MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA

Transkrypt

1 MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY I POLSKIEGO TOWARZYSTWA MIKROBIOLOGÓW 2 ROK LXIX KWARTALNIK 2017 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

2 MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA Organ Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny i Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów REDAKCJA Redaktor: WALDEMAR RASTAWICKI Zastępca Redaktora: RAFAŁ GIERCZYŃSKI Sekretarz: KATARZYNA ZACHARCZUK Redaktor językowy (język polski): STANISŁAW KAŁUŻEWSKI Redaktor językowy (język angielski): MARIA DOMINGUEZ Redaktor statystyczny: DANIEL RABCZENKO KOMITET REDAKCYJNY D. Dzierżanowska - Warszawa, S. Giedrys-Kalemba - Szczecin, E. Gołąb - Warszawa, E. Gospodarek - Bydgoszcz, P.B. Heczko - Kraków, A. Jaworski - Łódź, B. Litwińska - Warszawa, K. Piekarska - Warszawa, B. Różalska - Łódź, A. Stankiewicz - Warszawa, E.M. Szewczyk - Łódź, A. Szkaradkiewicz - Poznań, J. Szych - Warszawa, E.A. Trafny - Warszawa, S. Tyski - Warszawa, M.L. Zaremba - Białystok, A.A. Zasada - Warszawa, Z. Zwolska - Warszawa Adres Redakcji: Warszawa, ul. Chocimska 24 medmikrobiol@pzh.gov.pl Tel: ; Fax: Indeks Punktacja za publikację wg MNiSW 7 pkt. Index Copernicus 89,77 pkt. Kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia jest indeksowany w bazie danych pn. Polska Bibliografia Lekarska (PBL). NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY Skład i druk: Agencja Reklamowa TOP, ul. Toruńska 148, Włocławek, tel.: , fax: ,

3 SPIS TREŚCI PRACE ORYGINALNE R. Kotłowski. Identyfikacja 20 nowych rejonów zmiennych w genomach Staphylococcus aureus przydatnych do genotypowania koagulazo- -dodatnich gronkowców...93 M. Rzeczkowska, K. Piekarska, T. Wołkowicz, K. Semczuk, T. Kamińska, R. Gierczyński. Współwystępowanie plazmidowo kodowanych mechanizmów oporności: DHA-7, CTX-M-15, qnrb6 i aac(6 )-Ib-cr u pałeczek Klebsiella pneumoniae wytwarzających nabyte AmpC W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst. Występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek i lipopolisacharydów werotoksycznych pałeczek Escherichia coli (VTEC) w poszczególnych podklasach IgG u dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym A. Trzcińska, A. Częścik, B. Łagosz, J. Siennicka. Wirus krowianki (MVA) jako model wirusowy w badaniu wirusobójczej aktywności środków dezynfekcyjnych wobec wirusów osłonkowych V. Świżak, Ś. Dejneka, V. Chornous, V. Świżak, A. Azarov. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe 5-funkcjonalizowanych pochodnych imidazolu PRACE POGLĄDOWE K. Skonieczna-Żydecka, I. Łoniewski, W. Marlicz, B. Karakiewicz. Mikrobiota jelitowa jako potencjalna przyczyna zaburzeń funkcjonowania emocjonalnego człowieka M. Aptekorz, G. Martirosian. Metody mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń Clostridium difficile...177

4 CONTENTS ORIGINAL ARTICLES R. Kotłowski. Identification of 20 new variable regions in the genomes of Staphylococcus aureus useful for genotyping coagulase-positive staphylococci M. Rzeczkowska, K. Piekarska, T. Wołkowicz, K. Semczuk, T. Kamińska, R. Gierczyński. Co-existence of plasmid-mediated resistance: DHA-7, CTX-M-15, qnrb6 and aac(6 )-Ib-cr among acquired AmpC-producing Klebsiella pneumoniae W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst. Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to recombinant proteins and lipopolysaccharides of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) in children with haemolytic-uraemic syndrome A. Trzcińska, A. Częścik, B. Łagosz, J. Siennicka. Vaccinia virus (MVA) as a virus model in the study of virucidal activity of disinfectants against enveloped viruses V. Świżak, Ś. Dejneka, V. Chornous, V. Świżak, A. Azarov. Antimicrobial properties of 5-functionalized imidazole derivatives REVIEWS K. Skonieczna-Żydecka, I. Łoniewski, W. Marlicz, B. Karakiewicz. Gut microbiota and its potential contribution to human emotional disorders M. Aptekorz, G. Martirosian. Diagnostic methods for Clostridium difficile infections

5 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Roman Kotłowski Identyfikacja 20 nowych rejonów zmiennych w genomach Staphylococcus aureus przydatnych do genotypowania koagulazo-dodatnich gronkowców Identification of 20 new variable regions in the genomes of Staphylococcus aureus useful for genotyping coagulase-positive staphylococci Katedra Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii, Politechnika Gdańska W pracy zidentyfikowano 20 nowych rejonów zmiennych w genomach gronkowca złocistego przydatnych do badań epidemiologicznych metodą PCR. Teoretyczna analiza 35 genomów metodą PCR z udziałem 20 nowych regionów zmiennych pozwoliła na uzyskanie większej liczby genotypów w porównaniu do dwóch metod referencyjnych: REA-PFGE z udziałem endonukleazy SmaI oraz metody MLVA z udziałem 16 rejonów zmiennych. Słowa kluczowe: Staphylococcus aureus, genotypowanie, REA-PFGE, MLVA ABSTRACT Introduction: Staphylococcus aureus is the most frequently recognized microorganism responsible for hospital infections. Materials and Methods: Thirty five genomes were aligned and screened for the presence of variable regions suitable for PCR in order to design a new genotyping method. For comparative analysis, SmaI-REA-PFGE and MLVA were used. Results: Twenty new regions with various lengths were identified from multiple sequence alignment of the genomic DNA. Subsequently, 20 couples of primers were designed for the amplification of variable regions for the PCR method. Comparative analysis of both PCR genotyping methods and SmaI-REA-PFGE revealed higher number of genotypes for new method with the use of 35 genomic sequences. Conclusions: The simplicity and easy interpretation of the results in the designed PCR method using 20 new variable regions makes it an attractive alternative to SmaI-REA- PFGE and MLVA. Keywords: Staphylococcus aureus, genotyping, REA-PFGE, MLVA.

6 94 R. Kotłowski Nr 1 WSTĘP Gronkowiec złocisty jest gatunkiem najczęściej wywołującym zakażenia szpitalne (2). Z uwagi dużą liczbę toksyn oraz wielolekooporność, szczepy S. aureus stały się głównym problemem medycznym na świecie (1, 3). Z tego też względu, identyfikacja dominujących izolatów S. aureus jest kluczowa w zapobieganiu rozprzestrzeniania się koagulazo-dodatnich gronkowców. Pomimo dużej siły różnicującej metody REA-PFGE (ang. Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis), technika ta nie pozwala na wiarygodne porównywanie wzorów restrykcyjnych uzyskanych w różnych laboratoriach diagnostycznych. Do niedawna, możliwe jedynie było określenie typu fagowego oraz porównanie antybiogramów w epidemiologicznych badaniach dotyczących zakażeń gronkowcami. W 2012 roku, Sobral i wsp. (7) opracowali metodę genotypowania koagulazo-dodatnich gronkowców w oparciu o amplifikację tandemowych powtórzeń DNA, zwaną MLVA (ang. Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis) o porównywalnej sile różnicującej do metody REA-PFGE. W niniejszej pracy, bazującej na porównaniu całych genomów S. aureus, zidentyfikowano nowe rejony zmienne, inne niż w metodzie MLVA, które mogą być alternatywnie wykorzystane w reakcji PCR do różnicowania genomów koagulazo-dodatnich gronkowców. MATERIAŁ I METODY Do porównania 35 genomowych sekwencji uzyskanych z Genbanku NCBI (ang. National Centre for Biotechnology Information) zastosowano program komputerowy MAFFT v (4). Następnie, w zakonserwowanych ewolucyjnie rejonach genomowego DNA okalających rejony zmienne (Rycina 1), zaprojektowano 20 par sekwencji oligonukleotydowych do reakcji PCR (Tabela 1). Dla celów porównawczych zastosowano dwie metody diagnostyczne, metodę REA-PFGE, która obejmowała trawienie genomowego DNA enzymem restrykcyjnym SmaI przy wykorzystaniu programu Clone Manager 7 oraz technikę MLVA według publikacji Sobral i wsp. (7) z udziałem 16 rejonów zmiennych. WYNIKI Teoretyczne wyniki różnicowania z udziałem nowej metody pozwoliły na uzyskanie 23 genotypów (Tabela 2). W metodzie MLVA liczba genotypów była równa 20 (Tabela 3), a dla metody referencyjnej REA-PFGE uzyskano 21 genotypów (Rycina 2), przy punkcie odcięcia prążków równym 10,000 pz oraz homologii genotypów równej 99% dla wszystkich trzech metod. Bardziej wyraźne różnice pomiędzy genotypami uzyskano dla nowej metody genotypowania (Rycina 3) oraz MLVA (Rycina 4). W analizie porównawczej wielkości fragmentów DNA po reakcji PCR obejmującej nową metodę genotypowania oraz MLVA, oznaczone wielkości produktów PCR można rozróżnić na podstawie teoretycznych wartości zawartych w Tabeli 3 oraz Tabeli 4, przy czym większe różnice we wielkościach fragmentów PCR uzyskano dla nowej metody. W szczególności, różnicowanie genomów CP od CP lub CP od CP można wykonać przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym. Warto również zaznaczyć, iż w metodzie MLVA dla trzech szczepów o numerach CP013616, CP oraz CP nie uzyskano fragmentu PCR in silico dla pary starterów o numerze 15, co wskazuje na obecność delecji w rejonie SA2039 dla 3 z 35 analizowanych genomów S. aureus.

7 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 95 Tabela I. Sekwencje par starterów do reakcji PCR występujących na zewnątrz (flankujących) 20 nowych rejonów zmiennych. Table I. Sequences of PCR primers pairs flanking 20 new variable regions. L.p. Sekwencje par starterów oligonukleotydowych zaprojektowane do metody PCR Tm 1. SA1F 5'GTAGAAGCATTACAAGATGATGACTTTGTATTTGAC SA1R 5'CAATAGCCTTTCAAATAATTTAGTGTCAATTTTATTGATATTTGC 62 C (59 C) 2. SA2F 5'CGACCGCAATCCACAAAAGCACAAGCA 68 C SA2R 5'GTGATCACCCCAACCTGTTAATCCGATGT 3. SA3F 5'GTGATTTAACGAGCTTGGGACAGAAAACAAAG 59 C SA3R 5'AGCTATTACTATAAAAAACAGCAGTAAGATATTTCC 4. SA4F 5'GGGATAATTTGAAATCAAATATAACTTTATTCGACAGTTTGAAC SA4R 5'ATCAAATGCTCCCTTCAAAGTAGACATTG 62 C (59 C) 5. SA5F 5'GGATACTTATCAATCATACCTCTTTAACAACAGTGA SA5R 5'CAGAAGATATTAATCAAACAAAACAAGATATCCAAGATACAC 65 C (62 C) 6. SA6F 5'ACCCCATGTATAAGGATATCTGAAGTAGATTG SA6R 5'CATTAGCCATTGCAGTGGCAAGCA 65 C (62 C) 7. SA7F 5'GCTGAGATAATTTAATGAATCTCAGAACTCCTTTTG SA7R 5'CTAAATAGCTCACTCGCTACACCTCG 65 C (59 C) 8. SA8F 5'GCATAAGGGAGTGGGACAGAAATGA 65 C SA8R 5'GAGGGAGCCTAGGATAAATTAACGTC 9. SA9F 5'GTAATGGTTCTTCCACATTAGCCAC SA9R 5'GACATCACAATGTCCTAGGCTCTACA 62 C (62 C) 10. SA10F 5'GCAAACATACTTTGCACCTCCTGTATAATAAG SA10R 5'GTAGCTACATACAACCGCTCAAATATAG 62 C (59 C) 11. SA11F 5'ACATTTAAGGTGACCTTCATGCCAA SA11R 5'ACATGTGCCAAGACCACCAGCGA 59 C (59 C) 12. SA12F 5'CATTGATTTCAACATCTTGGTTGGTTTTTTATTTTG SA12R 5'ATGATAGGTGACAAGTATAACAAGACAATTTTGTG 59 C (56 C) 13. SA13F 5'GTTGATCCAATCGGTCAGGATGTCACA SA13R 5'CTTGGCTTACTGTTGGTTCTTGAACG 65 C (59 C) 14. SA14F 5'GAACAATTTGAGTTTGAAAAAGTAGAAATTGATAATGAACC 62 C SA14R 5'GACCGTAACCGCAATACCCATACCTA 15. SA15F 5'CCGCAACAACCAACACCAAAGCCA SA15R 5'ACCTCTTTACACTTGCAATAGTACTATTCTATTTC 62 C (53 C) 16. SA16F 5'GGTGTTAATTTAGCTTGCTTCTGTTTTGCAGC SA16R 5'CGCAACTTGAAGAAACGGTTGCCT 65 C (59 C) 17. SA17F 5'GGTATCAACAAGTGATAGCATCAAATGGAGATAAATTATAAAGG SA17R 5'CTTTGTGACACTAATCATCTACTTAACAATATCG 62 C 56 C 18. SA18F 5'CAATGCCAAGATTATTTATATGGACTTTTAGAGGCT SA18R 5'GACTCTTAAGTTGTAGTCATCTTACTGCTTATTTATGTTTG 65 C (62 C) 19. SA19F 5'CACGCCGTAAAGATGCCTAGATTCCT SA19R 5'GGCTCTTATGCAGTTGGAGCGAAG 68 C (68 C) 20. SA20F 5'TGGTGGTGTAACTCTTGAATCGGAGTC SA20R 5'GAAGTGCTGATGGTGATTCAGCAGTAAATC 68 C (65 C) Na szarym tle wyróżniono nukleotydy odpowiedzialne za tworzenie struktur drugorzędowych lub dimerów pomiędzy parami starterów lub w obrębie dwóch cząsteczek tego samego startera oligonukleotydowego. Tm oznacza temperaturę hybrydyzacji sekwencji starterów z matrycowym DNA podczas reakcji PCR. Highlighted in grey are nucleotides responsible for creation of secondary structures or dimers between primers from one pair or between two molecules of the same primer. Tm indicates hybridization temperature of primers with template DNA during PCR.

8 96 R. Kotłowski Nr 1 Sa1 Sa2 Sa3 Sa4 Sa5 Sa6 Sa7 Nowa metoda Metoda MLVA New method MLVA method Sa18 Sa19 Sa20 Sa17 Sa16 Sa15 Sa1729 Sa13 Sa14 Sa12 Sa8 Sa9 Sa10 Sa11 Sa1291 Sa1194 Sa1132 Sa1097 Sa0964 Sa0684 Sa0704 Sa0550 Sa0266 Sa0387 Sa0311 Sa0122 Sa2511 Sa2039 Sa1866 Lokalizacja sekwencji zmiennych w genomie S. aureus BX Localization of variable regions in S. aureus genome BX Rycina 1. Nowe i poznane już regiony zmienne dla genomu Staphylococcus aureus BX Figure 1. New and already known variable regions for Staphylococcus aureus genome BX

9 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 97 Tabela II. Teoretyczne wielkości amplikonów w parach zasad dla 20 nowych rejonów zmiennych w nowej metodzie genotypowania dla 35 genomów S. aureus. Table II. Theoretical sizes of amplicons in base pairs for 20 new variable regions in new genotyping method for 35 S. aureus complete genomes. Genomy S. aureus S. aureus genomes Zestawy par starterów / Pairs of primers BX CP CP CP CP CP NC_ NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_AP CP CP CP CP CP

10 98 R. Kotłowski Nr 1 UPGMA 21 Genotypów 21 Genotypes 85 87, , ,5 100 CP NZ_CP NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP CP NZ_CP CP NC_ CP CP CP NZ_AP CP CP CP NZ_CP CP CP CP CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 2. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie metody REA- PFGE z udziałem enzymu SmaI. Figure 2. Phylogenetic tree created for 35 S. aureus genomes based on REA-PFGE method using SmaI endonuclease.

11 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 99 Tabela III. Teoretyczne wielkości amplikonów w parach zasad dla 16 rejonów zmiennych w metodzie genotypowania MLVA dla 35 genomów S. aureus. Table III. Theoretical sizes of amplicons in base pairs for 16 variable regions in MLVA genotyping method for 35 S. aureus genomes. Genomy S. aureus Zestawy par primerów / Sets of primers S. aureus genomes BX CP CP CP CP CP NC_ NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_AP CP CP CP CP CP

12 100 R. Kotłowski Nr 1 UPGMA 23 genotypy 23 genotypes NZ_AP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_CP NC_ CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 3. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie nowej metody genotypowania. Figure 3. Phylogenetic tree created for 35 genomes of S. aureus on the basis of new genotyping method.

13 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 101 UPGMA 20 genotypów 20 genotypes CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_CP NC_ CP CP CP CP NZ_AP NZ_CP NZ_CP CP NZ_CP CP CP NZ_AP CP CP CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 4. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie metody MLVA. Figure 4. Phylogenetic tree created for 35 S. aureus genomes based on MLVA method

14 102 R. Kotłowski Nr 1 Przy wyborze sekwencji starterowych flankujących 20 nowych rejonów kierowano się następującymi kryteriami: (i) obecnością co najmniej 11 par GC w każdej sekwencji starterowej, (ii) obecnością jak największej liczby nukleotydów G lub C w obu sekwencjach starterowych, w celu minimalizacji oddziaływań pomiędzy cząsteczkami tego samego startera oligonukleotydowego lub dwóch różnych. Trzymanie się tych kryteriów doboru sekwencji starterowych umożliwia prowadzenie etapu hybrydyzacji z matrycowym DNA w temperaturze 62 C. Pozwoli to na zmniejszenie występowania niekorzystnych struktur drugorzędowych typu dimer oraz hairpin loop dla jednego lub większej liczby sekwencji starterowych. Ponadto, w celu zapewnienia specyficznej amplifikacji wybranych fragmentów DNA można zastosować termostabilną polimerazę DNA z dodatkiem przeciwciał blokującej aktywność enzymu poniżej 60 C lub termostabilną polimerazę uwięzioną w kapsułkach żelatynowych (5). Zapobiegnie to niepożądanym modyfikacjom sekwencji starterowych zawierających niekorzystne struktury w temperaturze poniżej 60 C. Optymalizacja techniki Multiplex-PCR z udziałem nowych sekwencji starterowych wymaga empirycznego sprawdzenia z powodu dużej liczby kombinacji oddziaływań pomiędzy sekwencjami starterów a matrycowym DNA. DYSKUSJA Analiza porównawcza wielkości fragmentów DNA po reakcji PCR dla nowej metody genotypowania oraz techniki MLVA prowadzona będzie na podstawie wyboru teoretycznych wartości przedstawionych w tabeli II i tabeli III. Zaletą nowej metody w porównaniu do techniki MLVA jest większa specyficzność amplifikacji DNA wynikająca z większej liczby par GC w sekwencjach starterowych. Pozwoli to na prowadzenie etapu annealingu sekwencji starterowych z matrycowym DNA w temperaturze 62 C, bez konieczności stosowania mniej specyficznej amplifikacji DNA metodą touchdown, jak to ma miejsce w metodzie genotypowania MLVA (7). Inną zaletą nowej, bardziej swoistej metody genotypowania, będzie możliwość wykrywania mieszanych zakażeń w przypadku uzyskania dwóch lub większej liczby prążków DNA zgodnych z oszacowaniem teoretycznym dla specyficznych regionów zmiennych. Biorąc pod uwagę (i) stopień złożoności oznaczania wyników genotypowania w metodzie SmaI-REA-PFGE spowodowany różną interpretacją wyników w poszczególnych laboratoriach (6) (ii) błędnie zaprojektowane sekwencje starterowe otaczające rejon zmienny Sa2039 w metodzie MLVA, oraz (iii) mniej specyficzną amplifikację DNA w metodzie MLVA (przebiegającej w nieco niższej temperaturze annealingu), można stwierdzić iż proponowana nowa metoda genotypowania koagulazo-dodatnich gronkowców z udziałem nowych sekwencji starterowych, będzie lepszą alternatywą w porównaniu do obu metod referencyjnych, jak i w porównaniu do fagotypowania (wykonywanego jedynie w wybranych ośrodkach referencyjnych). PIŚMIENNICTWO 1. Couvé-Deacon E, Mons F, Garnier F i inni. Neonatal Outbreak of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Clone Geraldine: A Bundle of Measures to Halt Transmission. Infect Control Hosp Epidemiol 2017; 38:

15 Nr 1 Genotypowanie S. aureus Dzierżanowska D. Patogeny bakteryjne zakażeń szpitalnych. W: Zakażenia szpitalne. Red. D.Dzierżanowska. Wydawnictwo α-medica press, Bielsko-Biała, 2008, Kaïret K, Ho E, Van Kerkhoven D i inni. USA300, A strain of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus, crossing Belgium s borders: outbreak of skin and soft tissue infections in a hospital in Belgium. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017; 36: Katoh K, Misawa K, Kuma K i inni. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res 2002; 15: Poddar SK, Sawyer MH, Connor JD. Evaluation of PCR assays in presence of antibody to thermostable DNA polymerases for detection of microbial agents: avoiding false negative results for specimen containing low-titer agent. J Clin Lab Anal 1998; 12: Pomorska-Wesołowska M, Małyszek K, Romaniszyn D i inni. Molekularna charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z zakażeń miejsca operowanego u pacjentów południowej Polski. Med Dosw Microbiol 2017; 69: Sobral D, Schwarz S, Bergonier D i inni. High throughput multiple locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) of Staphylococcus aureus from human, animal and food sources. PLoS One 2012; 7:e Otrzymano: 4 I 2017 Autor Autora: Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12, Katedra Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii, romkotlo@pg.gda.pl.

16

17 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Identification of 20 new variable regions in the genomes of Staphylococcus aureus useful for genotyping coagulase-positive staphylococci Roman Kotłowski Department of Molecular Biotechnology and Microbiology, University of Gdansk ABSTRACT Introduction: Staphylococcus aureus is the most frequently recognized microorganism responsible for hospital infections. Methods: Thirty five genomes were aligned and screened for the presence of variable regions suitable for PCR in order to design a new genotyping method. For comparative analysis, SmaI-REA-PFGE and MLVA were used. Results: Twenty new regions with various lengths were identified from multiple sequence alignment of the genomic DNA. Subsequently, 20 couples of primers were designed for the amplification of variable regions for the PCR method. Comparative analysis of both PCR genotyping methods and SmaI-REA-PFGE revealed higher number of genotypes for new method with the use of 35 genomic sequences. Conclusions: The simplicity and easy interpretation of the results in the designed PCR method using 20 new variable regions makes it an attractive alternative to SmaI-REA-PFGE and MLVA. Key words: Staphylococcus aureus, genotyping, SmaI-REA-PFGE, MLVA INTRODUCTION Staphylococcus aureus is the most common species causing nosocomial infections (2). Because of high number of toxins and multidrugresistance S. aureus strains become a major medical problem worldwide (1, 3). For this reason, determination of S. aureus dominant isolates is crucial for preventing its spread. However, in spite of high discriminatory power Restriction Enzyme Analysis Pulsed Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) often used in the differentiation of Staphylococcus aureus, has not been reliable in comparing the restriction patterns between the various diagnostic laboratories. Until 2012, it had only been possible to determine the phage type and compare antibiograms, universal markers in epidemiological studies on staphylococcal infections. In 2012, a new method for genotyping coagulase-positive staphylococci was presented: Multiple-Loci Variable-number of tandem repeats Analysis (MLVA), with a differentiating strength similar to REA-PFGE (7). In the present work based on multiple genomes alignment we identified new variable regions in the genomes of S. aureus other than those used in MLVA which can alternatively be used in PCR to differentiate the genomes of coagulase-positive staphylococci.

18 106 R. Kotłowski Nr 1 MATERIAL AND METHODS The comparison of 35 genomic sequences obtained from the NCBI Genbank (National Centre for Biotechnology Information) was performed with MAFFT v computer software (4). Then, in evolutionarily conserved regions of genomic DNA surrounding the 20 new variable regions (Figure 1), we designed 20 pairs of oligonucleotide sequences for PCR (Table I). For comparison, we used the reference method REA-PFGE which involved the digestion of genomic DNA with the restriction enzyme SmaI (on Clone Manager 7 software), and MLVA with 16 variable regions (7). Tabela I. Sekwencje par starterów do reakcji PCR występujących na zewnątrz (flankujących) 20 nowych rejonów zmiennych. Table I. Sequences of PCR primers pairs flanking 20 new variable regions. L.p. Sekwencje par starterów oligonukleotydowych zaprojektowane do metody PCR Tm 1. SA1F 5'GTAGAAGCATTACAAGATGATGACTTTGTATTTGAC SA1R 5'CAATAGCCTTTCAAATAATTTAGTGTCAATTTTATTGATATTTGC 62 C (59 C) 2. SA2F 5'CGACCGCAATCCACAAAAGCACAAGCA 68 C SA2R 5'GTGATCACCCCAACCTGTTAATCCGATGT 3. SA3F 5'GTGATTTAACGAGCTTGGGACAGAAAACAAAG 59 C SA3R 5'AGCTATTACTATAAAAAACAGCAGTAAGATATTTCC 4. SA4F 5'GGGATAATTTGAAATCAAATATAACTTTATTCGACAGTTTGAAC SA4R 5'ATCAAATGCTCCCTTCAAAGTAGACATTG 62 C (59 C) 5. SA5F 5'GGATACTTATCAATCATACCTCTTTAACAACAGTGA SA5R 5'CAGAAGATATTAATCAAACAAAACAAGATATCCAAGATACAC 65 C (62 C) 6. SA6F 5'ACCCCATGTATAAGGATATCTGAAGTAGATTG SA6R 5'CATTAGCCATTGCAGTGGCAAGCA 65 C (62 C) 7. SA7F 5'GCTGAGATAATTTAATGAATCTCAGAACTCCTTTTG SA7R 5'CTAAATAGCTCACTCGCTACACCTCG 65 C (59 C) 8. SA8F 5'GCATAAGGGAGTGGGACAGAAATGA 65 C SA8R 5'GAGGGAGCCTAGGATAAATTAACGTC 9. SA9F 5'GTAATGGTTCTTCCACATTAGCCAC SA9R 5'GACATCACAATGTCCTAGGCTCTACA 62 C (62 C) 10. SA10F 5'GCAAACATACTTTGCACCTCCTGTATAATAAG SA10R 5'GTAGCTACATACAACCGCTCAAATATAG 62 C (59 C) 11. SA11F 5'ACATTTAAGGTGACCTTCATGCCAA SA11R 5'ACATGTGCCAAGACCACCAGCGA 59 C (59 C) 12. SA12F 5'CATTGATTTCAACATCTTGGTTGGTTTTTTATTTTG SA12R 5'ATGATAGGTGACAAGTATAACAAGACAATTTTGTG 59 C (56 C) 13. SA13F 5'GTTGATCCAATCGGTCAGGATGTCACA SA13R 5'CTTGGCTTACTGTTGGTTCTTGAACG 65 C (59 C) 14. SA14F 5'GAACAATTTGAGTTTGAAAAAGTAGAAATTGATAATGAACC 62 C SA14R 5'GACCGTAACCGCAATACCCATACCTA 15. SA15F 5'CCGCAACAACCAACACCAAAGCCA SA15R 5'ACCTCTTTACACTTGCAATAGTACTATTCTATTTC 62 C (53 C) 16. SA16F 5'GGTGTTAATTTAGCTTGCTTCTGTTTTGCAGC SA16R 5'CGCAACTTGAAGAAACGGTTGCCT 65 C (59 C) 17. SA17F 5'GGTATCAACAAGTGATAGCATCAAATGGAGATAAATTATAAAGG SA17R 5'CTTTGTGACACTAATCATCTACTTAACAATATCG 62 C 56 C 18. SA18F 5'CAATGCCAAGATTATTTATATGGACTTTTAGAGGCT SA18R 5'GACTCTTAAGTTGTAGTCATCTTACTGCTTATTTATGTTTG 65 C (62 C) 19. SA19F 5'CACGCCGTAAAGATGCCTAGATTCCT SA19R 5'GGCTCTTATGCAGTTGGAGCGAAG 68 C (68 C) 20. SA20F 5'TGGTGGTGTAACTCTTGAATCGGAGTC SA20R 5'GAAGTGCTGATGGTGATTCAGCAGTAAATC 68 C (65 C)

19 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 107 Sa1 Sa2 Sa3 Sa4 Sa5 Sa6 Sa7 Nowa metoda Metoda MLVA New method MLVA method Sa18 Sa19 Sa20 Sa17 Sa16 Sa15 Sa1729 Sa13 Sa14 Sa12 Sa8 Sa9 Sa10 Sa11 Sa1291 Sa1194 Sa1132 Sa1097 Sa0964 Sa0684 Sa0704 Sa0550 Sa0266 Sa0387 Sa0311 Sa0122 Sa2511 Sa2039 Sa1866 Lokalizacja sekwencji zmiennych w genomie S. aureus BX Localization of variable regions in S. aureus genome BX Rycina 1. Nowe i poznane już regiony zmienne dla genomu Staphylococcus aureus BX Figure 1. New and already known variable regions for Staphylococcus aureus genome BX

20 108 R. Kotłowski Nr 1 Tabela II. Teoretyczne wielkości amplikonów w parach zasad dla 20 nowych rejonów zmiennych w nowej metodzie genotypowania dla 35 genomów S. aureus. Table II. Theoretical sizes of amplicons in base pairs for 20 new variable regions in new genotyping method for 35 S. aureus complete genomes. Genomy S. aureus S. aureus genomes Zestawy par starterów / Pairs of primers BX CP CP CP CP CP NC_ NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_AP CP CP CP CP CP

21 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 109 UPGMA 21 Genotypów 21 Genotypes 85 87, , ,5 100 CP NZ_CP NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP CP NZ_CP CP NC_ CP CP CP NZ_AP CP CP CP NZ_CP CP CP CP CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 2. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie metody REA- PFGE z udziałem enzymu SmaI. Figure 2. Phylogenetic tree created for 35 S. aureus genomes based on REA-PFGE method using SmaI endonuclease.

22 110 R. Kotłowski Nr 1 Tabela III. Teoretyczne wielkości amplikonów w parach zasad dla 16 rejonów zmiennych w metodzie genotypowania MLVA dla 35 genomów S. aureus. Table III. Theoretical sizes of amplicons in base pairs for 16 variable regions in MLVA genotyping method for 35 S. aureus genomes. Genomy S. aureus Zestawy par primerów / Sets of primers S. aureus genomes BX CP CP CP CP CP NC_ NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_AP CP CP CP CP CP

23 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 111 UPGMA 23 genotypy 23 genotypes NZ_AP CP CP CP CP NZ_AP CP CP NZ_CP NZ_CP CP NZ_CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_CP NC_ CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 3. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie nowej metody genotypowania. Figure 3. Phylogenetic tree created for 35 genomes of S. aureus on the basis of new genotyping method.

24 112 R. Kotłowski Nr 1 RESULTS The theoretical results of differentiation using the 20 new variable regions showed 23 genotypes (Table II). Using MLVA the number of genotypes was also 20 (Table III), while for the reference method SmaI-REA-PFGE it was only 21 (Figure 2), assuming the size of DNA fragments 10,000 bp and that genotypes are identical when they showed 99% homology for all three methods. Much clearer results, allowing a very good differentiation of the tested genotypes, were obtained with the use of PCR in the 20 new variable regions (Figure 3) and with MLVA (Figure 4). In the comparative analysis of the sizes of DNA fragments after PCR involving the new genotyping method and MLVA, the detected DNA fragments can be discriminated on the basis of the selection of theoretical sizes (Table II and Table III). Higher size-variation between PCR bands was obtained for new genotyping method. Especially, differentiation of genomes CP from CP or CP from CP can be done using simple agarose electrophoresis. At the same time, it is worth noting that for the variable region Sa2039 using MLVA (for three strains with codes CP013616, CP and CP013621) we did not obtain a PCR fragment in silico, which suggests the presence of deletions in the analyzed region of chromosome for three out of the 35 analyzed genomes of S. aureus (Table III). The selection of primer sequences surrounding the 20 new variable regions was made by the following principles: (i) the presence of at least 11 GC pairs in each primer sequence, and (ii) the presence of the greatest possible number of G or C nucleotides in the forward primer sequence and, respectively, the highest presence of C or G nucleotides in reverse sequences. After inversion of reverse primer there will be no possibility to create unfavorable structures only between G or only between C nucleotides present in both primers. The application of these criteria makes it feasible to introduce the stage of annealing primer sequences to the template DNA at minimum temperature 62 C, which will reduce the number of undesirable hairpin loops and dimers for one or a pair of oligonucleotide primers. Furthermore, in order to ensure specific amplification of a selected DNA fragment of S. aureus using the proposed primer sequences, we suggest to use thermostable DNA polymerase with the addition of antibodies (5) blocking the activity of the enzyme at a temperature below 60 C, or thermo-stable polymerase trapped in gelatin capsules. This will prevent the modification of primer sequences that are prone to create unfavorable structures before the entire mixture for PCR reaches a temperature of 60 C. The multiplex-pcr for the designed new pairs of primer sequences requires empirical evidence due to too many combinations of interactions between the oligonucleotide primers. DISCUSSION The advantage of the proposed new method of genotyping S. aureus strains over MLVA is the higher specificity of DNA amplification resulting from a greater number of GC pairs in starter sequences. This will permit primer sequence annealing to the template DNA of S. aureus at 62 C during all cycles of DNA amplification, without using the less specific touchdown technique during the amplification of variable regions in MLVA (7). Another advantage of the new more specific genotyping method is the possibility of detecting mixed infections, in the case of obtaining two or more DNA amplification products for specific variable regions that will be in agreement with theoretical estimation.

25 Nr 1 Genotypowanie S. aureus 113 UPGMA 20 genotypów 20 genotypes CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP CP NZ_CP NC_ CP CP CP CP NZ_AP NZ_CP NZ_CP CP NZ_CP CP CP NZ_AP CP CP CP CP BX Procent podobieństwa / Percent Similarity 99% Rycina 4. Drzewo filogenetyczne utworzone dla 35 genomów S. aureus na podstawie metody MLVA. Figure 4. Phylogenetic tree created for 35 S. aureus genomes based on MLVA method

26 114 R. Kotłowski Nr 1 Given (i) the degree of complexity of determination of genotyping results in SmaI- REA-PFGE caused by the difficulty in interpreting and comparing results between laboratories (6), (ii) incorrectly designed primer sequences surrounding the variable region Sa2039 in MLVA, (iii) less specific DNA amplification in MLVA (occurring at a slightly lower annealing temperature), and (iv) lower number of genotypes in MLVA, it can be assumed that the proposed new method of genotyping of coagulase-positive staphylococci with the participation of 20 new variable regions may be a better alternative compared to both reference methods, as well as in comparison to phagotyping (performed only in selected reference centers). REFERENCES 1. Couvé-Deacon E, Mons F, Garnier F et al. Neonatal Outbreak of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Clone Geraldine: A Bundle of Measures to Halt Transmission. Infect Control Hosp Epidemiol 2017; 38: Dzierżanowska D. Patogeny bakteryjne zakażeń szpitalnych. W: Zakażenia szpitalne. Red. D. Dzierżanowska. Wydawnictwo α-medica press, Bielsko-Biała, 2008, Kaïret K, Ho E, Van Kerkhoven D et al. USA300, A strain of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus, crossing Belgium s borders: outbreak of skin and soft tissue infections in a hospital in Belgium. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017; 36: Katoh K, Misawa K, Kuma K et al. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res 2002; 15: Poddar SK, Sawyer MH, Connor JD. Evaluation of PCR assays in presence of antibody to thermostable DNA polymerases for detection of microbial agents: avoiding false negative results for specimen containing low-titer agent. J Clin Lab Anal 1998; 12: Pomorska-Wesołowska M, Małyszek K, Romaniszyn D et al. Molekularna charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z zakażeń miejsca operowanego u pacjentów południowej Polski. Med Dosw Microbiol 2017; 69: Sobral D, Schwarz S, Bergonier D et al. High throughput multiple locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) of Staphylococcus aureus from human, animal and food sources. PLoS One 2012; 7: e Received: 4 I 2017 Author`s Address: Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12, Katedra Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii, romkotlo@pg.gda.pl.

27 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Współwystępowanie plazmidowo kodowanych mechanizmów oporności: DHA-7, CTX-M-15, qnrb6 i aac(6 )-Ib-cr u pałeczek Klebsiella pneumoniae wytwarzających nabyte AmpC Co-existence of plasmid-mediated resistance: DHA-7, CTX-M-15, qnrb6 and aac(6 )-Ib-cr among acquired AmpC-producing Klebsiella pneumoniae Rzeczkowska Magdalena 1 *, Piekarska Katarzyna 1, Wołkowicz Tomasz 1, Semczuk Katarzyna 2, Kamińska Teresa 3, Gierczyński Rafał 1 1 Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, Zakład Bakteriologii, Warszawa 2 Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka, Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Warszawa 3 Mazowieckie Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy, Laboratorium Mikrobiologiczne, Otwock Gram-ujemne pałeczki Klebsiella pneumoniae są jednym z dominujących etiologicznych czynników zakażeń szpitalnych. Często napotykanym problemem w terapii zakażeń wywoływanych przez te pałeczki jest ich narastająca oporność, w tym na antybiotyki ß laktamowe i fluorochinolony. Celem pracy była ocena współwystępowania wybranych, kodowanych plazmidowo mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe i fluorochinolony u pałeczek K. pneumoniae wytwarzających nabyte cefalosporynazy typu AmpC. Przeprowadzone badania wskazują na zdolność szpitalnych szczepów pałeczek K. pneumoniae do nabywania i akumulacji genów kodujących mechanizmy oporności tj. pampc, ESBL i PMQR. Fakt akumulowania PMQR, AmpC i ESBL stanowić może formę skutecznej odpowiedzi na presję selekcyjną wynikłą ze skojarzonego stosowania ß laktamów i fluorochinolonów w lecznictwie. Słowa kluczowe: Klebsiella pneumoniae, plazmidowo-kodowane cefalosporynazy typu AmpC, pampc, ESBL, PMQR ABSTRACT Introduction: Increasing antimicrobial resistance, especially towards third and fourth generation cephalosporins, aminoglycosides and fluoroquinolones have been reported last decade and poses serious therapeutic problems with treating K. pneumoniae infections in humans. Extended-spectrum β lactamases (ESBLs) constitute the predominant mechanism of

28 116 M. Rzeczkowska i inni Nr 1 acquired antibiotic resistance to β lactams. During the past few years, increasing occurrence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases (pampcs) was increasingly reported. Moreover, plasmid-mediated quinolone-resistance (PMQR) has been reported in co-existence with pampcs and ESBLs. Therefore, the aim of our study was to analyse the diversity of ESBLs and plasmid-mediated PMQR among K. pneumoniae pampc-producing isolates. Material and Methods: Twenty-two clinical isolates of K. pneumonia resistant to third-generation cephalosporins were prospectively collected in 3 hospitals in the Warsaw city and suburbs, Poland during period of 3-months. AmpCs and ESBLs were detected by phenotypic methods: sensitivity to cefoxitin, disk potentiation test (DPT) and duble-disk synergy test (DDST). MICs of 8 antimicrobial agents were determined by E-test. pampc, ESBL, QNR and QepA genes were detected by PCR and DNA sequencing. The aac(6 )-Ib was detected by PCR, the presence of aac(6 )-Ib-cr gene variant was identified by digestion of the PCR product with BtsCI. PFGE with XbaI endonuclease was performed to investigate the clonality of the tested isolates. Results: Five of 22 tested isolates of K. pneumoniae produced AmpC β-lactamases of DHA family. All the isolates were found to co-produce extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) of CTX-M-15 family. Furthermore, 4 of the AmpC producing isolates were positive for PMQR determinants. Two of them carried sole aac(6 )-Ib-cr variant gene while the remaining 2 isolates harbored qnrb6 in addition to the aac(6 )-Ib-cr variant. No clonality was found by XbaI-PFGE. Conclusions: Accumulation of plasmid-mediated AmpC, ESBL and PMQR resistance traits by K. pneumoniae may be the ad hoc strategy to cope with the third generation beta-lactams and fluoroquinolones. Horizontal transfer seem to play the primary role in dissemination of these resistance traits among K. pneumoniae. Key words: Klebsiella pneumoniae, plasmid-encoded AmpC cephalosporinases, pampc, ESBL, PMQR WSTĘP Należące do rodziny Enterobacteriaceae, Gram-ujemne pałeczki Klebsiella pneumoniae stanowią jeden z dominujących czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Znaczącym problemem w terapii zakażeń wywoływanych przez te drobnoustroje jest ich narastająca oporność na antybiotyki z grupy ß-laktamów, aminoglikozydów i fluorochinolonów. Dane EARS-Net wskazują, że w Polsce w latach nastąpił wzrost z 37,1% do 52,5% szczepów K. pneumoniae opornych jednocześnie na cefalosporyny III generacji, aminoglikozydy i fluorochinolony (7). Oporność na cefalosporyny III generacji jest przede wszystkim warunkowana wytwarzaniem przez szczep β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL (ang. extended-spectrum beta-lactamase) i/lub cefalosporynaz AmpC. Mechanizmy te są istotne ze względu na potencjał szybkiego rozprzestrzeniania, bowiem kodujące je geny są zwykle przenoszone na ruchomych elementach genetycznych takich jak plazmidy (1, 12, 21, 33). Jak dotąd, najbardziej rozpowszechnionym nabytym mechanizmem oporności na antybiotyki β laktamowe wytwarzanym przez pałeczki Enterobacteriaceae są enzymy typu ESBL, zwłaszcza należące do rodziny CTX-M (1, 2). Niemniej jednak, w ostatnich latach wzrosło także znaczenie cefalosporynaz typu AmpC, zwłaszcza tych kodowanych plazmidowo pampc (ang. plasmid-mediated AmpC β lactamase) (12, 16, 17, 19, 26). Wytwarzanie

29 Nr 1 Mechanizmy oporności K. pneumoniae AmpC+ 117 tych nabytych enzymów AmpC stwierdzano głównie u Klebsiella sp., Escherichia coli, Salmonella sp. i Proteus mirabilis. Są to gatunki które nie wytwarzają chromosomalnie kodowanych cefalosporynaz typu AmpC z wyjątkiem niektórych szczepów E. coli wytwarzających konstytutywnie chromosomalne AmpC na bardzo niskim poziomie ekspresji. Plazmidowo kodowane β laktamazy pampc, podobnie do ESBL, hydrolizują szerokie spektrum antybiotyków β laktamowych, w tym penicyliny, oksyimino-cefalosporyny, cefamycyny i aztreonam (12, 33). Ze względu na znaczne zróżnicowanie aktywności enzymów pampc, w praktyce laboratoryjnej przydatnym czynnikiem preselekcyjnym jest stwierdzenie oporności badanego szczepu na cefoksytynę (4, 5, 15, 32). Wśród enzymów pampc dotychczas wyodrębniono 8 rodzin: CMY, FOX, ACC, LAT, MIR, ACT, MOX i DHA. U pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae najczęściej spotykane są enzymy z rodzin: CMY, DHA i FOX. Natomiast, wywodzące się od Morganella morganii enzymy DHA, należą do najczęściej występujących pampc u K. pneumoniae (6, 12, 29, 18,19). Jak wskazują dane piśmiennictwa, geny kodujące plazmidowo przenoszone β-laktamazy tj. ESBL i pampc, często współwystępują z innymi plazmidowo kodowanymi mechanizmami oporności, w tym na fluorochinolony (17, 25, 27, 34). Do najczęściej występujących u pałeczek Enterobacteriaceae plazmidowo kodowanych mechanizmów oporności na fluorochinolony - PMQR (ang. plasmid-mediated quinolone resistance) należą: a) białka Qnr (chroniące gyrazę przed działaniem chinolonów), b) AAC(6 )-Ib-cr (wariant acetylotransferazy aminoglikozydowej powodujący oporność na antybiotyki aminoglikozydowe tj. amikacynę, tobramycynę, kanamycynę i hydrofilowe fluorochinolony tj. ciprofloksacynę oraz norfloksacynę) i c) QepA (plazmidowo kodowana pompa błonowa) (27). Powszechnie wiadomo, że nabycie mechanizmu PMQR powoduje jedynie obniżoną wrażliwość na fluorochinolony (MIC ciprofloksacyny 0,25 1 mg/l). Obecność genów warunkujących PMQR sprzyja jednak selekcji mutacji w genach chromosomalnych kodujących podjednostki gyrazy i topoizomerazy IV, przyczyniając się tym samym do wystąpienia oporności na wysokie stężenia fluorochinolonów (25, 27). W Polsce, w odróżnieniu od innych krajów (3, 9, 30, 34, 26), problem współwystępowania plazmidowo - kodowanych mechanizmów AmpC, ESBL i PMQR wśród pałeczek K. pneumoniae nie był dotychczas często opisywany. Z tego względu celem prezentowanych badań była ocena współwystępowania wybranych, kodowanych plazmidowo mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe i fluorochinolony u pałeczek K. pneumoniae wytwarzających cefalosporynazy typu pampc. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Materiał do badań stanowiły 22 izolaty K. pneumoniae oporne na cefoksytynę i cefalosporyny trzeciej generacji. Izolaty zostały wyodrębnione z materiału klinicznego od ludzi w trzech szpitalach zlokalizowanych w Warszawie i okolicach. Izolaty te uzyskano w okresie od r. do roku w ramach badania prospektywnego. Przynależność gatunkową i profil lekowrażliwości badanych izolatów określono przy użyciu komercyjnego systemu automatycznego Vitek 2 (BioMérieux, Francja). Szczepy kontrolne. W testach fenotypowych jako kontrole posłużyły szczepy wzorcowe pochodzące z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (American Type Culture Collection ATCC): E. coli ATCC kontrola ujemna (szczep niewytwarzający β-laktamaz, wrażliwy na kwas nalidyksowym i fluorochinolony); E. cloacae

30 118 M. Rzeczkowska i inni Nr 1 ATCC BAA-1143 kontrola wysokiej ekspresji AmpC (szczep wytwarzający na wysokim poziomie chromosomalnie kodowaną β-laktamazę typu AmpC); K. pneumoniae ATCC BAA kontrola niskiej ekspresji AmpC (szczep wytwarzający na niskim poziomie cefalosporynazę z rodziny DHA-1); K. pneumoniae ATCC kontrola dodatnia ESBL (szczep wytwarzający ESBL SHV-18). Do celów kontrolnych posłużono się także szczepami uzyskanymi z kolekcji Narodowego Instytutu Leków: K. pneumoniae 2102/06 - kontrola dodatnia (szczep wytwarzający β-laktamazę DHA-1); P. mirabilis 1662/00 - kontrola dodatnia (szczep wytwarzający β-laktamazę CMY-15). Dodatkowo, w reakcji PCR jako dodatnie kontrole użyto preparaty DNA uzyskane ze szczepów wzorcowych: E. colij53 zawierający plazmid pmg252 (qnra); Salmonella Convallis (qnrb); S. Typhimurium (qnrs); K. pneumoniae (nr. 60) (aac(6 )-Ib-cr) (24); Salmonella Oranienburg (32/01) (bla CTX-M-3 ) (10); K. pneumoniae 2102/06 (bla DHA-1); P. mirabilis 1662/00 (bla CMY-15). Zastosowane testy fenotypowe: 1. U badanych izolatów K. pneumoniae opornych na cefoksytynę i cefalosporyny 3 generacji (n=22) oceniono zdolność wytwarzania β-laktamaz pampc stosując test synergii dwóch krążków - DDST (ang. duble-disk synergy test) i test synergizmu - DPT (ang. disk potentation test) wykonane zgodnie z wcześniej opisaną metodyką (28). W przypadku obu testów, jako inhibitor AmpC zastosowano kwas phenyloboronowy (PBA). 2. Zdolność wytwarzania ESBL określono stosując test DDST (ang. duble-disk synergy test) (14). 3. Oznaczenia wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (MIC) dla amoksycyliny z kwasem klawulanowym (AMC) aztreonamu (ATM), cefoksytyny (FOX), cefotaksymu (CTX), ceftriaksonu (CRO), cefepimu (FEP), kwasu nalidyksowego (NA) oraz ciprofloksacyny (CIP) dokonano przy zastosowaniu pasków z gradientem stężeń antybiotyku (biomerieux). Izolacja plazmidowego DNA. Preparaty plazmidowego DNA przygotowano przy użyciu komercyjnego zestawu Plasmid Mini AX (A&A Biotechnology, Polska) zgodnie z instrukcją producenta. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR). Do wykrycia wybranych genetycznych markerów oporności zastosowano łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) stosując niżej wymienione startery i warunki reakcji: a) Geny kodujące pampc: bla DHA, bla ACC, bla CIT, bla EBC, bla FOX i bla MOX wykrywano stosując startery oraz warunki reakcji multipleks PCR opisane przez Pѐrez-Pѐrez i wsp. (20). Do reakcji sekwencjonowania zastosowano startery opisane uprzednio (31) oraz startery opracowane we własnym zakresie, dla których temperatura przyłączania wynosiła 61 C (DHA-F:5 AATGATCCGGCGGCAAAATACCAG-3 oraz DHA-R: 5 CGACATAGGCGCCGGAACCAGT-3 ). b) Konserwatywnego, rdzeniowego fragmentu genu bla CTX-M, poszukiwano stosując startery oraz warunki reakcji PCR opisane uprzednio (10). Natomiast do reakcji sekwencjonowania genu bla CTX-M zastosowano startery opracowane we własnym zakresie, dla których temperatura przyłączania wynosiła 66 C (CTX- -MLF: 5 -GCTGATGGCGACGGCAACC-3 oraz CTX-MLR: 5-CTAATA- CATCGCGACGGCTTTCTG-3 ).

31 Nr 1 Mechanizmy oporności K. pneumoniae AmpC+ 119 Rycina 1. Zestawienie przewidywanej sekwencji aminokwasowej β-laktamazy pampc z rodziny DHA (DHA-1: GenBank accession no.y16410; DHA-7: GenBank accession no. HQ456945). F fenyloalanina, S seryna.

32 120 M. Rzeczkowska i inni Nr 1 c) Wybrane fragmenty genów PMQR: qnra, qnrb, qnrs, aac(6 )-Ib-cr oraz qepa wykrywano stosując startery i termiczne warunki reakcji PCR opisane uprzednio (22, 23, 24). Dodatkowo, obecność wariantu genu aac(6 )-Ib-cr potwierdzano poprzez analizę restrykcyjną produktu PCR stosując endonukleazę BtsCI (Fermentas, Litwa) według metodyki opisanej uprzednio (23, 24). Sekwencjonowanie. Produkty amplifikacji PCR oczyszczono przy użyciu odczynnika ExoSAP-IT (Affymetrix) a następnie poddano reakcji sekwencjonowania obu nici DNA metodą Sangera (Genomed, Polska). Uzyskane sekwencje nukleotydowe porównywano z sekwencjami referencyjnymi znajdującymi się w bazie GenBank oznaczonymi odpowiednio: Y16410 (DHA-1), HQ (DHA-7), AY (CTX-M-15), EF (QNR B6). Analizę sekwencji nukleotydowych przeprowadzono przy użyciu programu BLAST oraz CLC Sequence Viewer v (CLC Inc., Aartus, Dania). PFGE. Analizy polimorfizmu długości restrykcyjnych fragmentów chromosomalnego DNA dokonano przy użyciu endonukleazy XbaI (Fermentas Life Science) oraz aparatu CHEF DR II (Biorad, USA) zgodnie z warunkami opisanymi uprzednio (24). Analizę stopnia podobieństwa uzyskanych genotypów PFGE prowadzono przy użyciu oprogramowania komputerowego BioNumerics Software v. 6.6 firmy Applied Maths (Belgia) stosując algorytm klasteryzacji UPGMA (ang. unweighted pair group method with arithmetic mean) oraz współczynnik podobieństwa Dice a (zastosowano współczynnik optymalizacji 1,5% i współczynnik tolerancji 1,5%). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Pałeczki K. pneumoniae są jednym z najczęściej izolowanych czynników zakażeń szpitalnych zarówno wśród dorosłych, jak i dzieci. Infekcje przez nie wywoływane stanowią istotny problem terapeutyczny, co jest ściśle związane z narastającą opornością tych drobnoustrojów na różne grupy leków przeciwbakteryjnych. Co więcej, powszechne stosowanie antybiotyków doprowadziło do pojawienia się szczepów kumulujących mechanizmy warunkujące oporność na różne grupy antybiotyków, tzw. szczepów MDR (ang. multidrug resistant). Aktualnie szczepy takie stanowią problem o zasięgu globalnym (7). Większość genów warunkujących oporność na klinicznie istotne grupy antybiotyków, występuje na ruchomych elementach genetycznych, co umożliwia ich szerokie rozprzestrzenianie się wśród szczepów zarówno tego samego gatunku, jak i pomiędzy gatunkami. W ostatnich latach obserwuje się wzrost znaczenia nabytych β-laktamaz typu AmpC (pampc) (12, 16, 19, 15, 26). Ze względu na swe szerokie spektrum substratowe (podobne jak w przypadku ESBL), enzymy typu AmpC odgrywają szczególne znaczenie zwłaszcza wśród gatunków, które nie posiadają chromosomalnie kodowanych cefalosporynaz (12). Pomimo, że wśród Enterobacteriaceae nabyte β-laktamazy pampc wykrywane są na całym świecie, to nie są one jednak tak powszechne jak ESBL (2, 12). Jak wskazują wyniki badań przeprowadzonych przez Mata i wsp. (16), w Hiszpanii, na przestrzeni lat częstość występowania pałeczek Enterobacteriaceae wytwarzających nabyte AmpC wzrosła ponad dwudziestokrotnie z 0,06% w roku 1999 do 1,3% w roku W Irlandii, Roche i wsp. (26) określił częstość występowania pampc wśród izolatów K. pneumoniae na poziomie 3%. Natomiast w Korei Południowej, Park i wsp. (19) stwierdzili, że częstość występowania nabytych cefalosporynaz pampc u K. pneumoniae występuje na poziomie 7,2%.

33 Nr 1 Mechanizmy oporności K. pneumoniae AmpC+ 121 W prezentowanych badaniach wytwarzanie pampc potwierdzono zarówno fenotypowo, jak i genotypowo u 5 izolatów K. pneumoniae (Tabela I), co stanowi 5% łącznej liczby izolatów (n=100) tego gatunku zebranych w trakcie badania prospektywnego w trzech szpitalach (dane niepublikowane). Ponieważ liczba izolatów ze stwierdzonym mechanizmem pampc jest niska a jednocześnie wskazuje ona na wysoki szacunkowy udział (5%) pampc w całkowitej populacji K. pneumoniae dlatego obiektywna ocena tego zjawiska w kraju wymaga zbadania większej liczby szczepów. Rycina 2. Dendrogram genetycznego podobieństwa badanych izolatów K. pneumoniae wytwarzających nabyte AmpC różnicowanych metodą PFGE. Pałeczki K. pneumoniae stanowiące przedmiot naszych badań wytwarzały β laktamazę pampc należącą do rodziny DHA. Uzyskane wyniki są zgodne z obserwacjami innych autorów (3, 6, 18, 19, 29) według których geny bla DHA są jednymi z najczęściej występujących determinant pampc u K. pneumoniae. Jak dotąd, w ogólnodostępnej bazie danych zamieszonej na stronie Lahey Clinic ( zamieszczono 23 warianty sekwencji genu DHA. Wariantem najczęściej stwierdzanym u K. pneumoniae jest DHA-1 (6, 15, 18, 30, 31). W naszych badaniach dominującym wariantem okazał się DHA-7 stwierdzony u 4 z 5 badanych izolatów. Wariant DHA-7 (sekwencja odniesienia: GenBank accession no. HQ456945) różni się od DHA-1 (sekwencja odniesienia: GenBank accession no. Y16410) jedną substytucją Phe340 Ser (F340S). W przypadku jednego izolatu oznaczonego nr. 30 (Tabela I, Rycina 1) nie udało się określić wariantu z zastosowanymi starterami. Szczep ten poddany zostanie dalszym badaniom. Zgodnie z naszą wiedzą, niniejsza praca stanowi pierwsze doniesienie wskazujące na występowanie DHA-7 u pałeczek K. pneumoniae. Jak dotąd, obecność tego wariantu stwierdzono w genomie E. cloacae (18). W prezentowanych badaniach wszystkie badane izolaty K. pneumoniae wytwarzające nabytą β-laktamazę AmpC posiadały również ESBL z rodziny CTX-M. Współwystępowanie tych dwóch mechanizmów oporności było obserwowane przez wielu autorów (17, 9, 11, 30). Aktualnie znanych jest kilkaset enzymów o aktywności ESBL ( org), należących gównie do trzech rodzin TEM, SHV i CTX-M. W Polsce, podobnie jak i w innych krajach na świecie, do najbardziej rozpowszechnionych należą enzymy z rodziny CTX-M (2, 8). Jeszcze w ubiegłej dekadzie w naszym kraju dominował wariant CTX-M-3, jednak w prezentowanych badaniach, podobnie do obserwacji innych autorów, wszystkie badane izolaty K. pneumoniae wytwarzające ESBL typu CTX-M, posiadały gen bla CTX-M-15 warunkujący wytwarzanie β-laktamazy CTX-M-15 (Tabela I).

34 122 M. Rzeczkowska i inni Nr 1 Tabela I. Charakterystyka izolatów K. pneumoniae wytwarzających cefalosporynazy AmpC. Nr izolatu* Materiał ESBL (DDST) FOX 1 (mm) Testy fenotypowe AmpC MIC 4 (mg/l) DPT 2 DDST 3 AMC ATM FOX CTX CRO FEP NA CIP pampc ESBL PMQR PCR 30 mocz NT > >32 > >256 8 DHA-like CTX-M-15 qnrb6, aac(6 )-Ib-cr 35 płyn z j. otrzewnej >256 >256 >32 > >256 >24 DHA-7 CTX-M-15 qnrb6, aac(6 )-Ib-cr 155 minibal >256 >256 > >256 >32 DHA-7 CTX-M-15 aac(6 )-Ib-cr 9 mocz > >32 > >256 >32 DHA-7 CTX-M-15 aac(6 )-Ib-cr 22 wymaz z odleżyny NT > >256 >32 DHA-7 CTX-M-15 *Klebsiella pneumoniae; 1- FOX cefoksytyna (R<19 mm); 2- DPT - test synergizmu; 3- DDST- test synergii dwóch krążków; 4- MIC - minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii; AMC amoksycylina/kwas klawulanowy; ATM aztreonam; CTX cefotaksym; CRO cefrtiakson; FEP cefepim; NA kwas nalidyksowy; CIP ciprofloksacyna; NT nie testowano.

35 Nr 1 Mechanizmy oporności K. pneumoniae AmpC+ 123 Plazmidy zawierające genetyczne determinanty warunkujące wytwarzanie β-laktamaz typu AmpC i ESBL mogą zawierać również geny warunkujące oporność na inne grupy antybiotyków, w tym fluorochinolony (3, 17, 34). Co ciekawe, w prezentowanych badaniach 4 z 5 izolatów wytwarzających DHA i CTX-M-15 posiadały wariant acetylotransferazy aminoglikozydowej - AAC(6 )-Ib-cr, który jest związany także z obniżoną wrażliwością na hydrofilowe fluorochinolony tj. ciprofloksacynę i norfloksacynę. Ponadto, u dwóch izolatów (nr 30 i 35) wykryto dodatkowo obecność innego, plazmidowo kodowanego mechanizmu oporności na fluorochinolony (PMQR) tzn. QnrB6. Podobne współwystępowanie determinant oporności w swoich badaniach stwierdzili Compain i wsp. (3), który w genomie K. pneumoniae wykrył geny bla DHA-1, bla CTX-M-15 i qnrb4. Natomiast Yang i wsp. (34) potwierdzili obecność zarówno genów: bla DHA-1, bla CTX-M-14, bla TEM-1, qnrb4 jak i aac(6 )-Ib-cr. Według danych piśmiennictwa (13, 17, 24, 27) spośród PMQR opisywanych u Enterobacteriaceae zarówno gen qnrb, jak i aac(6 )-Ib-cr należą do najbardziej rozpowszechnionych, co potwierdziły także nasze wcześniejsze badania (24). U badanych izolatów nie stwierdzono innych genów warunkujących mechanizm oporności typu PMQR takich jak: qnra, qnrs oraz qepa. Profil lekooporności badanych izolatów K. pneumoniae przedstawiono w tabeli 1. Charakteryzowały się one wysokimi wartościami MIC zarówno antybiotyków β laktamowych, jak i fluorochinolonów. Analiza profili genetycznych XbaI-PFGE przeprowadzona u badanych izolatów K. pneumoniae wytwarzających pampc wykazała, że ich podobieństwo genetyczne mieściło się w zakresie od 76 % do 97 % (Rycina 2). Najwyższy stopień podobieństwa (97%) stwierdzono pomiędzy izolatami nr 35 i 155, co mogłoby wskazywać na ich wzajemne powiązanie epidemiologiczne. Jednakże, izolaty te wyosobniono od dwóch pacjentów przebywających w dwóch różnych szpitalach. Wynik ten mógłby wskazywać na potencjalne szerzenie się klonu epidemicznego pomiędzy szpitalami, jednak takie stwierdzenie wymagałoby zbadania szczepów K. pneumonie wyosobnionych w tym samym przedziale czasowym w większej liczbie szpitali. PODSUMOWANIE Po raz pierwszy zaobserwowano mechanizm AmpC typu DHA-7 u Klebsiella pneumoniae, co potwierdza wyjątkową zdolność tego gatunku pałeczek Enterobacteriaceae do nabywania nowych mechanizmów oporności. Co więcej, współwystępowanie mechanizmów oporności AmpC wraz z ESBL znacząco ogranicza możliwe opcje terapeutyczne z użyciem antybiotyków β-laktamowych. Jednocześnie, fakt obecności mechanizmów PMQR u badanych izolatów wskazuje na proces dostosowawczy tych drobnoustrojów do presji selekcyjnej wynikającej z powszechnego stosowania fluorochinolonów. Łącznie zebrane wyniki pokazują, że pałeczki K. pneumoniae zdolne do wytwarzania nabytych mechanizmów oporności typu AmpC przejawiają właściwości adaptacyjne typowe dla endemicznych szczepów szpitalnych, o czym świadczy kumulacja lokalnie rozpowszechnionych mechanizmów oporności na dwie grupy antybiotyków najczęściej stosowane w terapii. PODZIĘKOWANIA Autorzy dziękują prof. Markowi Gniadkowskiemu i dr Annie Baraniak z Narodowego Instytutu Leków w Warszawie za udostępnienie szczepów: K. pneumoniae 2102/06 (DHA- 1) i P. mirabilis 1662/00 (CMY-15), które posłużyły jako dodatnie kontrole w testach fenotypowych oraz w reakcji PCR.

36 124 M. Rzeczkowska i inni Nr 1 Część wyników została opublikowana w postaci doniesienia zjazdowego na XXVIII Zjeździe Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów, Bydgoszcz , w ramach realizacji zadania statutowego NIZP-PZH nr.: 5/EMMŁ/2014 i 3/EM/2016. Badania wykonane w ramach zadania statutowego NIZP-PZH nr.: 5/EMMŁ/2014 i 3/EM/2016. PIŚMIENNICTWO 1. Bush K. Alarming β-lactamase-mediated resistance in multidrug-resistant Enterobacteriaceae. Curr Opin Microbiol 2010; 13: Baraniak A, Izdebski R, Fiett J i inni. Comparative population analysis of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrum β-lactamases colonizing patients in rehabilitation centers in four countries. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: Compain F, Decré D, Fulgencio JP i inni. Molecular characterization of DHA-1-producing Klebsiella pneumoniae isolates collected during a 4-year period in an intensive care unit. Diagn Microbiol Infect Dis 2014; 80: Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Occurrence and detection of AmpC β-lactamase among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a Veterans Medical Center. J Clin Microbiol 2000; 38: Coudron PE. Inhibitor-basted methods for detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase in Klepsiella spp., Escherichia coli and Proteus mirabilis. J Clin Microbiol 2005; 43: Ding H, Yang Y, Lu Q i inni. The prevalence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases among clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from five children s hospitals in China. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27: EARS-Net Annual Reports. Antimicrobial resistance surveillance in Europe Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (www. ecdc.europa.eu). 8. Empel J, Baraniak A, Literacka E i inni. Beta-PL Study Group: Molecular survey of beta-lactamases conferring resistance to newer beta-lactams in Enterobacteriaceae isolates from Polish hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52(7): Gharout-Sait A, Touati A, Guillard T i inni. Molecular characterization and epidemiology of cefoxitin resistance among Enteroba- cteriaceae lacking inducible chromosomal ampc genes from hospitalized and non-hospitalized patients in Algeria: description of new sequence type in Klebsiella pneumoniae isolates. Braz J Infect Dis 2015; 19: Gierczyński, R, Szych J, Cieślik A i inni. The occurrence of the first two CTX-M-3 and TEM-1 producing isolates of Salmonella enterica serovar Oranienburg in Poland Int J Antimicrob Agents 2003; 21: Han C, Yang Y, Wang M i inni. The prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants among clinical isolates of ESBL or AmpC-producing Escherichia coli from Chinese pediatric patients. Microbiol Immunol 2010; 54: Jacoby GA. AmpC β-lactamases. Clin Microbiol Rev 2009; 22:

37 Nr 1 Mechanizmy oporności K. pneumoniae AmpC Jiang Y, Zhou Z, Qian Y i inni. Plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac(6 )-Ib-cr in extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in China. J Antimicrob Chemother 2008; 61: Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 1988; 10: Luk S, Wong WK, Ho AY i inni. Clinical features and molecular epidemiology of plasmid-mediated DHA-type AmpC β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae blood culture isolates, Hong Kong. J Glob Antimicrob Resist 2016; 7: Mata C, Miró E, Riviera A i inni. Prevalence of acquired AmpC β-lactamases in Enterobacteriaceae lacking inducible chromosomal ampc genes at a Spanish hospital from 1999 to Clin Microbiol Infect 2010; 16: Mata C, Miró E, Toleman M, Rivera MA i inni. Association of bla(dha-1) and qnrb genes carried by broad-host-range plasmids among isolates of Enterobacteriaceae at a Spanish hospital. Clin Microbiol Infect 2011; 17: Miró E, Agüero J, Larrosa MN i inni. Prevalence and molecular epidemiology of acquired AmpC β-lactamases and carbapenemases in Enterobacteriaceae isolates from 35 hospitals in Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013; 32: Park MJ, Kim TK, Song W i inni. An increase in the clinical isolation of acquired AmpC β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in Korea from 2007 to Ann Lab Med 2013; 33: Pérez-Pèrez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: Philippon A, Arlet G, Jacoby GA. Plasmid-determined AmpC-type β-lactameses. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: Piekarska K, Rzeczkowska M, Zacharczuk K i inni. Występowanie genów qnr u niewrażliwych na fluorochinolony pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae izolowanych z materiału klinicznego. Med Dośw Mikrobiol 2012; 64: Piekarska K, Rzeczkowska M, Chróst A i inni. Występowanie i charakterystyka genu acc(6 )-Ib-cr kodującego enzym modyfikujący fluorochinolony u opornych na ciprofloksacynę szczepów Enterobacteriaceae wyizolowanych od ludzi. Med Dośw Mikrobiol 2013; 65: Piekarska K, Wołkowicz T, Zacharczuk K i inni. Co-existence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants and mutations in gyra and parc among fluoroquinolone-resistant clinical Enterobacteriaceae isolated in a tertiary hospital in Warsaw, Poland. Int J Antimicrob Agents 2015; 45: Poirel L, Cattoir V, Nordmann P. Is plasmid-mediated quinolone resistance a clinical significant problem? Clin Microbiol Infect 2008; 14: Roche C, Boo TW, Walsh F, Crowley B. Detection and molecular characterisation of plasmidic AmpC b-lactamases in Klebsiella pneumoniae isolates from a tertiary-care hospital in Dublin, Ireland. Clin Microbiol Infect 2008; 14: Rodríguez-Martínez JM, Machuca J, Cano ME i inni. Plasmid-mediated quinolone resistance: Two decades on. Drug Resist Updat 2016; 29:

38 126 M. Rzeczkowska i inni Nr Rzeczkowska M, Piekarska K, Gierczyński R. Charakterystyka opornych na fluorochinolony izolatów z gatunku K. pneumoniae, P. mirabilit i E. coli wytwarzających β laktamazy typu ESBL i AmpC. Med Dosw Mikrobiol 2012; 64: Shi WF, Zhou J, Qin JP. Transconjugation and genotyping of the plasmid-mediated AmpC beta-lactamase and extended-spectrum beta-lactamase genes in Klebsiella pneumoniae. Chin Med J 2009; 122: Seo MR, Park YS, Pai H. Characteristics of plasmid-mediated quinolone resistance genes in extended-spectrum cephalosporin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Korea. Chemotherapy 2010; 56: Singtohin S, Chanawong A, Lulitanond A i inni. CMY-2, CMY-8b, and DHA-1 plasmid-mediated AmpC β-lactamases among clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from a university hospital, Thailand. Diagn Microbiol Infect Dis 2010; 68: Tan TY, Ng LSY, He J i inni. Evaluation of screening methods to detect plasmid-mediated AmpC in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: Thomson KS. Extender-spectrum-β-lactamase, AmpC and carbapenemase issues. J Clin Microbiol 2010; 48: Yang H, Chen H, Yang Q, Chen M i inni. High prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance genes qnr and aac(6 )-Ib-cr in clinical isolates of Enterobacteriaceae from nine teaching hospitals in China. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: Otrzymano: 26 VI 2017 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

39 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek i lipopolisacharydów werotoksycznych pałeczek Escherichia coli (VTEC) w poszczególnych podklasach IgG u dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to recombinant proteins and lipopolysaccharides of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) in children with haemolytic-uraemic syndrome Waldemar Rastawicki, Kornelia Gielarowiec, Anna Chróst Zakład Bakteriologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie Określono częstość występowania i poziom przeciwciał podklas IgG1-IgG4 dla LPS oraz rekombinowanych białek werotoksycznych pałeczek E. coli u dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym. Przeprowadzone badania wykazały, że w przebiegu zakażenia VTEC najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1 i IgG2 dla LPS, następnie dla intyminy i białka Tir oraz dla werotoksyny 2b. Przeciwciała podklasy IgG3, a zwłaszcza podklasy IgG4 dla rekombinowanych białek w badanych próbkach surowicy diagnozowano znacznie rzadziej. Słowa kluczowe: przeciwciała podklasy IgG, E. coli O157, E. coli non-o157, VTEC ABSTRACT Introduction: The present study was aimed at determining the IgG subclass distribution against LPS and recombinant proteins of verocytotoxin-producing E.coli (VTEC) in children with haemolytic-uraemic syndrome. Materials and Methods: The total number of 17 serum samples obtained from children with bacteriologically and/or serologically confirmed VTEC infections were tested by in-house ELISA for the presence of IgG1-IgG4 antibodies. As the antigen in ELISA were used LPS of E. coli serotype O157, O26, O111, O121, O145 and recombinants proteins: verocytotoxin 2b, intimin and Tir. Results: In the present study most frequently and in the highest levels antibodies of subclass IgG1 and IgG2 to LPS, intimin and Tir protein were diagnosed. The arithmetic means of OD 450 of antibodies IgG3 and IgG4 to these antigens were over two-times lower than antibodies IgG1 measured in all of tested serum samples. Antibodies of subclass IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 in diagnostically significant level to verocytotoxin 2b were diagnosed only in 8, 3, 4 and 3 serum samples for 17 tested, respectively.

40 128 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst Nr 1 Conclusions: In conclusion, IgG1 and IgG2 antibodies to LPS, intimin and Tir protein are predominating IgG subclass diagnosed in children with haemolytic-uraemic syndrome. Key words: IgG subclass antibodies, E. coli O157, E. coli non-o157, VTEC WSTĘP Dane epidemiologiczne z wielu państw Europy pokazują, że werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC) stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego (4). Odpowiedzialne są one za wywoływanie krwotocznego zapalenia okrężnicy, zespołu hemolityczno-mocznicowego (haemolytic ureamic syndrome HUS), czy małopłytkowej plamicy zakrzepowej (thrombotic thrombocytopenic purpura TTP). Szczególnie niebezpiecznym powikłaniem zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli u małych dzieci jest HUS, definiowany jako triada objawów klinicznych: niedokrwistość hemolityczna z fragmentacją krwinek czerwonych, małopłytkowość i ostra niewydolność nerek. Różna etiopatogeneza stanowi podstawę klasyfikacji zespołu na trzy postaci: D+HUS typowa postać z biegunką poprzedzającą, atypowa postać D-HUS bez poprzedzającej biegunki oraz wtórna postać HUS (10). Pałeczki VTEC należą do różnych grup serologicznych, najczęściej do grupy O157, rzadziej do innych, umownie określanych mianem non O157, takich jak: O26, O103, O111, O121, O145 czy O104 (11). Do wywołania pełnych objawów zakażenia konieczne jest posiadanie przez te szczepy różnych czynników zjadliwości, w tym przede wszystkim werotoksyny I i/lub II, kodowanych na mobilnym elemencie genetycznym (fagu). Klasyczne, najczęściej izolowane szczepy VTEC powstają poprzez nabycie faga przez enteropatogenny szczep E. coli (EPEC), stąd najczęściej posiadają one takie dodatkowe mechanizmy wirulencji jak intymina, białko Tir, białko Esp czy hemolizyna (1, 7). Diagnostyka zakażeń wywoływanych przez werotoksyczne pałeczki E. coli sprowadza się głównie do zastosowania metod hodowlanych, polegających na izolacji bakterii z próbek kału pacjenta i następnie określeniu ich chorobotwórczych właściwości. Trzeba mieć jednak na uwadze, że pałeczki VTEC ze względu na bardzo krótki okres przebywania w układzie pokarmowym (kilka dni), morfologiczne podobieństwo do innych niechorobotwórczych pałeczek E. coli i częstą utratę genów kodujących werotoksyny w wyniku pasażowania, są trudne do izolacji w warunkach rutynowo prowadzonej diagnostyki bakteriologicznej. Z tego względu poszukiwanie swoistych przeciwciał może być przydatne zarówno w rutynowej, bieżącej diagnostyce jak również w retrospektywnych badaniach dotyczących rozpowszechnienia zakażeń wywoływanych przez pałeczki VTEC w populacji (2, 3). We wcześniej przeprowadzonych badaniach wykazaliśmy, że w przebiegu HUS u dzieci dochodzi do wytwarzania wysokiego poziomu swoistych przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM, zarówno dla lipopolisacharydów jak i dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, intyminy i białka Tir (8, 9). Szczególnie wysoki poziom w przebiegu zakażenia osiągają przeciwciała klasy IgG, które stanowią około 70-75% całkowitej puli wszystkich immunoglobulin człowieka. Ze względu na typ łańcucha ciężkiego, przeciwciała klasy IgG można podzielić na cztery podklasy IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (5, 6). Jak dotąd brak jest w dostępnym piśmiennictwie danych dotyczących udziału przeciwciał należących do poszczególnych podklas IgG w odpowiedzi humoralnej w przebiegu naturalnego zakażenia

41 Nr 1 Przeciwciała podklas IgG dla VTEC u dzieci z HUS 129 werotoksycznymi pałeczkami E. coli. Z tego względu, celem prezentowanej pracy była ocena występowania przeciwciał dla pałeczek VTEC w poszczególnych podklasach IgG w próbkach surowicy dzieci z zespołem-hemolityczno mocznicowym. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 17 próbek surowicy uzyskanych od dzieci z objawami zespołu hemolityczno-mocznicowego, w których we wcześniej wykonanych, rutynowych badaniach odczynem ELISA, stwierdzono podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG dla LPS oraz rekombinowanych białek pałeczek E. coli. Od siedmiu badanych osób wyizolowano z kału werotoksyczne pałeczki E. coli. Odczyn ELISA. Badania przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA zgodnie z procedurą podaną uprzednio (8, 9). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi-Sorp firmy Nunc opłaszczonych zawiesiną rekombinowanych białek oraz lipopolisacharydów. Rekombinowane białko Tir, fragment białka intyminy i werotoksynę 2b uzyskano metodami inżynierii genetycznej przy użyciu wektora pet30ek/lic firmy Novagen i oczyszczono metodą chromatografii metalopowinowactwa (IMAC) przy wykorzystaniu złoża Ni 2+ - IDA (His Bind Resing firmy Novagen). Preparaty lipopolisacharydów uzyskano zmodyfikowaną metodą Boivina ze szczepów E. coli należących do następujących grup serologicznych: O26, O111, O121, O145 oraz O157. W odczynie ELI- SA posłużono się mysimi, monoklonalnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Invitrogen) dla ludzkich immunoglobulin IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W wyniku wstępnego miareczkowania przyjęto rozcieńczenie koniugatów anty-igg1 1/400 i IgG2- -IgG4 1/250. Wartość diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał wyliczano ze średniej arytmetycznej wartości poziomu przeciwciał oznaczonych w próbkach surowicy osób klinicznie zdrowych powiększonej o 3 odchylenia standardowe. WYNIKI I DYSKUSJA W tabeli I przedstawiono poziom przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, białka Tir i intyminy oraz dla antygenów LPS w 17 próbkach surowicy uzyskanych od osób z zespołem hemolityczno-mocznicowym. U sześciu osób (pacjenci nr 1-6), we wcześniej wykonanych rutynowych badaniach odczynem ELISA, wykryto wysoki poziom przeciwciał klasy IgG, IgA i IgM dla pałeczek E. coli z grupy serologicznej O157. Dwie pierwsze próbki surowicy zostały uzyskane od osób z bakteriologicznie potwierdzonym zakażeniem wywołanym przez werotoksyczne szczepy pałeczek E. coli O157 (pacjent nr 1 i 2). W przeprowadzonych badaniach, we wszystkich 6 próbkach surowicy stwierdzono wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 i IgG2 dla antygenu LPS. Przeciwciała podklasy IgG3 i IgG4 osiągały niższy poziom, aczkolwiek w większości przypadków diagnostycznie znamienny. U osób z zakażeniem wywołanym przez werotoksyczne pałeczki E. coli O157 stwierdzano również z reguły wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 dla intyminy, białka Tir oraz werotoksyny 2b. Diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał podklasy IgG2 i IgG3 najczęściej wykazywano dla intyminy, rzadziej dla białka Tir i werotoksyny.

42 130 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst Nr 1 Tabela I. Poziom przeciwciał oznaczony odczynem ELISA (OD 450 ) w poszczególnych podklasach IgG dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, białka Tir, intyminy oraz dla antygenów LPS w próbkach surowicy osób z zespołem hemolityczno-mocznicowym. Nr pacjenta/serotyp E. coli/izolacja Werotoksyna 2b Tir Intymina LPS IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Nr 1 / O157 / Tak 0,66 0,26 0,28 0,15 1,04 0,34 0,28 0,13 1,72 0,59 0,17 0,19 1,90 1,59 0,82 0,41 Nr 2 / O157 / Tak 0,70 0,53 0,44 0,20 1,15 0,50 0,41 0,22 0,66 0,35 0,37 0,17 1,75 1,41 1,29 0,42 Nr 3 / O157 / Nie 0,76 0,28 1,03 0,13 1,50 0,35 0,33 0,13 1,82 0,35 0,67 0,15 1,64 0,80 1,11 0,29 Nr 4 / O157 / Nie 0,50 0,28 0,33 0,18 0,79 0,31 0,17 0,12 1,00 0,17 0,21 0,10 1,50 0,71 0,20 0,21 Nr 5 / O157 / Nie 0,97 0,42 1,37 0,18 1,91 0,77 0,34 0,23 1,92 0,79 1,77 0,17 1,53 1,64 0,59 0,35 Nr 6 / O157 / Nie 0,97 0,65 0,40 0,25 1,08 0,52 0,30 0,20 1,69 0,35 0,29 0,14 1,73 1,59 0,70 0,44 Nr 7 / O26 / Nie 0,49 0,28 0,25 0,15 0,57 0,29 0,17 0,12 1,15 0,43 0,19 0,11 0,77 0,71 0,23 0,13 Nr 8 / O26 / Tak 0,32 0,29 0,22 0,13 0,62 0,25 0,14 0,12 1,49 0,37 0,14 0,10 0,91 0,34 0,22 0,14 Nr 9 / O26 / Tak 0,52 0,30 0,25 0,16 0,78 0,29 0,16 0,13 1,37 0,31 0,22 0,13 1,43 0,48 0,61 0,15 Nr 10 / O145 / Nie 0,59 1,05 0,23 0,16 0,37 0,30 0,16 0,12 1,02 0,40 0,12 0,11 0,70 0,47 0,20 0,15 Nr 11 / O145 / Tak 0,90 0,68 0,82 0,25 0,94 0,48 0,27 0,19 1,79 1,44 0,47 0,18 0,79 0,53 0,77 0,18 Nr 12 / O145 / Nie 0,56 0,49 0,34 0,26 1,57 0,57 0,31 0,32 1,52 0,35 0,20 0,31 1,24 0,55 0,39 0,24 Nr 13 / O145 / Nie 0,73 0,36 0,76 0,21 1,94 0,50 0,30 0,28 1,91 0,85 0,45 0,26 1,67 1,48 1,17 0,14 Nr 14 / O145 / Nie 0,38 0,26 0,52 0,17 1,83 0,40 0,15 0,22 1,45 0,23 0,13 0,15 0,97 0,51 0,36 0,18 Nr 15 / O111 / Tak 0,53 0,44 0,20 0,18 1,34 0,53 0,15 0,21 1,28 0,45 0,13 0,14 0,38 0,34 0,16 0,12 Nr 16 / O111 / Tak 0,49 0,41 0,22 0,16 0,91 0,43 0,18 0,21 1,13 0,35 0,13 0,15 0,37 0,24 0,15 0,11 Nr 17 / O111 / Nie 0,71 0,50 0,52 0,28 1,53 0,50 0,39 0,47 1,17 0,35 0,24 0,20 0,28 0,22 0,21 0,20 Wartość cut off 0,65 0,65 0,65 0,25 0,90 0,50 0,30 0,25 1,00 0,35 0,45 0,25 0,90 0,45 0,55 0,35

43 Nr 1 Przeciwciała podklas IgG dla VTEC u dzieci z HUS 131 U pozostałych 11 osób chorych, z zakażeniem wywołanym przez pałeczki E. coli z grupy serologicznej O26, O145 lub O111, najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1 i IgG2 dla intyminy, następnie dla białka Tir oraz lipopolisacharydów, najrzadziej zaś dla werotoksyny. Przeciwciała podklasy IgG3 oraz IgG4 w tej grupie badanych osób wykrywano sporadycznie na diagnostycznie znamiennym poziomie. Pomimo, że w przypadku pacjentów nr 8, 9, 11, 15 i 16 zakażenie przez werotoksyczne pałeczki E. coli zostało potwierdzone wyizolowaniem szczepu i określeniem w PCR obecności genów kodujących werotoksyny, odczynem ELISA wykryto podwyższony poziom przeciwciał podklasy IgG1-IgG4 dla werotoksyny 2b tylko u jednej osoby (pacjent nr 11). Tak więc, pomimo tego że szczep posiadał determinanty genetyczne werotoksyny i był zdolny do wywołania zespołu hemolityczno-mocznicowego to u osób zakażonych nie wykryto przeciwciał skierowanych dla tego białka. Co istotne, u pozostałych osób zakażonych szczepami non- -O157 wykryto natomiast diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał dla białka Tir bądź intyminy. Przeciwciała poszczególnych podklas IgG różnią się między sobą nie tylko budową lecz także właściwościami biologicznymi. Podczas zakażenia, białkowe antygeny drobnoustrojów najsilniej stymulują produkcję przeciwciał podklasy IgG1 i IgG3, znacznie słabiej klasy IgG4 oraz IgG2, natomiast antygeny lipopolisacharydowe najsilniej stymulują z kolei wytwarzanie przeciwciał podklasy IgG2 (5, 6). Tak więc, wykazanie w prezentowanych badaniach dominacji przeciwciał podklasy IgG1 dla antygenów białkowych w surowicy osób chorych było zgodne z oczekiwaniem. Ciekawy wydaje się natomiast fakt wykrycia w surowicy badanych osób równie wysokiego poziomu przeciwciał podklasy IgG2 i IgG1 dla LPS. Prezentowane przez nas wyniki badań wykazały, że w przebiegu zakażenia pałeczkami VTEC produkowane są przeciwciała należące do wszystkich czterech podklas IgG. Najwyższe poziomy osiągają przeciwciała skierowane dla LPS i to nie tylko podklasy IgG2 ale także IgG1. Trzeba jednak mieć na uwadze, że wykazanie u chorych osób obecności przeciwciał dla LPS z określonych serotypów nie świadczy bezpośrednio o zakażeniu szczepami werotoksycznymi. W badanych próbkach surowicy dzieci z HUS stwierdzano także wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 i IgG2 dla intyminy i białkatir. Przeciwciała podklasy IgG3, a zwłaszcza IgG4, dla rekombinowanych białek, wykrywano w znacznie niższych poziomach. *Badania wykonane w ramach zadania statutowego 5/EM.1 NIZP-PZH na rok 2017 PIŚMIENNICTWO 1. Chart H, Cheasty T. Human infections with Verocytotoxin-producing Escherichia coli O years of E. coli O157 serodiagnosis. J Med Microbiol 2008; 57: Chart H, Jenkins C. The serodiagnosis of infections caused by verocytotoxin-producing Escherichia coli. J App Microbiol 1999; 86: Chart H, Perry N, Cheasty T, Wright P. The kinetics of antibody production to antigens of Escherichia coli O157 in a pregnant woman with haemolytic uraemic syndrome. J Med Microbiol 2002; 51:522-5.

44 132 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst Nr 1 4. EFSA, European Food Safe Authority Journal. The Community Summery Report on Trends and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreak in the European Union in Journal 2010; 8: Hamilton RG. Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin Chem 1987; 33: Jakóbisiak M. Przeciwciała, str W: Immunologia. Red. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Jenkins C, Chart H, Smith HR i inni. Antibody response of patients infected with Verocytotoxin producing Escherichia coli to protein antigens encoded on the LEE locus. J Med Microbiol 2000; 49: Rastawicki W, Rokosz-Chudziak N. Ocena przydatności odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał dla lipopolisacharydów enterokrwotocznych pałeczek Escherichia coli (EHEC) u osób z zaburzeniami układu pokarmowego i zespołem hemolityczno-mocznicowym. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: Rastawicki W, Śmietańska K, Chróst A i inni. Wykorzystanie wybranych, rekombinowanych białek w serodiagnostyce zakażeń wywoływanych przez werotoksyczne pałeczki Escherichia coli (VTEC) u ludzi. Med Dośw Mikrobiol 2016; 68: Sieniawska M, Wyszyńska T. Nefrologia dziecięca. Tom 2. Biblioteka lekarza Specjalisty. Warszawa Szych J. W etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. Pod redakcją Marka Jagielskiego. Biblioteka Diagnosty Laboratoryjnego. Fundacja Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2011, str Otrzymano: 19 VI 2017 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie

45 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Wirus krowianki (MVA) jako model wirusowy w badaniu wirusobójczej aktywności środków dezynfekcyjnych wobec wirusów osłonkowych Vaccinia virus (MVA) as a virus model in the study of virucidal activity of disinfectants against enveloped viruses Agnieszka Trzcińska, Agnieszka Częścik, Barbara Łagosz, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, Warszawa Fundamentem w zapobieganiu zakażeniom związanymi z usługami medycznymi, głównie zakażeniami szpitalnymi, jest właściwa higiena rąk przy użyciu środków dezynfekcyjnych o precyzyjnie określonym zakresie działania, co wymaga zastosowania prawidłowej metodyki ich badania. Celem badania była weryfikacja nowego zakresu badań wirusobójczej aktywności produktów przeznaczonych do dezynfekcji rąk metodą wcierania i do higienicznego mycia rąk. Słowa kluczowe: wirus krowianki, aktywność wirusobójcza, PN-EN14476, wirusy osłonkowe ABSTRACT Introduction: The basis for preventing infection associated with the medical area, including hospital infections is proper hand hygiene using disinfectants with a precisely defined range of action. It requires the proper methodology of their examination. The aim of the study was to verify the new scope of virucidal activity testing of products for hygienic handrub and handwash - virucidal activity against enveloped viruses. Material and Methods: Procedures for testing the virucidal activity of the products for hygienic handrub and handwash (including the reference test) described in the standard PN-EN 14476:2013+A1:2015 were used. Results: The appropriate ranges of reduction of the infectious MVA titre in the reference test with 0,004% glutaraldehyde was obtained. The mean reduction of vaccinia virus titre was 0,815 ± 0,563 log after 5 minute contact time and 2,065 ± 0,555 log after 15 minute contact time. Also, the virucidal activity of ethanol and isopropanol in different concentration were tested. In case of 50% concentration of both alcohols, a titer reduction of at least 5,25 logs was achieved

46 134 A.Trzcińska i inni Nr 1 Conclusions: Obtained results confirmed the correctness of the work of the test system, which aims to assess the virucidal activity of the hygienic handrub and handwash products in the range virucidal activity against enveloped viruses test system meets all the criteria required by the standard. Key words: vaccinia virus, virucidal activity, PN-EN14476, enveloped viruses WSTĘP Dezynfekcja to działania prowadzone za pomocą środków chemicznych lub fizycznych, polegające na niszczeniu drobnoustrojów chorobotwórczych z wyłączeniem spor bakteryjnych. Dotyczy ona przede wszystkim środowiska zewnętrznego (narzędzi, powierzchni, tekstyliów, itd.), ale może dotyczyć również powłok ciała. Celem dezynfekcji jest zredukowanie liczby drobnoustrojów do takiego poziomu, aby zdezynfekowany przedmiot nie był już źródłem infekcji, dlatego też proces dezynfekcji jest istotnym elementem w profilaktyce i zwalczaniu zakażeń oraz niezbędnym elementem utrzymania higieny w zakładach opieki zdrowotnej. Podstawą w zapobieganiu zakażeniom związanym z obszarem medycznym, w tym zakażeniom szpitalnym, jest właściwa higiena rąk przy użyciu preparatów dezynfekcyjnych spełniających odpowiednie kryteria (2, 18). Idealny środek dezynfekcyjny, poza m.in. szybkim działaniem, trwałością, nietoksycznością, nie podleganiem wpływom środowiska, powinien przede wszystkim charakteryzować się jak najszerszym spektrum działania biobójczego, obejmującego bakterie, wirusy, grzyby i prątki (16). Wrażliwość drobnoustrojów na działanie chemicznych środków dezynfekcyjnych jest zróżnicowana od najbardziej opornych prionów po najbardziej wrażliwe wirusy osłonkowe. Precyzyjne określenie zakresu działania środka dezynfekcyjnego wiąże się z zastosowaniem prawidłowej metodyki badania, ponieważ błędne oznaczenie parametrów aktywności (stężenie, czas kontaktu, zakres) może prowadzić do nieodpowiedniego stosowania produktu. W Unii Europejskiej metodyka badania aktywności biobójczej preparatów dezynfekcyjnych jest znormalizowana. Obecnie metodyka określania aktywności wirusobójczej produktów stosowanych w obszarze medycznym jest opisana w normie PN-EN (13). Jest to norma Fazy 2, Etapu 1 stosująca metodę zawiesinową do ustalenia czy dany chemiczny środek dezynfekcyjny ma działanie wirusobójcze. Wymagania i wytyczne dotyczące warunków badania opisane w normie są uzależnione od przeznaczenia badanego preparatu. Norma wyróżnia 4 grupy badanych produktów: 1) preparaty do dezynfekcji narzędzi; 2) preparaty do dezynfekcji powierzchni; 3) preparaty do dezynfekcji tekstyliów i 4) preparaty do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania oraz preparaty do higienicznego mycia rąk. W ramach tej ostatniej grupy produkty mogą być badane pod kątem pełnego zakresu aktywności wirusobójczej, ograniczonego zakresu aktywności wirusobójczej oraz wprowadzonego w ostatniej edycji normy poprawką A1 określenia aktywności wirusobójczej tylko wobec wirusów osłonkowych (Tabela I). Celem badania było wprowadzenie i weryfikacja metodyki badania aktywności wirusobójczej produktów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania i do higienicznego mycia rąk w ramach nowego zakresu badań działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe.

47 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych 135 Tabela I. PN-EN 14476:2013+A1: Wymagania dotyczące badania preparatów do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania i higienicznego mycia rąk. Minimalny zakres badanych wirusów (obligatoryjny) Dodatkowy zakres Temperatura badania Czas kontaktu Substancja obciążająca W przypadku preparatów do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania należy wykonać badanie przynajmniej w warunkach czystych. W przypadku preparatów do higienicznego mycia rąk należy wykonać badanie przynajmniej w warunkach brudnych. Pełny zakres aktywności wirusobójczej: Wirus polio Wirus adeno Mysi norowirus Ograniczony zakres aktywności wirusobójczej: Wirus adeno Mysi norowirus Działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe: Wirus krowianki Każdy istotny, stosowny model wirusowy 20 o C Zgodnie z rekomendacją wytwórcy, ale pomiędzy 30 i 120 sekund Warunki czyste badania: 0,3 g/l roztwór albuminy bydlęcej Warunki brudne badania: 3,0 g/l roztwór albuminy bydlęcej plus 3,0 ml/l erytrocytów baranich MATERIAŁ I METODY Wirus. Wirus krowianki, modyfikowany szczep Ankara MVA (ATCC-VR-1508). MVA to posiadający osłonkę DNA wirus należący do rodziny Poxviridae, podrodziny Chordopoxvirinae, rodzaju Orthopoxvirus. Po namnożeniu wirusa porcjowano i do dalszych badań przechowywano w temperaturze -70 o C. Badania prowadzono z wirusem na poziomie 1 i 2 pasażu. Hodowla komórkowa. Fibroblastyczna linia ciągła BHK-21 (ATCC-CCL-10) wyprowadzona z nerki chomika Mesocricetus auratus. Hodowlę komórkową namnożono zgodnie z procedurą podaną przez producenta, rozporcjowano i do dalszych badań przechowywano w ciekłym azocie, w temperaturze -188 o C. Badania prowadzono z hodowlą na poziomie 5 i 6 pasażu. Podłoża hodowlane. Podłoże wzrostowe podłoże Eagle a (EMEM) wzbogacone 10% płodowej surowicy cielęcej i 3% L-glutaminy, zawierające 100 jednostek/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny oraz podłoże utrzymujące podłoże Eagle a (EMEM) wzbogacone 2% płodowej surowicy cielęcej i 3% L-glutaminy, zawierające 100 jednostek/ ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny. Preparaty chemiczne. 1) 25% roztwór aldehydu glutarowego f-my Sigma (G-6257); 2) 96% (V/V) alkohol etylowy (etanol) f-my POCH; 3) 99,7% (w/w) 2-propanol

48 136 A.Trzcińska i inni Nr 1 (izopropanol) f-my POCH. W badaniu zastosowano 20%, 30% i 50% stężenie alkoholi przygotowane w stosunku objętościowym. Oznaczanie miana zakaźnego wirusa. Miano wirusa krowianki określano w mikropłytce metodą obecności/braku efektu cytopatycznego (quantal test) w zawiesinie komórek BHK-21. Po sporządzeniu szeregu rozcieńczeń wirusa w stosunku 1:10 (co 1 log), do ośmiu dołków w mikropłytce, zawierających 100 µl zawiesiny komórek BHK-21 o odpowiedniej gęstości (8-10 tys.komórek / dołek), dodawano po 100 µl każdego rozcieńczenia wirusa. Kontrolę stanowiły dołki tylko z hodowlą komórkową, bez zawiesiny wirusowej. Mikropłytki inkubowano w temperaturze 37 o C± 1 o C, w atmosferze 5% CO 2 przez okres 7 dni, a zmiany w hodowli komórkowej obserwowano w mikroskopie świetlnym. Miano zakaźne wirusa krowianki (wraz z oceną biometryczną) obliczano według metody Spaermana-Kärbera (13, 15). Określenie cytotoksyczności badanych preparatów chemicznych dla hodowli komórkowej. W celu sprawdzenia możliwości wystąpienia zmian morfologicznych wywołanych w komórkach hodowli BHK-21 przez stosowane preparaty chemiczne (aldehyd glutarowy, etanol, izopropanol) mogących mieć wpływ na wynik badania przygotowano serię rozcieńczeń preparatów w stosunku 1:10 w podłożu hodowlanym i dodawano do hodowli komórkowej. Wystąpienie ewentualnych zmian obserwowano w mikroskopie świetlnym. Określenie zdolności preparatów (alkoholi) do inaktywacji wirusa krowianki zgodnie z PN-EN Zasada badania opierała się na określeniu zdolności badanego produktu do inaktywacji wirusa krowianki na podstawie spadku miana zakaźnego wirusa na skutek działania produktu. Jako kryterium posiadania w/w zdolności przez badany produkt przyjęto spadek miana zakaźnego wirusa o co najmniej 4 w dziesiętnej skali logarytmicznej (4 log) różnica pomiędzy mianem zakaźnym wirusa krowianki w mieszaninie kontrolnej a mianem zakaźnym wirusa krowianki w mieszaninie do badania zawierającej określone stężenie badanego produktu. Miaszanina do badania zawierała: 1 ml zawiesiny wirusa krowianki (MVA); 1 ml substancji obciążającej; 8 ml badanego roztworu produktu (etanol lub izopropanol) w odpowiednim stężeniu. Końcowe stężenie alkoholi wynosiło 20%, 30% lub 50%. Mieszanina kontrolna zawierała: 1 ml zawiesiny wirusa krowianki (MVA); 1 ml substancji obciążającej; 8 ml sterylnej wody. Po przygotowaniu mieszaniny inkubowano w temperaturze 20 o C± 1 o C, przez czas kontaktu 1 minuta, mieszczący się w obowiązkowym zakresie podanym w normie oraz dodatkowy czas 3 minuty. Po upływie wybranego czasu kontaktu 0,5 ml każdej mieszaniny przenoszono do 4,5 ml oziębionego na lodzie podłoża utrzymującego, wykonywano serię rozcieńczeń (co 1 log) i oznaczano miano zakaźne wirusa krowianki. Test referencyjny. Prawidłowość działania systemu badawczego sprawdzono wykonując w powtórzeniu test inaktywacji wirusa krowianki ze związkiem chemicznym o uznanym działaniu wirusobójczym aldehydem glutarowym. Zdolność aldehydu glutarowego do inaktywacji wirusa krowianki określono w następujących warunkach: stężenie aldehydu glutarowego: 0,004% czasy kontaktu: 5 i 15 minut temperatura badania: 20 o C± 1 o C substancja obciążająca: buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS).

49 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych 137 Po upływie założonych czasów kontaktu określano miano zakaźne wirusa krowianki w mieszaninie do badania zawierającej 0,004% aldehydu glutarowego i porównywano do miana wirusa w mieszaninie kontrolnej. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zgodnie z wymaganiami obowiązującej obecnie edycji normy PN-EN 14476:2013+A1:2015 wirusobójcza aktywność produktów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania oraz higienicznego mycia rąk po raz pierwszy może być oceniana aż w 3 zakresach: pełne działanie wirusobójcze, ograniczone spektrum działania wirusobójczego, działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe. W przypadku każdego z wymienionych zakresów badanie wykonywane jest na innym zestawie obligatoryjnych modeli wirusowych. Jeżeli produkt przejdzie z pozytywnym skutkiem badanie na 3 modelach wirusowych wirusie polio i adeno oraz mysim norowirusie można uznać, że posiada on pełny zakres aktywności wirusobójczej, w takim stężeniu i czasie kontaktu, w którym inaktywowane są wszystkie 3 wymienione modele wirusowe. W przypadku ogranicznego spektrum aktywności wirusobojczej badanie wykonywane jest obowiązkowo z 2 modelami wirusowymi: wirusem adeno i mysim norowirusem. Posiadanie przez produkt ograniczonego zakresu działania wirusobójczego (w czasie i stężeniu, w którym inaktywowane są oba badane modele wirusowe) oznacza, że ma on aktywność wirusobójczą wobec wszystkich wirusów osłonkowych i badanych wirusów. Nowością w tej edycji normy PN-EN jest wprowadzenie 3 zakresu, czyli badania pod kątem działania wirusobójczego tylko na wirusy osłonkowe, w którym wirusowym modelem testowym jest modyfikowany szczep Ankara wirusa krowianki (MVA). Inaktywacja tego wirusa w danym czasie kontaktu przez produkt o określonym stężeniu oznacza, że w tych parametrach posiada on aktywność wirusobójczą wobec wirusow osłonkowych. Wybór modyfikowanego szczepu Ankara wirusa krowianki jako modelu badawczego w normie jest wynikiem wielu czynników. Przede wszystkim szczep Ankara (MVA) jest bardzo silnie atenuowanym szczepem wirusa krowianki, który w toku wielu badań został wykazany jako bezpieczny dla ludzi. Ze względu na wysoki profil bezpieczeństwa ten szczep wirusa krowianki jest uważany za szczep z wyboru do prowadzenia badań klinicznych (19). Poza tym jest on doskonałym kandydatem do użycia jako system wektorowy w szczepionkach rekombinowanych (5, 12, 17, 20). Atenuacja szczepu jest wynikiem kilkusetkrotnego pasażowania w hodowli komórkowej (10, 11), czego wynikiem była utrata ok. 15% genomu wyjściowego, w tym specyficznych genów regulujących zakres gospodarzy wirusa oraz tych odpowiedzialnych za unikanie układu odpornościowego gospodarza (1, 3). Wynikiem procesu atenuacji jest również ekstremalne ograniczenie zdolności replikacji MVA w komórkach ssaków (4, 6), co ze względów bezpieczeństwa jest również niezwykle istotne. Ponadto, w wielu laboratoriach przeprowadzono porównawcze badania modyfikowanego szczepu Ankara i szczepu Elstree wirusa krowianki, które wykazały brak znaczących różnic we wrażliwości tych szczepów na środki dezynfekcyjne zawierające różne substancje aktywne, co potwierdza, że MVA jest dobrym modelem badawczym, który daje porównywalne wyniki ze szczepem Elstree (9, 14). Zastosowany w naszych badaniach modyfikowany szczep wirusa Ankara (ATCC) charakteryzował się stabilną wartością miana zakaźnego na poziomie jednego pasażu i pomiędzy dwoma pasażami (Ryc.1), ze średnim logtcid 50 równym 6,815 ± 0,223. Uzyskane miano zakaźne wirusa było wystarczająco wy-

50 138 A.Trzcińska i inni Nr 1 sokie, aby pozwolić na określenie redukcji miana o 4 log w badaniu działania wirusobójczego środka dezynfekcyjnego, co jest jednym z kryteriów pozytywnej weryfikacji opisanej w normie metodyki badania. Drugim istotnym kryterium są wyniki testu referencyjnego, które muszą zawierać się w określonych zakresach. Zgodnie z wytycznymi normy PN-EN w czasie badania aktywności wirusobójczej danego środka dezynfekcyjnego jednocześnie powinien być wykonany test referencyjny ze związkiem chemicznym o uznanym działaniu wirusobójczym. Test referencyjny ma na celu kontrolę prawidłowości działania systemu badawczego na który składają się przede wszystkim wirus testowy, hodowla komórkowa, dokładność warunków inkubacji (temperatura i czas kontaktu). Badanie referencyjne inaktywacji wirusa krowianki (MVA) zostało wykonane z 0,004% roztworem aldehydu glutarowego. Uzyskane wyniki redukcji miana zakaźnego wirusa (Tabela II) mieściły się w założonych zakresach podanych w normie, zarówno dla czasu kontaktu 5, jak i 15 minut. 6,5 6,7 6,9 7,1 7,3 log TCID 50 Rycina 1. Stabilność miana wirusa krowianki (MVA) Tabela II. Test referencyjny z 0,004% aldehydem glutarowym Czas kontaktu (w min.) Miano MVA (log TCID 50 ) Błąd standardowy (S) Redukcja (R) miana MVA 95% przedział ufności dla R Średnia (R śr ) redukcja miana MVA 95% przedział ufności dla R śr 0 7,25 0, ,13 0,183 nd nd nd nd 5 6,38 0,206 0,75 0, ,25 0,221 0,88 0,574 0,815 0, ,00 0,189 2,13 0, ,13 0,226 2,00 0,582 2,065 0,555 nd nie dotyczy; MVA wirus krowianki, modyfikowany szczep Ankara Zakresy te wynoszą 0,75-3,50 log w przypadku czasu kontaktu 5 minut oraz 2,0-4,0 log dla czasu kontaktu 15 minut. Średnia redukcja miana wirusa krowianki w przeprowadzonym badaniu referencyjnym wynosiła 0,815 ± 0,563 log po 5 minutowym czasie kontaktu oraz 2,065 ± 0,555 log po 15 minutowym czasie kontaktu. Co najmniej 4 log redukcję miana zakaźnego MVA uzyskano w kilku laboratoriach w ramach badań międzylaboratoryjnych po

51 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych minutowej inkubacji z 0,05% i 0,1% aldehydem glutarowym (14). Przetestowano również wrażliwość MVA na działanie różnych stężeń etanolu oraz izopropanolu, stosując 2 czasy kontaktu: 1 minutę i 3 minuty (Ryc.2). W przypadku 20% stężenia obu alkoholi zarówno po czasie kontaktu 1 minuta, jak i 3 minuty uzyskano redukcję miana zakaźnego MVA 1,38 log. logtcid Stężenie 20% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 logtcid Stężenie 30% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 logtcid Stężenie 50% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 Ryc. 2. Aktywność wirusobójcza etanolu (E) i izopropanolu (Izo) wobec wirusa krowianki po czasie kontaktu 1 minuta (1) i 3 minuty (3). K0-1 i K02 kontrola wirusa po czasie kontaktu 0 minut. Wynik ten wskazuje, że 20% etanol i izopropanol nie wykazują aktywności wirusobojczej wobec wirusa krowianki. W przypadku 50% stężenia etanolu i izopropanolu uzyskano redukcję miana na poziomie co najmniej 5,25 log, co wskazuje na posiadanie przez badane alkohole w tym stężeniu działania wirusobójczego wobec wirusa krowianki i zgodnie z wytycznymi normy PN-EN również wobec innych wirusów osłonkowych. Podobne wyniki dla w/w stężeń etanolu i izopropanolu w czasie kontaktu 1 minuta uzyskano w 3 różnych laboratoriach w ramach badań porównawczych (14). Wymagana 4 log redukcja miana

52 140 A.Trzcińska i inni Nr 1 wirusa krowianki nie została uzyskana po 1 minucie w przypadku 30% etanolu, natomiast 30% izopropanol powodował redukcję na poziomie co najmniej 5 log. Wyniki dla izopropanolu w tym stężeniu były zróznicowane w przypadku badań w innych laboratoriach od 0,5 ± 0,44 log do 3,69 ± 0,53 log (14). Modyfikowany szczep Ankara wirusa krowianki jeszcze przed oficjalnym umieszczeniem go jako model testowy w normie PN-EN był przez wiele laboratoriów charakteryzowany i porównywany z innymi wirusami osłonkowymi (np. wirusem Ebola, MERS-CoV) pod kątem swojej wrażliwości na działanie różnych środków dezynfekcyjnych lub wybranych substancji aktywnych (7, 8, 9), co potwierdziło skuteczność jego wyboru jako model testowy w normie. Artykuł jest wynikiem realizacji zadania badawczego (8/EM/2016) w planie naukowym NIZP-PZH (projekt badawczy ). PIŚMIENNICTWO 1. Antoine G, Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. Virology 1998; 244: Bingham J, Abell G, Kienast L i inni. Health care worker hand contamination at critical moments in outpatient care settings. Am J Infect Control 2016; 44: Blanchard TJ, Alcami A, Andrea P, Smith GL. Modified vaccinia virus Ankara undergoes limited replication in human cells and lacks several immunomodulatory proteins: implications for use as a human vaccine. J Gen Virol 1998; 79: Carroll MW, Moss B. Host range and cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus: propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 1997; 238: Di Mario G, Sciaraffia E, Facchini M i inni. Protective immunity against influenza in HLA-A2 transgenic mice by modified vaccinia virus Ankara vectored vaccines containing internal influenza proteins. Pathog Glob Health 2017; 111: Drexler I, Heller K, Wahren B i inni. Highly attenuated modified vaccinia virus Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells. J Gen Virol 1998; 79: Eggers M, Eickmann M, Kowalski K i inni. Povidone-iodine hand wash and hand rub products demonstrated excellent in vitro virucidal efficacy against Ebola virus and modified vaccinia virus Ankara, the new European test virus for enveloped viruses. BMC Infect Dis 2015; 15: Eggers M, Eickmann M, Zorn J. Rapid and effective virucidal activity of povidone- -iodine products against middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and modified vaccinia virus Ankara (MVA). Infect Dis Ther 2015; 4: Hartnack S, Essbauer S, Truyen U. Substitution of vaccinia virus Elstree by modified vaccinia virus Ankara to test the virucidal efficacy of chemical disinfectants. Zoonoses Public Health. 2008; 55: Mayr A, Hochstein-Mintzel V, Stickl H. Passage history, properties, and applicability of the attenuated vaccinia virus strain MVA. Infection 1975; 3: 6-14.

53 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych McCurdy LH, Larkin BD, Martin JE i inni. Modified vaccinia Ankara: potential as an alternative smallpox vaccine. Clin Infect Dis 2004; 38: Pavot V, Sebastian S, Turner AV i inni. Generation and production of modified vaccinia virus Ankara (MVA) as a vaccine vector. Methods Mol Biol 2017; 1581: PN-EN 14476:2013+A1:2015. Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne - Ilościowa zawiesinowa metoda określania wirusobójczego działania w obszarze medycznym - Metoda badania i wymagania (Faza 2/Etap 1). Data publikacji: Rabenau HF, Rapp I, Steinmann J. Can vaccinia virus be replaced by MVA virus for testing virucidal activity of chemical disinfectants? BMC Infect Dis 2010; 10: Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol 2016; 5: Rutala WA, Weber DJ. Selection of the ideal disinfectant. Infect Control Hosp Epidemiol 2014; 35: Schweneker M, Laimbacher AS, Zimmer G i inni. Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara Generating Ebola Virus-Like Particles. J Virol 2017; 91: e doi: /JVI Siddharta A, Pfaender S, Vielle NJ i inni. Virucidal activity of World Health Organization-recommended formulations against enveloped viruses, including Zika, Ebola, and emerging coronaviruses. J Infect Dis 2017; 215: Verheust C, Goossens M, Pauwels K, Breyer D. Biosafety aspects of modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vectors used for gene therapy or vaccination. Vaccine 2012; 30: Volz A, Sutter G. Modified vaccinia virus Ankara: history, value in basic research, and current perspectives for vaccine development. Adv Virus Res 2017; 97: Otrzymano: 14 VI 2017 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

54

55 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Przeciwdrobnoustrojowe właściwości 5-funkcjonalizowanych pochodnych imidazolu Antimicrobial properties of 5-functionalized imidazole derivatives Veronika Świżak 1, Światosław Dejneka 1, Vitali Chornous 1, Vitali Świżak 2, Alexander Azarov 2 1 HSEE of Ukraine Bukovinian State Medical University, c. Chernivtsi, Ukraine 2 Bogomolets National Medical University, c. Kyiv, Ukraine Przeprowadzono porównanie przeciwdrobnoustrojowej aktywności 6 różnych grup imidazoli posiadających różne grupy funkcyjne w pozycji C-5. Aktywność przeciwdrobnoustrojową badano wobec wybranych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz grzybów drożdżopodobnych. Badania umożliwiły wybranie grup imidazoli o najwyższej aktywności wobec badanych drobnoustrojów i przedstawienie zaleceń dotyczących syntezy nowych przeciwdrobnoustrojowych związków chemicznych. Słowa kluczowe: 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu, właściwości przeciwdrobnoustrojowe, aktywność przeciwgrzybicza ABSTRACT Introduction: Resistance of microorganisms to antibiotics is a threat for human health all over the world and is a global issue. New antibiotics are essential for the fight against medical resistance of pathogenic microorganisms. In spite of the fact that certain promising antibacterial agents are now on the development stage, there is an sharp need of new antibiotic compounds, especially effective against multiple medical resistance of microorganisms. Imidazole derivatives are extremely promising group of chemical compounds to find new antibiotics. They can be considered as one of the major classes of biologically active compounds with a wide spectrum of action. Methods: 75 new synthesized compounds were selected to compare their antimicrobial properties. These compounds belong to six different groups 5-carbofunctionalized imidazoles. Antimicrobial properties of imidazole derivatives were studied in vitro by means of two-fold serial dilution method in liquid nutrient medium. Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal or yeasticidal concentrations of chemical compounds were detected concerning reference-strains of Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus АТСС 25923), Gram-negative bacteria (Escherichia coli АТСС 25922), and simply yeast (Candida albiсans АТСС ).

56 144 V. Świżak i inni Nr 1 Results: 5-carbofunctionalized imidazoles manifest their antimicrobial activity concerning Gram-positive bacteria (S. aureus АТСС 25923), Gram-negative bacteria (E. coli АТСС 25922), and simply yeast (C. albiсans АТСС ) which enable to consider them as chemical compounds with a wide spectrum of antimicrobial action. At the same time their anticandidiasis activity is higher than that of antibacterial action. For example, average values of minimal inhibitory concentrations of all the six groups of the compounds examined concerning the reference-strain C. albicans АТСС were 90,92±32,04 µg/ml, while their average values of minimal inhibitory concentrations were 139,20±29,71 µg/ml concerning E. coli АТСС and 143,45±27,60 µg/ml concerning S. aureus АТСС Similar regularities were found for yeasticidal and bactericidal concentrations of the examined 5-carbofunctionalized imidazoles their average values were 167,14±46,33, 279,73±42,57 and 284,66±41,26 µg/ml respectively. Antimicrobial activity of 5-carbofunctionalized imidazoles depends on their chemical structure. Conclusions: Comparison of antimicrobial activity of different six groups of 5-carbofunctionalized imidazoles enabled to select their most promising representatives and substantiate recommendations concerning the following synthesis of new antimicrobial chemical compounds. Key words: 5-carbonfunctional imidazole, antimicrobial properties, antibacterial activity, anticandidiasis activity. INTRODUCTION Resistance of microorganisms to antibiotics is a threat for human health all over the world (2,30) and is a global issue (1,3,21). Multiple medical resistance occurred in the majority of organisms reaching alarming scales in recent years (4,13,16,28,29). It is a great clinical problem during treatment of infectious diseases (10,20,27). This tendency presents a serious danger for the lives of patients (5). New antibiotics are essential for the struggle against medical resistance of pathogenic microorganisms (11,15,24). Imidazole derivatives are extremely promising group of chemical compounds to find new antibiotics. They can be considered as one of the major classes of biologically active compounds with a wide spectrum of action. Numerous imidazole compounds with a high therapeutic efficacy are widely used in clinical work in the treatment of different groups of diseases as anti-tumor, antifungal, antibacterial, anti-tuberculous, anti-inflammatory, anti-neuropathic, antihypertensive, antihistamine, anti-parasitic, antiviral agents. Although the search for more active and less toxic medical preparations on the base of imidazole seems to be essential (32). In spite of the fact that certain promising antibacterial agents are now on the development stage, there is an acute need of new antibiotic compounds, especially effective against multiple medical resistance of microorganisms (26). Objective: to compare antimicrobial activity in vitro of various groups of 5-carbofunctionalized imidazoles to establish recommendations for concerning the following synthesis of new antimicrobial chemical compounds.

57 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 145 MATERIAL AND METHODS Seventy five new synthesized compounds were selected to compare their antimicrobial properties belonging to six different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles: 13 derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-methylcarbonyls (group 1), 8 derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 2), 8 derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones (group 3), 9 derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propane-1-ones (group 4), 12 derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid (group 5) and 25 thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes and their certain derivatives (group 6). General formulas of the six different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles are the following: N R2 N R2 R1 R1 R1 N R1 N Ar O Ar O group 1 group 2 R2 R2 N N R1 N N Ar 2 Ar 1 Ar 1 O group 3 group 4 R2 O R2 N N N N N R1 N N NO 2 Ar 2 O S N R3 N Ar 1 Ar 1 group 5 group 6 The substances examined are original substances first synthesized at the Department of Medical and Pharmaceutical Chemistry, the Higher State Educational Establishment of Ukraine Bukovina State Medical University (Chernivtsi, Ukraine) by PhD, associate professor Chornous V.O. (6-8,17). The substances are solid, crystal compounds of white or yellowish-red colour, odorless, insoluble in water, moderately soluble in 96% ethyl alcohol, well soluble in dimethylsulphoxide (DMSO) and dimethylformamide (DMF). The structure of the synthesized compounds was proved by NMR methods, and their content by quantitative element analysis.

58 146 V. Świżak i inni Nr 1 The names of these compounds are presented in Tables 1-6. To prepare solutions of synthesized 5-carbofunctionalized imidazoles 0,1 ml of DMSO and sterile distilled water were used, bringing a matrix solution to 1000 µg/ml. Table 1. Antimicrobial activity of 2,4-disubstituted (1-aryl-1H-imidazole-5-yl) methanoles (µg/ml). Cipher compound The name of the compound S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC (4-chloro-1-phenyl-1H-imidazol-5-yl) methanol [4-chloro-1-(2-methylphenyl)-1Himidazol-5-yl]methanol [4-chloro-1-(4-methylphenyl)-1Himidazol-5-yl]methanol [4-chloro-1-(3-methylphenyl)-1Himidazol-5-yl]methanol [4-chloro-1-(4-chlorophenyl)-1Himidazol-5-yl]methanol [1-(2-bromophenyl)-4-chloro-1Himidazol-5-yl]methanol [1-(2-bromo-4-methylphenyl)-4- chloro-1h-imidazol-5-yl]methanol (2,4-dichlor o-1-phenyl-1h-imidazol- 5-yl)methanol [2,4-dichloro-1-(4-methylphenyl)-1Himidazol-5-yl]methanol {[5-(hydroxymethyl)-1-(3-methylphenyl)- 1H-imidazol-4-yl]thio}acetic acid ,25 62, ,62 31, , ,25 31, > , ,62 31, ,62 31, ,25 62, , ,25 31, {[5-(hydroxymethyl)-1-(4-methylphenyl)- 1H-imidazol-4-yl]thio}acetic acid ,62 31,25 Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration Examination of antimicrobial properties of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles was made in vitro by means of two-fold serial dilution method in liquid nutrient medium (18). Minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal or yeasticidal concentrations (MBC, MYC) of chemical compounds were detected concerning reference-strains of Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus АТСС 25923), Gram-negative bacteria (Escherichia coli АТСС 25922), and simply yeast

59 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 147 (Candida albiсans АТСС ). Optic density while preparing microbial suspension of an examined microorganism (10 5 CFU/ml for bacteria and 10 4 CFU/ml for yeast) was controlled by means of the densitometer DEN-1 Biosan. The temperature of incubation of microorganisms was 37 о С, time - 24 hours (for yeast 28 о С, and 48 hours respectively). Table 2. Antimicrobial activity of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (µg/ml). Cipher compound The name of the compound chloro-1-(2-chlorophenyl)-1H-imidazole-5-carbaldehyde (benzylthio)-4-chloro-1-phenyl- 1H-imidazole-5-carbaldehyde chloro-5-formyl-1-(4-methylphenyl)- 1H-imidazole-2-sulfonic acid chloro-5-formyl-1-phenyl-1H-imidazole-2-sulfonamide 1423 {[1-(4-fluorophenyl)-5-formyl-1Himidazol-4-yl]thio}acetic acid 2471 {[5-formyl-1-(4-methylphenyl)-1Himidazol-4-yl]thio}acetic acid [(4-chlorophenyl)thio]-1-(4-methylphenyl)-1H-imidazole-5- carbaldehyde formyl-1-(3-methylphenyl)-1H-imida zole-4-sulfonic acid Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC Minimal inhibitory concentration was the least concentration of a substance examined with the presence of which there was no culture growth seen. Bactericidal (yeasticidal) concentration of the examined substances was detected by the results of inoculation on appropriate dense nutrient media. All the experiments were accompanied by appropriate control: control of the medium for sterility, control of culture growth in the medium without a compound. In order to obtain reliable results the experiments were conducted three times with every concentration of a compound and examined culture of microorganisms. Antimicrobial action was compared separately for each of the three different referencestrains (S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС and C. albiсans АТСС ). At the same time, minimal inhibitory concentrations and bactericidal (yeasticidal) activity of the examined compounds was analyzed. Mean value (X) and standard error of the mean value (Sx) of inhibitory and bactericidal (yeasticidal) concentrations were calculated for every of 6 groups of 5-carbofunctionalized imidazoles.

60 148 V. Świżak i inni Nr 1 RESULTS The obtained results of studies in vitro antibacterial properties of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning reference-strains of Gram-positive (S. aureus АТСС 25923) and Gram-negative bacteria (E. coli АТСС 25922) and their anticandidiasis activity concerning the reference-strain of simply yeast (C. albiсans АТСС ) (Tables 1-6) enabled to compare antimicrobial action of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles. Table 3. Antimicrobial activity of derivatives 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1- one (µg/ml). Cipher compound 2652 The name of the compound S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 3- (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl) -1- (2,4-dychlorofenyl) prop-2-en-1-one 62, , ,25 31, (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl) -1- (2,4-dyftorofenyl) prop-2-en-1-one 62, , ,25 62, (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl) -1- (pyrazine-1-yl) prop-2-en-1-one 3- [4-chloro-1- (3-methylphenyl) imidazole-5-yl] -1- (2,4-dyftorofenyl) prop-2-en-1-one 62, , , , ,62 31, [4-chloro-1-(4-methoxyphenyl) imidazole-5-yl] -1- (2,4-dyftorofenyl) prop-2-en-1-one 3- [4-chloro-1- (3-methylphenyl) imidazole-5-yl] -1- (4-chlorophenyl) prop-2-en-1-one {[5- [3- (3-chlorophenyl) -3-oksoprop-1-en-1-yl] -1- (1-naphthyl) -1H-imidazole-4-yl] thio} acetic acid 3- (4-chloro-1-fenylimidazol-5-yl) (4-ftorofenyl) prop-2-en-1-one Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration 31, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 31,25 62,5 31, ,62 15, , ,62 31,25

61 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 149 MIC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group Group of 5-carbofunctionalized imidazoles Fig. 1. Average values of minimal inhibitory concentration (MIC) of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning reference-strain of S. aureus АТСС (µg/ml) Fig. 1 demonstrates that the lowest average values of MIC (57,29±3,51 µg/ml) are specific for 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid (group 5), and the highest ones (244,80±106,50 µg/ml) derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propane-1-ones (group 4). It should be noted that the compounds forming group 4 manifest antibacterial activity concerning S. aureus АТСС within rather wide ranges from 15,62 to 1000 µg/ml (Table 4). The indicated above stipulates rather great importance of the standard error of MIC for this group as a result of a considerable effect of substitutes on the activity of the examined compounds. The derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones (group 3) and thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes and their certain derivatives (group 6) also manifest greater antibacterial activity concerning S. aureus АТСС (Fig. 1). Their average values of MIC are 70,31±12,87 and 71,25±9,11 µg/ml respectively. Rather less activity was manifested by the derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-methylcarbonyls (group 1) and derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 2), the average values of MIC of which are 182,69±17,99 and 234,37±15,63 µg/ml respectively. Similar regularities are found in comparison of bactericidal activity of the examined 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain of S. aureus АТСС (Fig. 2). MBC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group 6 Group of 5-carbofunctionalized imidazoles Fig. 2. Average values of minimal bactericidal concentrations (MBC) of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain S. aureus АТСС (µg/ml)

62 150 V. Świżak i inni Nr 1 Fig. 2 demonstrates that the highest bactericidal activity is manifested by the representatives of the groups 3, 5 and 6 average values of their MBC are within the limits from 157,50±20,45 to 179,70±27,54 µg/ml. On the contrary, the representatives of the groups 1, 2 and 4 manifest less bactericidal action from 340,30±97,22 to 468,75±31,25 µg/ml were their average values of MBC. The regularities found in comparison of antibacterial action of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain of S. aureus АТСС 25923, were characteristic for the reference-strain of E. coli АТСС (Fig. 3 and 4). MIC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group Group of 5-carbofunctionalized imidazoles Fig. 3. Average values of minimal inhibitory concentration (MIC) of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain E.coli АТСС (µg/ml) MBC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group Group of 5-carbofunctionalized imidazoles Fig. 4. Average values of minimal bactericidal concentrations (MBC) of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain E.coli АТСС (µg/ml) As to E. coli АТСС the most active were the derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones (group 3), derivatives of 2,4-disubstituted 1-arylimidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid (group 5), and thiosemicarbazones of

63 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 151 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 6). Average values of their MIC were from 35,16±3,91 (group 5) to 77,50±11,71 (group 6) µg/ml (Fig. 3), and MBC - from 151,00±17,97 (group 5) to 171,90±22,87 (group 3) µg/ml (Fig. 4). The derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-methylcarbonyls (group 1) and derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 2), 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propane-1-ones (group 4) similar to the case with S. aureus АТСС 25923, manifested rather less antibacterial activity concerning E.coli АТСС Average values of their MIC were from 218,80±20,46 to 230,77±27,76 µg/ ml (Fig. 3), and MBC - from 298,60±97,59 to 451,93±59,27 µg/ml (Fig. 4). Examination of anticandidiasis action of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles found that the representatives of the 4 and 6 examined groups have MIC concerning the reference-strain C. albicans АТСС lower than 50 µg/ml (Fig. 5). MIC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group Group of 5-carbofunctionalized imidazoles Fig. 5. Average values of minimal inhibitory concentration (MIC) of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain C.albicans АТСС (µg/ml) The highest anticandidiasis action is manifested by the derivatives of 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones (group 3), derivatives of 2,4-disubstituted 1-arylimidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid (group 5). Average values of their MIC were 21,48±2,86 and 23,43±4,08 µg/ml (Fig. 5). Lower anticandidiasis activity was manifested by the derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-methylcarbonyls (group 1) and thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 6). Average values of their MIC were 37,27±8,58 and 36,25±9,41 µg/ml. The derivatives of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes (group 2) and 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propane-1-ones (group 4) have average values of MIC 187,50±23,62 and 239,60±143,70 µg/ml (Fig. 5). Average values of MYC of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles are presented in Fig.6.

64 152 V. Świżak i inni Nr 1 MYC [µg/ml] group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 group 6 Group of 5-carbofunctionalized imidazoles 0 Fig. 6. Average values of minimal yeasticidal concentrations (MYC) of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles concerning the reference-strain C.albicans АТСС (µg/ml) Fig. 6 demonstrates that the highest yeasticidal activity is manifested by the representatives of the groups 3, 6, 5 and 1 average values of their MYC were within the limits from 60,55±27,45 to 93,75±25,76 µg/ml. On the contrary, the representatives of the groups 4 and 2 manifest less yeasticidal action - 303,80±140,90 and 406,20±45,75 µg/ml respectively were their average values of MYC. Table 4. Antimicrobial activity of derivatives 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propane-1- one (µg/ml). Cipher compound The name of the compound 3- (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl) -1- (4-ftorofenil) -4-nitrobutan-1- one 3- [4-chloro-1- (4-methylphenyl) imidazole-5-yl] -1- (3-chlorophenyl) -4-nitrobutan-1- one 3- [4-chloro-1- (4-methylphenyl) imidazole-5-yl] -1- (2,4-dyhlorofenil) -4-nitrobutan- 1-one 3- [4-chloro-1- (3-methylphenyl) imidazole-5-yl] -1- (2,4-dyftorofenil) -4-nitrobutan- 1-one S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC , ,62 31, , , ,62 31, ,25 62,5 15,62 15,62

65 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 153 Cipher compound The name of the compound 3- (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl] (2,4-dyftorofenil) -4-nitrobutan- 1-one 3- (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl] (pyrazine-2-yl) -4-nitrobutan- 1-one 3- [4-chloro-1- (4-methylphenyl) imidazole-5-yl] (2,4-dyftorofenil) -4-nitrobutan- 1-one 3- (4-chloro-1-fenilimidazol-5-yl] (3-chlorophenyl) -4-nitrobutan- 1-one 3- (4-chloro-1-fenilimidazol yl] -1- (2,4-dyhlorofenil) -4-nitrobutan-1-one Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC ,25 62,5 62, , ,25 31,25 15,62 62,5 62, ,25 62,5 62, , Comparison of antibacterial action of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles has found the following. Average values of minimal inhibitory concentration (MIC) concerning reference-strain of S. aureus АТСС were within wide scales (Fig. 1). Table 5. Antimicrobial activity of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-ylidene-hydrazones of isonicotinic acid (µg/ml). Cipher compound The name of the compound ({1-(4-fluorophenyl)-5-[(E)- (isonicotinoylhydrazono)methyl]- 1H-imidazol-4-yl}thio)acetic acid N -{(1E)-[4-chloro-2-(2- chlorophenyl)-1-phenyl-1himidazol-5-yl]methylene} isonicotinohydrazide N -{(1E)-[4-chloro-1-(2- methylphenyl)-1h-imidazol-5-yl] methylene}isonicotinohydrazide S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 62, , , , , , ,25 62,5 15,62 62,5 15,62 31,25

66 154 V. Świżak i inni Nr 1 Cipher compound 1587 The name of the compound N -{(1E)-[2,4-dichloro-1-(4- fluorophenyl)-1h-imidazol-5-yl] methylene}isonicotinohydrazide N -{(1E)-[4-(benzylthio)-1-phenyl H-imidazol-5-yl]methylene} isonicotinohydrazide ({5-[(E)-(isonicotinoylhydrazono) 1848 methyl]-1-phenyl-1h-imidazol-4-yl} thio)acetic acid {[5-[(E)-(isonicotinoylhydrazono) 1849 methyl]-1-(1-naphthyl)-1himidazol-4-yl]thio}acetic acid {[5-[(E)-(isonicotinoylhydrazono) 1850 methyl]-1-(3-methylphenyl)-1himidazol-4-yl]thio}acetic acid {[5-[(E)-(isonicotinoylhydrazono) 1851 methyl]-1-(4-methylphenyl)-1himidazol-4-yl]thio}acetic acid {[5-[(E)-(isonicotinoylhydrazono) 1854 methyl]-1-(2-methylphenyl)-1himidazol-4-yl]thio}acetic acid N -((1Z)-{3-[4-(trifluoromethyl) 2618 phenyl]-1h-pyrazol-4-yl}methylene) isonicotinohydrazide Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 62, , ,25 31,25 62, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 62, , ,62 31,25 31,25 62,5 31, ,62 15,62 Table 6. Antimicrobial activity of thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5- carbaldehydes and some of their derivatives (µg/ml). Cipher compound The name of the compound 4-chloro-1-(2-methylphenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 2,4-dichloro-1-(4-fluorophenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 62, ,25 62,5 31,25 62,5 62, ,25 62,5 31,25 62,5

67 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 155 Cipher compound The name of the compound 2-azido-4-chloro-1-(4- methylphenyl)-1h-imidazole-5- carbaldehyde thiosemicarbazone 4-chloro-1-methyl-2-(3- nitrophenyl)-1h-imidazole-5- carbaldehyde thiosemicarbazone 4-mercapto-1-phenyl-1H-imidazole- 5-carbaldehyde thiosemicarbazone [(5-{(E)-[(aminocarbonothioyl) hydrazono]methyl}-1-phenyl-1himidazol-4-yl)thio]acetic acid 4-chloro-2-(2-chlorophenyl)- 1-phenyl-1H-imidazole-5- carbaldehyde thiosemicarbazone 4-chloro-2-methoxy-1-methyl- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 4-chloro-2-(cyclohexylthio)- 1-phenyl-1H-imidazole-5- carbaldehyde thiosemicarbazone 4-(benzylthio)-1-phenyl-1Himidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 2-amino-4-chloro-1-(4- methylphenyl)-1h-imidazole-5- carbaldehyde thiosemicarbazone 4-chloro-1-(4-fluorophenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 4-chloro-1-(4-methylphenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 2,4-dichloro-1-(4-chlorophenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 2,4-dichloro-1-(4-fluorophenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone 2,4-dichloro-1-(4-methylphenyl)- 1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone {[5-{(E)-[(aminocarbonothioyl) hydrazono]methyl}-1-(2- methylphenyl)-1h-imidazol-4-yl] thio}acetic acid S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 31,25 62,5 31,25 62,5 62, , ,25 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 62, ,62 15,62 62, , ,25 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 15,62 15,62 62,5 62,5 31,25 62,5 15,62 31,25 31,25 62,5 62,5 62,5 15,62 31,25 31, , ,62 31,25 62, , , , ,62 15,62 62, , ,62 15,62 62, , ,25 62,5 62, , ,25 31,25 62, , ,25 62,5 62, , ,62 15,62

68 156 V. Świżak i inni Nr 1 Cipher compound The name of the compound {[5-{(E)-[(aminocarbonothioyl) hydrazono]methyl}-1-(1-naphthyl)- 1H-imidazol-4-yl]thio}acetic acid {[5-{(E)-[(aminocarbonothioyl) hydrazono]methyl}-1-(4- chlorophenyl)-1h-imidazol-4-yl] thio}acetic acid {[5-{(E)-[(aminocarbonothioyl) hydrazono]methyl}-1-(4- methylphenyl)-1h-imidazol-4-yl] thio}acetic acid [(2Z)-2-((2E)-{[4-chloro-1-(4- fluorophenyl)-1h-imidazol-5-yl] methylene}hydrazono)-4-oxo-1,3- thiazolidin-5-yl]acetic acid [(1-(1-naphthyl)-5-{(E)-[(4-oxo-4,5- dihydro-1,3-thiazol-2-yl)hydrazono] methyl}-1h-imidazol-4-yl)thio] acetic acid {[5-((E)-{(2Z)-[5-(carboxymethyl)- 4-oxo-1,3-thiazolidin-2-ylidene] hydrazono}methyl)-1-(4- fluorophenyl)-1h-imidazol-4-yl] thio}acetic acid ((2Z)-2-{(2E)-[(4-chloro-1-phenyl- 1H-imidazol-5-yl)methylene] hydrazono}-4-oxo-1,3-thiazolidin-5- yl)acetic acid [(2Z)-2-((2E)-{[2,4-dichloro-1-(4- fluorophenyl)-1h-imidazol-5-yl] methylene}hydrazono)-4-oxo-1,3- thiazolidin-5-yl]acetic acid Notes: MIC - minimal inhibitory concentration MBC - minimum bactericidal concentration MYC - minimum yeasticidal concentration S.aureus ATCC E.coli АТСС C.albicans АТСС MIC MBC MIC MBC MIC MYC 62,5 62,5 62, ,62 15, ,62 15,62 62, ,62 31,25 62, , , ,5 62, ,25 62, , ,62 31, , ,5 125 It should be noted that examined 5-carbofunctionalized imidazoles in general manifest anticandidiasis action higher than that of their antibacterial activity (Tables 1-6). For example, average values of MIC of all the six groups of examined compounds concerning the reference-strain C. albicans АТСС were 90,92±32,04 µg/ml, while their average values of MBC - 139,20±29,71 µg/ml concerning E. coli АТСС and 143,45±27,60 µg/ml concerning S. aureus АТСС Similar regularities were found concerning yeasticidal and bactericidal concentrations of the examined 5-carbofunctionalized imidazoles - their average values were 167,14±46,33, 279,73±42,57 and 284,66±41,26 µg/ml respectively.

69 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu 157 Antimicrobial activity of the examined compound was found to depend on their chemical structure. For example, examination of the influence of chemical structure of the derivatives of 2,3-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-methylcarbonyls and 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes on their antimicrobial activity found that the level of biological activity is affected by the group of a substitute in the position of 5-imidazole cycle and the substitutes in the positions of 1, 2 and 4 (Tables 1-2). In particular, the compounds of a similar structure having in the position 5 alcohol-hydroxyl, demonstrated twofold activity as compared to the compounds with aldehyde group. Introduction of aryl substitute of fluorine lipophilic atom into the aromatic cycle decreases bactericidal action while introduction of methyl group intensifies it. Changing hydrogen atom in the position 2 into chlorine atom does not practically influence on the value of antimicrobial action of compounds. DISCUSSION Ever since the discovery of imidazole as early as the 1840s, the research and development of imidazole-based compounds have been quite a rapidly developing and increasingly active field due to their wide potential applications as medicinal drugs, agrochemicals, artificial materials, artificial acceptors, supramolecular ligands, biomimetic catalysts, etc. Applications of pharmacological imidazole derivatives in medicinal chemistry (as anticancer, antifungal, antibacterial, antituberculous, antiparasitic, antihistaminic, antineuropathic, antihypertensive, antiinflammatory, antiviral, and other medicinal agents) have especially achieved great progress (32). Azole compounds such as imidazoles and triazoles are the first class of synthetic antifungal agents. However, along with a widespread use of current antifungal drugs, the increasing fungal resistance has largely influenced on their therapeutic effects (10,26). Thus, the search of structurally new imidazoles with more effective, less toxic, and less resistance remains to be a highly challenging task and has aroused great interest to medicinal chemistry (14). In addition to investigation of structural modifications of clinical drugs, development of imidazole antifungal compounds with a new structural skeleton is one more significant direction (32). Taking into account the mentioned above, 75 new synthesized compounds were selected to compare their antimicrobial properties belonging to six different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles. Comparison of antimicrobial activity of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles enabled to select their most promising groups (thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes and their certain derivatives, 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid, and 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones) and representatives (N -{(1E)- [4-chloro-1-(2-methylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]methylene}isonicotinohydrazide, N - ((1Z)-{3-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-pyrazol-4-yl}methylene)isonicotinohydrazide, 4-chloro-2-(2-chlorophenyl)-1-phenyl-1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone, 3-[4-chloro-1-(4-methoxyphenyl) imidazole-5-yl]-1-(2,4-dyftorofenyl) prop-2-en-1-one, and {[5- [3-(3-chlorophenyl)-3-oksoprop-1-en-1-yl]-1-(1-naphthyl)-1H-imidazole-4-yl] thio} acetic acid). In the indicated representatives of 5-carbofunctionalized imidazoles a minimal inhibiting concentrations concerning the reference-strain C. albicans АТСС

70 158 V. Świżak i inni Nr were 15,62 µg/ml, concerning E. coli АТСС and S. aureus АТСС ,62-31,25 µg/ml. The obtained results of antimicrobial activity of 5-carbofunctionalized imidazoles were compared with the values of antimicrobial activity of other imidazole derivatives presented in scientific literature. Comparison of anticandidiasis activity has found the following. Fluconazole is a well-known first-line antifungal drug recommended by the World Health Organization (WHO). Its exceptional therapeutic record for Candida infections has received special attention. However, several disadvantages including increase of fluconazole-resistant C. albicans isolates together with a wide clinical use of fluconazole, low water solubility, ineffectiveness against invasive aspergillosis and non-fungicide limit its clinical use. Therefore, much work has been devoted to further structural modification of fluconazole. Fluconazole analogues manifest antifungal activity with MIC values of 32 µg/ml against C. albicans, C. mycoderma, C. utilis, and Beer yeast (33). We have determined that 33 out of 75 examined representatives of 5-carbofunctionalized imidazoles possess minimal inhibiting concentration concerning the reference-strain C. albicans АТСС on the level of 15,62 µg/ml, which is twice as less than MIC of fluconazole analogues. Chromene-based imidazole manifested anti-c. albicans activity with MIC value of 12,5 µg/ml as compared to ketoconazole (MIC = 12,5 µg/ml) (25). The indicated results of anticandidiasis activity of chromene-based imidazoleare close to those obtained for 5-carbofunctionalized imidazoles (15,62 µg/ml). Experimental MIC values of substituted imidazole derivatives concerning Candida albicans (ATCC 10231), Candida albicans (ATCC 24433) were found to be on the level of μg/ml (12). These results are close to our obtained data as well. Minimal inhibitory concentration of 4-chloro-5-(2-nitrovinyl)-1h-imidazoles and products of their interaction with 3-methyl-2-pyrazolin-5-one concerning C. albicans was found to be on the level of µg/ml (9). The investigations performed by us demonstrated that 5-carbofunctionalized imidazoles manifest 8-16 times higher anticandidiasis activity as compared to 4-chloro-5-(2-nitrovinyl)-1h-imidazoles and products of their interaction with 3-methyl-2-pyrazolin-5-one. Anticandidiasis activity of 5-carbofunctionalized imidazoles is on the level of anticandidiasis activity of ketoconazole (MIC = 12,5 μg/ml) (25), but it is less than that of clotrimazole (MIC = 5 µg/ml) (19) and fluconazole (MIC = 1 μg/ml) (12). Comparison of antibacterial activity has found the following. Carbazole-based imidazoles bearing alkyl or aralkyl linker displayed compatible or even superior antibacterial activities with MIC values in the range of 1-8 µg/ml to chloramphenicol and norfloxacin toward S. aureus, methicillin-resistant S. aureus (MRSA), Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and B. proteus (31). Antibacterial activity of the examined 5-carbofunctionalized imidazoles concerning E. coli АТСС and S. aureus АТСС is 2-16 times lower than that of indicated carbazole-based imidazoles. Triphenyl imidazole derivatives can effectively inhibit the growth of E. coli and S. aureus with MIC values in the range of µg/ml, which was comparable to tetracycline (MIC = 250 µg/ml) (22,23). The studies performed by us demonstrated that

71 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu carbofunctionalized imidazoles manifest antibacterial activity times as much as compared to triphenyl imidazole derivatives. Therefore, review of scientific literature showed that investigated 5-carbofunctionalized imidazoles manifest in a number of cases antibacterial activity higher or equal to that of new synthetic derivatives of imidazole and medicines applied in clinical practical work. Although in a part of cases they demonstrate lower activity. From one side, it is indicative of availability of 5-carbofunctionalized imidazoles as antimicrobial means (first of all anticandidal compounds), and on the other hand, it stipulates the need of further search of new representatives of 5-carbofunctionalized imidazoleswith more pronounced antimicrobial activity. Successful strategies and structure-activity relationships are discussed (32). Therefore, we have studied the effect of chemical structure of 5-carbofunctionalized imidazoles on their antimicrobial activity. At the same time we have determined that antimicrobial activity of 5-carbofunctionalized imidazoles depends on their chemical structure. Comparison of antimicrobial activity of different representatives of 5-carbofunctionalized imidazoles determined by us regularities of «chemical structure - antimicrobial activity» dependence enabled to substantiate recommendations concerning the following synthesis of new antimicrobial chemical compounds. CONCLUSIONS 1. 5-carbofunctionalized imidazoles manifest their antimicrobial activity concerning Gram-positive bacteria (S. aureus АТСС 25923), Gram-negative bacteria (E. coli АТСС 25922), and simply yeast (C. albiсans АТСС ) which enable to consider them as chemical compounds with a wide spectrum of antimicrobial action. At the same time their anticandidiasis activity is higher than that of antibacterial action. 2. Minimal yeasticidal concentration of 5-carbofunctionalized imidazoles in an average was 1,84 times higher and minimal bactericidal concentration was in an average twice as much their minimal inhibitory concentration. 3. Comparison of antimicrobial activity of different groups of 5-carbofunctionalized imidazoles enabled to select their most promising groups (thiosemicarbazones of 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-carbaldehydes and their certain derivatives, 2,4-disubstituted 1-aryl-imidazole-5-ilidenhydrazones of isonicotinic acid, and 2,4-disubstituted 3-(1-aryl-imidazole-5-il) propene-1-ones) and representatives (N -{(1E)- [4-chloro-1-(2-methylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]methylene}isonicotinohydrazide, N - ((1Z)-{3-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-pyrazol-4-yl}methylene)isonicotinohydrazide, 4-chloro-2-(2-chlorophenyl)-1-phenyl-1H-imidazole-5-carbaldehyde thiosemicarbazone, 3-[4-chloro-1-(4-methoxyphenyl) imidazole-5-yl]-1-(2,4-dyftorofenyl) prop-2-en-1-one, and {[5- [3-(3-chlorophenyl)-3-oksoprop-1-en-1-yl]-1-(1-naphthyl)-1H-imidazole-4-yl] thio} acetic acid). 4. Antimicrobial activity of 5-carbofunctionalized imidazoles depends on their chemical structure. The regularities of «chemical structure - antimicrobial activity» dependence and comparison of antimicrobial activity of different representatives of 5-carbofunctionalized imidazoles enabled us to substantiate recommendations concerning the following synthesis of new antimicrobial chemical compounds.

72 160 V. Świżak i inni Nr 1 REFERENCES 1. Amábile-Cuevas CF. Antibiotics and Antibiotic Resistance in the Environment. Mexico 2015, Berendonk T, Manaia C, Merlin C et al. Tackling antibiotic resistance: the environmental framework. Nat Rev Microbiol 2015; 13: Bhullar K, Waglechner N, Pawlowski A et al. Antibiotic resistance is prevalent in an isolated cave microbiome. PLoS ONE 2012; 7: Botelho AM, Nunes ZD, Asensi MD et al. Characterization of coagulase-negative staphylococci isolated from hospital indoor air and a comparative analysis between airborne and inpatient isolates of Staphylococcus epidermidis. J Med Microbiol 2012; 61: Carlet J, Jarlier V, Harbarth S et al. Ready for a world without antibiotics? The pensières antibiotic resistance call to action. Antimicrob Resist Infect Control 2012; 1: Chornous VA, Grozav AN, Klyukovskii DV et al. Polyfunctional imidazoles: VII. 1-aryl-4-chloro-5-[hydroxy(halo)methyl]-1H-imidazoles and their derivatives. Russ J Org Chem 2013; 49: Chornous VA, Grozav AN, Rusanov EB et al. Polyfunctional imidazoles: II. Synthesis and reactions with nucleophilic reagents of 1-substituted 2,4-dichloro-1H-imidazole- 5-carbaldehydes. Russ J Org Chem 2011; 47: Chornous VA, Grozav AN, Todoriko LD et al. Synthesis and Biological Activity of 4-Chloro- 1H-Imidazole-5-Carbaldehyde Thiosemicarbazones. Pharm Chem J 2014; 47: Chornous VO, Mel nyk OYa, Grozav AM et al. Synthesis and antimicrobial activity of 4-chloro-5-(2-nitrovinyl)-1h-imidazoles and products of their interaction with 3-methyl-2-pyrazolin-5-one. J of Organic and Pharm Chemistry 2014; 12: Costa C, Pires C, Cabrito TR et al. Candida glabrata drug: H+ antiporter CgQdr2 confers imidazole drug resistance, being activated by transcription factor CgPdr1. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: Davin-Regli A, Pages J-M. Cross-resistance between biocides and antimicrobials: an emerging question. Rev sci tech Off int Epiz 2012; 31: Gupta AK, Jain A, Mishra S, Jiaswal A. Design and Synthesis of Substituted Imidazole Derivatives as Antifungal Agents. Internat J of Drug Design and Discovery 2012; 3: Kasprzyk J, Piechowicz L, Wiśniewska K et al. Zróżnicowanie typów spa i kaset SCCmec u klinicznych szczepów Staphylococcus aureus opornych na metycylinę izolowanych w ośrodkach regionu gdańskiego. Med Dośw Mikrobiol 2015; 67: Lamberth C, Dumeunier R, Trah S, et al. Synthesis and fungicidal activity of tubulin polymerisation promoters. Part 3: Imidazoles. Bioorg Med Chem 2013; 21: Lewis K. Persister cells: molecular mechanisms related to antibiotic tolerance. Springer Berlin Heidelberg 2012; 211: Lisiecki P. Lekooporność a wytwarzanie sideroforów u bakterii z rodzaju Enterococcus. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: Mel nik OY, Chornous VA, Vovk MV. Polyfunctional imidazoles: IX. Synthesis of 1-aryl-5-(2-aryl-3,4-dihydro-2H-pyrrol-4-yl)-4-chloro-1H-imidazoles. Russ J Org Chem 2015; 51:

73 Nr 1 5-funkcjonalizowane pochodne imidazolu Metodychni vkazivky Vyznachennja chutlyvosti mikroorganizmiv do antybakterial nyh preparativ. [Guidelines Determination of the sensitivity of microorganisms to antibiotics]. Kyiv: MOZ Ukrai ny 2007, 63. [in Ukrainian]. 19. Padmavathi V, Mahesh K, Reddy GD, Padmaja A. Synthesis and bioassay of pyrrolyl oxazolines and thiazolines. Eur J Med Chem 2010; 45: Pawelec M, Skrzeczyńska J, Połowniak-Pracka H et al. Kolonizacja przewodu pokarmowego szczepami wieloopornymi u pacjentów hospitalizowanych w Centrum Onkologii - Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie. Med Dośw Mikrobiol 2016; 68: Pei R, Joyner M, Knisley J. Revised Model for Antibiotic Resistance in a Hospital. East Tennessee state university 2015, Satyanarayana VSV, Sivakumar A, Ghoshb AR. Ultrasound-assisted synthesis of some new Schiff base derivatives incorporating imidazole moiety, their characterization and biological evaluation. J Pharm Res 2010; 3: Satyanarayana VSV, Sivakumar A. An efficient and novel one-pot synthesis of 2,4,5-triaryl-1-imidazoles catalyzed by UO2 (NO3)2-6H2O under heterogeneous conditions. Chem Pap 2011; 65: Sengupta S, Chattopadhyay MK, Grossart H-P. The multifaceted roles of antibiotics and antibioticresistance in nature. Front Microbiol 2013; 4: Thareja S, Verma A, Kalra A et al. Novel chromeneimidazole derivatives as antifungal compounds: Synthesis and in vitro evaluation. Acta Pol Pharm 2010; 67: Tommasi R, Brown DG, Walkup GK et al. ESKAPEing the labyrinth of antibacterial discovery. Nat Rev Drug Discov 2015; 14: Urbaniak A, Głowacka A, Kowalczyk E et al. Przeciwbakteryjne działanie olejku cynamonowego na wybrane bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: Waksmańska W, Wiczkowski A, Bobiński R, Ślemp-Migiel A. Zakażenia gronkowcowe w Podhalańskim Szpitalu Specjalistycznym im. Jana Pawła II w Nowym Targu w latach analiza antybiotykoporności. Med Dośw Mikrobiol 2017; 69: Wiercińska O, Chojecka A, Kanclerski et al. Znaczenie pomp efflux w wielolekowej oporności Gram-ujemnych bakterii. Med Dośw Mikrobiol 2015: 67: Willems R. EVOTAR - Evolution and Transfer of Antibiotic Resistance - FP7 Project. Impact 2016; 1: Zhang FF, Gan LL, Zhou CH. Synthesis, antibacterial and antifungal activities of some carbazole derivatives. Bioorg Med Chem Lett 2010; 20: Zhang L, Peng XM, Damu GL et al. Comprehensive review in current developments of imidazole-based medicinal chemistry. Med Res Rev 2014; 34: Zhang SL, Chang JJ, Damu GLV et al. Berberine azoles as antimicrobial agents: Synthesis, biological evaluation and their interactions with human serum albumin. MedChemComm 2013; 4: Received: 31 V 2017 Author`s Address: 58002, Ukraina, Czerniowce, Plac Teatralny, 2 Stan Bukovina Uniwersytet Medyczny, Zakład Mikrobiologii i Wirusologii,

74

75 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Mikrobiota jelitowa jako potencjalna przyczyna zaburzeń funkcjonowania emocjonalnego człowieka Gut microbiota and its potential contribution to human emotional disorders Karolina Skonieczna-Żydecka 1, Igor Łoniewski 1,2, Wojciech Marlicz 3#, Beata Karakiewicz 4 1 Zakład Biochemii i Żywienia Człowieka, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie 2 Sanprobi Sp. z o.o. Sp. K, Szczecin, Poland 3 Department of Gastroenterology, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie 4 Katedra i Zakład Zdrowia Publicznego, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie W 2013 roku zespół badaczy pod kierownictwem Cryan a wprowadził termin psychobiotyk dla określenia nowej generacji preparatów probiotycznych wykazujących korzyści zdrowotne u pacjentów leczonych z powodu zaburzeń emocjonalnych i psychicznych. Wykazano bowiem, że brak równowagi mikrobiologicznej w jelicie odgrywa rolę w patogenezie oraz wpływa na przebieg kliniczny zaburzeń neurorozwojowych (autyzm) i emocjonalnych (depresja, schizofrenia) oraz schorzeń neurodegeneracyjnych (choroba Parkinsona i Alzhaimera). Słowa kluczowe: mikrobiota, zaburzenia emocjonalne, probiotyki ABSTRACT In 2013, a team of researchers led by Cryan introduced the term psychobiotics to describe a new generation of probiotic formulas that demonstrate health benefits in patients treated for psychopatic disorders. It has been shown that microbiota imbalance in the gut plays a role in the pathogenesis and clinical course of neurodevelopmental (autism spectrum disorders), emotional (depression, schizophrenia) and neurodegenerative disorders (Parkinson s and Alzheimer s disease). Key words: microbiota, emotional disorders, probiotics

76 164 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr 1 WPROWADZENIE Jelita człowieka są skolonizowane przez mikroorganizmy, w tym bakterie, archeowce, wirusy oraz eukaryota, określane mianem mikrobioty jelitowej. Mikrobiota jelitowa zdominowana jest przez bakterie należące do typów Firmicutes oraz Bacteroidetes. Mniej liczne są typy Proteobacteria oraz Actinobacteria i Fuscobacteria (25). Ten złożony ekosystem podlega nieustannym zmianom w życiu człowieka. Kompozycja mikrobioty jelitowej kształtowana jest podczas porodu, zależy od sposobu karmienia małego dziecka, diety w kolejnych latach życia, farmakoterapii (głównie antybiotyki, steroidy, inhibitory pompy protonowej) oraz przebytych stanów zapalnych i procedur zabiegowych w obrębie przewodu pokarmowego. Biocenoza ta jednak nieustannie dąży do zachowania homeostazy, tak ilościowej jak i jakościowej wykazując dodatni wpływ na zdrowie gospodarza (30). Mikrobiota jelitowa pełni funkcje metaboliczną, troficzną oraz immunologiczną w organizmie człowieka, przy czym uzupełniają się one wzajemnie (58). Metaboliczną aktywność bakterii jelitowych opisują zdolności flory jelitowej do rozkładu niestrawionych resztek pokarmowych w drodze fermentacji. Produktami tych przemian są m.in. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (ang. short chain fatty acids SCFAs) stanowiące źródło energii dla kolonocytów. Metabolity te wpływają również ciągłość nabłonka jelitowego (endothelium) i na parametry morfologiczne jego komórek, tj. liczbę komórek wyściełających kosmki jelitowe i krypty, realizując funkcję troficzną mikrobiota (30). Szczególną rolę odgrywa produkcja maślanu, którego dominującymi producentami są Faecalibacterium prausnitzii, z rodzaju Clostridium oraz Butyrivibrio i Eubacterium (23). Wybrane rodzaje bakterii jelitowych, w tym również mikrobiota jelita cienkiego, produkują witaminy, głównie K oraz z grupy B. Mikrobiota jelitowa zwiększa również przyswajalność składników mineralnych, zaś produkując hydrolazy odgrywa rolę w procesie trawienia lipidów co znajduje odzwierciedlenie w parametrach gospodarki lipidowej pacjenta. Stymulacja syntezy mucyn przez drobnoustroje jelitowe jest jednym z czynników chroniących endothelium przed inwazją patogenów i toksyn zapobiegając ich translokacji do układu krwionośnego i w konsekwencji rozwojowi systemowego stanu zapalnego. Wykazując działanie oparte na zasadach tzw. inhibicji kompetycyjnej o biotop oraz składniki odżywcze, bakterie komensalne jelit rywalizują z drobnoustrojami chorobotwórczymi ograniczając możliwości ich kolonizacji. Proces ten przebiega przy współudziale jelitowych białek przeciwdrobnoustrojowych (bakteriocyn) oraz innych produktów metabolizmu mikrobioty (np. jony wodorowe) (30). Mikroorganizmy tworzące ekosystem jelitowy uczestniczą w sprawnej i szybkiej eliminacji szkodliwych antygenów obecnych w świetle jelita. Proces ten odbywa się w drodze molekularnej, poprzez przyłączenie struktur bakteryjnych do receptorów TLR (ang. Toll Like Receptors) oraz domen NOD (ang. Nucleotide Oligomerisation Domain). Sprawne i prawidłowe mechanizmy interakcji mikrobioty jelitowej z komórkami tkanki limfatycznej przewodu pokarmowego GALT (ang. Gut Associated Lymphoid Tissue) wpływają na wytworzenie tolerancji wobec bakterii komensalnych i antygenów żywności (43).

77 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka 165 STRES A ZACHOWANIE Czynniki stresogenne są rejestrowane przez układ nerwowy. Stresory wewnętrzne (np. głód, pragnienie) docierają do pnia mózgu, zaś stresory zewnętrzne (np. ostre światło, głośne dźwięki) do neuronów somatosensorycznych (odbierających bodźce zmysłowe). Kolejno oba rodzaje stresorów kierowane są do struktur układu limbicznego obejmującego część kory mózgowej, struktury podkorowe (ciało migdałowate) oraz hipokamp (Rycina 1). Dokonują się tutaj: i) analiza oraz ii) przetworzenie informacji z sygnałów nerwowych co skutkuje wyzwoleniem określonych reakcji wegetatywnych i emocjonalnych. Szczególne znaczenie ma również aktywacja układów podwzgórze-przysadka-nadnercza oraz adrenergicznego, skutkująca uwolnieniem hormonów stresu (54). W badaniach na modelach zwierzęcych stosowano liczne metody indukcji stresu w celu wywołania zmian behawioralnych. Do najczęściej stosowanych modeli należą testy wymienione w tabeli 1. Tabela I. Testy indukujące stres w modelach zwierzęcych (20). Model eksperymentalny Test wymuszonego pływania (ang. forced swimming test) Test zawieszenia za ogon (ang. tail suspension test) Test odseparowania od matki (ang. maternal separation) Test chronicznego łagodnego stresu (ang. chronic mild test) Test braku dostępu do wody (ang. water avoidance test) Przebieg testu Zwierzęta zanurza się w cylindrycznym naczyniu wypełnionym letnią wodą do wysokości uniemożliwiającej stanie na dnie. Zwierzę próbuje wydostać się z naczynia, po pewnym czasie rezygnując i zastygając w bezruchu. Czas bezruchu (rezygnacji) jest dodatnio skorelowany z natężeniem zachowań depresyjnych Zwierzę jest uwiązywane za ogon i wieszane w powietrzu. Próbuje uwolnić się od nieprzyjemnej sytuacji. Czas przeznaczony na aktywny wysiłek dążący do uwolnienia się jest wykładnikiem zachowań emocjonalnych. Im dłuższy czas bezruchu tym silniejsze zaburzenia emocjonalne. Test stosowany w badaniach nad stresem w początkowych okresach rozwoju. Młode zwierzęta odseparowuje się od matki w powtarzalnych cyklach, np. 3 godziny dziennie przez 14 kolejnych dni, wywołując u nich zaburzenia emocjonalne. Łagodne bodźce stresowe, np. zmiany temperatury, oświetlenia, ograniczenie dostępu do pokarmu stosuje się naprzemiennie przez kilka tygodni. Zmiany w zachowaniu zwierząt (anhedonia) nie ustępują nawet po kilku tygodniach od zaprzestania działania bodźców Zwierzę umieszczane jest na platformie znajdującej się w zbiorniku z wodą. Jednocześnie stosuje się deprywację pojenia w celu wywołania stresu psychologicznego (agresji) Model przewlekłego. Nieprzewidywalnego stresu (ang. chronic unpredictable stress) Drastyczne bodźce stresowe, np. unieruchomienie, zanurzanie w zimnej wodzie stosowane są do momentu (ok. 3 tygodni) manifestacji zmian w zachowaniu wywołanych motywacyjną wartością bodźców. Zwierzęta są apatyczne, niezdolne do nauki, a ich reakcja samodrażnienia jest osłabiona.

78 166 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr 1 Rycina 1. Szlaki komunikacji jelita z centralnym układem nerwowym (12). HPA oś podwzgórze- -przysadka-nadnercza, GABA- Kwas γ-aminomasłowy, 5-HT-serotonina ZACHOWANIE A MIKROBIOTA Badania naukowe potwierdzają, że zachowanie jest częściowo wykładnikiem kompozycji mikrobioty jelitowej. Jelito oraz mózg komunikują się bowiem ze sobą poprzez oś mózgowo-jelitową (42). Stanowi ona zespół neuronów, w tym nerw błędny oraz włókna zazwojowe Auerbach a i Meissner a, które łączą CUN człowieka z przewodem pokarmowym oraz jego gruczołami dodatkowymi tj. trzustką i wątrobą (55). Komunikacja pomiędzy jelitem a mózgowiem ma dwukierunkowy charakter, a zaangażowane są w nią czynniki neuronalne, endokrynne oraz immunologiczne (rycina 1) (32). Wyniki badań naukowych sugerują, że zespół mikroorganizmów jelitowych wydzielając szereg substancji neuroaktywnych oraz immunokompetentnych kształtuje właściwą strukturę oraz funkcje obszarów mózgowia zaangażowanych w kontrolę emocji, aktywność ruchową oraz zdolności poznawcze (9, 14, 19). Wykazano, że mikrobiota jelitowa zaangażowana jest w procesy mielinizacji neuronów kory przedczołowej (22) oraz współuczestniczy w kształtowania ultrastruktury ciała migdałowatego oraz hipokampu (29). W literaturze tematu postuluje się również udział mikrobioty jelitowej w patogenezie oraz przebiegu klinicznym zaburzeń neurorozwojowych (31), emocjonalnych (18, 50) oraz schorzeń neurodegeneracyjnych (34, 39). Udowodniono, że endotoksyny uwalniane przez drobnoustroje patogenne (lipopolisacharyd) mogą wpływać na nastrój oraz zdolności poznawcze w drodze pośredniej związanej z aktywacją układu odpornościowego, lub bezpośredniej poprzez receptory Toll-podobne zlokalizowane na powierzchni komórek glejowych (33).

79 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka 167 Zaburzenia równowagi w obrębie mikrobioty jelitowej, określane mianem dysbiozy, wywołują zmiany w przepuszczalności bariery jelitowej. Bariera jelitowa to fizyczna struktura obecna w jelicie, którą tworzą komórki nabłonkowe pokryte warstwą ochronnego śluzu zasiedlanego przez zespół mikroorganizmów jelitowych oraz komórki układu krwionośnego, chłonnego, immunologicznego i nerwowego (45). Najistotniejszym elementem bariery jest tzw. monowarstwa komórek nabłonkowych. Tworzą ją przede wszystkim enterocyty (80%), odpowiedzialne za wchłanianie składników odżywczych z pożywienia, ale i wzbudzające aktywność odpornościową poprzez sekrecję cytokin i ekspresję receptorów immunologicznych w błonie komórkowej. Warstwa nabłonkowa zawiera także komórki kubkowe, Panetha oraz M, których zadaniem jest odpowiednio produkcja śluzu, synteza defensyn i wychwyt antygenów ze światła jelita (45). Obecne w pojedynczej warstwie nabłonkowej komórki enterchromatofilne uwalniają hormony i neuropeptydy. Integralność bariery jelitowej zapewniają ścisłe połączenia miedzy komórkami nabłonkowymi jelita, tzw. ścisłe złącza (ang. Tight junctions, TJ). Są to kompleksy wielobiałkowe zbudowane z klaudyn, okludyn, białek adhezyjnych (ang. junctional adhesion molecules, JAM) oraz triceluliny (rycina 2). Jako białka przezbłonowe, kontaktują one cytozol z proteinami zonula occludens (ZO), które z kolei łączą się cytokszkietelem komórek nabłonka jelitowego. Wskutek fosforylacji łańcuchów lekkich miozyny wyzwalany jest skurcz aktyny co rozluźnia strukturę złącza i pozwala na transport substancji na drodze parakomórkowej. Rycina 2. Struktura złączy ścisłych w szczytowo-bocznej powierzchnia komórek nabłonkowych jelita (37). Kooperacja składowych bariery jelitowej jest niezbędna dla selektywnej absorpcji składników odżywczych, jonów i wody oraz sekrecji w jelicie. Jednocześnie strukturalno- -funkcjonalna homoeostaza tej struktury ogranicza pasaż mikroorganizmów chorobotwórczych i innych szkodliwych antygenów do krwi. Dysbioza może upośledzać integralność bariery jelitowej co zaburza komunikację pomiędzy jelitem a CUN. Dochodzi do wzrostu

80 168 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr 1 stężenia antygenów (endotoksyn bakteryjnych oraz niecałkowicie strawionych składników pokarmowych) we krwi co stymuluje wydzielanie mediatorów zapalenia docierających konsekwentnie do mózgowia (14, 19). W efekcie może to wywoływać apoptozę komórek nerwowych i doprowadzić do rozwoju zaburzeń emocjonalnych, ograniczeń poznawczych i innych psychopatologii (19, 30, 31, 41, 46, 50). Sterowanie składem mikrobioty jelitowej może być realizowane przede wszystkim przez suplementację preparatów probiotycznych/prebiotycznych oraz modyfikację żywienia (60). Probiotyki to żywe komórki bakteryjne, które podane w odpowiedniej ilości wykazują korzystny wpływ na zdrowie gospodarza (30). Idea probiotykoterapii zakłada, że egzogenna podaż żywych szczepów bakterii probiotycznych przywróci stan eubiozy (równowagi) w jelicie. Komórki bakteryjne obecne w probiotyku, namnażając się w jelicie po jego podaniu, równolegle zmniejszają liczbę niekorzystnych mikroorganizmów. W ten sposób zostają stworzone optymalne warunki do regeneracji własnej, unikatowej dla każdego mikrobioty jelitowej. W licznych eksperymentach wykazano, że wybrane preparaty probiotyczne, tj. zawierające żywy, bezpieczny oraz o wysokiej aktywności biologicznej szczep bakteryjny wpływają na emocje i zachowanie (30). Jako pierwsze dowodów na udział probiotyków w kształtowaniu zdrowia emocjonalnego dostarczyły badania na zwierzętach. BADANIA NA MODELACH ZWIERZĘCYCH W jednym z pierwszych badań in vivo, testowano wpływ suplementacji szczepem Bifidobacterium infantis na zachowania depresyjne u szczurów poddanych testowi wymuszonego pływania. Ustalono, że probiotykoterapia wywołała zmniejszenie intensywności produkcji cytokin prozapalnych oraz wzrost syntezy tryptofanu - będącego prekursorem serotoniny w CUN testowanych zwierząt (16). Ten sam zespół badawczy w 2010 roku potwierdził antydepresyjne właściwości szczepu B. infantis u zwierząt, które odseparowano od matki. Ustalono, że efektywność probiotykoterapii była porównywalna z farmakoterapią stosowaną w przebiegu zaburzeń depresyjnych (Citalopram). Zastosowana terapia przywróciła również wyjściowe stężenie noradrenaliny w pniu mózgu i ograniczyła intensywność zaburzeń behawioralnych (15). U myszy po zawale mięśnia sercowego probiotykoterapia wykorzystująca szczepy Lactobacillus helveticus R0052 i Bifidobacterium longum R0175 ograniczyła apoptozę komórek nerwowych w strukturach układu limbicznego odpowiedzialnego za emocje (21). Podobnie, suplementacja preparatem zawierającym Lactobacillus rhamnosus JB-1 zmniejszyła natężenie objawów depresyjnych oraz napadów złości u myszy. Udowodniono, że szczep probiotyczny JB-1 wywołał obniżenie ekspresji mrna dla GABA Aα2 w korze przedczołowej i amygdali, a wzrost w hipokampie (8). Zespół neurobiologów kierowany przez Messaoudi (34) udowodnił, że skutki przewlekłego stresu u szczurów zostały ograniczone zastosowaniem preparatu probiotycznego zawierającego Lactobacillus helveticus R0052 oraz Bifidobacterium longum R0175, porównywalnie do efektu obserwowanego po podaży preparatów zawierających diazepam. W tym samym roku Gareau i wsp. (20) zainfekowali szczury łagodnym patogenem jelitowym Citrobacter rodentium. Kiedy u zwierząt wywołano intensywny stres (brak dostępu do wody) zaobserwowano ubytki w pamięci. Probiotykoterapia wykorzystująca szczepy L rhamnosus R0011 oraz L helveticus R0052 stosowana przed oraz równolegle do infek-

81 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka 169 cji ograniczyła utratę zdolności pamięciowych. Ohland i wsp. (38) wykorzystując dziką (normalną) linię myszy oraz zwierzęta pozbawione genu IL-10 (przez to skłonne do infekcji) zaobserwowali, że zachodni model żywienia wywołał u gryzoni dysbiozę i kolejno agresję. Zachowania te ustępowały po suplementacji L. helveticus R0052. W 2014 roku Ait-Belgnaoui i wsp. (1) udowodnili, że suplementacja wspomnianymi szczepami probiotycznymi mediuje funkcjom sieci neuronów koordynujących plastyczność synaptyczną. Probiotyki zmniejszyły aktywację neuronów w jądrze podwzgórza, jądrze przykomorowym ciała migdałowatego oraz zakręcie zębatym hipokampu u zwierząt. Co równie istotne, wskazane szczepy probiotyczne wpłynęły korzystnie na rozwój dendrytów wykazując tym samym zdolność do aktywacji neurogenezy. Liang i wsp. (28) w badaniach na modelu szczurzym dowiedli, że Lactobacillus helveticus NS8 wykazuje zdolności antydepresyjne. U gryzoni, u których eksperymentalnie zaindukowano stres w teście unieruchomienia, zastosowany szczep probiotyczny ograniczył manifestację zachowań agresywnych oraz depresyjnych. W surowicy krwi zwierząt obniżeniu uległo stężenie kortykosteronu w odpowiedzi na ograniczenie syntezy adrenokortykotropiny. Co istotne stężenia serotoniny oraz norepinefryny w hipokampie uległy zwiększeniu, podobnie jak ekspresja neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (ang. brain-derived neurotrophic factor) na poziomie mrna w tym obszarze. Wyniki najnowszych badań (49) sugerują, że probiotykoterapia oparta o Bifidobacterium longum 1714 wpływa korzystnie na procesy uczenia się oraz pamięć. Cowan i wsp. (13) wykazali, że u myszy odseparowanych po urodzeniu od matki, podaż L rhamnosus R0011 oraz L helveticus R0052 zarówno u młodych jak i ojców gryzoni uczestniczy w przywróceniu/kształtowaniu struktury i funkcji obszarów mózgowia zaangażowanych w emocje. BADANIA KLINICZNE - PSYCHOBIOTYKI Zaskakujące wyniki badań przeprowadzonych u zwierząt stanowiły wstęp do badań klinicznych. Zgodnie z definicją psychobiotyku, badania te za cel stawiają ocenę skuteczności probiotykoterapii w terapii zaburzeń nastroju i ograniczeń emocjonalnych. W 2007 roku Benton i wsp. (4) zastosowali szczep Lactobacillus casei Shirota u 124 zdrowych ochotników w 21 dniowej terapii, dowodząc jego udziału w poprawie nastroju analizowanych osób. Dwa lata później, ten sam szczep probiotyczny wykorzystali Rao i wsp. (44) którzy zrekrutowali 35 pacjentów z objawami zespołu przewlekłego zmęczenia. Po 8 tygodniowej suplementacji badacze zaobserwowali istotne obniżenie intensywności zachowań agresywnych u osób otrzymujących probiotyk w porównaniu do początku badania. W tym samym roku Yamamura i wsp. (61) wykazali, że 3 tygodniowa podaż mleka fermentowanego z udziałem Lactobacillus helveticus CM4 istotnie zwiększyła jakość snu i zmniejszyła liczbę wybudzeń nocnych u osób starszych, w średnim wieku 72 lat. Messaoudi i wsp. (34) analizowali wpływ suplementacji szczepami Lactobacillus helveticus R0052 i Bifidobacterium longum R0175 na stężenie wolnego kortyzolu oraz nasilenie objawów lękowych i depresyjnych mierzonych metodami ankietowymi. Po 30 dniach terapii, w 30 osobowej grupie badanej wykazano obniżenie stopnia somatyzacji, lęku, intensywności zachowań depresyjnych oraz wskaźnika agresji-wrogości, a także obniżenie stężenia kortyzolu w osoczu. Probiotykoterapia szczepem Bifidobacterium animalis subsp

82 170 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr 1 lactis DN zawartym w mlecznym napoju fermentowanym stosowana przez 28 dni wywołała korzystne zmiany aktywności obszarów mózgowia odpowiedzialnych za emocje oraz funkcje afektywne oceniane przy pomocy funkcjonalnego obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (53). W 2015 roku przeprowadzono podwójnie zaślepione oraz randomizowane badanie kliniczne, w którym określano skuteczność wieloszczepowego preparatu probiotycznego w ograniczeniu liczby oraz intensywności negatywnych myśli i smutku (51). Preparat podawany zdrowym osobom włączonym do grupy badanej zawierał następujące szczepy probiotyczne: Bifidobacterium bifidum W23, Bifidobacterium lactis W52, Lactobacillus acidophilus W37, Lactobacillus brevis W63, Lactobacillus casei W56, Lactobacillus salivarius W24 oraz Lactobacillus lactis W19 i W5. Eksperyment trwał 4 tygodnie. Po jego zakończeniu zauważono istotne statystycznie obniżenie nasilenia globalnych zachowań depresyjnych u osób przyjmujących suplement w porównaniu do ochotników spożywających placebo. Potwierdzono, że przyjmowany probiotyk ograniczył objawy agresji oraz ruminacji - definiowanej jako nieustanne wątpliwości co do faktu oraz jakości wykonanych czynności w analizowanej grupie (51). Rok później zespół badawczy kierowany przez Clarke (3) wskazał, że szczep probiotyczny Bifidobacterium longum 1714 wykazuje właściwości usprawniające pamięć oraz redukujące objawy stresu. Udowodniono, że osoby suplementowane szczepem probiotycznym miały istotnie niższe stężenie kortyzolu w ślinie po 30 minutach od indukcji stresu w teście ochłodzenia dłoni. Zauważono też, że natężenie stresu ocenianego kwestionariuszem samooceny Cohen a było niższe u ochotników przyjmujących Bifidobacterium longum Co więcej, osoby z grupy badanej osiągały wyższą punktację w testach poznawczych w porównaniu do grupy placebo. Potwierdzono, że czynność bioelektryczna mózgowia osób suplementowanych probiotykiem była klinicznie lepsza. Wykonując badanie elektroencefalograficzne zauważono, że moc fal Theta z elektrody środkowo centralnej (odprowadzenie Cz), rejestrującej aktywność ze środkowej i przyśrodkowej okolicy centralnej była niższa u osób badanych w porównaniu do otrzymujących placebo (3). W tym samym roku Kato-Kataoka i wsp. (24) zwerbowali do badań studentów medycyny, u których zastosowali suplementację mlekiem fermentowanym z udziałem Lactobacillus casei Shirota. Badanie przeprowadzono w okresie sesji egzaminacyjnej, stanowiącej źródło stresu dla badanych uczniów. U osób otrzymujących placebo zaobserwowano, że stopień agresji, stężenie kortyzolu w ślinie i L-tryptofanu w surowicy krwi było istotnie wyższe w dniu poprzedzającym egzamin w porównaniu do ochotników spożywających probiotyk. Co więcej, przyjmowany suplement spowodował wzrost stężenia serotoniny w kale w dwa tygodnie po zakończeniu interwencji dietetycznej. Zmniejszeniu uległy też częstości występowania wegetatywnych objawów stresu, tj. bólów brzucha oraz przeziębienia (24). A PREBIOTYKI? Należy jednocześnie zwrócić uwagę, że modyfikacja mikrobioty jelitowej może odbywać się z wykorzystaniem prebiotyków. Pojęcie prebiotyki określa składniki żywności, które są źródłem energii dla bakterii jelitowych i korzystnie wpływają na zdrowie gospodarza. Należą tutaj fruktooligosacharydy, pochodne galaktozy i β-glukanów oraz laktoferyna, które nie są trawione przez endogenne enzymy człowieka i w formie niezmienionej

83 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka 171 docierają do okrężnicy gdzie ulegają fermentacji przy udziale bakterii jelitowych (30). Jak dotąd opracowania dotyczące wpływu prebiotykoterapii na działanie CUN są nieliczne. Udowodniono jednak, że galaktooligosacharydy (GOS) wpływają korzystnie na syntezę czynnika neurotropowego pochodzenia mózgowego, synaptofizyny i innych molekuł odgrywających rolę w plastyczności neuronalnej (47, 59). Wykazano również, że suplementacja GOS nie tylko ogranicza stan zapalny wywołany obecnością lipopolisacharydu bakteryjnego, ale również stabilizuje nastrój (48). Laktoferryna została zidentyfikowana jako czynnik wpływający korzystnie na procesy pamięciowe i aktywność szlaków molekularnych neuroplastyczności (10). Najnowsze badania dowodzą, że podaż kompleksu substancji probiotycznych (GOS, polidekstroza, laktoferyna) wpływa korzystnie na ultarastrukturę mózgowia, zwłaszcza układu limbicznego (36, 57, 59) oraz ogranicza niekorzystne zmiany w CUN wywołane stresem (35). PRZESZCZEP MIKROBIOTY JELITOWEJ Kształtowanie składu mikroflory jelit może być realizowane w drodze przeszczepu mikrobioty jelitowej (ang. Fecal microbiota transplantation, FMT). Procedura FMT polega na przeniesienie kału zdrowego dawcy do przewodu pokarmowego biorcy, głównie w formie przyjmowanych doustnie mrożonych kapsułek (27, 62), choć treść kałowa może być również podawana do dwunastnicy przy wykorzystaniu endoskopu (56). W świetle literatury, FMT jest rekomendowana w leczeniu opornych na antybiotykoterapię i nawracających zakażeń Clostridium diffilile (40). Skuteczność metody w innych schorzeniach (11, 17, 39) nie została potwierdzona lub znajduje się nadal w fazie badań eksperymentalnych (Tabela 2). W opinii autorów niniejszego opracowania badania naukowe dotyczące możliwości klinicznego zastosowania FMT w leczeniu zaburzeń emocjonalnych nie istnieją. Badania nad wykorzystaniem FMT w zaburzeniach neurologicznych prowadził zespół naukowy Borody. W 2011 zastosowali oni FMT u trzech pacjentów z rozpoznanym stwardnieniem rozsianym uzyskując normalizację rytmu wypróżnień i istotne zmniejszenie intensywności objawów neurologicznych badanych osób (5). W tym samym roku naukowcy. przeszczepili kał kobiecie z dystonią mikolonoczną i przewlekłą biegunką. Zastosowana procedura wpłynęła nie tylko na redukcję liczby oddawanych stolców, ale poprawiła również w blisko 90% objawy neurologiczne (7). Rok później doniesiono o korzyściach płynących z zastosowania FMT u 60 pacjentów z zespołem przewlekłego zmęczenia (ang. Chronić fatigue syndrome, CFS) diagnozowanym w przebiegu zespołu jelita drażliwego (6). Przeszczep mikrobioty jelitowej u 70% badanych wywołał zmniejszenie wykładników klinicznych CFS. Całkowite ustąpienie objawów schorzenia po latach od FMT wskazało 7 z 12 objętych kontrolą pacjentów. Należy zaznaczyć, że badania opisujące FMT jako wsparcie terapeutyczne schorzeń neuropsychiatrycznych są ograniczone do pojedynczych prac, w większości opisów przypadków na podstawie których nie można wysuwać wniosków co do skuteczności oraz bezpieczeństwa metody (15), tym bardziej że opisano już przypadki powikłań po FMT, jak otyłość olbrzymia u kobiety leczonej z powodu nawrotowego zakażenia Clostridium difficile (2) czy mikroskopowe zapalenie jelita u pacjenta z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy (52)

84 172 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr 1 Tabela II. Kliniczne zastosowanie transplantacji mikrobioty jelitowej (11, 17, 39). Skuteczność potwierdzona w randomizowanych badaniach klinicznych Zakażenia Clostridium difficile* Choroba Leśniowskiego-Crohn a Wrzodziejące zapalenie jelita grubego^ Cukrzyca typu 1 Insulinooporność//cukrzyca typu 2 Skuteczność potwierdzona w badaniach obserwacyjnych # Choroba Parkinsona Dystonia miokloniczna Fibromialgia Małopłytkowość samoistna Stwardnienie rozsiane Zaburzenia ze spektrum autyzmu Zaparcia czynnościowe Zespół Jelita Nadwrażliwego (IBS) Zespół metaboliczny Zespół przewlekłego zmęczenia *-rekomendacja kliniczna (ESCMID) w przypadku zakażenia opornego na standardowe leczenie ^-skuteczność potwierdzona w randomizowanych badaniach klinicznych, rekomendacja w toku #-skuteczność oparta na pojedynczych badaniach doświadczalnych i opisach przypadków ESCMID = European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases PODSUMOWANIE Wyniki badań naukowych potwierdzają, że kompozycja mikrobioty jelitowej wpływa na strukturę oraz funkcje obszarów mózgowia zaangażowanych w kontrolę emocji, aktywność ruchową oraz procesy poznawcze. Analizy przeprowadzone w grupie zdrowych (bez zaburzeń psychicznych) osób wskazują, że przywrócenie równowagi ekosystemu jelitowego realizowane m.in. za pośrednictwem probiotykoterapii wspomaga łagodzenia negatywnych objawów stresu oraz ograniczenia manifestacji złego nastroju i agresji. PIŚMIENNICTWO 1. Ait-Belgnaoui A, Colom A, Braniste V i inni. Probiotic gut effect prevents the chronic psychological stress-induced brain activity abnormality in mice. Neurogastroenterol Motil 2014; 26: Alang N, Kelly CR. Weight gain after fecal microbiota transplantation. Open Forum Infect Dis 2015; 2: ofv Allen AP, Hutch W, Borre YE i inni. Bifidobacterium longum 1714 as a translational psychobiotic: modulation of stress, electrophysiology and neurocognition in healthy volunteers. Transl Psychiatry 2016; 6: e Benton D, Williams C, Brown A. Impact of consuming a milk drink containing a probiotic on mood and cognition. Eur J Clin Nutr 2007; 61: Borody TJ, Leis SM, Campbell J i inni. Fecal microbiota transplantation (FMT) in multiple sclerosis (MS). Am J Gastroenterol 2011;106: S352.

85 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka Borody TJ, Nowak A, Finlayson S. The GI microbiome and its role in chronic fatigue syndrome: A summary of bacteriotherapy. J Australas Coll Nutr Env Med 2012; 31: Borody TJ, Rosen DM, Torres M, i inni. Myoclonus-dystonia (M-D) mediated by GI microbiota diarrhoea treatment improves M-D symptoms. Am J Gastroenterol 2011; 106: S Bravo JA, Forsythe P, Chew MV i inni. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: Bruce-Keller AJ, Salbaum JM, Luo M i inni. Obese-type gut microbiota induce neurobehavioral changes in the absence of obesity. Biol Psychiatry 2015; 77: Chen Y, Zheng Z, Zhu X i inni. Lactoferrin Promotes Early Neurodevelopment and Cognition in Postnatal Piglets by Upregulating the BDNF Signaling Pathway and Polysialylation. Mol Neurobiol 2015; 52: Choi HH, Cho YS. Fecal Microbiota Transplantation: Current Applications, Effectiveness, and Future Perspectives. Clin Endosc 2016; 49: Collins SM, Surette M, Bercik P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nat Rev Microbiol 2012; 10: Cowan CS, Callaghan BL, Richardson R. The effects of a probiotic formulation (Lactobacillus rhamnosus and L. helveticus) on developmental trajectories of emotional learning in stressed infant rats. Transl Psychiatry 2016; 6: e Cryan JF, Dinan TG. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nat Rev Neurosci 2012; 13: Desbonnet L, Garrett L, Clarke G i inni. The effects of the probiotic Bifidobacterium infantis in the maternal separation model of depression. Neuroscience 2010; 170: Desbonnet L, Garrett L, Clarke G i inni. The probiotic Bifidobacteria infantis: An assessment of potential antidepressant properties in the rat. J Psychiatr Res 2008; 43: Evrensel A, Ceylan ME. Fecal Microbiota Transplantation and Its Usage in Neuropsychiatric Disorders. Clin Psychopharmacol Neurosci 2016; 14: Evrensel A, Ceylan ME. The Gut-Brain Axis: The Missing Link in Depression. Clin Psychopharmacol Neurosci 2015; 13: Foster JA, McVey Neufeld KA. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression. Trends Neurosci 2013; 36: Gareau MG, Wine E, Rodrigues DM i inni. Bacterial infection causes stress-induced memory dysfunction in mice. Gut 2011 ; 60: Girard SA, Bah TM, Kaloustian S i inni. Lactobacillus helveticus and Bifidobacterium longum taken in combination reduce the apoptosis propensity in the limbic system after myocardial infarction in a rat model. Br J Nutr 2009; 102: Hoban AE, Stilling RM, Ryan FJ i inni. Regulation of prefrontal cortex myelination by the microbiota. Transl Psychiatry 2016; 6: e Hold GL, Schwiertz A, Aminov RI i inni. Oligonucleotide probes that detect quantitatively significant groups of butyrate-producing bacteria in human faces. Appl Environ Microb 2003; 69:

86 174 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr Kato-Kataoka A, Nishida K, Takada M i inni. Fermented Milk Containing Lactobacillus casei Strain Shirota Preserves the Diversity of the Gut Microbiota and Relieves Abdominal Dysfunction in Healthy Medical Students Exposed to Academic Stress. Appl Environ Microbiol 2016;82: Koppel N, Balskus EP. Exploring and Understanding the Biochemical Diversity of the Human Microbiota. Cell Chem Biol 2016; 23: Krishnan V, Nestler EJ. Animal models of depression: molecular perspectives. Curr Top Behav Neurosci 2011; 7: Lee CH, Steiner T, Petrof EO i inni. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2016; 315: Liang S, Wang T, Hu X i inni. Administration of Lactobacillus helveticus NS8 improves behavioral, cognitive, and biochemical aberrations caused by chronic restraint stress. Neuroscience 2015; 310: Luczynski P, Whelan SO, O Sullivan C i inni. Adult microbiota-deficient mice have distinct dendritic morphological changes: differential effects in the amygdala and hippocampus. Eur J Neurosci 2016; 44: Lynch SV, Pedersen O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. N Engl J Med 2016 ; 375: Madore C, Leyrolle Q, Lacabanne C i inni. Neuroinflammation in Autism: Plausible Role of Maternal Inflammation, Dietary Omega 3, and Microbiota. Neural Plast 2016; 2016: Mayer EA, Knight R, Mazmanian SK i inni. Gut microbes and the brain: paradigm shift in neuroscience. J Neurosci 2014; 34: McCusker RH, Kelley KW. Immune-neural connections: how the immune system s response to infectious agents influences behavior. J Exp Biol ; 216: Messaoudi M, Lalonde R, Violle N i inni. Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects. Br J Nutr 2011; 105: Mika A, Day HE, Martinez A i inni. Early life diets with prebiotics and bioactive milk fractions attenuate the impact of stress on learned helplessness behaviours and alter gene expression within neural circuits important for stress resistance. Eur J Neurosci 2016 doi: /ejn (Epub ahead of print Mudd AT, Alexander LS, Berding K i inni. Dietary Prebiotics, Milk Fat Globule Membrane, and Lactoferrin Affects Structural Neurodevelopment in the Young Piglet. Front Pediatr 2016; 4: Odenwald MA, Turner JR. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017; 14: Ohland CL, Kish L, Bell H i inni. Effects of Lactobacillus helveticus on murine behavior are dependent on diet and genotype and correlate with alterations in the gut microbiome. Psychoneuroendocrinology 2013; 38: Ostrowska L, Marlicz W, Łoniewski I. Transplantacja mikroflory jelitowej w leczeniu otyłości i zaburzeń metabolicznych metoda nadal ryzykowna i niepotwierdzona wynikami badań klinicznych. Forum Zab Metabol 2013; 4:

87 Nr 1 Mikrobiota jelitowa a emocjonalny stan człowieka Paramsothy S, Kamm MA, Kaakoush NO i inni. Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2017; 389: Pistollato F, Sumalla Cano S, Elio I i inni. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutr Rev 2016; 74: Powell N, Walker MM, Talley NJ. The mucosal immune system: master regulator of bidirectional gut-brain communications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017 doi: /nrgastro Purchiaroni F, Tortora A, Gabrielli M i inni. The role of intestinal microbiota and the immune system. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2013; 17: Rao AV, Bested AC, Beaulne TM i inni. A randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of chronic fatigue syndrome. Gut Pathog 2009; 1: Salvo-Romero E, Alonso-Cotoner C, Pardo-Camacho C i inni. The intestinal barrier function and its involvement in digestive disease. Rev Esp Enferm Dig 2015; 107: Sampson TR, Debelius JW, Thron T i inni. Gut Microbiota Regulate Motor Deficits and Neuroinflammation in a Model of Parkinson s Disease. Cell 2016; 167: Savignac HM, Corona G, Mills H i inni. Prebiotic feeding elevates central brain derived neurotrophic factor, N-methyl-D-aspartate receptor subunits and D-serine. Neurochem Int 2013; 63: Savignac HM, Couch Y, Stratford M i inni. Prebiotic administration normalizes lipopolysaccharide (LPS)-induced anxiety and cortical 5-HT2A receptor and IL1-β levels in male mice. Brain Behav Immun 2016; 52: Savignac HM, Kiely B, Dinan TG i inni. Bifidobacteria exert strain-specific effects on stress-related behavior and physiology in BALB/c mice. Neurogastroenterol Motil 2014; 26: Slyepchenko A, Maes M, Jacka FN i inni. Gut Microbiota, Bacterial Translocation, and Interactions with Diet: Pathophysiological Links between Major Depressive Disorder and Non-Communicable Medical Comorbidities. Psychother Psychosom 2017; 86: Steenbergen L, Sellaro R, van Hemert S i inni. A randomized controlled trial to test the effect of multispecies probiotics on cognitive reactivity to sad mood. Brain Behav Immun 2015; 48: Tariq R, Smyrk T, Pardi DS i inni. New-Onset Microscopic Colitis in an Ulcerative Colitis Patient After Fecal Microbiota Transplantation. Am J Gastroenterol. 2016; 111: Tillisch K, Labus J, Kilpatrick L i inni. Consumption of fermented milk product with probiotic modulates brain activity. Gastroenterology 2013; 144: Tsigos C, Kyrou I, Kassi E i inni. Stress, Endocrine Physiology and Pathophysiology. In: De Groot LJ, Chrousos G, Dungan K, Feingold KR, Grossman A, Hershman JM, Koch C, Korbonits M, McLachlan R, New M, Purnell J, Rebar R, Singer F, Vinik A, editors. Endotext (Internet). South Dartmouth (MA): MDText.com, Inc.; Mar 10.

88 176 K. Skonieczna-Żydecka i inni Nr Udit S, Gautron L. Molecular anatomy of the gut-brain axis revealed with transgenic technolo gies: implications in metabolic research. Front. Neurosci 2013; 7: van Nood E, Vrieze A, Nieuwdorp M i inni. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med. 2013; 368: Waworuntu RV, Hanania T, Boikess SR i inni. Early life diet containing prebiotics and bioactive whey protein fractions increased dendritic spine density of rat hippocampal neurons. Int J Dev Neurosci 2016; 55: Weiss GA, Hennet T. Mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis. Cell Mol Life Sci 2017 Mar 28. doi: /s x. 59. Williams S, Chen L, Savignac HM i inni. Neonatal prebiotic (BGOS) supplementation increases the levels of synaptophysin, GluN2A -subunits and BDNF proteins in the adult rat hippocampus. Synapse 2016; 70: Wu H, Tremaroli V, Bäckhed F. Linking Microbiota to Human Diseases: A Systems Biology Perspective. Trends Endocrinol Metab 2015; 26: Yamamura S, Morishima H, Kumano-go T i inni. The effect of Lactobacillus helveticus fermented milk on sleep and health perception in elderly subjects. Eur J Clin Nutr 2009; 63: Youngster I, Mahabamunuge J, Systrom HK i inni. Oral, frozen fecal microbiota transplant (FMT) capsules for recurrent Clostridium difficile infection. BMC Med. 2016; 14: 134. Otrzymano: 12 IV 2017 r. Adres Autora: Szczecin, ul. Unii Lubelskiej 1, Klinika Gastroenetrologii, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, marlicz@hotmail.com

89 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Metody mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń Clostridium difficile Diagnostic methods for Clostridium difficile infections Małgorzata Aptekorz, Gayane Martirosian Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Clostridium difficile jest przyczyną 30-50% biegunek poantybiotykowych, co stanowi olbrzymie obciążenie kliniczne i ekonomiczne. U około 30% pacjentów dochodzi do nawracających zakażeń i aż u 45-65% z nich rozwijają się kolejne nawroty choroby. Podejrzenie zakażenia C. difficile wymaga bezzwłocznego wprowadzenia odpowiednich działań w obrębie kontroli zakażeń celem zapobiegania ich dalszego rozprzestrzeniania się w szpitalu. Szybka i precyzyjna diagnostyka zakażeń C. difficile jest bardzo ważnym elementem w całym łańcuchu procedur niezbędnych do wykonania. W pracy zostały omówione różne algorytmy diagnostyczne, a także porównano skuteczność stosowanych w tym celu testów immunoenzymatycznych, membranowych i molekularnych. Słowa kluczowe: Zakażenia Clostridium difficile, algorytmy diagnostyczne ABSTRACT About 30%-50% of hospital antibiotic-associated diarrheas are caused by C. difficile, which constitutes a huge clinical and economic burden. Relapses are a frequent problem (in 30 % of CDI patients) and 45-65% of these patients develop multiple recurrences. Suspicion of the CDI requires immediate action to be taken within the control of infection to prevent further spread in the hospital. Rapid and precise diagnostic is very important element in the chain of required procedures. Certain diagnostic algorithms and effectivity of different immunoenzymatic, membrane and molecular tests were compared and discussed in this publication. Keywords: Clostridium difficile Infection, diagnostic algorithms

90 178 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 WSTĘP Clostridium difficile to Gram-dodatnia, beztlenowo rosnąca laseczka produkująca spory, która odpowiedzialna jest za szerokie spektrum zakażeń, począwszy od łagodnej biegunki do zagrażających życiu rzekomobłoniastego zapalenia jelit oraz okrężnicy olbrzymiej. W około 90% przypadków zakażeń wywołanych przez C. difficile (CDI) pacjenci w wywiadzie zaznaczają antybiotykoterapię poprzedzającą wystąpienie objawów klinicznych. Szacuje się, że u 5-35% pacjentów przebywających w placówkach opieki zdrowotnej i otrzymujących antybiotyki może rozwinąć się biegunka. C. difficile jest przyczyną 30-50% biegunek poantybiotykowych, co stanowi olbrzymie obciążenie kliniczne i ekonomiczne (8, 20, 32). Jako czynniki ryzyka wystąpienia CDI wskazuje się wiek powyżej 65 roku życia, hospitalizację oraz długotrwałą terapię inhibitorami pompy protonowej, antagonistami receptorów H 2 itd. Wśród czynników ryzyka CDI wymieniane są chemioterapia, a także inwazyjne procedury diagnostyczne i terapeutyczne w obrębie przewodu pokarmowego, hipoalbuminemia, choroby nerek, przeszczepy narządów, zakażenie wirusem HIV, choroby autoimmunologiczne, nowotwory i choroby zapalne jelit (11, 19, 29). Bardzo często dochodzi do zakażeń nawracających - u 30% pacjentów, i aż u 45-65% z nich rozwijają się kolejne nawroty choroby. Nawroty CDI najczęściej dotyczą populacji pacjentów starszych, z chorobami współistniejącymi, nierzadko występuje kaskada nawrotów wynikająca między innymi ze złego stanu zdrowia i słabszej skuteczności środków terapeutycznych (15, 24, 28, 31). Powszechne stosowanie antybiotyków jest główną przyczyną rozwoju CDI. Na skutek występujących zaburzeń równowagi mikroflory jelitowej - jako niepożądanego następstwa antybiotykoterapii, namnaża się C. difficile, produkując dwie białkowe toksyny o wysokiej masie cząsteczkowej, uznawane za główne czynniki zjadliwości. Toksyna A jest enterotoksyną powodującą wzrost wydzielania i utratę elektrolitów i płynów, co doprowadza do objawów biegunkowych. Toksyna B posiada silne właściwości cytotoksyczne wobec enterocytów. Toksyny przyłączając się do mikrokosmków komórek nabłonkowych jelit powodują ich apoptozę (5). Toksyny A i B C. difficile (CDT) są kodowane przez geny tcda i tcdb zlokalizowane w regionie PaLoc genomu bakterii o wielkości 19,6 kpz. Nie wszystkie szczepy jednak posiadają te geny i produkują toksyny. W ostatnim czasie obserwuje się ogniska choroby o cięższym przebiegu, wysokim odsetku nawrotów, powikłań i zwiększonej śmiertelności. Dodatkowo, obserwuje się pojawienie szczepów C. difficile opornych na wiele leków przeciwbakteryjnych oraz hiperwirulentnego szczepu C. difficile PCR rybotypu 027, charakteryzującego się wysoką opornością na fluorochinolony, zwiększoną produkcją toksyn A i B, wytwarzaniem dodatkowej toksyny binarnej (CDT) oraz według niektórych autorów podwyższoną zdolnością do tworzenia spor (1, 16, 21). Co gorsza zakażenie szczepem hiperwirulentnym jest istotnym czynnikiem ryzyka nawrotu choroby (18). CO ZROBIĆ W PRZYPADKU CDI Podejrzenie CDI wymaga bezzwłocznego wprowadzenia odpowiednich działań celem zapobiegania dalszego rozprzestrzeniania się zakażenia w szpitalu. Działania te obejmują m. in. szybką i skuteczną diagnostykę, nadzór, szkolenie personelu zwłaszcza w obrębie

91 Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 179 szerzenia się zakażenia i epidemiologii a także właściwą higienę rąk oraz właściwe postępowanie dezynfekcyjne dotyczące środowiska szpitalnego i sprzętu. Ponadto, wskazana jest weryfikacja polityki antybiotykowej i to zarówno dotycząca terapii jak i profilaktyki zakażeń. Zaleca się rezygnację ze zbędnej terapii przeciwbakteryjnej i/lub zminimalizowanie częstości i czasu jej trwania oraz ograniczenie liczby przepisanych leków przeciwdrobnoustrojowych. Szczególnie przydatne okazuje się ograniczenie stosowania klindamycyny, fluorochinolonów i cefalosporyn. W stosunku do pacjenta z biegunką rekomenduje się zapewnienie prawidłowej równowagi wodno-elektrolitowej oraz zaprzestanie antybiotykoterapii (w miarę możliwości) a także aplikacji leków zwalniających motorykę jelit i inhibitorów pompy protonowej. Powyższe działania powodują ustąpienie biegunki w około 20% przypadków (4, 5, 10, 17). Jednakże nawet skrupulatne przestrzeganie powyższych zaleceń czasami nie skutkuje całkowitą eliminacją CDI ze względu na powszechną obecność spor C. difficile w placówkach opieki zdrowotnej, w środowisku zewnętrznym i nawet w żywności. Z uwagi na wzrost liczby CDI istnieje pilna potrzeba potwierdzenia zakażenia, zastosowania efektywnego leczenia i skutecznej strategii zapobiegania CDI (19, 28). W związku z wyżej wymienionym szybka i precyzyjna diagnostyka CDI jest bardzo ważnym elementem w całym łańcuchu procedur niezbędnych do wykonania kiedy się podejrzewa zakażenie C. difficile. Zakażenie C. difficile według definicji EUCLID stwierdza się na podstawie obserwacji klinicznych pacjenta oraz wyników badań laboratoryjnych. W wyniku zakażenia u pacjenta pojawia się biegunka (i/lub ostre rozdęcie okrężnicy) i równocześnie stwierdza się obecność toksyn A/B C. difficile w kale lub obecność toksynotwórczego szczepu C. difficile w kale, czy też endoskopowo rozpoznaje się rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, bądź potwierdza się zakażenie C. difficile histopatologicznie podczas kolektomii lub autopsji (9, 10). DIAGNOSTYKA CDI Badania mikrobiologiczne powinny być wykonane tylko z próbek kału pacjentów ze stwierdzoną biegunką, którą należy definiować jako luźne stolce, przyjmujące kształt naczynia, pojawiające się co najmniej 3 krotnie lub częściej w ciągu 24 godzin, lub gdy istnieje podejrzenie niedrożności jelit (10). Złotym standardem wśród testów wykrywających toksyny C. difficile jest test cytotoksyczności CCNA (cell cytotoxicity neutralization assay). CCNA charakteryzuje się wysoką swoistością i wysoką pozytywną wartością predykcyjną, ale test technicznie jest skomplikowany, a wynik dostępny po co najmniej 48 godzinach. Posiew próbki kału pacjenta w celu wykrycia szczepu C. difficile (TC) produkującego toksyny uważa się za metodę bardzo czułą. Jednak hodowla jest czasochłonna (3-5 dni) w związku z tym nie jest powszechnie wykonywana w laboratoriach diagnostycznych (2, 6). Obie wymienione metody są polecane jako referencyjne, z wynikami których powinno porównywać się wyniki uzyskane przy zastosowaniu innych testów (5). Jak dotąd, żadna z istniejących metod diagnostycznych nie uwzględnia równocześnie wszystkich warunków idealnego testu: wysokiej czułości i swoistości, niskich kosztów i krótkiego czasu uzyskania wyniku. Zdarza się, że przyczyny ekonomiczne ograniczają możliwości diagnostyczne i laboratoria poprzestają na wykonaniu pojedynczego testu.

92 180 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 Może to prowadzić do wykazania fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych wyników, w efekcie czego dochodzi albo do niepotrzebnego leczenia chorych lub pominięcia terapii pacjentów zakażonych (22). Aby tego uniknąć, w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej CDI wykorzystuje dwu lub trójstopniowy algorytm: skriningowy test potwierdza się jednym lub dwoma kolejnymi testami lub metodą referencyjną. Pierwszy test powinien się charakteryzować wysoką ujemną wartością predykcyjną (negative predictive value, NPV) czyli niezawodnością wobec próbek z ujemnym wynikiem badania; warunki takie spełniają testy: GDH EIA i testy molekularne NAAT (nucleic acid amplification test). Ujemny wynik wstępnego testu jest raportowany zwrotnie, natomiast wynik dodatni wymaga potwierdzenia kolejnym testem, który powinien być wysoce specyficzny i wiarygodnie klasyfikować próbki jako CDI. Testy drugiego etapu powinny charakteryzować się wysoką dodatnią wartością predykcyjną (positive predictive value, PPV), czyli są prawdziwie dodatnie; np. toxin A/B EIA (4, 5, 7). Debast i wsp. (10) zalecają algorytm, który w pierwszym etapie przewiduje wykonanie testu immunoenzymatycznego wykrywającego GDH, a potem testy w kierunku toksyn C. difficile. Próbki z ujemnym wynikiem raportowane są jako ujemne, natomiast próbki z dodatnim wynikiem poddawane są dalszym badaniom testami wykrywającymi obecność wolnych toksyn w kale lub genów toksyn. Z kolei Crobach i wsp. (7) jako najlepszą strategię postępowania w zakażeniach CDI sugerują dwa algorytmy, oba dwuetapowe. Pierwszy: wykonanie NAAT i testu immunoenzymatycznego (EIA) wykrywającego toksyny A/B C. difficile, natomiast drugi algorytm przewiduje wykonanie GDH EIA oraz testu EIA, wykrywającego toksyny A/B. Polskie rekomendacje dotyczące diagnostyki CDI zalecają wykonanie dwuetapowego algorytmu badań (14). Niemniej jednak Alfa i wsp. (2) wykazali, że jeżeli stosuje się dwustopniowy algorytm składający się z testów EIA w kierunku GDH i w kierunku toksyn A/B, nie jest wykrywana ponad jedna trzecia zakażeń wywołanych toksynotwórczymi szczepami C. difficile. Obecność wolnych toksyn w kale jest istotną wskazówką ponieważ potwierdzono wzrost ryzyka śmierci u takich pacjentów w porównaniu z pacjentami, u których nie wykrywa się toksyn w kale, a tylko w szczepie wyhodowanym. Kryterium to sugeruje, iż potwierdzanie obecności wolnych toksyn powinno być istotnym etapem w diagnozowaniu infekcji C. difficile (23). Natomiast powtórne badanie laboratoryjne w trakcie tego samego epizodu biegunki ma ograniczoną wartość i nie jest zalecane (5). W badaniach laboratoryjnych diagnostyki CDI wykorzystuje się szereg testów potwierdzających/wykluczających obecność antygenu GDH i toksyn C. difficile: testy immunoenzymatyczne (enzyme immunoassays, enzyme-linked immunosorbent assays) lub testy immunochromatograficzne oraz NAAT (4). WYKRYWANIE ANTYGENU GDH I TOKSYN C. DIFFICILE Pierwotnie obecność dehydrogenazy glutaminianowej badano stosunkowo szybkimi i niedrogimi testami lateksowymi, których swoistość była stosunkowo wysoka (94-98%) jednak czułość (58-68%) była niewystarczająca (5). Obecnie występowanie antygenu GDH w kale najczęściej bada się metodami immunoenzymatycznymi, testy są łatwe do wykonania a wynik badania może być dostępny bardzo szybko. Testy te są produkowane

93 Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 181 jako testy płytkowe dołkowe (well-type) EIA, w których wynik jest odczytywany wizualnie i/lub spektrofotometrycznie oraz membranowe (membrane-type) EIA tylko do odczytu wizualnego (3, 27). Crobach i wsp. (7) porównali wyniki testów GDH typu płytkowego oraz typu membranowego z obydwoma testami referencyjnymi (CCNA i TC), otrzymując wysokie wartości czułości i swoistości (odpowiednio od 86% do 97% vs 90% do 95%). Natomiast Zheng i wsp. (33) badali próbki kału na obecność antygenu GDH metodą immunoenzymatyczną płytkową oraz metodą NAATs z wykorzystaniem PCR (poszukując fragmentu genu glud). W swoich badaniach wykazali bardzo wysoką czułość obu metod, jednak z uwagi na prostotę, czas wykonania oraz względy ekonomiczne, jako testy przesiewowe polecili metodę immunoenzymatyczną. Tymczasem Tenover i wsp. (30) opisali przypadki, w których we wstępnych badaniach na obecność antygenu GDH aż 15% próbek kału zawierających toksynotwórcze szczepy C. difficile nie zostatało poprawnie zidentyfikowanych. Prócz tego przedstawiono wynik czułości testu membranowego GDH EIA (wynoszące ~60%) w porównaniu z hodowlą toksynotwórczego szczepu wnioskując, iż badania przesiewowe na obecność tegoż antygenu są mniej czułe niż dotychczas sądzono. Autor interpretuje to zjawisko zmniejszoną czułością wykrywania GDH w próbkach kału, z których hodowano szczepy PCR rybotypów innych niż rybotyp 027 (30). Wyniki czułości i swoistości różnią się znacznie, jak to wyżej przedstawiono w zależności od użytego testu GDH, dlatego wskazane jest monitorowanie badań dotyczących tych wartości oraz poszukiwanie nowych wydajniejszych testów (5). Antygen GDH to enzym charakterystyczny dla wszystkich szczepów C. difficile, zarówno wytwarzających jak i nie wytwarzających toksyn (4, 28). Dlatego też ujemny wynik raportowany jest zwrotnie, natomiast wynik dodatni jest łączony z kolejnymi testami pozwalającymi na potwierdzenie lub wykluczenie obecności wolnych toksyn A/B C. difficile lub ich genów w kale (6, 7). Na rynku dostępny jest szeroki wybór testów opartych na metodach immunoenzymatycznych oraz molekularnych (4). Testy immunoenzymatyczne wykrywające toksyny A/B C. difficile wykorzystują różne substraty oraz przeciwciała; mogą być podobne do testów wykrywających antygen GDH, typu płytkowego EIA, membranowych EIA i zautomatyzowanych EIA, wykrywających toksyny A/B; wyniki zaś mogą być rejestrowane wizualnie lub spektrofotometrycznie (7, 12, 26). Porównując dołkowe testy wykrywające toksyny A/B EIA oraz membranowe Crobach i wsp. (7) uzyskali niskie wartości czułości (45% - 91%), natomiast swoistość mieściła się w wysokim zakresie 96% - 100%. W podobnych badaniach Butler i wsp. (4) uzyskali czułość około 70% a swoistości około 98%. Metody immunoenzymatyczne wykrywające toksyny A/B C. difficile charakteryzują się wysoką swoistością jednak nie są one wystarczająco czułe, co w konsekwencji może prowadzić do niedoszacowania liczby zakażeń (30). TESTY MOLEKULARNE Badania molekularne NAATs oparte o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) a także izotermiczne amplifikacje DNA za pośrednictwem tzw. pętli (LAMP - loop mediated isotermal amplification) lub amplifikacje zależne od helikazy (HAD - helicase dependent amplification) są najnowszymi, szybkimi i precyzyjnymi metodami wprowadzonymi do diagnostyki CDI (7, 13, 23, 30). NAATs, w tym testy komercyjne, zostały opracowane

94 182 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 do wykrywania najczęściej pojedynczych lub rzadziej łącznie obydwu genów kodujących toksyny A i B C. difficile (tcda, tcdb) oraz toksynę binarną (tcdc) a także delecję 117 nukleotydu genu tcdc. Metody te charakteryzują się wysoką czułością (95%) i swoistością (98%) i coraz częściej są wykorzystywane w rutynowej diagnostyce szpitalnej (4, 7). Metody molekularne wymagają wysokiego poziomu wiedzy technicznej, specjalistycznej aparatury i odczynników, wyspecjalizowanego personelu, dodatkowo są kosztowne w porównaniu z innymi metodami, co powoduje, że są często niedostępne szczególnie w mniejszych laboratoriach. Alfa i wsp. (2) przedstawili koszty testów z wykorzystaniem różnych metod diagnostycznych CDI: koszt pojedynczego testu wynosił: do 40 USD dla NAAT, do 14 USD dla testów immunoenzymatycznych, do 11,5 USD dla hodowli szczepu i badaniu jego toksynotwórczości oraz do 10 USD dla testów wykrywających GDH i toksyny A i B. Koszt dwustopniowego algorytmu, składającego się z immunoenzymatycznego oznaczenia antygenu GDH i toksyn A/B C. difficile z potwierdzeniem metodą NAAT wynosił od 90 do 112 USD. Sharp i wsp. (25) porównali koszty badania NAAT, które wynosiły około 33 USD z kosztami testu EIA wykrywającego równocześnie obecność GDH i toksyn - 12 USD. W przypadku 12% próbek, dla których nie uzyskano jednoznacznych wyników, dodatkowo stosowali metodę PCR osiągając wzrost kosztów do około 45 USD. Bywa, iż z uwagi na wysoką czułość i swoistość testów NAAT oraz wyższy koszt i długi czas przeprowadzenia badania w formie dwustopniowego algorytmu, laboratoria ograniczają się jedynie do wykonania testów molekularnych, wykrywających geny toksyn (23). W rutynowej diagnostyce nie można jednak ograniczać się jedynie do wykonywania badań genetycznych ponieważ testy te wykrywają jedynie geny kodujące toksyny, a nie same toksyny, a u pacjentów skolonizowanych toksynotwórczym szczepem C. difficile biegunka może wystąpić również z innych przyczyn (7). Co ważniejsze Crobach i wsp. (7) wskazali, że z obrazem klinicznym koreluje raczej obecność wolnych toksyn w kale (dodatni wynik CCNA) a nie sama obecność toksynotwórczego szczepu (dodatni wynik TC). Stąd próbki kału z dodatnim wynikiem CCNA (wskazujące na obecność wolnych toksyn w kale) są uznawane jako prawdziwie dodatnie. Problematyczne pozostają jednak próbki kału pacjentów, które charakteryzują się obecnością toksynotwórczego szczepu (NAAT-dodatnie; TC-dodatnie) przy równoczesnym braku wolnych toksyn w kale (EIA i CCNA-ujemne). Niewątpliwie obecność genów toksyn A/B C. difficile i/lub toksynotwórczego szczepu w próbkach kału pacjentów z podejrzeniem CDI nie musi skutkować ekspresją tych genów i produkcją toksyn, ponadto prawdopodobna jest obecność wolnych toksyn lecz w ilościach poniżej progu wykrywalności testu (7). Z naszych doświadczeń, nabytych po przebadaniu próbek materiału klinicznego uzyskanego od ponad 500 osób podejrzanych w kierunku CDI wynika, że nie zawsze uzyskuje się 100% zgodności wyników wszystkich używanych testów. Dlatego też stosowanie kilkustopniowego algorytmu diagnostycznego w zestawieniu ze stanem klinicznym pacjenta powinno być podstawą diagnostyczną zgodną z wymogami EBM. PODSUMOWANIE W rutynowej diagnostyce CDI wykorzystuje się dwu lub trójstopniowy algorytm: skriningowy test potwierdza się jednym lub dwoma kolejnymi testami lub metodą referencyjną. Szybka i precyzyjna diagnostyka CDI jest bardzo istotna ze względu na możliwość

95 Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 183 szybkiego rozpoczęcia odpowiedniego leczenia, a także wdrożenia szeregu procedur kontroli zakażeń niezbędnych do zlokalizowania zakażenia i prewencji dalszego szerzenia się go w środowisku szpitalnym. Podziękowania: Praca została wykonana w ramach projektu wewnętrznego KNW-1-091/K/6/0 Wydziału Lekarskiego w Katowicach Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. PIŚMIENNICTWO 1. Abou Chakra CN, Pepin J, Sirard S, Valiquette L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: a systematic review. PLoS One. 2014; 9: e Alfa MJ, Sepehri S. Combination of culture, antigen and toxin detection, and cytotoxin neutralization assay for optimal Clostridium difficile diagnostic testing. Can J Infect Dis Med Microbiol 2013; 24: Arimoto J, Horita N, Kato S i inni. Diagnostic test accuracy of glutamate dehydrogenase for Clostridium difficile: Systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 2016; 6: Butler M, Olson A, Drekonja D i inni. Early Diagnosis, Prevention, and Treatment of Clostridium difficile: Update. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); Cohen SH, Gerding DN, Johnson S i inni. Society for Healthcare Epidemiology of America; Infectious Diseases Society of America. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the society for healthcare epidemiology of America (SHEA) and the infectious diseases society of America (IDSA). Infect Control Hosp Epidemiol 2010; 31: Crobach MJ, Dekkers OM, Wilcox MH, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID): data review and recommendations for diagnosing Clostridium difficile-infection (CDI). Clin Microbiol Infect 2009; 15: Crobach MJ, Planche T, Eckert C i inni. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the diagnostic guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect 2016; 22: Culligan EP, Sleator RD. Advances in the Microbiome: Applications to Clostridium difficile Infection. J Clin Med 2016; 5. pii: E Davies KA, Ashwin H, Longshaw CM i inni. Diversity of Clostridium difficile PCR ribotypes in Europe: results from the European, multicentre, prospective, biannual, point-prevalence study of Clostridium difficile infection in hospitalised patients with diarrhoea (EUCLID), 2012 and Euro Surveill 2016; Debast SB, Bauer MP, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the treatment guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect 2014; 20: Denève C, Janoir C, Poilane I i inni. New trends in Clostridium difficile virulence and pathogenesis. Int J Antimicrob Agents 2009; 33: 24-8.

96 184 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr Eastwood K, Else P, Charlett A, Wilcox MH. Comparison of nine commercially available Clostridium difficile toxin detection assays, a real-time PCR assay for C. difficile tcdb, and a glutamate dehydrogenase detection assay to cytotoxin testing and cytotoxigenic culture methods. J Clin Microbiol 2009; 47: Goldenberg SD, Cliff PR, Smith S i inni. Two-step glutamate dehydrogenase antigen real-time polymerase chain reaction assay for detection of toxigenic Clostridium difficile. J Hosp Infect 2010; 74: Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile. Diagnostyka, terapia, profilaktyka Narodowy Program Ochrony Antybiotyków. Warszawa. Narodowy Instytut Leków Kelly CP. A 76-year-old man with recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea: review of C. difficile infection. JAMA 2009; 301: Khanna S, Pardi DS. The growing incidence and severity of Clostridium difficile infection in inpatient and outpatient settings. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2010; 4: Korman TM. Diagnosis and management of Clostridium difficile infection. Semin Respir Crit Care Med 2015; 36: Marsh JW, Arora R, Schlackman JL i inni. Association of relapse of Clostridium difficile disease with BI/NAP1/027. J Clin Microbiol 2012; 50: Martin J, Wilcox MH. New and emerging therapies for Clostridium difficile infection. Curr Opin Infect Dis 2016; 29: McFarland LV. Antibiotic-associated diarrhea: epidemiology, trends and treatment. Future Microbiol 2008; 3: O Connor JR, Johnson S, Gerding DN. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology 2009; 136: Planche T, Aghaizu A, Holliman R i inni. Diagnosis of Clostridium difficile infection by toxin detection kits: a systematic review. Lancet Infect Dis 2008; 8: Planche TD, Davies KA, Coen PG i inni. Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection. Lancet Infect Dis 2013; 13: Rodrigues R, Barber GE, Ananthakrishnan AN. A Comprehensive Study of Costs Associated With Recurrent Clostridium difficile Infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2017; 38: Sharp SE, Ruden LO, Pohl JC i inni. Evaluation of the C.Diff Quik Chek Complete Assay, a new glutamate dehydrogenase and A/B toxin combination lateral flow assay for use in rapid, simple diagnosis of Clostridium difficile disease. J Clin Microbiol 2010; 48: She RC, Durrant RJ, Petti CA. Evaluation of enzyme immunoassays to detect Clostridium difficile toxin from anaerobic stool culture. Am J Clin Pathol 2009; 131: Shetty N, Wren MW, Coen PG. The role of glutamate dehydrogenase for the detection of Clostridium difficile in faecal samples: a meta-analysis. J Hosp Infect 2011; 77: Surawicz CM, Brandt LJ, Binion DG i inni. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention of Clostridium difficile infections. Am J Gastroenterol. 2013; 108:

97 Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile Tabak YP, Zilberberg MD, Johannes RS i inni. Attributable burden of hospital-onset Clostridium difficile infection: a propensity score matching study. Infect Control Hosp Epidemiol 2013; 34: Tenover FC, Baron EJ, Peterson LR, Persing DH. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile infection can molecular amplification methods move us out of uncertainty? J Mol Diagn. 2011; 13: Vindigni SM, Surawicz CM. C. difficile Infection: Changing Epidemiology and Management Paradigms. Clin Transl Gastroenterol. 2015; 6: e Wiegand PN, Nathwani D, Wilcox MH. Clinical and economic burden of Clostridium difficile infection in Europe: a systematic review of healthcare-facility-acquired infection. J Hosp Infect 2012; 81: Zheng L, Keller SF, Lyerly DM i inni. Multicenter evaluation of a new screening test that detects Clostridium difficile in fecal specimens. J Clin Microbiol 2004; 42: Otrzymano: 10 V 2017 r. Adres Autora: Katowice, ul. Księcia Józefa Poniatowskiego 15, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

98

99 Nr Szanowni Państwo Członkowie PTM Warszawa, r.. Poniżej przekazujemy szereg informacji o naszej aktualnej działalności. 1. Został uruchomiony system rejestracji uczestników Konferencji 90 lat PTM. Zmianie uległy niektóre terminy związane z Konferencją. Do br. jest ustalony nowy termin nadsyłania abstraktów na naszą Konferencję. Zniżka na opłatę rejestracyjną obowiązuje do 07 lipca br. Zależy nam, aby w konferencji uczestniczyły zwłaszcza osoby wybrane w Oddziałach jako delegaci na Walne Zgromadzenie Delegatów PTM w Bydgoszczy. Zgodnie z obowiązującym Statutem PTM osoby, które otrzymały mandat delegata pełnią swoją funkcję przez 4 lata, czyli cały okres trwania kadencji ZG PTM. Osoby te zachowują więc swój mandat na Nadzwyczajne Walne Zgromadzenie Delegatów w Krakowie, na którym będziemy zmieniać Statut PTM. Bardzo zachęcamy do udziału w Konferencji 2. Zwróciliśmy się do firmy EthicalMedTech - Conference Vetting System ( o umieszczenie naszej Konferencji na ich platformie, co miało świadczyć o transparentności i etyczności postępowania podczas organizacji naszej Konferencji. Podnosiły tę sprawę firmy BioMériux oraz Izba Producentów i Dystrybutorów Diagnostyki Laboratoryjnej Związek Pracodawców. Z otrzymanej odpowiedzi wynika jednak, że na razie do systemu nie są wprowadzane konferencje krajowe i tym samym sprawa jest nieaktualna. Wobec tego ponownie poprosiliśmy powyższe firmy o rozważenie możliwości wsparcia finansowego naszego Towarzystwa, poprzez zostanie Członkiem Wspierającym PTM, zamieszczenie reklam związanych z mikrobiologią w czasopismach PTM oraz udział jako sponsorzy lub wystawcy na naszej Konferencji. 3. Pani dr hab. Jolanta Solecka prof. NIZP-PZH wyraziła zgodę na objęcie funkcji Redaktora Naczelnego Polish Journal of Microbiology (PJM) (Editor-in-Chief). Pani prof. dr hab. Elżbieta Anna Trafny członek Prezydium ZG PTM, zgodziła się działać w Redakcji PJM jako Zastępca Redaktora Naczelnego (Deputy Editor). Obsługa redakcji PJM będzie prowadzona przez zespół prof. J. Soleckiej w NIZP-PZH. Przekazanie spraw przez dotychczasowy zespół i objęcie obowiązków redakcji PJM przez nowy zespół osób odbywać się będzie stopniowo w ciągu kilku miesięcy br. Prosimy o przesyłanie do biura PTM propozycji osób ze stopniem naukowym doktora z Państwa Oddziałów, którzy mogliby podjąć się recenzowania manuskryptów przesyłanych do działów PJM: Environmental Microbiology, Medical Microbiology, Microscopic Fungi, Molecular Microbiology, Virology. 4. W czerwcu br. zacznie działać nowa strona internetowa kwartalnika Postępy Mikrobiologii, po czym przystąpimy do porządkowania strony internetowej PJM.

100 188 Nr 1 5. Główna Komisja Rewizyjna, po otrzymaniu wyjaśnień, przyjęła raport finansowy PTM za 2016 r. przygotowany przez firmę Unirach z Bydgoszczy; 6. W dniu br. zorganizowaliśmy zebranie Prezydium ZG PTM w trybie korespondencyjnym, aby przyjąć szereg uchwał, w tym o przyjęciu 20 nowych członków zwyczajnych PTM, Srebrnego Członka Wspierającego PTM oraz o objęciem patronatem PTM II Ogólnopolską Konferencję Działania przeciwdrobnoustrojowe. 7. Trzeba rozważyć problem obniżenia kosztów wydawania czasopism PM i PJM, wydaje się celowe zrezygnowanie z obligatoryjnego rozsyłania zeszytów czasopism do członków PTM. Dysponujemy internetowymi, aktualnie poprawianymi, wydaniami PM i PJM, do których wszyscy mają dostęp za darmo. W przypadku wersji papierowych zeszytów czasopism - ich druk i wysyłka są bardzo kosztowne. Zmniejszenie nakładu do 120 drukowanych egzemplarzy rozsyłanych do bibliotek oraz członków Rad Redakcyjnych i Redakcji czasopism pozwoli na zmianę formy druku na cyfrowy tańszy. Zmiany te można by wprowadzić od nowego roku. Jeżeli ktoś chciałby otrzymywać wersję papierową zeszytów, już nie w ramach rocznej składki PTM, lecz w drodze prenumeraty, wnosiłby dodatkowa opłatę, która obniżona byłaby dla członków PTM. Sprawa będzie omawiana na Nadzwyczajnym Walnym Zgromadzeniu Delegatów, na razie jest sygnalizowana członkom ZG PTM do przemyślenia. Nieopisana w Statucie zasada darmowego rozsyłania zeszytów czasopism do członków PTM obowiązywała od dawna i była dużym, ale kosztownym przywilejem. Obecnie Towarzystwa nie stać na tę formę, a w dobie dostępu do wersji internetowej, traci również sens drukowania zeszytów. Wiele czasopism przechodzi obecnie na ogólnie dostępne wersje elektroniczne. 8. Będziemy się kontaktować z Institute of Scientific Information (ISI) w Filadelfii (USA) zawiadującą przyznawaniem Impact Factor, aby uzyskać informacje, co możemy zmienić w formie naszych czasopism, aby nie utracić aktualnego współczynnika IF, a wprowadzić zmiany zmierzające do zmniejszenia kosztów wydawniczych, np. wydania tylko internetowe lub zmniejszenia nakładu tylko do 120 egzemplarzy (tańszy druk cyfrowy). 9. Rozważany jest pomysł, aby w Postępach Mikrobiologii zamieszczać artykuły w języku angielskim, autorów krajowych i zagranicznych, co powinno poprawić cytowalność tego czasopisma. 10. Rozważany jest pomysł, aby podczas wszystkich konferencji współorganizowanych przez PTM, członkowie naszego Towarzystwa otrzymywali zniżki na opłaty rejestracyjne. Obecnie ma to miejsce w przypadku konferencji 90 lat PTM i konferencji Mikrobiologia Farmaceutyczna. Organizatorzy przyszłych konferencji z udziałem PTM proszeni są o przemyślenie przedstawionej propozycji. 11. Rozważany jest pomysł, aby w przypadku pozyskania Członka Wspierającego PTM czy sponsora, przez dany Oddział Terenowy PTM, połowa środków finansowych przekazana przez Członka Wspierającego PTM lub sponsora mogła być wykorzystana na potrzeby statutowe przez Oddział PTM, który pozyskał dodatkowe środki finansowe. 12. Bardzo się cieszymy, że firma Aesculap Chifa Sp. z o.o., ul. Tysiąclecia 14, Nowy Tomyśl, przystąpiła do PTM jako Srebrny Członek Wspierający PTM. 13. Zauważalny jest w ostatnim czasie wzrost płacenia zaległych składek PTM, za co bardzo dziękujemy. Liczby osób płacących składkę PTM za dany rok: do br. wynosiły: 2015 r ,

101 Nr r , 2017 r a na dzień br. wynoszą - i wzrosły odpowiednio: 2015 r (+23), 2016 r (+61), 2017 r (+345). 14. Informujemy, że laureatem tegorocznej nagrody FEMS-Lwoff Award został Pan prof. Jeff Errington, Dyrektor The Centre for Bacterial Cell Biology w Newcastle University. 15. Złożyliśmy wniosek do FEMS o dofinansowanie Konferencji 90 lat PTM w ramach FEMS Meeting Organizer Grant. 16. Pani prof. Beata Sadowska poinformowała, iż przygotowała wstępny dokument zawierający stanowisko PTM oraz propozycję rozwiązań kwalifikacyjnych dla absolwentów kierunku Mikrobiologia ubiegających się o wpis na Listę Diagnostów Laboratoryjnych, który został przesłany Pani dr J. Jursie-Kulaszy oraz Pani dr E. Stefaniuk z prośbą o przeanalizowanie. 17. Na naszą prośbę Redaktorzy Naczelni czasopism Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej oraz Przegląd Epidemiologiczny wyrazili zgodę na udostępnienie materiałów archiwalnych ze swoich czasopism, dotyczących zasłużonych polskich mikrobiologów. Materiały te zostaną zamieszczone na stronie internetowej PTM w zakładce Historia>Wspomnienia o Mikrobiologach, za co bardzo dziękujemy. 18. Na stronie internetowej PTM zamieszczane są informacje przekazywane przez Zarządy Oddziałów Terenowych PTM dotyczące lokalnej działalności. Prosimy o zapoznanie się ze stroną PTM, która jest na bieżąco aktualizowana. 19. Prężnie działa strona PTM na facebooku, liczba poślubień przekroczyła wartość 300. Dziękujemy Paniom, które wprowadzają nowe informacje na stronę facebooka i stronę PTM. 20. Na przełomie maja i czerwca odbyła się VI Konferencja Naukowo-Szkoleniowa Mikrobiologia Farmaceutyczna, współorganizowana przez PTM, na której omówiono zasady funkcjonowania Sekcji Mikrobiologia Farmaceutyczna. Na naszej stronie internetowej w zakładce Struktura > Sekcje znajdują się propozycje utworzenia szeregu Sekcji zajmujących się szczególnymi obszarami mikrobiologii. Osoby zainteresowane współpracą, wymianą informacji, doświadczeń i wiedzy w danych obszarach mikrobiologii mogą przystępować do danych sekcji jednej lub kilku. Zachęcamy do włączania się w działalność tych Sekcji. Pozdrawiamy serdecznie,

102 190 Nr 1 INFORMACJA O KONFERENCJACH WSPÓŁORGANIZOWANYCH PRZEZ POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW ORAZ Z PATRONATEM PTM W 2017 r. Konferencja Jubileuszowa 90 lat Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów, PTM wczoraj dziś jutro Kraków, września 2017 r. Komunikat I Konferencja Jubileuszowa Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów organizowana jest przede wszystkim z okazji 90-tej rocznicy powołania naszego Stowarzyszenia. Jednocześnie w 2017 roku przypada rocznica 160-lecia urodzin Ojca mikrobiologii polskiej profesora Odona Bujwida oraz 130-lecia wygłoszenia przez niego w Krakowie słynnych pięciu odczytów o bakteryjach. W 2017 roku upływa także 90 lat od powołania ogólnoświatowego stowarzyszenia towarzystw mikrobiologicznych International Society of Microbiology, obecnie International Union of Microbiological Societies (IUMS), którego współzałożycielem było PTM. Konferencji towarzyszyć będzie Nadzwyczajne Walne Zgromadzenie Delegatów Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów, które podejmie uchwały w sprawie wprowadzenia zmian do Statutu PTM. Tematyka konferencji, poza częścią poświęconą historii polskiej mikrobiologii ze szczególnym uwzględnieniem roli prof. O. Bujwida oraz działalności PTM, będzie również dotyczyła przeglądu osiągnięć naukowych różnych dyscyplin mikrobiologii. Planuje się zorganizowanie sesji wykładowej, na którą zostaną zaproszeni najwybitniejsi polscy naukowcy z różnych dyscyplin mikrobiologii oraz kilku sesji plakatowych, na których wszyscy mikrobiolodzy, a zwłaszcza Delegaci na Walne Zgromadzenie PTM będą mogli przedstawić wyniki swoich prac. Planuje się również stworzenie warunków umożliwiających zorganizowanie stoisk wystawowych przez różne firmy działające w obszarze mikrobiologii. Spotkanie członków Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów będzie okazją do poznania początków polskiej mikrobiologii i serologii, do dyskusji, przeglądu sesji plakatowych, do integracji pokoleń mikrobiologów, do rekreacji w czasie spotkań koleżeńskich w uroczym klimacie dawnej stolicy Polski. Konferencja organizowana jest przez Polskie Towarzystwo Mikrobiologów i Uniwersytet Jagielloński

103 Nr Termin nadsyłania streszczenia plakatu: r. Termin powiadomienia o akceptacji streszczenia: r. Opłaty zjazdowe: Osoby do 35 roku życia (w tym studenci) członkowie PTM W terminie do dnia r.: 100 zł; w terminie po r.: 150 zł Osoby do 35 roku życia (w tym studenci) nie będący członkami PTM udział czynny W terminie do dnia r.: 200 zł; w terminie po r.: 250 zł Członkowie PTM W terminie do dnia r.: 300 zł; w terminie po r.: 400 zł Osoby nie będące członkami PTM W terminie do dnia r.: 400 zł; w terminie po r.: 500 zł Konferencja BioMillenium 2017 Trendy i rozwiązania w biotechnologii i mikrobiologii, Gdańsk, 6-8 września 2017 r. Szanowni Państwo W imieniu Komitetu Organizacyjnego mamy zaszczyt zaprosić Państwa do udziału w Konferencji BioMillenium 2017 Trendy i rozwiązania w biotechnologii i mikrobiologii, która odbędzie się w dniach 6-8 września 2017 na terenie Politechniki Gdańskiej w Gdańsku. Głównym organizatorem Konferencji jest Katedra Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii Politechniki Gdańskiej oraz Gdański Oddział Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Współorganizatorami są również Katedra Mikrobiologii i Katedra Immunologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Szczecińskiego oraz Gdański Oddział Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Chorób Zakaźnych. Prezentowane zagadnienia będą podzielone na pięć tematycznych sesji: * Biotechnologia: w medycynie, w przemyśle, w ochronie środowiska, * Mikrobiologia: kliniczna, molekularna Konferencja rozpocznie się wykładem przedstawiającym sylwetkę, zainteresowania i osiągnięcia naukowe zmarłego w tym roku prof. hab. dr Józefa Kur, założyciela Katedry Biotechnologii Molekularnej i Mikrobiologii Politechniki Gdańskiej oraz naukowca, który swoimi pracami nie tylko wiele wniósł wiele do mikrobiologii i biotechnologii, ale był ich wielkim popularyzatorem. Przewidujemy wykłady plenarne, prezentacje ustne, sesję plakatową oraz warsztaty praktyczne prowadzone przez firmy. Mamy nadzieję, że prezentacje wyników Państwa badań naukowych pokażą, że biotechnologia nie jest wciąż dziedziną nauki przyszłości, ale już dziś przyniosła rozwiązania stosowane w wielu gałęziach przemysłu i w medycynie oraz że mikrobiologia nie jest

104 192 Nr 1 skostniałą dziedziną, ale obszarem nauki, w którym zarówno tworzy się, jak i wykorzystuje nowoczesne technologie. Wierzymy, że Konferencja będzie okazją do nawiązania kontaktów umożliwiających efektywną współpracę. Wszystkim, którzy wezmą udział w Konferencji, życzymy miłego pobytu w Gdańsku. Szczegółowy program i informacje zostaną przesłane w następnym komunikacie. Organizatorzy Konferencji BioMillenium 2017 Kontakt: sekretariat oraz ; ; ; Mikrobiologia w Ochronie Zdrowia i Środowiska - MIKROBIOT 2017, Łódź, września 2017 r. W imieniu Organizatorów, Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Uniwersytetu Łódzkiego oraz Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów mamy przyjemność serdecznie Państwa zaprosić do wzięcia udziału w IV edycji konferencji naukowej Mikrobiologia w Ochronie Zdrowia i Środowiska - MIKROBIOT 2017, która odbędzie się w Łodzi w dniach września 2017 r. Głównym celem Konferencji jest wymiana informacji naukowej w zakresie mikrobiologii, immunologii i biotechnologii, w tym badań czynników chorobotwórczości drobnoustrojów, reakcji organizmu człowieka na zakażenia, epidemiologii zakażeń, struktury i fizjologii mikroorganizmów środowiskowych, możliwości ich wykorzystania w procesach biotechnologicznych oraz w eliminacji skażeń środowiska, a także dotyczących interakcji drobnoustrojów z innymi organizmami w różnych mikroniszach środowiskowych. Wzorem poprzednich edycji konferencji MIKROBIOT, które cieszyły się bardzo dużym zainteresowaniem środowisk naukowych z całej Polski i spotkały się z uznaniem gości z zagranicy, również podczas zbliżającej się IV edycji MIKROBIOT 2017 wykłady plenarne wygłoszą wybitni naukowcy, między innymi z Niemiec, Portugalii, Francji czy Włoch. Oficjalnym językiem konferencji będzie język angielski. W ramach konferencji MIKRO- BIOT 2017 odbędą się cztery sesje tematyczne: 1. Mikrobiologia kliniczna i immunologia 2. Biotechnologia mikrobiologiczna 3. Mikrobiologia ogólna i środowiskowa 4. Genetyka i genomika drobnoustrojów

105 Nr Konferencja pod patronatem PTM II Ogólnopolską Konferencję Działania przeciwdrobnoustrojowe. Bydgoszcz, r. Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu wraz ze Stowarzyszeniem Rozwój Mikrobiologii organizują II Ogólnopolską Konferencję Działania przeciwdrobnoustrojowe Pragniemy spotkać się w szerokim gronie specjalistów, aby poznawać nowe możliwości, jak również ograniczenia działań przeciwdrobnoustrojowych oraz zagrożenia wynikające z obecności drobnoustrojów. Powyższe zagadnienia są wyzwaniem dla współczesnej medycyny, farmacji, kosmetologii, higieny, epidemiologii i mikrobiologii. W związku z tym, tematyka Konferencji adresowana jest nie tylko do osób zajmujących się dezynfekcją i sterylizacją, ale także do osób związanych z produkcją żywności, leków, kosmetyków, mikrobiologów różnych specjalności oraz diagnostów laboratoryjnych, immunologów, epidemiologów i lekarzy. Powyższe zagadnienia będą omawiane w aspekcie klinicznym, diagnostycznym i prewencyjnym. Przewidzieliśmy dla Państwa trzy sesje naukowe: 1. Procesy dezynfekcji i sterylizacji w obszarze medycznym i przemysłowym 2. Działania przeciwdrobnoustrojowe w szpitalu i w warunkach polowych 3. Związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym oraz sesje plakatowe. W ramach każdej sesji przewidziane są krótkie wystąpienia ustne uczestników.

106 194 Nr 1 INFORMACJE O KONFERENCJI: Aule A i B budynku REKTORATU Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Bydgoszcz, ul. Jagiellońska Planowane rozpoczęcie rejestracji od godz. 900 Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Stowarzyszenie Rozwój Mikrobiologii Bydgoszcz, ul. Marii Skłodowskiej - Curie 9 Telefony: Informacje ogólne - tel , Płatności - tel rozw_mikrob@cm.umk.pl do r zł/osoba od r zł/osoba Organizatorzy nie zapewniają noclegu, ani nie pokrywają kosztów przejazdu Odbiorca: Stowarzyszenie ROZWÓJ MIKROBIOLOGII Bydgoszcz, ul. Marii Skłodowskiej - Curie 9 Nr konta: BGŻ Tytułem: Nazwisko i Imię, II OKDP Wystąpienie ustne 10-minutowe; Plakat w formie elektronicznej (MS PowerPoint) o zdefiniowanych wymiarach: cm (układ pionowy) Udział bierny Zgłoszeń prosimy dokonywać na druku Formularza Uczestnictwa i przesłać go w wersji elektronicznej (format.doc) na adres rozw_mikrob@cm.umk.pl do dnia r. Organizatorzy zastrzegają sobie prawo wyboru streszczeń do prezentacji ustnej i plakatowej. Termin nadsyłania streszczeń upływa r. Format streszczenia musi być zgodny z załączonym Formularzem Streszczenia. Jeden uczestnik może nadesłać jedno streszczenie - każde kolejne to koszt 15 zł. KOMITET NAUKOWY: Prof. dr hab. n. med. Eugenia Gospodarek-Komkowska - przewodnicząca Dr n. med. Agnieszka Mikucka - w-ce przewodnicząca Dr inż. Krzysztof Skowron - w-ce przewodniczący

107 Nr Konferencja pod patronatem PTM IX OGÓLNOPOLSKA KONFERENCJA HYDROMIKROBIOLOGICZNA HYDROMICRO 2017: DROBNOUSTROJE - OSIĄGNIĘCIA I WYZWANIA września 2017, Olsztyn Szanowni Państwo! Bardzo serdecznie zapraszamy na IX Ogólnopolską Konferencję Hydromikrobiologiczną, organizowaną w dniach od 17 do 19 września 2017 roku przez Katedrę Mikrobiologii Środowiskowej Wydziału Nauk o Środowisku Uniwersytetu Warmińsko Mazurskiego w Olsztynie. Będzie to dziewiąte ogólnopolskie spotkanie środowisk naukowych związanych z mikroorganizmami ekosystemów wodnych. Poprzednie spotkania odbywały się w: Słupsku-Ustce (2000), Toruniu (2002), Zielonej Górze - Łagowie (2004), Mikołajkach (2006), Warszawie - Wierzbie (2008), Gdańsku (2010), Wrocławiu (2013) oraz Gliwicach (2015). Tematyka konferencji obejmuje: mikroorganizmy wód śródlądowych, podziemnych i morskich, mikroorganizmy w inżynierii środowiska, sanitarno bakteriologiczne aspekty oczyszczania ścieków, transmisję mikroorganizmów patogennych drogą wodną, zanieczyszczenia biologiczne w systemach wodnych biobezpieczeństwo i bioremediację wód, diagnostykę organizmów wodnych, mikrobiologię przemysłową i biotechnologię. Językiem konferencji jest język polski lub angielski Zgłoszenia (w postaci wypełnionej karty zgłoszenia uczestnictwa - do pobrania ze strony należy przesłać do 30 maja 2017 roku na adres: hydromicro@uwm.edu.pl Streszczenia w języku polskim lub angielskim przygotowane wg schematu zamieszczonego na stronie Konferencji prosimy przesyłać droga mailową do 30 czerwca 2017 roku. Konferencja odbędzie się w Olsztynie, w atrakcyjnie usytuowanym hotelu Omega. W imieniu Komitetu Organizacyjnego Dr hab. Zofia Filipkowska, prof. UWM

108 196 Nr 1 Konferencja pod patronatem PTM IV edycja konferencji Wektory i patogeny w przeszłości i przyszłości Wrocław, 24 listopada 2017 Szanowni Państwo, Instytut Genetyki i Mikrobiologii Uniwersytetu Wrocławskiego oraz Wrocławski Oddział Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów i Wrocławski Oddział Polskiego Towarzystwa Parazytologicznego zapraszają na IV edycję konferencji pt. Wektory i patogeny w przeszłości i przyszłości. Konferencja ma na celu prezentację badań z zakresu mikrobiologii i parazytologii jakie są prowadzone aktualnie w krajowych jak i zagranicznych jednostkach naukowych. Pragniemy również udokumentować historyczny dorobek polskich naukowców w tych dziedzinach. W tym roku szczególną uwagą objęty będzie problem uwarunkowanych środowiskowo chorób infekcyjnych i inwazyjnych, których czynnikami etiologicznym są patogeny transmitowane przez stawonogi (wektory), głównie hematofagiczne kleszcze i komary, a także ukazanie skutecznych sposobów zapobiegania i monitorowania tych zagrożeń. Podczas konferencji planowana jest prezentacja praktycznych osiągnięć 20-letniej współpracy Instytutu Genetyki i Mikrobiologii UWr z Wydziałem Środowiska i Rolnictwa Urzędu Miasta Wrocławia w zakresie biologicznego (mikrobiologicznego) zwalczania komarów na terenie Aglomeracji Wrocławskiej. Ważnym celem konferencji jest także integracja środowiska naukowego oraz ukazanie osiągnięć naukowych młodych adeptów nauki. Szczegółowe informacje zamieszczone są na stronie: Organizator: Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii Miejsce: Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii ul. Przybyszewskiego 63/77, Wrocław

109 Nr Konferencja pod patronatem PTM 7 Międzynarodowa Konferencja Weiglowska Lwów, września 2017 r. Rudolf Weigl był wybitnym polskim mikrobiologiem austriackiego pochodzenia. Pracował w czasach międzywojennych we Lwowie (dzisiejsza Ukraina) w dziedzinach mikrobiologii lekarskiej, parazytologii, immunologii oraz biotechnologii, opracowując przy tym pierwszą skuteczną szczepionkę przeciwko durowi plamistemu. Mikrobiolodzy polscy i ukraińscy od 2003 r. organizują naprzemiennie w Polsce i Ukrainie dwustronne (później międzynarodowe) konferencje Weiglowskie w dziedzinie mikrobiologii i dyscyplinach pokrewnych. Poprzednie konferencje Weigowskie odbywały się we Lwowie (2003), Warszawie (2007), Odessie (2009), Wrocławiu (2011), Czerniowcach (2013) oraz w Gdańsku (2015). Kolejną, 7 konferencję Weiglowską zaplanowano zorganizować we Lwowie, mieście, gdzie R. Weigl pracował. Główne tematy konferencji to mikrobiologia ogólna, mikrobiologia lekarska, mikrobiologia środowiskowa, immunologia oraz biotechnologia. Konferencja odbędzie się w przepięknym Lwowskim Budynku Uczonych. Głównymi uczestnikami konferencji będą mikrobiolodzy ukraińscy i polscy, jednak przewiduje się także udział naukowców z innych krajów (Austria, Francja, Niemcy, Szwecja, Włochy, USA, Japonia). W konferencji weźmie udział około 250 uczestników. Oprócz programu naukowego, przewidziane są: wycieczka po Lwowie, koncert, recepcja oraz na życzenie - bankiet, spektakl w Operze Lwowskiej, a także wycieczka do pobliskich zamków. Konferencja przyczyni się do nawiązania bliższych kontaktów z naukowcami z Ukrainy oraz wzmocnieniu przyjacielskich stosunków między naszymi narodami. Planuje się, ze opłata konferencyjna wyniesie 140 Euro oraz 110 Euro dla młodych naukowców. Koszty obejmą 3 obiady, recepcję, 5 poczęstunków podczas przerw na kawę, wycieczka po mieście oraz materiały konferencyjne. Dodatkowo płatne będą bankiet (około 40 Euro) oraz spektakl w operze Lwowskiej (10 Euro). Po konferencji można będzie odwiedzić zamek Oleski (1 dzień), Poczajow i Krzemieniec (1 dzień) lub Kamieniec Podolski (2 dni), wycieczki te są płatne dodatkowo.

110 198 Nr 1 Ukrainian Society of Cell Biology For the attention of specialists in the field of microbiology, biotechnology, immunology. Institute of Cell Biology National Academy of Sciences of Ukraine, All-Ukrainian Public Organization Ukrainian Society of Cell Biology inform you about: 7th International Weigl Conference that will be held on September 26-29, 2017 in Lviv, Ukraine, in the main building of Ivan Franko Lviv National University. List of planned sessions: 1. Microbial cell biology. 2. Microbial biotechnology. 3. Environmental microbiology. 4. Metabolism and regulation. 5. Medical microbiology. 6. Immunology. 7. Microbe-host cell interaction. 8. Microbial genetics. Participation of leading foreign and ukrainian scientists is expected in the Conference. Working language English. weigl2017@gmail.com Early bird registration & payment (till May 31, 2017): 110 / 90. Materials received after the deadline will not be accepted. Each person may submit up to 3 abstracts. Invitation letters to the participants of the conference will be sent by before 1 st September Complete information is presented on the website: CONTACT INFORMATION OF ORGANIZING COMMITTEE REPRESENTATIVES Address: Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine, Drahomanov Street, 14/16, Lviv, Ukraine. Dmytruk K.V., Head of Secretariat PhD, Senior Scientist Phone: ; FAX: , е-mail: dmytruk@cellbiol.lviv.ua / dmytruk77@gmail.com Barska M.L., Executive Secretary of Ukrainian Society of Cell Biology, PhD, Phone: ; FAX: , е-mail: barska@cellbiol.lviv.ua

111 Nr Złoty Członek Wspierający PTM Od r. CZŁONKOWIE WSPIERAJĄCY PTM HCS Europe Hygiene & Cleaning Solutions, ul. Warszawska 9a, Węgrzce k/ Krakowa Tel: (12) , , fax (12) Firma projektuje profesjonalne systemy utrzymania czystości i higieny dla klientów o szczególnych wymaganiach higienicznych, m.in. kompleksowe systemy mycia, dezynfekcji, osuszania rąk dla pracowników służby zdrowia, preparaty do dezynfekcji powierzchni dla służby zdrowia, systemy sterylizacji narzędzi. Srebrny Członek Wspierający PTM Od r. Aesculap Chifa Sp. z o.o. ul. Tysiąclecia Nowy Tomyśl Tel. (61) , Fax (61) Aesculap Chifa Sp. z o.o. jest członkiem grupy B. Braun, jednej z wiodących na świecie firm medycznych, produkującej i dystrybuującej miedzy innymi preparaty do antyseptyki rąk, skóry, błon śluzowych, do mycia i dezynfekcji wyrobów medycznych oraz powierzchni.