Stomatologia estetyczna

Transkrypt

1 Stomatologia estetyczna in vitro Domowe wybielanie zębów z użyciem nakładek na noc zyskało popularność na całym świecie jako metoda zachowawcza rozjaśniania naturalnych zębów. Pierwotnym oraz używanym obecnie środkiem do nocnego wybielania nakładkowego jest nadtlenek karbamidu [1]; wiele dostępnych obecnie systemów zawiera 10% nadtlenek karbamidu jako aktywny składnik wybielający [2, 3]. Proces wybielania zębów zakłada bezpośredni kontakt środka wybielającego z powierzchnią zęba przez dłuższy czas. Jednakże ten bezpośredni długotrwały kontakt zwiększył obawy co do potencjalnych działań niepożądanych, jakie środki wybielające mogą wywierać na szkliwo. W poprzednich badaniach za pomocą różnych metod oceniano potencjalne działania niepo- 47

2 Próbki zębów skanowano dwukrotnie: przed i po aplikacji środka wybielającego. W obu badaniach zastosowano te same parametry skanowania. Dane z obu badań analizowano w zestawieniach parami: dane wyjściowe (pierwsze skanowanie) oraz dane uzyskane po wybielaniu (drugie skanowanie). Zawartość minerałów na powierzchni próbek oraz w warstwach podpowierzchniowych była określana ilościowo przed i po wybielaniu. Do tego celu przekonwertowano liniowy współczynnik osłabienia na wartości stężenia minerałów, zakładając, że składnikiem absorbującym promieniowanie rentgenowskie był hydroksyapatyt wapnia. Wykonano indywidualny uchwyt do próbek, aby za jego pomocą ustabilizować preparaty w skanerze μct. Podczas badania umieszczono wilgotna gąbkę w uchwycie do próbek, sam uchwyt uszczelniono folią samoprzylegającą, aby zachować wilgotne środowisko i zapobiec pęknięciom, które mogłyby się pojawić w środowisku suchym. Próbki zeskanowano na całej grubości, zachowując wysoką rozdzielczość. Odtworzony obraz miał rozżądane 10% nadtlenku karbamidu na fizyczne i chemiczne właściwości szkliwa. Do metod tych należały: analiza SEM [3], analiza profilometryczna [4], testy na mikrotwardość i odporność na złamania [5], pomiary ilości utraconego wapnia czy spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni [7]. Pomimo że dostępne są różne techniki oceny zawartości minerałów w szkliwie [8], do ustalenia możliwego wpływu demineralizacyjnych środków wybielających na szkliwo wielu badaczy wybierało testy na mikrotwardość [5, 9 11]. Za pomocą tej metody możliwa jest ilościowa ocena utraty i wzrostu zawartości minerałów, jednak działa ona destrukcyjnie na próbki szkliwa [12]. Tomografia mikrokomputerowa (μct) jest nową i rozwijającą się technologią, która może być używania do mapowania rozkładu minerałów w zębach, nie niszcząc ich [13]. Tomografia mikrokomputerowa była szeroko stosowana do badania mineralnej zawartości szkliwa [13 17]. Metoda ta uważana jest za użyteczne narzędzie do ilościowych pomiarów w badaniach stomatologicznych [18.] Jednakże użycie μct do badania wpływu materiałów stomatologicznych na zawartość minerałów w szkliwie i zębinie ograniczało się do badań nad użyciem lasera i metod trawienia [19 21]. Obecna wiedza na temat wpływu środków wybielających zawierających 10% nadtlenek karbamidu na zawartość mineralną szkliwa obejmuje wiele za i przeciw [22]. Istnieje potrzeba przeprowadzenia większej liczby badań nad wpływem środków wybielających na szkliwo [6]. Tomografia mikrokomputerowa nie była jeszcze używana do oceny wpływu środków wybielających na szkliwo. Dlatego też, w niniejszym badaniu użyto μct do prześledzenia ewentualnego wpływu demineralizacyjnego 10% nadtlenek karbamidu na szkliwo po okresowym wybielaniu w warunkach in vitro. Sześć usuniętych zdrowych ludzkich drugich trzonowców szczęki przechowywano w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej do momentu, gdy były potrzebne. Z zębów wycięto dwanaście próbek w kształcie walca, każdy o przekroju 2x3 mm i długości 4 mm, za pomocą diamentowej piłki (precyzyjnej diamentowej piły linowej, Well, Niemcy) z chłodzeniem wodnym. Próbki wykonano w taki sposób, aby wszystkie pochodziły ze środkowej policzkowej 1/3 korony anatomicznej. Preparaty wyszczotkowano miękką szczoteczką do zębów (Oral B nr 35, włókna miękkie, Oral B Laboratories, Belmont, USA) pod bieżącą wodą destylowaną. Wszystkie powierzchnie, z wyjątkiem naturalnej powierzchni szkliwa, pokryto lakierem do paznokci. Użyto skanera μct (μct 80, Scanco, Szwajcaria) do oceny zawartości minerałów w preparatach zębów zarówno przed, jak i po zastosowaniu nadtlenku karbamidu. Po pierwszym skanowaniu próbki przeniesiono na sterylną płytkę do hodowli komórkowej. Wnętrze zagłębień wypełniono okrągłymi kawałkami gąbki z otworem w środku. Przed umieszczeniem próbek w otworach, gąbki zwilżono sztuczną śliną (Seria numer 17336, Saliveze, Wyvern, Wielka Brytania) celem stworzenia warunków klinicznych. Sztuczna ślina, zgodnie z danymi producenta, zawierała chlorek wapnia, chlorek magnezu, chlorek sodu, chlorek potasu, dwuzasadowy fosforan dwusodowy, sorbitol oraz karboksymetylocelulozę. Próbki zostały umieszczone w sposób odsłaniajacy jedynie część policzkową szkliwa. Za pomocą strzykawki o objętości 1 ml (BD, Plastipak, Irlandia) na powierzchnię naturalnego szkliwa naniesiono 0,01 ml żelu wybielającego zawierającego 10% nadtlenek karbamidu (Regular, Ultradent, USA). Zmierzone natychmiast po otwarciu, za pomocą skalibrowanego ph-metru (Orion 920A, Thermo Electron, USA) ph żelu wynosiło 6,8. Próbki przechowywano w wilgotnym środowisku w temperaturze 37 przez 8 godzin. Po tym okresie próbki spłukano wodą destylowaną, aby usunąć żel. Następnie zostały one zanurzone w sztucznej ślinie wewnątrz płytek i inkubowano je w temperaturze 37 przez kolejne 16 godzin. Substytut śliny miał ph równe 6,9. Cykl wybielania był powtarzany przez 15 następujących po sobie dni. 48

3 dzielczość 2048x2048 pikseli z izotropowym wokselem o wymiarze 25 μm. W stacji roboczej szarości obrazu odzwierciedlone są w skali poziomów szarości od do Im bardziej zmineralizowana tkanka, tym wyższa wartość poziomu szarości. Ustalono optymalne wartości progowe dla zębiny i szkliwa na odpowiednio 296 i 580. Wybrano sześć obszarów zainteresowania (ROI) dla każdej próbki zęba za pomocą oprogramowania obliczeniowego dostępnego dla stacji roboczej skanera (Ryc. 1). Na stacji roboczej użyto wartości progowej dla szkliwa w celu zdefiniowania wewnętrznej wartości podczas automatycznego wyznaczania konturów dla ROI-1, ROI-2, ROI-3, ROI-4, ROI-5 i ROI-6. Jako graniczną wartość zewnętrzną wybrano 81, która odpowiadała lakierowi do paznokci, powietrzu i wilgotnej gąbce, przez co zostały wykluczone z obliczeń. Podczas automatycznego wyznaczania konturów dla ROI, liczba iteracji została ustalona na 3X, co pozwoliło na dobre dopasowanie granic ROI do granic próbek szkliwa. ROI-5 zdefiniowano manualnie, gdyż łatwiej było określić granicę pomiędzy szkliwem a zębiną w sposób manualny (z przyczyn praktycznych). Wartości szarości, które przekraczały wartości progowe dla szkliwa i zębiny, określono odpowiednio jako szkliwo i zębinę. Grubość każdego ROI wynosiła 50 μm. ROI-1, 2, 3, 4 i 6 zawierały wszystkie woksele odpowiadające szkliwu, podczas gdy ROI-5 zawierał wszystkie woksele odpowiadające zębinie. Innymi słowy, każdy ROI zawierał całość szkliwa lub zębiny dostępnej w dwóch kolejnych warstwach grubości 25 μm. I tak: ROI-1 rozpoczynał się od powierzchni szkliwa, sięgając do 50 μm w głąb, następne były z ROI-2, ROI-3 i ROI-4. ROI-5 rozciągał się od połączenia szkliwno-zębinowego w kierunku zębiny, a ROI-6 od tego samego punktu w kierunku powierzchni. Przeprowadzono obliczenia dla każdego ROI przed i po zastosowaniu środka wybielającego. Oceniono w sumie 144 obszary przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu dostępnego w stacji roboczej. Wartości median szarości z każdego obszaru przekształcono na jednostkę g/cm 3, przy założeniu, że substancją absorbującą promienie rentgenowskie jest hydroksyapatyt wapnia. Do tego celu użyto samodzielnie wykonanego cylindrycznego bloku hydroksyapatytu (Plasma Biotal Ltd, Buxton, Wielka Brytania), o gęstości 2,9 g/cm3, średnicy 13 mm i wysokości 3 mm, który zeskanowano przy użyciu tych samych parametrów skanera. Uzyskane w powyższy sposób dane zostały użyte w celu wyznaczenia ekwiwalentu gęstości hydroksyapatytu. Wyniki Tabela I przedstawia średnie wartości ekwiwalentu gęstości hydroksyapatytu dla różnych obszarów ROI. Porównano zawartości minerałów przed i po zastosowaniu 10% nadtlenku karbamidu (test t dla par skojarzonych, p=0,05). Zaobserwowano istotną statystycznie różnicę zawartości minerałów ekwiwalentu hydroksyapatytu dla ROI-1, który odpowiada zewnętrznej 50 μm warstwie szkliwa (test t dla par skojarzonych, p<0,05). Dla pozostałych porównań nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy (test t dla par, p>0,05) (Tab. II). Omówienie Zgodnie z zaleceniami producenta, pacjent powinien używać nakładek wypełnionych środkiem wybielającym przez noc, po czym następuje przerwa w noszeniu (dzień). Dlatego też w niniejszym badaniu użyto cyklicznego modelu zawierającego okresy wybielania oraz okresy remineralizacji sztuczną śliną, celem symulacji fizjologicznych warunków podczas domowego wybielania. Założono, że czas wybielania wynoszący 8 godzin odzwierciedli sytuację kliniczną. Ilość nadtlenku karbamidu została dobrana w taki sposób, aby wystarczała do całkowitego pokrycia powierzchni szkliwa. Substytut śliny miał ph neutralne i zawierał elektrolity, naśladując ludzką ślinę. 49

4 Pomimo że dostępnych jest wiele różnych technik oceny mineralizacji szkliwa [8], pomiary ilościowe utraty lub wzrostu minerałów są możliwe jedynie przy użyciu bezpośrednich technik chemicznych i radiologicznych [12]. Powszechnie używane techniki, jak mikroradiografia poprzeczna (TMR) i metody badania mikrotwardości przekrojów, mogą być stosowane dla ustalenia głębokości zmiany. Jednakże obie te metody są destrukcyjne dla szkliwa [12], podczas gdy μct bada zmineralizowane próbki szkliwa w trzech wymiarach, nie niszcząc próbek [13]. Dostępne Parametry μct 80 są następujące: woksel izotropowy o rozmiarach lub μm oraz macierz obrazu o wymiarach 512x512, 1024x1024 lub 2048x2048 pikseli. Dla niniejszego badania obraz rekonstrukcji 3D miał rozdzielczość 2048x2048 pikseli, a wielkość izotropowego woksela wynosiła 25 μm. Inne metody, które bazują na osłabianiu promieniowania X, np. TMR, mogą dostarczyć ilościowych pomiarów tylko zdemineralizowanych zmian w cienkich równoległych przekrojach zębów (typowo 100 μm), ukazując jednowymiarowo (linia) lub dwuwymiarowo (obszar) rozkład minerałów [23]. μct można również porównać do mikroskopii sił atomowych (AFM), która jest potężnym narzędziem do bezpośredniej obserwacji procesów powierzchniowych w nanorozdzielczości. Uznano ją za odpowiednie narzędzie do pomiarów wysokiej rozdzielczości (10-10 m) kryształów i powierzchni szkliwa, w celu określenia wczesnych faz rozpuszczania minerałów [24]. AFM cechuje wyższa rozdzielczość, niż μct, jednakże zaletą μct jest możliwość oceny zarówno powierzchni, jak i głębiej położonych warstw szkliwa w trzech wymiarach. μct używano wcześniej w badaniach stomatologicznych do mapowania i oceny ilościowej zawartości mineralnej szkliwa [13 21]. Jak dotąd nie wykorzystano tej metody w celu analizy poszczególnych, wybranych obszarów zainteresowania (ROI). W niniejszym badaniu, w ocenie otrzymanych obrazów, wybór całych poziomych przekrojów szkliwa i zębiny przy użyciu obliczonych progów z iteracją jako ROI oraz niedestrukcyjna natura μct umożliwiły ocenę tych samych ROI tej samej próbki przed i po wybielaniu. Wykonany na zamówienie uchwyt do próbek pozwolił na dokładne ustabilizowanie próbek szkliwa dla obu badań przed wybielaniem i po wybielaniu. W niniejszym badaniu użyto lakieru do paznokci do pokrycia powierzchni cięcia przekrojów preparatów zęba, aby zapobiec interakcji żelu wybielającego z tymi powierzchniami. W badaniu przeprowadzonym przez Iijima i wsp. nad wpływem lakieru do paznokci na pomiary remineralizacji przekrojów szkliwa zastosowano metodę mikroradiografii [25]. Zgodnie z wynikami powyższego badania, wpływ lakieru do paznokci na główne parametry mikroradiografii, takie jak Ld, (głębokość zmiany) i Delta Z (utrata minerałów) wynosił mniej niż 5% wartości średnich. W naszym badaniu możliwy wpływ lakieru do paznokci, wilgotnej gąbki i powietrza wykluczono przy użyciu progowania wartości zewnetrzej, które odpowiadało tym strukturom. W literaturze stomatologicznej nadal spotyka się kontrowersje co do powodowania demineralizacji zębów przez nadtlenek karbamidu [6, 22, 26]. W niniejszym badaniu, ocena za pomocą μct tych samych ROI po klinicznej aplikacji środka wybielają-

5 cego zawierającego 10% nadtlenku karbamidu, trwającej 15 dni, ujawniła po wybielaniu istotną utratę minerałów w zewnętrznej warstwie 50 μm szkliwa. Nie było uszkodzeń w głębszych warstwach szkliwa ani w połączeniu szkliwno-zębinowym. Nie przeprowadzono dotychczas żadnych badań przy użyciu μct, które dotyczyłyby wpływu środków wybielających na szkliwo i zębinę. Jednakże Seghi i Dendry [5] stwierdzili, że próbki szkliwa poddane wybielaniu za pomocą 10% nadtlenku karbamidu przez 12 godzin nie zmieniły swoich wartości mikrotwardości powierzchniowej. Potocnik i wsp. [11] również stwierdzili, że wybielanie za pomocą 10% nadtlenku karbamidu przez 336 godzin nie wpłynęło znacząco na mikrotwardość szkliwa. W badaniu przeprowadzonym przez Lopes i wsp. [27] aplikacja 10% nadtlenku karbamidu na szkliwo przez 3 godzinny dziennie, a następnie zanurzenie w sztucznej ślinie na resztę doby przez 2 tygodnie nie zmieniły mikrotwardości próbek. Niezgodność powyższych badań z naszymi wynikami może być spowodowana inną metodologią oraz innymi okresami ekspozycji stosowanymi w tym badaniu. Z kolei Cimilli i Pameijer [28] donosili, że zastosowanie 10% nadtlenku karbamidu na szkliwo przez 5 lub 10 dni, przez 6 godzin dziennie, obniżyło twardość w skali Vickersa na poziomie 110 μm poniżej powierzchni szkliwa. Attin i wsp. [26] mierzyli twardość szkliwa w skali Knoopa. Po zastosowaniu 10% nadtlenku karbamidu zauważyli, że demineralizacja nastąpiła od powierzchni na głębokość 1,08 μm poniżej powierzchni szkliwa. Mimo że wyniki obu tych badań wskazały na istotną utratę minerałów w zewnętrznych warstwach szkliwa, obserwowany stopień demineralizacji znacznie się różnił. Mikrotwardość szkliwa jest funkcją liniową zawartości minerałów, jednakże metoda badania jest destrukcyjna dla próbek szkliwa [12]. Dlatego też nie- możliwe jest badanie tej samej objętości próbki badanej i kontrolnej. Może to być przyczyną niezgodności powyższych wyników z naszym badaniem. Wyjściowa gęstość mineralna obszaru ROI-1 miała niższe wartości niż pozostałe warstwy szkliwa (Tab. I). Donoszono, że zasadniczym czynnikiem determinującym rozwój i odwracalność demineralizacji jest termodynamiczny poziom nasycenia w ośrodku otaczającym minerały zęba. Remineralizacja zdemineralizowanych uszkodzeń podpowierzchniowych wymaga obecności wapnia i fosforanów, które zasadniczo pochodzą ze śliny i płynu płytkowego [29]. Z powodu braku informacji o wieku pacjentów i/lub fazie wyrzynania zębów użytych w niniejszym badaniu dyskusyjna pozostaje kwestia, czy owe niskie wartości wyjściowe gęstości mineralnej uwrażliwiły szkliwo na demineralizację. W przerwach pomiędzy aplikacją środka wybielającego preparaty szkliwa zanurzano w sztucznej ślinie o neutralnym ph, która zawierała wapń i fosforany, a zatem można było po niej oczekiwać efektu remineralizacyjnego [7]. Jednakże wartości wyjściowe uzyskane w tym badaniu pochodziły z próbek szkliwa przed zanurzeniem w substytucie śliny i dlatego też nie można było ocenić ilościowo wzrostu minerałów ze sztucznej śliny. Żel z 10% nadtlenkiem karbamidu użyty w niniejszym badaniu miał ph równe 6,9, dlatego też zaobserwowana demineralizacja nie może zostać przypisana niskiemu ph żelu. Z drugiej jednak strony, niektóre z powszechnie dostępnych produktów zawierają EDTA [30], który jest płynnym roztworem sodowej soli kwasu etylenodiaminotetraoctowego o ph 7,3 [31]. Donoszono o zmiękczającym wpływie EDTA na zębinę [31], co może tłumaczyć działanie demineralizacyjne niektórych środków wybielających. Nie wiemy, czy środek wybielający zastosowany w niniejszym badaniu zawierał EDTA lub inny składnik 51

6 chelatujący wapń. Co więcej, efekt demineralizacyjny mógł być wynikiem zmiany w strukturze szkliwa spowodowanej niekontrolowaną reakcją rodnika nadtlenkowego [5]. W badaniu McCrackena i Haywooda [6] oceniano ilość utraconego wapnia z ludzkiego szkliwa po ekspozycji na standardowy 10% roztwór wybielający nadtlenku karbamidu. Badacze stwierdzili, że ilość wapnia utraconego po stosowaniu na szkliwo przez 6 godzin 10% nadtlenku karbamidu była znacząco różna od ilości utraconego wapnia w zębach kontrolnych poddanych działaniu wody destylowanej w tym samym czasie. Jednakże ilość utraconego wapnia w zębach zanurzonych w coca coli nie różniła się znacząco od ilości utraconego wapnia w grupie potraktowanej 10% nadtlenkiem karbamidu. Konsumpcja powyższych napojów jest bardzo częsta w populacji pacjentów i dlatego też potrzeba dalszych badań z pozytywną kontrolą, aby ocenić wyniki naszego badania. Obserwowana w niniejszym badaniu powierzchniowa demineralizacja może zwiększyć podatność na ścieranie zębów spowodowane czynnikami abrazyjnymi, jak np. szczotkowanie zębów [22]. Aby ustalić, czy owa demineralizacja może ulec remineralizacji w dłuższym okresie przez ślinę i fluorki, należy przeprowadzić dalsze badania porównujące różne dostępne marki i stężenia. Wnioski Niniejsze badanie sugeruje, że użycie μct wraz z zaproponowaną metodą wyboru i oceny ROI jest rzeczywiście wiarygodnym narzędziem badania efektów wywoływanych przez środki wybielające. Niedestrukcyjna metoda pozwala na porównania w parach i pomaga uniknąć błędów, które mogą powstać, gdy porównuje się w jednej próbce zęba dwa różne obszary, które mogą mieć różną zawartość minerałów. Biorąc pod uwagę ograniczenia badania in vitro, stwierdzono, że aplikacja 10% nadtlenku karbamidu na szkliwo przez 2 tygodnie spowodowała demineralizację sięgającą na głębokość 50 μm poniżej powierzchni szkliwa. Powinno się prowadzić dalsze badania z grupami kontrolnymi, aby zweryfikować te wyniki. Zaleca się dokładne rozważenie zastosowania środków wybielających u pacjentów podatnych na próchnicę i ścieranie zębów. Badanie wspierał Wydział Stomatologii Odtwórczej Uniwersytetu w Leeds. Chcielibyśmy podziękować dr Nigelowi Bubbowi za wsparcie intelektualne i techniczne w przygotowaniu dysków hydroksyapatytu oraz panu Ianowi Smithowi za wsparcie techniczne w przygotowaniu uchwytów próbek. Substytut śliny użyty w niniejszym badaniu został podarowany przez Wyvern Medical Haywood VB, Heyman HO. Nightguard vital bleaching. Quintessence International 1989;20: Kelleher MGD, Roe FJ. The safety in-use of 10% carbamide peroxide (Opalescence) for bleaching teeth under the supervision of a dentist. British Dental Journal 1999;187: Haywood VB, Leech T, Heyman H, Crumpler D, Bruggers K. Nightguard vital bleaching: effects on enamel surface texture and diffusion. Quintessence International 1990; 21(10): McGuckin RS, Babin JF, Meyer BJ. Alterations in human enamel surface morphology following vital bleaching. Journal of Prosthetic Dentistry 1992;68: Seghi RR, Denry I. Effects of external bleaching on indentation and abrasion characteristics of human enamel in-vitro. Journal of Dental Research 1992;71(6): Mc Cracken MS, Haywood VB. Demineralization effects of 10 percent carbamide peroxide. Journal of Dentistry 1996;24: Oltu U, Gu rgan S. Effects of three concentrations of carbamide peroxide on the structure of enamel. Journal of Oral Rehabilitation 2000;27: Arends J, Bosch JJ. Demineralization and remineralization evaluation techniques. Journal of Dental Research 1992;71: Joiner A, Thakker G, Cooper Y. Evaluation of a 6% carbamide peroxide tooth whitening gel on enamel and dentine microhardness in-vitro. Journal of Dentistry 2004;32: Oliveira de R, Basting RT, Algisto JA, Rodrigues AL, Serra MC. Effects of a carbamide peroxide agent and desensitising dentifrices on enamel microhardness. American Journal of Dentistry 2003;16:42 6. Potocnik I, Ladislav K, Dominik G. Effect of 10% carbamide peroxide bleaching gel on enamel microhardness, microstructure and mineral content. Journal of Endodontics 2000; 26(4): White DJ, Faller RV, Bowman WD. Demineralization and remineralization evaluation techniques-added considerations. Journal of Dental Research 1992;71: Elliot JC, Davis GR, Anderson P, Wong FSL, Dowker SEP, Mercer C. Application of laboratory microtomography to the study of mineralised tissues. Anales de Quimica Int. Ed. 1997;93:S77 S82. Kinney JH, Balooch M, Haupt DL, Marshall SJ, Marshall GW.

7 Mineral distribution and dimensional changes in human dentine during demineralization. Journal of Dental Research 1995;74(5): Wong FSL, Elliot JC, Anderson A, Davis GR. Three dimensional mineral distribution in the dentine of a rat incisor measured by X-ray microtomography. Journal of Dental Research 1995;74:849. Anderson P, Elliot JC, Bose U, Jones S. A comparison of the mineral content of enamel and dentine in human premolars and enamel pearls measured by X-ray microtomography. Archives of Oral Biology 1996;41: Davis GR, Wong FSL. X-ray microtomography of bones and teeth. Physiological measurement 1996;17: Mercer CE, Anderson P. X-ray microtomography: a novel technique for quantification of effects in enamel following CO2 laser application. British Dental Journal 1996;180: Groth EDB, Mercer CE, Anderson P. Microtomographic analysis of subsurface enamel and dentine following Er:YAG laser and acid etching. European Journal of Prosthodontics and Restorative Dentistry 2001;9:73 9. Periasamy K, Anderson P, Brook AH. A quantitative study of the effect of pumicing and etching on the remineralization of enamel opacities. International Journal of Pediatric Dentistry 2001;11: Mercer C, Anderson P, Davies G. A study of Er;YAG laser ablation using X-ray microtomography. British Dental Journal 2003;194: Attin T, Kielbassa M, Schwanenberg M, Hellwig E. Effect of fluoride treatment on remineralization of bleached enamel. Journal of Oral Rehabilitation 1997;24: Dowker SEP, Elliott JC, Davis GR, Wassif HS. Longitudinal study of the three-dimensional development of subsurface enamel lesions during in vitro demineralization. Caries Research 2003;37: Finke M, Jandt KD, Parker D. The early stages of native enamel dissolution studied with atomic force microscopy. Journal of Colloid and Interface Science 2000;232: Iijima Y, Takagi O, Duschner H, Ruben J, Arends J. Influence of nail varnish on the remineralization of enamel single sections assessed by microradiography and confocal laser scanning microscopy. Caries Research 1998;32(5): Attin T, Muller T, Paty A, Lennon AM. Influence of different bleaching systems on fracture toughness and hardness of enamel. Operative Dentistry 2004;29(2): Lopes GC, Bonissoni L, Baratieri LN, Vieira LC, Monteiro Jr S. Effect of bleaching Agents on the hardness and morphology of enamel. Journal of Esthetic and Restorative Dentistry 2002;14: Cimill H, Pameijer CH. Effect of carbamide peroxide bleaching agents on the physical properties and chemical composition of enamel. American Journal of Dentisty 2001; 14(2):63 6. Aoba T. Solubility Properties of human tooth mineral and pathogenesis of dental caries. Oral Diseases 2004; 10: Pinheiro Junior EC, Fidel RA, da Cruz Filho AM, Silva RG, Pecora JD. In vito action of various carbamide peroxide gel bleaching agents on the microhardness of human enamel. Brazilian Dental Journal 1996; (2):75 9. Hülsmann M, Heckendorff M, Scha fers F. Comparative in-vitro evaluation of three chelator pastes. International Endodontic Journal 2002; 35: