in., 2014 PH3; Błaszczyk i in., 2015 PH5). Bytując na zdegradowanym, lignocelulozowym materiale roślinnym, wykazują jednocześnie działanie antagonistycznie względem innych grzybów, głównie patogenów roślin, takich jak: Botrytis cinerea, Fusarium spp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, Verticillium dahilae, czy Sclerotinia spp. (Harman i in., 2004; Verma i in. 2007; Druzhinina i in., 2011; Błaszczyk i in., 2014). Wydajnie konkurują z nimi o składniki odżywcze, w tym wydzieliny korzeniowe, oraz nowe nisze ekologiczne, np. miejsce infekcji na korzeniu. Efektywnie współzawodniczą dzięki zdolnościom do mykopasożytnictwa i antybiozy, sekrecji różnych enzymów litycznych i metabolitów wtórnych (Vinale i in., 2008; Druzhinina i in., 2011). W ryzosferze grzyby Trichoderma mają zdolność do zasiedlania zewnętrznych warstwy korzeni roślin, przy czym głównie wnikają do przestrzeni międzykomórkowych epidermy (Druzhinina i in., 2011). W ostatnich latach pojawiły się doniesienia na temat występowania Trichoderma w tkankach roślin również w formie endofitów (Druzhinina i in., 2011; Strakowska i in., 2014 PH3). Badania pokazują, iż obecności gatunków Trichoderma w ryzosferze i tkankach roślin prowadzi do zwiększonej odporności roślin na stresy biotyczne i abiotyczne, przyczynia się także do stymulacji wzrostu i rozwoju systemu korzeniowego oraz części nadziemnych roślin, a w konsekwencji do wydajniejszego ich plonowania (Woo i in., 2014). Stwierdzony, naturalny potencjał antagonistyczny gatunków Trichoderma względem niektórych fitopatogenów, oraz występowanie tych mikroorganizmów w formie symbiontów roślin i endofitów sprawia, że grzyby Trichoderma postrzegane są jako ważne czynniki kontroli biologicznej (ang. Biological Control Agent, BCA), zdolne do ograniczania populacji patogenów w środowisku rolniczym oraz ochrony roślin i poprawy ich cech użytkowych (Błaszczyk i in., 2014; Woo i in., 2014). Badania nad możliwością wykorzystania Trichoderma w ochronie roślin uprawnych prowadzone są już od ponad 70 lat (Woo i in., 2014). Jednakże w kontekście organizmów antagonistycznych względem fitopatogenów rozpatrywane były do tej pory tylko nieliczne gatunki Trichoderma, głównie Trichoderma harzianum, a nawet pojedyncze szczepy (Woo i in., 2014; Błaszczyk i in PH6). Dotychczasowa wiedza na temat odziaływania różnorodnych gatunków i szczepów Trichoderma z patogenami roślin, a w szczególności z grzybami Fusarium, które zaliczane są do najbardziej istotnych czynników chorobotwórczych zbóż, była znikoma. Pewien wkład w wyjaśnienie tych kwestii wniosły badania wstępne prowadzone przez moich współpracowników z Zespołu. Zespół od kilkunastu lat zajmuje się zagadnieniami związanymi z chorobami zbóż wywoływanymi 3

5 przez grzyby z rodzaju Fusarium izolacją i identyfikacją gatunkową patogenów i ich metabolitów (mikotoksyn), a także poszukiwaniem metod zapobiegania występowania fuzarioz (głównie fuzariozy kłosów pszenicy, jęczmienia, pszenżyta i fuzariozy kolb kukurydzy), a w konsekwencji metod ograniczania syntezy i akumulacji mikotoksyn fuzaryjnych w płodach rolnych. Badania Zespołu prowadzone w kierunku poszukiwania nowych metod biologicznej ochrony zbóż przed patogenami Fusarium wykazały, że w grupie mikroorganizmów zdolnych do ograniczania syntezy mikotoksyn fuzaryjnych znajdują się szczepy z gatunku Trichoderma atroviride i Trichoderma longibrachiatum (Buśko i in., 2008; Popiel i in., 2008). Istotny dla podjęcia dalszych badań okazał się fakt, iż jeden z tych szczepów został wyizolowany w Polsce. W oparciu o dostępną literaturę stwierdzono, iż brak jest dostatecznej wiedzy na temat występowania, ekologii i bioróżnorodności gatunkowej grzybów Trichoderma, podpartej wynikami analiz morfologicznych, molekularnych i biochemicznych szerokiego spektrum izolatów, pochodzących z różnych nisz ekologicznych w Polsce. W świetle tego, jak również na podstawie wyników pilotażowych prowadzonych w Zespole w zakresie oddziaływań Trichoderma z toksynotwórczymi gatunkami Fusarium, sformułowane zostały dwa następujące cele badawcze: 1. Identyfikacja gatunkowa grzybów Trichoderma pochodzących z różnych biotopów w Polsce. 2. Ocena zdolności antagonistycznych polskich szczepów Trichoderma względem toksynotwórczych gatunków Fusarium. Cel 1. Identyfikacja gatunkowa grzybów Trichoderma pochodzących z różnych biotopów w Polsce. W 2011 roku International Subcommission on the Taxonomy of Trichoderma and Hypocrea (ISTH, opublikowała listę 104 gatunków zaklasyfikowanych do rodzaju Trichoderma zarówno na podstawie cech morfologicznych, jak i danych molekularnych. Lista ta została zaktualizowana i obecnie podaje liczbę 254 gatunków Trichoderma oraz obowiązujących je nazw (Bissett i in., 2015). Odnotowano, iż ponad 75 z tych gatunków lub kompleksów gatunków występuje w Europie (Jaklitsch 2009; 2011). Gatunki te zostały zidentyfikowane głównie w Austrii, Niemczech, Holandii i Wielkiej Brytanii. Natomiast informacji na temat bioróżnorodności gatunkowej Trichoderma w Polsce było jak dotąd niewiele. Jedyne źródło danych stanowiła krytyczna lista grzybów mikroskopijnych Polski (Mułenko i in., 2008), w której wyszczególniono 20 gatunków Trichoderma. Warto jednak podkreślić, iż gatunki te zostały wyizolowane w latach i zidentyfikowano je na podstawie cech morfologicznych. Identyfikacja gatunkowa Trichoderma w oparciu o analizę morfologiczną jest jednak niezwykle trudna i może być obarczona dużym błędem. Większość gatunków lub grup gatunków z rodzaju Trichoderma wykazuje duże podobieństwo pod względem budowy fialid, systemu rozgałęzień konidioforów, cech zarodników, czy wzroście kolonii (Samuels, 2006). Dlatego też w coraz większej liczbie prac zaczęto korzystać z danych molekularnych, a dokładnie z analizy sekwencji wybranych genów lub fragmentów DNA (Druzhinina i in., 2005). W celu zautomatyzowania metod identyfikacji gatunków Trichoderma w oparciu o dane sekwencyjne oraz kontroli i weryfikacji licznych danych zamieszczanych w bazie NCBI GenBank (National Center for Biotechnology Information, International Commission on the Taxonomy of Fungi (ICTF) powołała podkomisję do spraw taksonomii Hypocrea/Trichoderma (ISTH, 4

6 Utworzona została lokalna baza danych sekwencji nukleotydowych dla gatunków Trichoderma oraz opracowano i udostępniono narzędzia oraz programy do analizy tych danych, takie jak TrichOKey, TrichoBLAST i TichoMARK (Druzhinina i in., 2005; Kopchinskiy i in., 2005; Głównymi markerami filogenetycznymi stosowanymi w identyfikacji gatunkowej Trichoderma są markery oparte na analizie sekwencji regionu ITS1 i ITS2 rrna (ang. internally transcribed spacer regions 1 and 2 of the rrna gene cluster) oraz sekwencji czwartego i piątego intronu genu tef1 (ang. translation elongation factor 1-alpha gene) kodującego elongacyjny czynnik translacyjny 1- alfa (Kopchinskiy i in. 2005; Druzhinina i in. 2005, W przypadku identyfikacji nowych gatunków istnieje konieczność przeprowadzenia dodatkowych analiz sekwencyjnych, takich genów jak: rpb2 kodujący podjednostkę b polimerazy RNA II, cal1 kodujący kalmodulinę oraz chi18-5 kodujący endochitynazę 42 (ISTH, W związku z powyższym, pierwszym etapem podjętych przeze mnie badań była izolacja grzybów Trichoderma z różnych substratów i lokalizacji w Polsce oraz ich identyfikacja gatunkowa na podstawie morfologii i danych molekularnych. W pracy pozyskano łącznie 385 izolatów Trichoderma. Zostały one wyizolowane z próchniejącego drewna (Błaszczyk i in., 2011 PH1; Jeleń i in., 2014 PH4; Błaszczyk i in., 2016 PH5), gleby i ryzosfery roślin (Błaszczyk i in., 2011 PH1), upraw pieczarek i boczniaków, w tym z kompostu i ścian budynków (Błaszczyk i in., 2011 PH1; Błaszczyk i in., 2013 PH2) oraz z ziarniaków zbóż (Błaszczyk i in PH1). Próby drewna z objawami korozji zebrano z 12 lokalizacji z parków i lasów Polski. Próby z upraw pieczarek i boczniaków zebrano z ponad 80 lokalizacji w Polsce. Natomiast próby gleby leśnej i rolniczej oraz ziarniaków zbóż pochodziły z 6 lokalizacji. Na podstawie analizy morfologicznej oraz analizy sekwencji regionu ITS1-5.8S-ITS2 rrna i fragmentu genu tef1 zidentyfikowano 19 gatunków, a mianowicie: Trichoderma aggressivum Samuels & W. Gams, Trichoderma atroviride P. Karst., Trichoderma citrinoviride Bissett, Trichoderma cremeum P. Chaverri & Samuels, Trichoderma gamsii Samuels & Druzhin., Trichoderma hamatum (Bonord.) Bain., Trichoderma koningii Oudem., Trichoderma koningiopsis Samuels, C. Suárez & H.C. Evans, Trichoderma longibrachiatum Rifai, Trichoderma longipile Bissett, Trichoderma sp. (Hypocrea parapilulifera B.S. Lu, Druzhin. & Samuels), Trichoderma pleurotum S.H. Yu & M.S. Park, Trichoderma pleuroticola S.H. Yu & M.S. Park, Trichoderma polysporum Rifai, Trichoderma virens (J.H. Miller, Giddens & A.A. Foster), Trichoderma viride Schumach., Trichoderma tomentosum Bissett oraz kompleks gatunków Trichoderma harzianum i Trichoderma viridescens. W przypadku gatunków T. pleurotum i T. pleuroticola, wstępnej identyfikacji dokonano na podstawie analizy markerów gatunkowo-specyficznych typu PCR-multiplex, opracowanych dla tych grzybów (Błaszczyk i in., 2013 PH2). W związku z najnowszymi danymi z zakresu taksonomii kompleksu gatunków T. harzianum (Chaverri i in., 2015) i T. viridescens (Jaklitsch i in., 2013), przeprowadzono dodatkowe analizy sekwencji fragmentu genu tef1 dla izolatów pochodzących z południowej części Polski (Błaszczyk i in., 2016 PH5). Na tej podstawie, w grupie izolatów z kompleksu T. harzianum zidentyfikowano 2 gatunki, a mianowicie: Trichoderma atrobrunneum F.B. Rocha, P.Chaverri & W. Jaklitsch i Trichoderma harzianum Rifai. Natomiast z grupy izolatów z kompleksu T. viridescens, wyodrębniono 3 gatunki: Trichoderma viridarium Jaklitsch, Samuels & Voglmayr, Trichoderma trixiae Samuels & Jaklitsch i Trichoderma paraviridescens Jaklitsch, Samuels & Voglmayr. Gatunkiem/kompleksem gatunków najliczniej (76 izolatów) reprezentowanym był T. harzianum (Błaszczyk i in., 2011 PH1; Błaszczyk i in., 2013 PH2; Błaszczyk i in., 5

7 2016 PH5). Źródłem izolatów z tego kompleksu były głównie próby skorodowanego drewna zebrane z lasów i parków w centralnej i zachodniej części Polski (Błaszczyk i in., 2011 PH1). Gatunki z kompleksu T. harzianum uważano za jedne z najpowszechniej występujących na świecie gatunków Trichoderma, których obecność stwierdzono w różnych ekosystemach i niszach ekologicznych. W roku 2015 została zrewidowana taksonomia tego kompleksu, na podstawie której wyodrębniono co najmniej 14 gatunków (Chaverri i in., 2015). Dwa z tych gatunków, a mianowicie T. harzianum Rifai i T. atrobrunneum zostały zidentyfikowane w pracy Błaszczyk i in. (2016 PH5). Według Chaverri i in. (2015), gatunki te występują jedynie w Europie i Ameryce Północnej. Należy dodać, iż T. harzianum Rifai został wyizolowany jak dotąd z gleby i kompostu do uprawy pieczarek, natomiast T. atrobrunneum ze skorodowanego drewna, innych grzybów i również z gleby (Chaverri i in. 2015). Drugim, licznie (66 izolatów) reprezentowanym gatunkiem, wyizolowanym z gleby leśnej, kompostu i drewna z objawami korozji był T. viride (Błaszczyk i in., 2011 PH1; Jeleń i in., 2014 PH4; Błaszczyk i in., 2016 PH5). W odróżnieniu od kompleksu T. harzianum, głównym źródłem izolatów tego gatunku były próby drewna zebrane z lasów w południowej części Polski, a mianowicie z Tatrzańskiego Parku Narodowego, Gorczańskiego Parku Narodowego i Karkonoskiego Parku Narodowego (Błaszczyk i in., 2016 PH5). Trichoderma viride wraz z blisko spokrewnionym kompleksem gatunków T. viridescens występuje powszechnie w północnej i południowej strefie klimatu umiarkowanego Europy (Austria, Czechy, Anglia, Francja, Niemcy, Irlandia Północna, Rosja, Szwecja), Japonii, Kanady, USA i Nowej Zelandii (Samuels 2006; Jaklitsch i in. 2006; Jaklitsch 2011). Natomiast spośród trzech gatunków z kompleksu T. viridescens (T. viridarium, T. trixiae, T. paraviridescens), zidentyfikowanych w prezentowanych obecnie badaniach, najpowszechniej występującym gatunkiem w Europie jest T. paraviridescens (Jaklitsch i in., 2013). Trichoderma viridarium został zidentyfikowany do tej pory w części południowej Europy, a T. trixiae jedynie w Niemczech (Jaklitsch i in., 2013). Gatunkami reprezentowanymi przez niewielką liczbę izolatów, a nawet przez pojedyncze izolaty, których występowanie było ograniczone tylko do określonej lokalizacji i/lub substratu, były: T. longibrachiatum (4 izolaty), T. gamsii (4 izolaty), T. longipile (2 izolaty), T. koningiopsis (2 izolaty), T. pleuroticola (2 izolaty), T. cremeum (1 izolat), T. polysporum (1 izolat) i T. tomentosum (1 izolat) (Błaszczyk i in., 2011 PH1; Błaszczyk i in., 2013 PH2; Błaszczyk i in., 2016 PH5). Obecność gatunków: T. longibrachiatum, T. gamsii, T. koningiopsis i T. polysporum została odnotowana zarówno w Europe, jak i w obu Amerykach, Australii i Azji (Kubicek i in., 2003; Zhang i in., 2005; Carvajal i in., 2009; Jaklitsch 2009, 2011; Belayneh Mulaw i in., 2010; Hoyos-López-Quintero i in., 2013), przy czym T. longibrachatum i T. koningiopsis wyizolowano głównie z regionów o klimacie ciepłym i tropikalnym. Natomiast obecność T. longipile stwierdzono jedynie w Europie i Ameryce Północnej (Kubicek i in., 2008). Wartym uwagi wydaje się również fakt, iż jak dotąd w Europie nie odnotowano występowania gatunku T. cremeum. Dane literaturowe wskazują, iż jedynie jego stadium płciowe (teleomorfa Hypocrea cremea) zostało znalezione w Ameryce Północnej i Nowej Zelandii (Chaverri i in., 2003). W prezentowanych obecnie badaniach, jedyny izolat (AN392) z tego gatunku uzyskano z drewna z objawami korozji zebranego w górach Gorce (Błaszczyk i in PH5). Również unikalnym izolatem jest AN471, uzyskany ze skorodowanego drewna zebranego w Tatrzańskim Parku Narodowym (Błaszczyk i in. 2016, PH5). Przypuszcza się, iż izolat ten jest stadium bezpłciowym (anamorfą) bardzo rzadkiego gatunku Hypocrea parapilulifera, zidentyfikowanego jedynie w Europie i Ameryce Północnej (Jaklitsch, 2011). Natomiast w dotychczasowych pracach opisujących gatunek T. tomentosum brak jest danych na temat miejsca jego występowania 6

8 (Bisset, 2015). W niniejszych badaniach jedyny izolat z tego gatunku uzyskano z gleby, z Wielkopolskiego Parku Narodowego (Błaszczyk i in., 2011 PH1) Wśród gatunków, które zidentyfikowano w obecnych badaniach, a które reprezentowane były przez znikomą liczbę izolatów jest T. pleuroticola (Błaszczyk i in., 2013 PH2). Dwa izolaty z tego gatunku zostały pozyskane ze słomy zbożowej stanowiącej podłoże do uprawy boczniaków, zebranej z dwóch różnych lokalizacji (Babimost i Widzim Stary, wschodnia część Polski). Z danych literaturowych wynika, iż obecność grzybów z tego gatunku wykryto zarówno na owocnikach boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.) w środowisku naturalnym, jak i w warunkach uprawowych, w tym na podłożu produkcyjnym (Park i in., 2004a, b; Szekeres i in., 2005; Hatvani i in., 2007; Komoń-Żelazowska i in., 2007; Kredics i in., 2009). Gatunek ten jest patogenem wywołującym tzw. zieloną pleśń (ang. green mould disease) u boczniaka ostrygowatego (Park i in., 2004a, b, 2006; Komoń-Żelazowska i in., 2007). Drugim gatunkiem, również uznanym za patogena boczniaka ostrygowatego i wywołującym zieloną pleśń, jest T. pleurotum (Park i in., 2004a, b, 2006; Komoń-Żelazowska i in., 2007). W odróżnieniu od T. pleuroticola, nie stwierdzono obecności tego grzyba w środowisku naturalnym (Park i in., 2004a, b; Szekeres i in., 2005; Hatvani i in.; 2007; Komoń-Żelazowska i in., 2007; Kredics i in., 2009). W niniejszych badaniach 47 izolatów zidentyfikowano jako T. pleurotum (Błaszczyk i in., 2013 PH2). Wszystkie te izolaty uzyskano z podłoży (słomy zbożowej) do produkcji boczniaka, pochodzących z 47 różnych farm w Polsce. Analiza porównawcza uzyskanych sekwencji nukleotydowych regionu ITS1/ITS2 rrna z sekwencjami pozyskanymi z bazy danych GenBank NCBI ( wykazała, że wszystkie polskie izolaty T. pleurotum reprezentują jeden haplotyp, identyczny z haplotypem szczepów T. pleurotum pochodzących z Węgier (C.P.K.2113, C.P.K. 2096, C.P.K. 2097, C.P.K. 2100, C.P.K. 2116, C.P.K. 2117) i Rumunii (C.P.K. 2814) (Błaszczyk i in., 2013 PH2). Natomiast analiza porównawcza sekwencji fragmentu genu tef1 ujawniła występowanie dwóch haplotypów (oznaczonych umownie jako: T i N ) w kolekcji izolatów T. pleurotum pochodzących z Polski. Ponadto, analizy sekwencji tef1 wykazały, że szczepy haplotypu T są identyczne w badanym regionie DNA ze szczepami wyizolowanymi na Węgrzech i w Rumunii. Izolaty haplotypu N posiadają natomiast unikalny allel (Błaszczyk i in., 2013 PH2). Podobne badania, przeprowadzone dla 2 szczepów T. pleuroticola wykazały, że szczepy te są identyczne ze szczepem C.P.K. 1540, pochodzącym z Włoch (Błaszczyk i in., 2013 PH2) i różnią się od szczepów pochodzących z Węgier i Rumunii. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano, że dystrybucja obydwu typów ( T i N ) izolatów T. pleurotum nie była skorelowana z lokalizacją farm w Polsce, z których pochodziły badane izolaty. Zdaniem Komoń-Żelazowskiej i in. (2007), źródłem zakażenia upraw boczniaka grzybami T. pleurotum jest podłoże produkcyjne. Przypuszcza się zatem, iż rozmieszczenie tych dwóch haplotypów T. pleurotum w Polsce, związane jest z pochodzeniem (producentem) podłoża stosowanego przez farmerów w uprawach boczniaków. Podobnie, ze względu na obrót (import-eksport) podłoży produkcyjnych do uprawy boczniaka wśród krajów europejskich, można wyjaśnić identyczność polskich izolatów T. pleurotum typu T do szczepów zidentyfikowanych na Węgrzech i w Rumunii. Niestety, tego typu założenia nie są uzasadnione w przypadku gatunków T. pleuroticola, ponieważ do tej pory droga szerzenia się infekcji tych grzybów nie została poznana. Wiadomym jest tylko to, że gatunek T. pleuroticola występuje zarówno w środowisku naturalnym jak i uprawowym boczniaka, a zatem źródła infekcji tego patogena mogą być różne (Kredics i in., 2009). Podobny natomiast mechanizm dystrybucji szczepów zaobserwowano w przypadku gatunku T. aggressivum f. europaeum, który jest patogenem pieczarki dwuzarodnikowej Agaricus bisporus (J.E. Lange) (Hatvani i in. 2007; Komoń- 7

9 Żelazowska i in. 2007). Wykazano, że głównym źródłem infekcji T. aggressivum jest kompost stosowany do uprawy pieczarek. Warto dodać, że gatunku tego, podobnie jak T. pleurotum nie zidentyfikowano do tej pory w środowisku naturalnym. W Polsce, T. aggressivum został po raz pierwszy opisany jako sprawca zielonej pleśni pieczarek przez Szczech i in. (2008). Obecne badania molekularne, oparte o analizę sekwencji nukleotydowych regionu ITS1-5.8S-ITS2 rrna, potwierdziły występowanie gatunku T. aggressivum na uprawach pieczarek w Polsce (Błaszczyk i in., 2011 PH1). Dodatkowo, na podstawie analizy porównawczej uzyskanych sekwencji nukleotydowych wyodrębniono w grupie izolatów T. aggressivum trzy haplotypy (określone umownie A1, A2, A3) (Błaszczyk i in., 2011 PH10), charakterystyczne dla T. aggressivum f. europaeum (Hatvani i in., 2007). W prezentowanych badaniach wykazano ponadto, że uprawy pieczarek i boczniaków w Polsce są źródłem również innych gatunków Trichoderma. Z upraw pieczarek kompostu i ścian budynków wyizolowano takie gatunki jak: T. atroviride, T. citrinoviride, T. harzianum, T. longibrachiatum, T. viride i T. virens (Błaszczyk i in., 2011 PH1). Wśród izolatów T. pleurotum i T. pleuroticola pochodzących z upraw boczniaków, zidentyfikowano także T. atroviride i T. harzianum (Błaszczyk i in., 2013 PH2). Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że cennym źródłem gatunków Trichoderma w Polsce, w tym gatunków rzadkich, jest gleba. Dwadzieścia dwa izolaty pozyskane z tego siedliska reprezentowały aż 9 gatunków (T. atroviride, T. citrinoviride, T. gamsii, T. hamatum, T. harzianum, T. polysporum, T. tomentosum, T. viride i T. viridescens). Jednakże za siedlisko (mikrosiedlisko) o najwyższej bioróżnorodności w odniesieniu do gatunków Trichoderma uznano drewno z objawami korozji, zebrane w lasach i parkach Polski. Najwyższy poziom różnorodności gatunkowej i ich równocenność, a także stosunkowo równomierne rozmieszczenie gatunków zaobserwowano w Tatrzańskim Parku Narodowym, Gorczańskim Parku Narodowym i Karkonoskim Parku Narodowego (wskaźniki Shannona: H =1.53 i E= 0.62, wskaźnik Simpsona: D=0.67; Błaszczyk i in., 2016 PH5) oraz w lasach i parkach w Wielkopolsce (wskaźniki Shannona: H = 1.75 i E = 0.8, wskaźnik Simpsona: D = 0.77; dane nie opublikowane, Błaszczyk i in., 2011 PH1). Co więcej, mikrosiedlisko to stanowiło źródło rzadkich gatunków, w tym gatunku T. cremeum, który, jak z danych literaturowych wynika, nie był do tej pory zidentyfikowany w Europie (Błaszczyk i in., 2016 PH5). Cel 2. Ocena zdolności antagonistycznych polskich szczepów Trichoderma względem toksynotwórczych gatunków Fusarium. Grzyby Fusarium zaliczane są do najbardziej istotnych czynników chorobotwórczych zbóż (Chełkowski, 1998; Bottalico i Perrone, 2002; Kiecana i in., 2006). Najgroźniejszą i najważniejszą pod względem ekonomicznym chorobą powodowaną przez Fusarium ssp. jest fuzarioza kłosów obserwowana u pszenicy, jęczmienia, pszenżyta i żyta (Gilbert i Haber, 2013; Wiśniewska i in., 2014) oraz fuzarioza kolb kukurydzy (Czembor i in., 2014). Fuzarioza kłosów/kolb określana jest kompleksem chorobowym, gdyż wywołuje ją kilka gatunków Fusarium, w tym: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium cerealis, Fusarium temperatum i Fusarium proliferatum (Goetze i in., 2010; Amarasinghe i in., 2014; Czembor i in., 2014). Gatunki te są producentami mikotoksyn, takich jak: trichoteceny (TCTs), fumonizyny (FBs), zearalenon (ZEN), bouwerycyna (BEA) i moniliformina (MON) (Jestoi, 2008; Goetze i in., 2010; Stępień i in., 2011; Stępień, 2014). Dlatego też fuzarioza kłosów i kolb poza tym, że obniża znacząco plon i pogarsza wartość odżywczą i technologiczną ziarna, powoduje również zanieczyszczenie ziarna szkodliwymi dla zdrowia ludzi i zwierząt mikotoksynami (Glen i in., 2007). 8

10 W kierunku ograniczenia występowania fuzariozy kłosów u zbóż i zminimalizowania ryzyka akumulacji toksycznych metabolitów w ziarniakach oraz produktach zbożowych i paszach podejmowane są różnorodne podejścia i strategie (Palazzini i in., 2007). Obecnie, za jedną z bardziej atrakcyjnych ekonomicznie i ekologicznie opcji, uznaje się ochronę biologiczną. Metoda ta polega na wykorzystaniu mikroorganizmów (tzw. czynników kontroli biologicznej BCA), które redukują negatywne skutki działania patogenów i/lub indukują reakcje odpornościowe u roślin. Do takich mikroorganizmów należą również grzyby z rodzaju Trichoderma (Woo i in., 2014). Wielokrotnie udowodniono, że grzyby te posiadają potencjał antagonistycznym względem fitopatogenów Fusarium. Niewiele jednak z tych prac dotyczyło oddziaływań z toksynotwórczymi gatunkami Fusarium (Błaszczyk i in., 2016 PH6). W związku z powyższym, podjęto badania zmierzające do określenia zdolności antagonistycznych różnych gatunków Trichoderma, również tych, które do tej pory nie były rozpatrywane w kontekście biologicznej ochrony roślin, względem toksynotwórczych patogenów Fusarium (Jeleń i in., 2014 PH4; Błaszczyk i in., 2016 PH5, Błaszczyk i in., 2016 PH6). W badaniach wykorzystano kolekcję polskich szczepów Trichoderma, które uzyskano w wyniku prac omówionych w pierwszej części tego rozdziału. Ponadto, wykorzystano 8 szczepów Fusarium, należących do kolekcji własnej IGR PAN, reprezentujących różne gatunki [F. avenaceum KF 2818, F. cerealis KF 1157, F. culmorum KF 846, KF 350, KF 2795, F. graminearum KF 2870, F. proliferatum KF 925, F. temperatum (F. subglutinans) KF 506] oraz różne chemotypy (Stępień i in., 2011; Wiśniewska i in., 2014; Jeleń i in., 2014 PH4; Błaszczyk i in., 2016 PH6). Aktywność antagonistyczna grzybów Trichoderma została określona na podstawie: (i) analizy wpływu szczepów Trichoderma i ich metabolitów na wzrost i zarodnikowanie gatunków Fusarium; (ii) oceny zdolności szczepów Trichoderma do hamowania biosyntezy mikotoksyn fuzaryjnych; (iii) obserwacji mikroskopowych oddziaływań szczepów Trichoderma Fusarium w bikulturach na podłożach laboratoryjnych (Jeleń i in., 2014 PH4, Błaszczyk i in., 2016 PH6). W wyniku przeprowadzonych eksperymentów zaobserwowano dużą zmienność w poziomie aktywności biologicznej pomiędzy gatunkami Trichoderma, jak również pomiędzy szczepami w obrębie gatunku, w stosunku do danego gatunku patogena. Co więcej, ten sam szczep Trichoderma wykazywał odmienny poziom aktywności antagonistycznej, w zależności od szczepu Fusarium. Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad oddziaływaniem grzybów Trichoderma z takimi patogenami jak: Rhizoctonia solani, Sclerotinia rolfsii, czy Sclerotinia sclerotiorum (Amin i in., 2010; Anees i in., 2010; Dubey i in., 2007; Inch i Gilbert, 2007; Schöneberg i in., 2015;. Shaigan i in., 2008; Qualhato i in., 2013). Świadczy to prawdopodobnie o unikalnym charakterze odziaływań patogen-antagonista, specyficznym dla danego układu szczepów. Należy jednak mieć na uwadze, że na typ interakcji mogą mieć również wpływ warunki doświadczalne (warunki hodowli kultur grzybowych), co zostało ostatnio opisane przez Schöneberg i in. (2015). Testy w bikulturach na pożywce agarowej wykazały zdolność kilkunastu szczepów Trichoderma (AN152, AN240, AN497, AN262, AN277, AN143, AN251, AN213, AN359, AN401, AN430, AN826, AN323) do inhibicji wzrostu wszystkich badanych gatunków Fusarium (F. avenaceum, F. cerealis, F. culmorum, F. graminearum i F. temperatum) w pierwszych dniach ko-inkubacji (Błaszczyk i in., 2016 PH6). Procent tej inhibicji szacował się od 1 do 80, w zależności od szczepu Trichoderma i gatunku patogena. Niektóre szczepy Trichoderma wykazały również zdolność do przerastania grzybni patogena i zarodnikowania na niej. Warto podkreślić, że jeden z badanych szczepów, a mianowicie 9

11 T. atroviride AN240, hamował wzrost wszystkich gatunków Fusarium, zanim doszło do kontaktu obu grzybni w bikulturze. W dalszym okresie hodowli szczep AN240 przerastał grzybnię patogena, a następnie produkował na niej zarodniki. Co więcej, obserwacje mikroskopowe strefy kontaktu grzybni T. atroviride AN240 i gatunków Fusarium ujawniły zdolność szczepu AN240 do tworzenia kolistych struktury wokół strzępek patogenów. W konsekwencji tego obserwowano proces wakuolizacji i plazmolizy strzępek Fusarium. Występowanie tego samego zjawiska odnotowano w bikulturach T. viride AN255 z F. graminearum. Tworzenie przez grzyb antagonistyczny spiralnych struktur wokół strzępek patogena uznaje się za wskaźnik jego potencjalnych zdolności do mykopasożytnictwa (Benitez i in., 2004; Schöneberg i in., 2015). Mechanizm mykopasożytnictwa wiąże się bowiem z bezpośrednim kontaktem antagonisty z patogenem i składa z takich etapów jak: rozpoznanie patogena, atak, stopniowa penetracja komórek patogena i jego śmierć. W procesie tym dużą rolę odgrywają enzymy lityczne (chitynazy, glukanazy, proteazy i in.) syntetyzowane przez grzyb antagonistyczny, które umożliwiają hydrolityczny rozpad ścian komórkowych patogena (Druzhinina i in., 2011; Verma i in., 2007). Kwestia zdolności polskich szczepów Trichoderma do produkcji enzymów litycznych, rozpatrywana była w pracy Błaszczyk i in. (2016 PH5) oraz stanowiła część pracy doktorskiej p. Judyty Strakowskiej (2015; Załącznik nr 3, III.K.), której byłam promotorem pomocniczym. W badaniach Błaszczyk i in. (2016 PH5) wykorzystano zestaw 119 izolatów Trichoderma uzyskanych z próchniejącego drewna zebranego w lasach polskich gór (Tatry, Karkonosze, Gorce). Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, iż wszystkie badane izolaty Trichoderma charakteryzują się zdolnością do produkcji celulaz i ksylanaz. Zaobserwowano natomiast różnice w poziomie tych aktywności zarówno pomiędzy gatunkami, jak i pomiędzy izolatami w obrębie gatunków. Spośród wszystkich badanych izolatów, najwyższą aktywnością celulolityczną wykazał się izolat AN392 T. cremeum, a także izolaty T. harzianum: AN415, AN394, AN373, AN367, AN312 i izolat AN327 T. gamsii. Najwyższą aktywność ksylanolityczną zaobserwowano u trzech izolatów T. viride: AN813, AN810, AN827 i dwóch izolatów T. viridescens: AN702, AN609. Badania te wykazały rzeczywisty potencjał szczepów Trichoderma pochodzących z drewna z objawami korozji do saprofitycznego stylu odżywiania. Z drugiej strony, u części z tych izolatów stwierdzono również aktywność antagonistyczną względem patogenów Fusarium, w tym zdolność do antybiozy i mykopasożytnictwa (Jeleń i in., 2014 PH4; Błaszczyk i in., 2016 PH6), co niejako potwierdza ostatnie badania i hipotezy na temat ewolucji i zmian w preferencjach żywieniowych oraz stylu życia grzybów Trichoderma (Chaverri i Samuels, 2013). Opis roli enzymów hemi- i celulolitycznych produkowanych przez grzyby Trichoderma w ich oportunistycznym stylu życia został szczegółowo przedstawiony w pracy przeglądowej Strakowska i in. (2013 PH4). Szczepy Trichoderma analizowane były również pod kątem ich zdolności do produkcji glukanaz enzymów bezpośrednio zaangażowanych w hydrolizę ścian komórkowych grzybów (Druzhinina i in., 2011). Podobnie jak w przypadku analizy enzymów hemi- i celulolitycznych, wszystkie izolaty Trichoderma wykazały zdolność do produkcji glukanaz, różniły się jedynie poziomem aktywności tych enzymów (rozprawa doktorska p. Judyty Strakowskiej, 2015; Załącznik nr 3, III.K.). Warto jednak podkreślić, iż w grupie izolatów wykazujących najwyższą aktywność glukanolityczną w danych warunkach, znalazły się dwa szczepy: T. atroviride AN240 i T. viride AN255, u których stwierdzono zdolność do owijania się, a następnie wnikania do wnętrza strzępek patogena (Błaszczyk i in., 2016 PH6). Wyniki te mogą świadczyć zatem o zdolności szczepów T. atroviride AN240 i T. viride AN255 do mykopasożytnictwa względem badanych gatunków Fusarium. 10

12 O właściwościach antagonistycznych grzybów Trichoderma decydują nie tylko mechanizmy konkurencji i mykopasożytnictwa, ale również antybiozy, polegającej na wytwarzaniu metabolitów wtórnych, w tym metabolitów lotnych, które działają hamująco lub letalnie na grzyb pasożytniczy (Verma i in., 2007; Druzhinina i in. 2011). W testach in vitro za przejaw antybiozy uznaje się zdolność do hamowania wzrostu patogena oraz tworzenia tzw. stref inhibicji (Almeida i in., 2007; Qualhato i in., 2013). W prezentowanych badaniach zdolność do inhibicji wzrostu jednego lub kilku gatunków Fusarium wykazała (w różnym zakresie) większość badanych szczepów Trichoderma (Błaszczyk i in., 2016 PH6). W związku z tym podjęto prace mające na celu ocenę zdolności polskich szczepów Trichoderma do produkcji metabolitów lotnych, w szczególności związków o właściwościach anty-grzybowych (Jeleń i in., 2014 PH4). Do badań wybrano 77 szczepów Trichoderma, reprezentujących 8 gatunków (T. atroviride, T. citrinoviride, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. viride, T. viridescens, T. virens). Za pomocą metody SPME GC-MS (ang. solid phase microextraction, gas chromatography-mass spectrometry) zidentyfikowano łącznie w kulturach tych mikroorganizmów ponad 40 metabolitów lotnych (Jeleń i in., 2014 PH4). Według wiedzy autora, siedemnaście z tych związków (linalol isobutyrate, 2-methyl-1- propenyl benzene, trans-2-(1-pentenyl)-furan, cis-2-(1-pentenyl)-furan, ethyl decanoated, ethyl octanoate, 2-heptanol, β-pinene, α-pinene, 1-pentanol, cyclohept-3-en-1-one, pyridine, methyl benzoate, 2-hexanone, geranyl acetone, 3-ethyl-5-methylphenol, 2-pentanone) po raz pierwszy opisano jako metabolity Trichoderma. Porównanie profili wszystkich metabolitów lotnych uzyskanych dla poszczególnych szczepów Trichoderma wykazało duże ich zróżnicowanie wewnątrz- i międzygatunkowe. Co więcej, nie zaobserwowano takich związków, które byłyby wspólne dla wszystkich gatunków, ani takich, które byłyby gatunkowo-specyficzne. Podobne spostrzeżenia odnotowano w pracach dotyczących chemotaksonomii grzybów z rodzaju Penicillium i Aspergillus (Sunesson i in., 1995; Fiedler i in., 2001; Polizzi i in., 2012). Obecne badania wykazały, że gatunkiem najefektywniejszym pod względem produkcji metabolitów lotnych jest T. atroviride (Jeleń i in., 2014 PH4). Wszystkie szczepy z tego gatunku produkowały 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one (6-PAP) metabolit o charakterystycznym kokosowym zapachu i właściwościach anty-grzybowych (Vinale i in., 2008), przy czym najwyższy poziom tego metabolitu wykryto w kulturze szczepu T. atroviride AN35 po 6 godzinach inkubacji na pożywce PDA. Obecność 6-PAP stwierdzono również w kulturach szczepów T. viride, T. viridescens, T. citrinoviride i T. hamatum (Jeleń i in., 2014 PH4). Warto podkreślić, że trzy z tych gatunków, a mianowicie: T. viridescens, T. citrinoviride i T. hamatum, nie były jak dotąd rozpoznane jako producenci 6-PAP. Dane literaturowe wskazują, że 6-PAP działa hamująco na wzrost grzybów chorobotwórczych, takich jak: Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Fusarium verticilioides, Phytophthora megasperma, Rhizoctonia solani (Vinale i in., 2008). Stwierdzono również, że metabolit ten ogranicza syntezę deoksyniwalenolu przez F. graminearum oraz wpływa stymulująco na wzrostu i odporność roślin (Cooney i in., 2001; Vinale i in., 2008; El-Hassan i Buchennauer, 2009). W prezentowanych obecnie badaniach zaobserwowano inhibicyjny wpływ oczyszczonego 6-PAP na wzrost 7 szczepów Fusarium, takich jak: F. avenaceum KF 2818, F. cerealis KF 1157, F. culmorum KF 846 i KF 350, F. graminearum KF 2870, F. proliferatum KF 925 oraz F. subglutinans (obecnie F. temperatum) KF 506 (Jeleń i in., 2014 PH4). Testy wykazały, że 6-PAP redukcje wzrost wszystkich szczepów Fusarium, przy czym zakres jego działania (% redukcji, czas) jest różny i zależy od stężenia tego metabolitu (Jeleń i in., 2014 PH4). Niemniej jednak, wyniki te pozwalają sądzić, że stwierdzona na podstawie testów w bikulturach zdolność szczepów Trichoderma do inhibicji wzrostu gatunków Fusarium (Błaszczyk i in PH6) jest 11

13 efektem antybiozy i zdolności tych szczepów do produkcji metabolitów lotnych o działaniu anty-grzybowym (Jeleń i in., 2014 PH4). Badania w bikulturach na pożywkach agarowych pozwoliły na wyselekcjonowanie 5 szczepów Trichoderma (T. atroviride AN152 i AN240, T. koningiopsis AN251, T. viride AN255 i AN430) o najwyższych aktywnościach antagonistycznych względem różnych gatunków Fusarium. Następnie, na podstawie testów w bikulturach na ryżu, dokonano oceny zdolności tych szczepów do redukcji syntezy mikotoksyn (ZEN, DON, 15-AcDON, 3- AcDON, NIV, MON, BEA) przez grzyby Fusarium (Błaszczyk i in., 2016 PH6). Zawartość mikotoksyn analizowano metodą HPLC po 21 dniach hodowli w pojedynczych kulturach (Trichoderma lub Fusarium) i bikulturach (Trichoderma/Fusarium) na ryżu. Gatunki Fusarium wykorzystane w badaniach reprezentowały następujące chemotypy: F. avenaceum KF 2818 MON; F. cerealis KF 1157 NIV; F. culmorum KF 2795 DON, NIV, ZEN, 3-AcDON; F. graminearum KF 2870 DON, NIV, ZEN, 15-AcDON; F. temperatum KF 506 MON, BEA. Zaobserwowano, że wszystkie badane grzyby antagonistyczne powodowały znaczny spadek (21% - 100%) zawartości toksyn w bikulturach, w stosunku do ilości tych toksyn produkowanych w pojedynczych kulturach przez izolaty Fusarium (F. avenaceum KF 2818, F. cerealis KF 1157, F. culmorum KF 846 i KF 350, F. graminearum KF 2870, F. proliferatum KF 925, F. temperatum KF 506). Wyjątek stanowił szczep T. viride AN430, który indukował produkcję ZEN u F. graminerum KF Warto dodać, że synteza pozostałych toksyn (DON, 15-AcDON i NIV) przez F. graminearum KF 2795 była ograniczana w obecności szczepu AN430. Z badań Matarese i in. (2012) wynika, że redukcja syntezy mikotoksyn w bikulturach jest związana z redukcją biomasy grzybów Fusarium przez Trichoderma. W przypadku szczepu AN430 przypuszcza się, że obecność tego antagonisty mogła stymulować F. graminearum do selektywnej nadprodukcji ZEN (Elmholt i in., 2008). Przeprowadzone badania pozwoliły na wyselekcjonowanie szczepów o wysokim potencjale antagonistycznym, takich jak: T. atroviride AN35, T. atroviride AN152, T. atroviride AN240, T. koningiopsis AN251 i T. viride AN255, charakteryzujących się zdolnością do inhibicji wzrostu różnych gatunków/szczepów Fusarium i redukcji poziomu syntezy mikotoksyn fuzaryjnych w bikulturach na podłożach stałych. Co więcej, wszystkie te szczepy wykazały zdolność do syntezy enzymów litycznych oraz licznych metabolitów lotnych, w tym metabolitów o stwierdzonym działaniu anty-grzybowym. Wyselekcjonowanie szczepy Trichoderma wykorzystane zostały w dalszych pracach nad poznaniem mechanizmów warunkujących zdolność Trichoderma do dekompozycji mikotoksyn fuzaryjnych. Co więcej, w celu potwierdzenia inhibicyjnego wpływu szczepów Trichoderma na wzrost grzybów Fusarium (F. avenaceum, F. culmorum, F. cerealis, F. graminearum i F. temperatum) i określenia zdolności tych szczepów do ograniczania poziomu inokulum patogena oraz akumulacji mikotoksyn fuzaryjnych w tkankach zbóż w warunkach naturalnych, przeprowadzone zostało trzyletnie modelowe doświadczenie polowe. Badania te realizowane były w ramach projektu pt.: Charakterystyka izolatów grzybów z rodzaju Trichoderma i Clonostachys o zdolnościach do rozkładu mikotoksyn fuzaryjnych, którego byłam kierownikiem. W celu określenia typu interakcji pomiędzy daną toksyną, a szczepem grzybów Trichoderma, prowadzone były hodowle kultur grzybowych w pożywkach płynnych z dodatkiem toksyny o znanym stężeniu. Zawartość toksyn w próbach (płyn pohodowlany, grzybnia) oznaczano z użyciem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem fluorescencyjnym i/lub UV oraz MS. Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, iż wszystkie szczepy Trichoderma redukowały (37%-100%) stężenie ZEN, FBs, DON, 3-AcDON i 15-AcDON w pożywce. Nie stwierdzono natomiast wpływu tych grzybów na poziom w pożywce takich toksyn jak: MON, NIV i BEA. Zaobserwowano, 12

14 że niektóre szczepy Trichoderma w czasie hodowli częściowo akumulują w grzybni dodaną do pożywki toksynę. Badania płynów pohodowlanych wykazały, że część z tych szczepów ma zdolność do metabolizowania mikotoksyn fuzaryjnych, głównie ZEN i fumonizyn. Podjęte zostały również prace mające na celu poznanie molekularnych podstaw warunkujących zdolność szczepów Trichoderma do degradacji i transformacji tych mikotoksyn w warunkach in vitro. W związku z obserwowaną zdolnością niektórych szczepów Trichoderma do metabolizowania zearalenonu, odnotowano u Trichoderma aktywność laktonazy zearalenonu oraz zidentyfikowano gen homologiczny do genu kodującego taki enzym u gatunku Clonostachys rosea, u którego po raz pierwszy opisano mechanizm biotransformacji ZEA w nieaktywną estrogennie pochodną (Takahasi-Ando i in., 2002). Wyniki te dyskutowane były w pracy Popiel i in. (2014, Załącznik nr 3, II.A.3), prezentowano je na międzynarodowych i krajowych konferencjach, a także stanowiły zasadniczą część pracy magisterskiej p. Anny Budzyńskiej, której byłam promotorem (Załącznik nr 3, III.J.). Pilotażowe doświadczenie polowe miało na celu określenie potencjału wyselekcjonowanych szczepów Trichoderma w biologicznej ochronie pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) przed fuzariozą kłosów i akumulacją mikotoksyn w ziarniakach. W wyniku przeprowadzonych trzyletnich doświadczeń polowych, odnotowano wzrost (od 0,4 do 37%) średniej masy ziarniaków oraz obniżenie (od 41 do 72%) poziomu toksyn w ziarniakach po zastosowaniu preinokulacji izolatami Trichoderma, w porównaniu z próbami pochodzącymi z poletek inokulowanych samym patogenem. Wyniki tych prac prezentowane były podczas konferencji krajowych i będą opracowane w formie publikacji. Najważniejsze osiągnięcia poznawcze i aplikacyjne zaprezentowanych badań: - Potwierdzenie występowania grzybów Trichoderma w Polsce i ich zróżnicowania gatunkowego: utworzenie kolekcji 385 izolatów Trichoderma pochodzących z sześciu różnych nisz ekologicznych: zidentyfikowanie 19 gatunków lub kompleksów gatunków na podstawie obserwacji morfologicznych oraz analizy sekwencyjnej regionu ITS1-ITS2 rrna oraz fragmentu (4 i 5 intron oraz 6 ekson) genu tef1 kodującego elongacyjny czynnik translacyjny; ustalenie, na podstawie analizy filogenetycznej opartej na sekwencjach nukleotydowych ITS i tef1 pokrewieństwa pomiędzy gatunkami Trichoderma pochodzącymi z Polski a gatunkami, których sekwencje zdeponowano w bazie danych NCBI GenBank i ISTH. - Udokumentowanie występowania w Polsce rzadkiego gatunku T. cremeum, którego jedynie stadium płciowe (teleomorfa H. cremea) wykryto jak dotąd w Ameryce Północnej i Nowej Zelandii. - Udokumentowanie po raz pierwszy, na podstawie obserwacji morfologicznych, analizy sekwencyjnej markerów filogenetycznych i analizy PCR multiplex, występowania w Polsce dwóch patogenicznych gatunków: T. pleurotum i T. pleuroticola oraz wykazanie ich związku z objawami tzw. zielonej pleśni na uprawach boczniaka ostrygowatego. - Określenie, na podstawie analiz molekularnych, zróżnicowania wewnątrzi międzygatunkowego szczepów T. pleurotum i T. pleuroticola wyizolowanych z upraw boczniaka ostrygowatego produkowanego w Polsce i w innych krajach, co wniosło nowe spojrzenie na drogę rozprzestrzeniania się tych patogenów w gospodarstwach europejskich i polskich. 13

15 - Potwierdzenie, na podstawie obserwacji morfologicznych i analizy sekwencyjnej markerów filogenetycznych, występowania w Polsce gatunku T. aggressivum f. europaeum i jego związku z objawami tzw. zielonej pleśni na uprawach pieczarki dwuzarodnikowej. - Określenie zdolności antagonistycznych różnych gatunków i szczepów Trichoderma pochodzących z Polski, względem sześciu toksynotwórczych gatunków Fusarium, takich jak: F. avenaceum, F. cerealis, F. culmorum, F. graminearum, F. proliferatum i F. temperatum; odnotowanie dużej zmienności w poziomie aktywności biologicznej pomiędzy gatunkami i szczepami Trichoderma w stosunku do patogenów Fusarium; wyselekcjonowanie szczepów o wysokim potencjale antagonistycznym, takich jak: T. atroviride AN35, T. atroviride AN152, T. atroviride AN240, T. koningiopsis AN251 i T. viride AN255, charakteryzujących się zdolnością do inhibicji wzrostu różnych gatunków/szczepów Fusarium oraz zdolnością do redukcji poziomu syntezy mikotoksyn fuzaryjnych. - Określenie aktywności celulolitycznych i ksylanolitycznych 119 szczepów Trichoderma, reprezentujących 12 gatunków lub kompleksów gatunków: wykazanie potencjału wszystkich gatunków Trichoderma, które zostały wyizolowane z fragmentów drewna z objawami korozji, do degradacji celulozy (papier filtracyjny Whatman nr 1) i hemicelulozy (ksylan drewna brzozowego) w danych warunkach doświadczalnych; wykazanie po raz pierwszy zdolności gatunków: T. cremeum, T. longipile i H. parapilulifera do produkcji kompleksu celulaz i ksylanaz. - Zbadanie zdolności 77 szczepów Trichoderma, reprezentujących osiem gatunków lub kompleksów gatunków pochodzących z różnych substratów i lokalizacji w Polsce, do produkcji 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one (6-PAP) i innych metabolitów lotnych, z wykorzystaniem metody SPME GC-MS: wykazanie dużego zróżnicowania wewnątrz- i międzygatunkowego pod względem syntezy 6-PAP i innych metabolitów lotnych w danych warunkach doświadczalnych; zidentyfikowanie łącznie ponad 40 metabolitów lotnych produkowanych w kulturach Trichoderma na podłożu PDA - siedemnaście z tych związków po raz pierwszy opisano jako metabolity Trichoderma; wyselekcjonowanie gatunku T. atroviride jako najefektywniejszego producenta 6-PAP i innych metabolitów lotnych na podłożu PDA; wykazanie po raz pierwszy zdolności gatunku T. citrinoviride i T. hamatum do produkcji 6-PAP na podłożu PDA. - Wykazanie inhibicyjnego wpływu 6-PAP na wzrost grzybni 6 gatunków Fusarium (F. avenaceum, F. cerealis, F. culmorum, F. graminearum, F. proliferatum, F. subglutinans/temperatum) na podłożu PDA. W wyniku przeprowadzonych badań utworzona została kolekcja 385 polskich szczepów Trichoderma, reprezentujących 19 gatunków, zidentyfikowanych na podstawie analiz morfologicznych i molekularnych. Prawidłowa identyfikacja gatunków Trichoderma jest niezwykle istotna z uwagi na znaczenie tych grzybów zarówno w rolnictwie ekologicznym, jak i w przemyśle. Mikroorganizmy te mają bowiem szerokie zastosowanie w biologicznej ochronie roślin oraz uznawane są za ważnych producentów enzymów i metabolitów wtórnych, w tym antybiotyków o znaczeniu przemysłowym. Dlatego też, tak scharakteryzowane szczepy stanowią materiał do dalszych badań własnych oraz badań 14