Analiza zróżnicowania bakterii endofitycznych zasiedlających różne odmiany kukurydzy (Zea mays L.)

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Przyrodniczo-Technologiczny mgr Katarzyna Pisarska Analiza zróżnicowania bakterii endofitycznych zasiedlających różne odmiany kukurydzy (Zea mays L.) Analysis of bacterial endophytes diversity colonizing the different cultivars of maize, Zea mays L. Praca doktorska wykonana w Zakładzie Mikrobiologii Rolniczej pod kierunkiem prof. dr hab. Stanisława Pietra Wrocław 2013

2 Badania w części finansowane przez Narodowe Centrum Nauki Nr 2011/01/N/NZ9/02332

3 Serdecznie dziękuję promotorowi Prof. dr hab. Stanisławowi Pietrowi za zainteresowanie tematem oraz cenne uwagi. Dziękuję Pani Teresie Lewickiej, Pani Janinie Urban, Mariuszowi Adamskiemu za nieocenioną pomoc.

4 Pracę dedykuję mojej Rodzinie

5 Spis treści 1. Przegląd literatury Wstęp Źródła bakterii endofitycznych Nasiona Fyllosfera Rizosfera Kolonizacja gospodarza przez bakterie endofityczne Liczebność bakterii endofitycznych Wpływ bakterii endofitycznych na roślinę Wiązanie wolnego azotu Produkcja fitohormonów Produkcja substancji przeciwko fitopatogenom Oddziaływania molekularne pomiędzy endofitami a roślinami Fitorekultywacja Endofity jako inhibitory wzrostu roślin Podsumowanie Cel pracy Materiały Materiał roślinny Podłoża Metodyka badań Izolacja endofitów z roślin z mikropoletek Uprawa kukurydzy w warunkach in vitro Izolacja endofitów z roślin in vitro Cechy fenotypowe i genotypowe badanych bakterii Identyfikacja izolatów na podstawie genu 16S rrna Wykorzystanie związków fenolowych jako jedyne źródło węgla i energii Wzrost w obecności związków fenolowych Produkcja metabolitów przeciwgrzybowych Produkcja związków rozpuszczających fosforan trójwapniowy Identyfikacja genu nifh Biosynteza enzymów degradujących ścianę komórkową roślin Biosynteza kwasu indolilo-3-octowego Biosynteza kwasu indolilo-3-masłowego Biosynteza kwasu salicylowego

6 Identyfikacja genu acds Wpływ zapraw nasiennych Wpływ endofitów na wzrost i procesy fizjologiczne kukurydzy Doświadczenie in vitro Doświadczenie wazonowe Pilotowe doświadczenie polowe Aktywność amoniakoliazy fenyloalaninowej PAL Aktywność peroksydazy gwajakolowej GPOX Zawartości chlorofilu Plon świeżej i suchej masy Analiza statystyczna Wyniki Izolacja i identyfikacja endofitów Izolacja endofitów z ziarniaków kukurydzy Izolacja endofitów z liści kukurydzy Identyfikacja endofitów kukurydzy Cechy fenotypowe i genotypowe endofitów Wykorzystanie kwasów fenolowych przez endofity Aktywność przeciwgrzybowa, zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia, obecność genu reduktazy nitrogenazy (nifh) badanych endofitów Analiza podobieństwa zespołów endofitów Aktywność enzymów pozakomórkowych hydrolzujących białka i polisacharydy Selekcja endofitów stymulujących wzrost siewek kukurydzy w warunkach in vitro Charakterystyka wybranych szczepów Biosynteza regulatorów wzrostu roślin Wpływ zapraw nasiennych Wpływ wybranych szczepów a procesy fizjologiczne kukurydzy w doświadczeniu wazonowym Wpływ mieszaniny wybranych bakterii na indukcję enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL), peroksydazy gwajakolowej (GPOX) oraz na zawartość chlorofilu w liściach w pilotowym doświadczeniu polowym Dyskusja Zróżnicowanie genotypowe endofiów Zróżnicowanie fenotypwe endofiów Wpływ endofitów na wzrost i rozwój roślin Wnioski Piśmiennictwo

7 8. Załączniki Tabele Wykresy Diagramy Fotografie

8 1. Przegląd literatury 1.1 Wstęp W warunkach naturalnych wzrost roślin jest ściśle uzależniony od szeregu czynników biotycznych i abiotycznych. Wśród czynników biotycznych znaczną rolę odgrywają drobnoustroje. Unikalne zespoły mikroorganizmów towarzyszące roślinom, jak w każdym biotopie, kształtowane są przez specyficzne cechy fizyko-chemiczne gleb jak również aktywność metaboliczną danej rośliny. Aktywne fizjologicznie drobnoustroje w glebie zasiedlają głównie strefę w pobliżu korzeni roślin tworząc specyficzną niszę, rizosferę. Pojęcia rizosfera w 1904 roku po raz pierwszy użył Hiltner. Rizosfera to gleba podlegająca oddziaływaniom wydzielin systemu korzeniowego i zasiedlające go drobnoustroje, które wykorzystują wydzieliny korzeniowe jako źródło węgla, azotu i energii [James i wsp. 1985]. Rizosfera jest uprzywilejowanym miejscem wzajemnego oddziaływania drobnoustrojów glebowych i roślin [Pietr 1990]. Większość drobnoustrojów rizosferowych jest neutralna, ponieważ nie wywiera żadnego zauważalnego wpływu na wzrost i rozwój roślin. Wzajemne oddziaływania roślina mikroorganizmy rizosferowe mogą być antagonistyczne lub nieantagonistyczne. Istotną rolę w zwiększeniu efektywności produkcji roślinnej jak i możliwości zasiedlania i przetrwania roślin w środowiskach naturalnych odgrywają mikroorganizmy, które wchodzą w różnego rodzaju nieantagonistyczne interakcje z roślinami. Wśród nich najlepiej poznane są układy symbioz mutualistycznych przynoszących korzyści obu stronom lub komensalizm korzystny dla jednej, a dla drugiej strony takiego układu jest obojętny. Specyficznym rodzajem symbiozy pomiędzy drobnoustrojami a roślinami jest endosymbioza. Występuje ona w momencie, gdy komórki jednego organizmu żyją we wnętrzu komórek lub tkanek innego organizmu. Od kilkudziesięciu lat wiadomo również, że drobnoustroje zasiedlają zdrowe rośliny. Bakterie te nazwano endofitami. Samo słowo endofit (ang. endophyte) oznacza dosłownie wewnątrz rośliny, endon z greckiego to wewnątrz a phyton to roślina. Prawdopodobnie każda roślina jest gospodarzem dla jednego lub kilku gatunków bakterii [Strobel 2004]. Za endofity uważa się drobnoustroje, zarówno bakterie jak i grzyby, które bytując we wnętrzu rośliny, nie powodują choroby gospodarza [Holliday 1989, Kado 1992]. W praktyce termin ten określa te drobnoustroje, które można wyizolować z powierzchniowo zdezynfekowanych tkanek roślinnych, które nie wykazują objawów 8

9 chorobowych [Holliday 1989]. Hardoim i wsp. [2008] podzielili endofity na: endofity fakultatywne drobnoustroje które mogą żyć we wnętrzu roślin oraz w innych środowiskach; endofity obligatoryjne drobnoustroje żyjące tylko i wyłącznie we wnętrzu rośliny, nie posiadają żadnego stadium życiowego, które przebiegałoby w środowisku zewnętrznym, przenoszone przez wektory; endofity okazjonalne drobnoustroje, które okazjonalnie kolonizują wnętrze rośliny jednocześnie czerpiąc z tego korzyści, w postaci dostępu do składników odżywczych, ochrony przed czynnikami zewnętrznymi lub braku konkurencji. Wiele bakterii endofitycznych, które do tej pory zostały poznane wyizolowano z rizosfery, rizoplany lub z wnętrza tkanek roślinnych [Klama 2004]. Wpływ tych bakterii na rośliny przebadano już pod kątem biologicznego zwalczania drobnoustrojów chorobotwórczych, indukcji odporności systemicznej, promowania wzrostu i rozwoju rośliny poprzez wiązanie wolnego azotu, syntezę fitostymulatorów, zwiększenia pobierania składników mineralnych czy zwiększenia odporności rośliny na niekorzystne czynniki abiotyczne. Najczęściej opisywanymi taksonami bakterii endofitycznych zasiedlających tkanki roślinne są z typu Proteobacteria rodzaje Azospirillum, Enterobacter, Pantoea i Pseudomonas, z typu Bacteroidetes rodzaj Flavobacterium oraz z typu Firmicutes rodzaj Bacillus [McInroy i Kloepper 1995b]. Jednak niewielka grupa roślin została kompleksowo przeanalizowana pod względem zasiedlających je endofitów [Ryan i wsp. 2008]. Najczęściej zespoły bakterii endofitycznych zasiedlających tkanki roślinne stanowią wachlarz rodzajów i gatunków [Rosenbleuth i Martinez-Romero 2006] Źródła bakterii endofitycznych Pochodzenie bakterii endofitycznych jest jednym z podstawowych pytań. W przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie, między innymi przez bulwy, cebule, kłącza, rozłogi czy sadzonki, części te, a co za tym idzie, rośliny potomne są już skolonizowane przez endofity [Dong i wsp. 1994]. Jednak źródłem tych drobnoustrojów są także nasiona, fyllosfera a przede wszystkim rizosfera. 9

10 Nasiona Hipoteza zaproponowana przez Mundt i Hinkle [1976], zakłada, że źródłem endofitów dla rośliny są nasiona. Ich badania nad obecnością bakterii endofitycznych w zalążkach roślinnych i nasionach 27 gatunków wykazały, że są one źródłem endofitów, w szczególności w przypadku nasion o uszkodzonych okrywach nasiennych. Badania Cankar'a i wsp. [2005] nad obecnością endofitów w nasionach świerku pospolitego (Picea abies L. Krast) wykazały obecność bakterii przede wszystkim w okrywie nasiennej, ale również w bielmie i zarodku. Również w przypadku niektórych gatunków eukaliptusów (Eucalyptus L'Her) nasiona stanowią rezerwuar bakterii endofitycznych [Ferreira i wsp. 2008]. Kaga i wsp. [2009] wykazali, iż ziarna ryżu (Oryza sativa L.) są również ważnym źródłem bakterii zasiedlających tkanki tej rośliny. Drobnoustroje, które zasiedlają okrywę nasienną ryżu wykazują zdolność do infekowania kolejnego pokolenia i są dominującymi gatunkami w tkankach w pełni rozwiniętej rośliny. Najprawdopodobniej o obecności endofitów w nasionach decyduje okrywa nasienna, im jest ona bardziej nierówna, tym większe zróznicowanie endofitów je zasiedla. W przypadku nasion o okrywie grubej i gładkiej dostęp drobnoustrojów do wnętrza jest znacznie utrudniony. Nasiona, w których do tej pory nie wykryto drobnoustrojów endofitycznych, mogą być zasiedlane przez nieliczne bakterie w swoich najgłębszych warstwach [Hallmann i wsp. 1997] Fyllosfera Fyllosfera to zbiór nadziemnych części rośliny wraz z mikroflorą i mikrofauną obecną na ich powierzchni. Drobnoustroje na powierzchnię roślin dostają się przede wszystkim z gleby w czasie kiełkowania, ale są również przenoszone przez wiatr wraz z kurzem lub pyłem, z kroplami deszczu bądź też przez owady [Dix i Webster 1995]. Endofity z powierzchni fyllosfery dostają się do wnętrza rośliny poprzez aparaty szparkowe, przetchlinki lub uszkodzenia naziemnych części, które stanowią naturalne wrota wnikania [Hallmann i wsp. 1997]. 10

11 Rizosfera Wielu badaczy podkreśla, że istotnym źródłem bakterii endofitycznych są drobnoustroje zasiedlające rizosferę. Gleba stanowi ważny rezerwuar drobnoustrojów. Bakterie z rizosfery wnikają do wnętrza korzenia poprzez tak zwane hot spots czyli miejsca powstawania korzeni bocznych, uszkodzone tkanki i mikropory a następnie migrują we wnętrzu rośliny poprzez apoplast i/lub tkanki przewodzące [Hurek i wsp 1994, James i wsp. 1994]. Dzięki temu mogą zasiedlać przestrzenie międzykomórkowe, ksylem a rzadziej wnętrza komórek szeregu organów, takich jak: korzenie, łodygi, liście, nasiona czy owoce. Obecność endofitów w tkance roślinnej uzależniona jest w dużej mierze od procesów metabolicznych gospodarza, jego wieku, rodzaju zasiedlanej tkanki a także od sezonu wegetacyjnego, w którym dokonuje się izolacji [Hardoim i wsp. 2008] Kolonizacja gospodarza przez bakterie endofityczne Drobnoustroje endofityczne, które zasiedlają nasiona, gwarantują sobie tym samym obecność w nowej roślinie. Dotyczy to również endofitów przenoszonych wraz z sadzonkami, bulwami czy podkładkami drzew owocowych. Asocjacje tych drobnoustrojów znajdują się w uprzywilejowanej sytuacji i mogą podlegać niewielkim modyfikacjom ze strony mikroorganizmów rizosferowych. Endofity pochodzące z rizosfery muszą skolonizować nowego gospodarza poprzez korzeń. Kolonizacja korzenia przebiega w dwóch fazach. W pierwszej z nich bakterie wiążą się na komórkach korzenia i wraz z jego wzrostem rozmieszczane są na całej powierzchni. W fazie drugiej drobnoustroje namnażają się w przestrzennie ograniczonych siedliskach [Gottlieb 2002]. W rizosferze dochodzi do selekcji drobnoustrojów, które posiadają większą zdolność do wykorzystywania wydzielin korzeniowych jako źródła węgla i energii i mogą rywalizować z innymi bakteriami [Rosenbleuth i Martinez-Romero 2006]. Pierwszy etap procesu kolonizacji rozpoczyna się od rozpoznania gatunkowo specyficznych wydzielin korzeniowych rośliny przez bakterie. W wyniku rozpoznania specyficznych związków organicznych w wydzielinach, np. określonych kwasów fenolowych lub aminokwasów, drobnoustroje migrują w kierunku ich źródła. Proces ten nazywamy chemotaksją. Zdolność chemotaksji w kierunku określonych komponentów 11

12 wydzielin korzeniowych jest istotnym elementem kolonizacji roślin przez bakterie [Gottlieb 2002], również przez drobnoustroje endofityczne. Pokazują to badania Bacilio-Jimenez i wsp. [2003]. Wśród wydzielin korzeniowych ryżu stwierdzili oni dominację glukozy, arabinozy, mannozy, galaktozy oraz aminokwasów takich jak histydyna, prolina, alanina oraz glicyna. Największe stężenie oraz zróżnicowanie węglowodanów i aminokwasów odnotowano w pierwszych dwóch tygodniach po wysiewie roślin. Chemotaksja endofitycznych izolatów Corynebacterium flavescens oraz Bacillus pumilus w stosunku do składników wydzielin korzeniowych ryżu była, odpowiednio 3,9 5,1 razy większa niż u wzorcowego izolatu A. brasiliense oraz razy większa w stosunku do Bacillus sp., drugiego wzorcowego izolatu [Bacilio-Jimenez i wsp. 2003]. Istotnym czynnikiem zapewniającym potencjalnym endofitom przewagę jest zdolność do wykorzystywania wielu składników wydzielin korzeniowych w procesie kolonizacji korzeni [Oksińska i wsp 2011]. Szczepy P. stutzeri PPS96, PSR2 oraz PSR21, które najefektywniej kolonizowały korzenie pszenicy (Triticum aestivum L.) wykorzystywały jako jedyne źródło węgla i energii kwas p-hydroksyfenylooctowy, bromobursztynowy, benzoesowy, pirogronian metylu, N-acetylo-D-glukozamonę, D-trehalozę oraz rybitol w przeciwieństwie do szczepów z tego samego gatunku o słabych zdolnościach do zasiedlania korzeni [Oksińska i wsp. 2011]. Hallman [2001] uważa, że do kontaktu gospodarza z potencjalnymi endofitami może dojść również na drodze elektrotaksji. Natomiast Shawn [2006] stwierdził, iż istotnymi czynnikami odgrywającymi rolę w komunikacji roślina bakteria są flawonoidy. Rola flawonoidów w stymulowaniu kolonizacji rośliny przez bakterie może mieć powiązanie z indukcją genów bakteryjnych odpowiedzialnych za syntezę lipopolisacharydu, który bierze udział w interakcji z receptorami błonowymi roślin [Reuhs i wsp. 2005]. Kolejnym etapem kolonizacji jest adhezja do powierzchni korzenia, a następnie intensywne podziały, które skutkują powstaniem mikrokolonii [Compant i wsp. 2008; James i wsp. 2002]. Wstępny etap adhezji to słabe, odwracalne oddziaływania międzycząsteczkowe np. typu oddziaływań van der Waalsa. Następnie rozpoczyna się kolejna, nieodwracalna faza spowodowana wiązaniem się za pośrednictwem fimbrii lub flagelli. Do kontaktu pomiędzy bakterią a powierzchnią korzenia może również dochodzić przy udziale zewnątrzkomórkowych białek bądź polimerów otoczkowych biorących udział w formowaniu kolonii [Gottlieb 2002]. Potencjał adhezyjny 12

13 drobnoustrojów uzależniony jest od fazy wzrostu i stopnia odżywienia komórek. Bakterie będące w fazie logarytmicznej przylegają w większym stopniu niż komórki znajdujące się w fazie stacjonarnej [Gottlieb 2002]. Michiels i wsp. [1991] opisując kolonizację korzeni pszenicy przez A. brasiliense Sp7 wyróżnili dwa etapy. Pierwszy z nich to adsorpcja (Ads) na powierzchni korzenia, osiąga maksymalny poziom po 2 godzinach inkubacji. Uzależniona jest od bakteryjnych białek powierzchniowych. Oddziaływania te jednak są słabe, gdyż drobnoustroje adsorbowane na powierzchni korzenia mogą zostać mechanicznie usunięte poprzez ich wirowanie. Drugi etap kolonizacji to zakotwiczanie (Anc) komórek zaabsorbowanych na powierzchni oraz komórek wolnych. Etap ten rozpoczyna się dopiero po 8 godzinach inkubacji a swoje maksimum osiąga po 16 godzinach inkubacji. Oba etapy są od siebie niezależne, gdyż mutanty izolatów A. brasiliense Sp7 pozbawione zdolności do adsorpcji nadal wykazywały zdolność do zakotwiczania na powierzchni. Etap zakotwiczania uzależniony jest natomiast od syntezy bakteryjnych zewnątrzkomórkowych polisacharydów. Michiels i wsp. [1991] w swoich badaniach potwierdzają to faktem, iż mutanty pozbawione zdolności biosyntezy Cal (ang. Calcofluor-binding polysaccharide) wykazywały 6-krotnie oraz 15-krotnie mniejszą zdolność zakotwiczania niż szczep z którego pochodziły. Drobnoustroje w strefie korzenia wnikają poprzez miejsca powstawania korzeni bocznych oraz poprzez strefę wydłużania i różnicowania się komórek [Roncato-Maccari i wsp. 2003]. Prieto i wsp. [2011] wskazali istotną rolę włośników w trakcie kolonizacji oliwki europejskiej (Olea europaea L.) przez Ps. fluorescens PICF7. Rizoplana korzeni oliwki europejskiej została szybko skolonizowana przez szczep Ps. fluorescens PICF7 znakowany markerem egfp (ang. the enhanced green fluorescent protein). Bakterie obserwowano na całej powierzchni włośników od drugiego dnia po bakteryzacji trzymiesięcznych roślin oliwki europejskiej. Kolonizację wnętrza włośników zaobserwowano już trzeciego dnia po bakteryzacji, występowała ona jednak sporadycznie, gdyż mniej niż 2% włośników zostało skolonizowanych wewnętrznie. Wewnątrz włośników bakterie występowały w postaci pojedynczych komórek lub tworzyły kolonie doczepione do wewnętrznych struktur błonowych włośników. Jednoczesna bakteryzacja oliwek szczepem Ps. fluorescens PICF7 znakowany markerem egfp lub markerem rfp (ang. the red fluorescent protein) wykazała zróżnicowaną kolonizację przez komórki wywodzące się z tych dwóch znakowanych 13

14 szczepów [Prieto i wsp. 2011]. Oba znakowane izolaty zostały zaobserwowane na epidermie włośników i dzieliły to samo miejsce kolonizacji, przy czym populacja pochodząca od jednej znakowanej komórki dominowała nad drugą. Sugeruje to wcześniejszą kolonizację określonego miejsca na włośniku przez jedną komórkę. Jednocześnie zaobserwowano kolonizację wnętrza włośników, które zawierały mieszaninę izolatów Ps. fluorescens PICF7 znakowanych egfp jak również rfp. Dowodzi to, iż wejście do wnętrza włośnika jednej komórki bakteryjnej nie zapobiega adhezji i penetracji przez inne komórki [Prieto i wsp. 2011]. Naruszenie ciągłości tkanek, wywołane przez patogeny lub czynniki mechaniczne, również stwarza wrota wejścia dla endofitów. Jednak wrota nie są wymagane, gdyż endofity bakteryjne potrafią wydzielać kompleksy enzymów CWDE (ang. Cell Wall Degrading Enzymes) takich jak enzymy celulolityczne, pektynolityczne i proteolityczne. Pozakomórkowe wydzielanie CWDE w celu degradacji roślinnej ściany komórkowej została stwierdzona między innymi u Azoarcus sp. BH72 [Reinhold-Hurek i wsp. 2006], Azospirillum irakense [Khammas i Kaiser 1992], Burkholderia sp. PsJN [Compant 2005], Enterobacter asburiae JM22 [Quadt-Hallmann i wsp. 1997], Klebsiella oxytoca [Kovtunovych i wsp. 1999] oraz Ps. fluorescens [Benhamout i wsp.1996]. Według Hallmann i wsp. [1997] synteza enzymów degradujących ściany komórkowe ma miejsce tylko i wyłącznie w momencie kolonizowania epidermy korzenia, nigdy w momencie kolonizowania przestrzeni międzykomórkowych rdzenia korzenia. Bakterie endofityczne produkują enzymy hydrolityczne wyłącznie we wczesnej fazie inwazji, nie stwierdzono ich wydzielania w trakcie bytowania we wnętrzu gospodarza [Benhamout i wsp. 1996]. Niska aktywność wydzielanych enzymów hydrolitycznych odróżnia bakterie endofityczne od patogenów bakteryjnych, których komórki wydzielają większą ilość enzymów hydrolitycznych powodujących uszkodzenia komórek roślinnych [Elbeltagy i ws. 2000]. Aktywną kolonizację roślin przez bakterie endofityczne zaobserwował Quadt-Hallmann i wsp. [1997b]. Inokulacja nasion bawełny (Gossypium hirustum L.) martwymi komórkami E. asburiae JM22 nie wykazała obecności bakterii nawet na powierzchni korzenia a inokulacji żywymi komórkami wykazała ich obecność na powierzchni korzenia, pomiędzy komórkami epidermy, w przestrzeniach komórkowych blisko powierzchni korzenia oraz w pobliżu tkanek przewodzących. 14

15 Pojedyncze komórki bakterii zaobserwowano nawet we wnętrzu komórek epidermy [Quadt-Hallmann i wsp. 1997b]. Mikrokolonie powstające na powierzchni korzenia stanowią punkt do inwazji do wnętrza tkanki roślinnej. W momencie, gdy komórki bakterii endofitycznych są już we wnętrzu rośliny dzielą się i kolonizują przestrzenie międzykomórkowe kory korzenia, a następnie kolonizują roślinę systemowo poprzez transport elementami przewodzącymi i/lub apoplastem [Hurek i wsp. 1994; James i wsp. 1994; Quadt-Hallmann i wsp. 1997]. Dystans, który pokonują drobnoustroje w trakcje rozprzestrzeniania w roślinie wynosi nawet 4 cm [Hallmann 2001]. Wyniki badań De Matos Nogueira i wsp. [2001] wskazują, iż dalsze rozprzesztrzenianie się endofitów w tkankach może być związane z ekspresją czynników rozluźniających ścianę komórkową przez gospodarza. Peterson i wsp. [1981] zaobserwowali, iż transport bakterii endofitycznych tkankami przewodzącymi jest ograniczony ze względu na samą budowę tych elementów i ma to związek z pasmami Kaspariego, które stanowią barierę utrudniającą endofitom przedostanie się przez endodermę. W warunkach naturalnych często jednak dochodzi do uszkodzeń endodermy, które pozwalają na przedostanie się drobnoustrojów do wnętrza tkanek przewodzących. Produkcja enzymów takich jak endoglukanaza [Reinhold-Hurek i wsp. 2006] czy endopoligalakturonaza [Compant 2005] wydaje się być niezbędna w procesie rozprzestrzeniania się endofitów. Tkanki przewodzące oraz przestrzenie międzykomórkowe to najczęściej zasiedlane nisze. Hallman i wsp. [1997] sugerują, że kolonizacja naczyń przewodzących rośliny jest ograniczona przestrzennie, co jest charakterystyczne dla bakterii endofitycznych i odróżnia je od patogenów roślinnych, które dzielą się znacznie szybciej a w efekcie mogą blokować naczynia Liczebność bakterii endofitycznych Zdolność bakterii endofitycznych do podziałów komórkowych we wnętrzu rośliny jest bardziej prawdopodobna niż ciągła ich inwazja do wnętrza, a wielkość populacji tych drobnoustrojów jest skorelowana ze stadium rozwojowym i wiekiem rośliny. Liczebność bakterii endofitycznych jest prawdopodobnie zależna od procesów metabolicznych rośliny oraz warunków środowiskowych. Czynniki biotyczne i abiotyczne również mają wpływ na to zjawisko [Hallmann 1997]. Liczebność bakterii endofitycznych jest największa w korzeniach i maleje w łodygach i liściach. Według Kobayashi i Palumbo [2000] naturalna liczebność bakterii endofitycznych dla lucerny 15

16 (Medicago sativa L.), słodkiej kukurydzy (Zea mays L.), buraka cukrowego (Beta vulgaris L.), bawełny, ziemniaka (Solanum tuberosum L.) i dyni (Cucurbita pepo L.) waha się pomiędzy j.t.k. g -1. Podobnie Zinniel i wsp. [2002] stwierdzili liczebności j.t.k. g -1 świeżej masy w tkankach soi, sorga, pszenicy i kukurydzy. Badania Fisher a i wsp. [1992] nad liczebnością endofitów w łodydze kukurydzy pokazują, iż liczebność mikroorganizmów waha się od 3.5 x 10 9 j.t.k. g -1 świeżej masy w partiach niższych, przez 4.5 x 10 7 j.t.k. g -1 świeżej masy w części środkowej po 2 x 10 5 j.t.k. g -1 świeżej masy w partiach wyższych łodygi. Rówież McInroy i Kloepper [1995a] badając endofity w dziesięciotygodniowych roślinach kukurydzy słodkiej stwierdzili obecność od 10 4 j.t.k. g -1 świeżej masy do 10 7 j.t.k. g -1 świeżej masy Wpływ bakterii endofitycznych na roślinę Odkrycie bakterii endofitycznych w roślinach było fenomenem i sporym wyzwaniem jest zrozumienie znaczenia ich funkcji. Wiadomo, że drobnoustroje mogą mieć pozytywny, negatywny lub obojętny wpływ na rośliny i środowisko. Z praktycznego punktu widzenia jesteśmy zainteresowani możliwością wykorzystania stymulującego działania bakterii na rośliny. Ryan i wsp. [2008] zaproponowali podział bakterii endofitycznych na cztery grupy funkcyjne. Do pierwszej z nich zaliczyli te bakterie, które odpowiadają za stymulację wzrostu i rozwoju roślin poprzez produkcję fitostymulatorów lub zwiększenie przyswajalności substancji odżywczych, w tym wiązanie wolnego azotu. W kolejnej grupie znalazły się te taksony, które produkują antybiotyki, substancje immunosupresyjne czy bioinsektycydy. Trzecia grupa endofitów indukuje odporność systemiczną roślin a ostatnia przyczynia się do polepszenia stanu środowiska naturalnego poprzez unieszkodliwianie toksycznych związków chemicznych takich jak np. fenole, chlorofenole, eter tert-butylowometylowy (MTBE), kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) czy 2,4,6-trinitrotoluen (TNT). Przedstawiciele tej grupy wykazują również zdolności do fitorekultywacji gleby skażonych metalami ciężkimi. 16

17 Wiązanie wolnego azotu Zdolność drobnoustrojów endofitycznych do wiązania wolnego azotu przyczynia się do zwiększenia puli azotu dostępnego dla rośliny. Na drodze biologicznego wiązania rocznie w biosferze przyswajane jest 175 x 10 6 ton azotu, z czego aż 30% zostaje związane przez układy niesymbiotyczne [Król i wsp. 2005]. Wśród diazotroficznych bakterii endofitycznych można wyróżnić przedstawicieli rodzajów Azospirillum, Acetobacter, Herbaspirillum, Azoarcus czy Azotobacter [Steenhoudt i Vanderleyden 2000]. Wiarygodnym markerem procesu wiązania wolnego azotu jest gen nifh, kodujący reduktazę nitrogenazy, amplifikowany przez uniwersalne primery PolF & PolR zaprojektowane przez Poly i wsp. [2001]. Zdolność do biologicznego wiązania wolnego azotu sprawia, że drobnoustroje te uznaje się również za stymulatory wzrostu roślin, nazwane PGPB (ang. Plant Growth Promoting Bacteria). Badania Rodrigues i wsp. [2008] nad wpływem Azospirillum amazonense na wzrost, plon oraz wiązanie azotu w ryżu wykazały wzrost akumulacji azotu w dojrzewającym zbożu z 3.5 do 18.5%. Inokulacja tym diazotrofem roślin ryżu wpłynęła również korzystnie na liczbę wiech oraz akumulację suchej masy w ziarnach. Wiele innych eksperymentów również potwierdza stymulujący wzrost i rozwój charakter diazotrofów [Klama 2004; Reinhold- Hurek i Hurek 1998; Strobel 2003]. Warto zwrócić szczególną uwagę na trzcinę cukrową (Saccharum officinarum L.), która na pewnych obszarach Brazylii uprawiana jest w monokulturze od kilkudziesięciu lat bez mineralnego nawożenia azotem. Przeprowadzone doświadczenia wskazują na to, że 50-80% azotu pobieranego przez tę roślinę pochodzi z atmosfery. Jest to możliwe dzięki symbiozie trzciny cukrowej z diazotroficzną bakterią G. diazotrophicus [Muthukumarasamy i wsp. 2002]. Należy również dodać, że znaczna część tego azotu pozostaje w resztkach pożniwnych i wzbogaca glebę Produkcja fitohormonów Bakterie endofityczne, tak jak i rizobakterie, mają zdolność do produkcji hormonów roślinnych. Jednym z najczęściej opisywanych jest kwas indolilo-3-octowy (IAA), należący do grupy auksyn. Enzymatyczna przemiana tryptofanu, prekursora IAA, jest prostą reakcją chemiczną, zatem zdolność drobnoustrojów do biosyntezy tego związku nie budzi zdziwienia [Pietr 1990]. Fitohormon ten stymuluje wzrost 17

18 wydłużeniowy, pobudza podziały komórkowe oraz indukuje tworzenie korzeni bocznych. Typowy efekt oddziaływania IAA zaobserwowali Long i wsp. [2008]. Inokulowali oni rośliny psianki czarnej (Solanum nigrum L.) wyizolowanymi endofitami, które wykazywały zdolność produkcji IAA. Wpłynęło to na modyfikacje wzrostu korzeni. Wyizolowane z buraka cukrowego przez Shi i wsp. [2009] bakterie endofityczne, również wykazywały zdolność do produkcji IAA. Inokulacja roślin trzema wybranymi izolatami, wykazującymi największą zdolności do produkcji IAA, wyraźnie podniosła plon świeżej i suchej masy roślin oraz liczbę liści na roślinę. Część drobnoustrojów endofitycznych wykazuje zdolność do produkcji kwasu indolilo-3- masłowego (IBA) zamiast IAA, który został stwierdzono w pozakomórkowych wydzielinach u A. brasiliense [Martinez-Morales i wsp.2003]. Kwas salicylowy (SA) należy również do hormonów roślinnych produkowanych przez bakterie. Związek ten bierze udział w indukcji odporności systemicznej rośliny (ISR) [Ran i wsp. 2005]. Jest również prekursorem do biosyntezy sideroforów u niektórych drobnoustrojów, m.in. bakterii z rodzaju Pseudomonas [Meyer i wsp. 1992]. Zdolność do biosyntezy SA została stwierdzona m.in. u Achromobacter xyloxidans SF2 i B. pumilus SF3, SF4 [Forchetti G. i wsp. 2010] oraz Ps. aeruginosa 7NSK2 [De Meyer i Hoffe 1997]. Niektóre bakterie endofityczne wykazują zdolność do modyfikacji poziomu etylenu w roślinie. Etylen hamuje wzrost wydłużeniowy oraz przyspiesza procesy dojrzewania i starzenia się tkanek. Ograniczenie ilości etylenu w tkankach roślinnych poprzez drobnoustroje polega na syntezie enzymu deaminazy kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego (ACC), który hydrolizuje ACC, prekursor etyleny, do amoniaku i kwasu ketomasłowego [Glick i wsp. 2007]. Badania Long'a i wsp. [2008] wykazały pozytywną korelację pomiędzy aktywnością bakteryjnej deaminazy ACC a wzrostem korzeni psianki czarnej, im większa aktywność bakteryjnej deaminazy ACC, tym korzenie rośliny były dłuższe. Long i wsp. [2008] stwierdzili również spadek ilość etylenu wydzielanego przez siewki w miarę wzrostu aktywności deaminazy ACC. Niektóre drobnoustroje, np. Ps. putida WU4, czy A. brasiliense Cd1843, dzięki zdolności do modyfikacji poziomu etylenu poprzez syntezę deaminazy ACC, ograniczają patogeniczność szczepów Rhizobium tumefaciens (syn. Agrobacterium tumefaciens) oraz Rhizobium vitis (syn. Agrobacterium vitis) infekujących rośliny pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.) i według Toklikishvili 18

19 i wsp. [2010] rokują nadzieję na ich wykorzystanie jako biologicznych środków ochrony roślin nazwanych w literaturze przedmiotu BCAs (ang. Biological Control Agents). Zdolność do biosyntezy innych hormonów roślinnych, tj. gibereliny (GA), cytokininy, kwas abscysynowy (ABA) czy kwas jasmonowy (JA) również została stwierdzona u drobnoustrojów endofitycznych. Badania Piccoli i wsp. [2011] wskazują, iż endofityczne szczepy Arthrobacter koreensis, wyizolowane z halofilnego gatunku roślin Prosopis strombulifera (Lam.) Benth., wykazały zdolność do produkcji nie tylko IAA, ale również ABA, GA 1, GA 3 oraz JA. Obecność ABA i JA została także stwierdzona w płynach pohodowlanych endofitycznych bakterii Ach. xyloxidans SF2 i B. pumilus SF3, SF4, wyizolowanych z roślin słonecznika zwyczajnego (Helianthus annuus L.). Produkcja dwóch fitohormonów przez te drobnoustroje była wyższa w warunkach stresu wodnego [Forchetti i wsp. 2007]. Endofityczne bakterie Ps. resinovorans oraz Paenibacillus polymaxa, wyizolowane z liści Gynura procumbens (Lour.) Merr., miały natomiast zdolność do produkcji związków o charakterze cytokinin [Bhore i wsp. 2010]. Badania nad produkcją fitohormonów przez endofity, podkreślają ich rolę w relacjach z gospodarzem, szczególnie w niekorzystnych warunkach środowiskowych [Piccoli i wsp. 2011] Produkcja substancji przeciwko fitopatogenom Wiele gatunków bakterii endofitycznych wykazuje antagonistycznie działanie przeciwko patogenicznym dla roślin bakteriom i grzybom. Endofityczne szczepy B. subtilis oraz Ps. fluorescens wykazywały antagonistyczne działanie przeciwko grzybom z gatunku Fusarium oxysporum powodującym zgniliznę orzeszków ziemnych (Arachis hypogaea L.), [Ziedan 2006]. Badania Chen i wsp. [1995] nad endofitycznymi izolatami z bawełny, również wskazują antagonistyczne działanie szeregu izolatów przeciwko grzybom z gatunku F. oxysporum. Wzrost tego patogenu był także hamowany w testach in vitro przez bakterie z rodzaju Bacillus, Paenibacillus i Pseudomonas pozyskanych z trzech odmian żeń-szenia (Panax ginseng C. Meyer) [Cho i wsp. 2007]. Izolaty pozyskane z żeń-szenia wykazywały również antagonistycznie działanie w stosunku do innych patogenów, m.in. Rhizoctonia solani, Phytium ultimum oraz w stosunku do Phytophtora caspsici. Izolat Bacillus sp. CY22, pozyskany z roślin rozwaru wielokwiatowego (Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.), 19

20 także hamował wzrost Rh. solani oraz Ph. ultimum [Cho i wsp. 2000]. Antagonistyczne działanie w stosunku do bakterii z gatunku Ralstonia solanacearum wykazywał pozyskany z bakłażanu (Solanum melongena L.), izolat Ps. fluorescens [Ramesh i wsp. 2009]. Również izolaty endofityczne z innych gatunków z rodziny psiankowatych (Solanum sp.) wykazywały antagonizm w testach in vitro przeciwko 9 patogenom, w tym przeciw R. tumefaciens [Long i wsp. 2003] Oddziaływania molekularne pomiędzy endofitami a roślinami Niewiele badań odnosi się do interakcji endofit roślina na poziomie molekularnym. Najprawdopodobniej zasiedlanie rośliny przez bakterie endofityczne ma wpływ na aktywność metaboliczną gospodarza. W związku z tym, aktywność metaboliczna rośliny ma ogromne znaczenie w regulacji tempa kolonizacji przez drobnoustroje endofityczne. Wiadomo, iż wczesne etapy kolonizacji rośliny przez drobnoustroje endofityczne są regulowane, wzmacniane lub osłabiane, przez samego gospodarza [Vargas i wsp. 2003]. Dowodzą tego badania Vinagre i wsp. [2006] nad ekspresją genu shr5, kodującego LRR-RLK (ang. Leucin Rich Repeats Receptor Like Kinase), białka zaangażowanego w transdukcję sygnału roślinnego w trakcie ustanawiania interakcji roślina - endofit. W przypadku inokulacji trzciny cukrowej bakteriami diazotroficznymi G. dizaotrophicus, Herbaspirillum seropedicae oraz A. brasilense zaobserwowano zahamowanie ekspresji genu shr5. Natomiast, gdy trzcina cukrowa była inokulowana bakteriami patogenicznymi z gatunku H. rubrisubalbicans odnotowano niewielki spadek ekspresji shr5. Badania te dowodzą, iż komórki trzciny cukrowej potrafią rozpoznać i reagować na bakterie korzystne i w inny sposób reagują na drobnoustroje patogenne. Gurjao de Carvalho i wsp. [2011] wskazali, iż w trakcie wczesnych etapów kolonizacji trzciny cukrowej przez endofityczne diazotroficzne bakterie, w komórkach gospodarza ulegają ekspresji różne, nie do końca poznane geny. Ponadto procesy regulujące, które zachodzą w roślinie w trakcie ustanawiania asocjacji dowodzą, iż gospodarz czynnie w tym uczestniczy. Tezę tą potwierdzają także badania De Matos Nogueira i wsp. [2001]. Rośliny trzciny cukrowej, inokulowane diazotrofami G. dizaotrophicus oraz H. rubrisubalbicans, czynnie uczestniczyły w ustanawianiu asocjacji poprzez indukcję niektórych genów, m.in. zaangażowanych w metabolizm azotu czy produkcję fitohormonów. Ponadto, ekspresji również ulegały dwa geny kodujące czynniki rozluźniające ścianę komórkową 20

21 - beta-ekspansynę oraz endo-1,4-betaglukanazę, co ułatwia roślinom rozprzestrzenianie się w całej roślinie. Afzal i wsp. [2008] uważają, iż mechanizmy, dzięki którym roślina odbiera bodźce i reaguje na nie, uzależnione są od białek receptorowych. Białka receptorowe RLKs (ang. Receptor Like Kinases) odgrywaja również istotną rolę w przypadku trzciny cukrowej i endofitycznych diazotroficznych bakterii [Van Peer i wsp. 1990]. Odpowiedź molekularna zachodzi również po stronie drobnoustrojów kolonizujących tkanki roślinne. W bakteriach endofitycznych ekspresji ulegają geny niezbędne do wniknięcia i skolonizowania tkanki, następnie te odpowiedzialne za przeżycie bakterii we wnętrzu tkanki roślinnej. Dochodzi także, w zależności od potrzeby, do ekspresji genów odpowiedzialnych za stymulowanie wzrostu rośliny, hamowanie czynnika patogennego lub produkcję różnych substancji biologicznie czynnych [Rosenbleuth i Martinez-Romero 2006]. Dowodzą tego między innymi badania Roncato-Maccari i wsp. [2003] nad endofityczną bakterią H. seropedicae LR15. Oznakowano geny nif wprowadzając kasetę gusa - kanamycyna w obrębie genu nifh (kodującego reduktazę nitrogenazy). Następnie nasiona kukurydzy, sorga (Sorghum bicolor (L.) Moench), ryżu oraz pszenicy inokulowano mutantami LR15. Ekspresję genów hif zaobserwowano w korzeniach, łodygach i liściach siewek jak również w komórkach bakteryjnych zlokalizowanych w wydzielinach na powierzchni korzeni [Roncato-Maccari i wsp. 2003]. Badania nad ekspresją bakteryjnego genu monoksygenazy alkanowej (alkb) w roślinie, kodującego enzymy degradujące olej napędowy, prowadził Andria i wsp. [2009]. Szczep Pseudomonas sp. ITRI53, pozyskany z endosfery roślin życicy (Lolium multiflorum L.), wykazywał większą ekspresję genu alkb, niż drugi testowany izolat Rhodococcus sp. ITRH43, pozyskany z rizosfery tej rośliny. Świadczy to o lepszej ochronie roślin życicy przed szkodliwym działaniem oleju napędowego przez bakterię endofityczną. Ponadto, ekspresja genu alkb zachodziła nie tylko w rizosferze, ale również in planta Fitorekultywacja Coraz częściej można spotkać się z zastosowaniem endofitów bakteryjnych w procesie rekultywacji gleb. Fitorekultywacja wykorzystuje rośliny w celu detoksykacji ksenobiotycznych związków lub w celu ich fitoekstrakcji, w szczególności 21

22 w przypadku metali ciężkich. Obywa się to poprzez ich akumulację i usunięcie wraz z biomasą roślin z danego środowiska. Rośliny, które są zdolne do akumulowania niezwykle wysokich ilości metali ciężkich bez żadnego wpływu na swój wzrost i rozwój zostały nazwane hyperakumulatorami. Należą do nich rośliny z rodzajów Thlaspi, Urtica, Chenopodium, Polygonum czy Alyssum [Baker i wsp. 1989, Freitas i wsp. 2004]. Drobnoustroje izolowane z zanieczyszczonych środowisk wykazują większą tolerancję na metale ciężkie a możliwości endofitów jako potencjalnych organizmów redukujących ich zawartość w środowisku są nieustannie badane. Bakterie endofityczne z gatunku Methylobacterium populi BJ001 wyizolowane z tkanek mieszańca topoli (Populus deltoides x nigra) wykazały zdolność do degradacji nitrowanych węglowodorów aromatycznych [Van Aken i wsp. 2004]. Badania Barac'a i wsp. [2004] nad bakteriami Burkholderia cepacia G4 wyizolowanymi z żółtego łubinu (Lupinus luteus L.) pokazały, iż inokulacja łubinu żółtego tym szczepem spowodowała wzrost tolerancji tej rośliny na toluen. Groch zwyczajny (Pisum sativum L.) szczepiony izolatami bakterii endofitycznej Ps. putida, zdolnymi do degradowania kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowgo, nie wykazały akumulacji tego herbicydu w tkankach w porównaniu do roślin niezasiedlonych bakteriami, które wykazywały objawy zatrucia [Germaine i wsp. 2006]. Natomiast szczepy bakterii endofitycznych, Sanguibacter sp. oraz Pseudomonas sp., wyizolowanych z nasion tytoniu (Nicotiana tabacum L.) wykazały zdolność do ograniczenia toksyczności kadmu w stosunku do tytoniu poprzez zwiększenie przyswajalności cynku i żelaza [Mastretta i wsp. 2009]. Madhaiyan i wsp. [2007] stwierdzili, że endofityczne Methylobacterium oryzae oraz Burkholderia sp., wyizolowane z tkanek ryżu, zredukowały toksyczny wpływ kadmu i niklu na nasiona pomidora w warunkach in vitro. Zmiana dostępności i toksyczności metali pod wpływem przemian metabolicznych indukowanych przez bakterie endofityczne wynika ze zmian odczynu w efekcie produkcji kwasów organicznych, kompleksowania jonów metali z udziałem sideroforów jak również tworzenia nierozpuszczalnych soli kwasów organicznych [Saravanan i wsp. 2007, Sheng i wsp. 2008] Endofity jako inhibitory wzrostu roślin Powiązania pomiędzy gospodarzem a endofitem mają charakter symbiozy mutualistycznej lub komensalizmu. Niektóre grzyby endofityczne, w zależności 22

23 od stadium rozwojowego grzyba, fazy życia rośliny, czynników środowiskowych oraz odpowiedzi gospodarza, mogą stać się patogenami [Schultz i Boyle, 2005]. Niewielka ilość danych nie pozwala odpowiedzieć na pytanie czy ten fakt może również dotyczyć endofitów bakteryjnych. Rosenblueth i Martinez-Romero [2006] sugerują, że niektóre bakterie endofityczne mogą stać się inhibitorami wzrostu rośliny pod wpływem określonych warunków, takich jak akumulacja CO 2, zmniejszenie dostępności O 2 lub w momencie interakcji z innym mikroorganizmem. Są również dane wskazujące, że bakteria, która dla jednej odmiany danego gatunku rośliny jest endofitem, dla niektórych odmian tego gatunku może być patogenem. Przykładem są bakterie z gatunku H. rubrisubalbicans, które tylko w przypadku niektórych odmian trzciny cukrowej powodują plamistość liści WMSD (ang. mild mottled stripe disease) [Olivares i wsp. 1996]. Innym przykładem na wybiórczość drobnoustrojów oraz gospodarzy mogą być niektóre szczepy z rodzaju Pseudomonas, izolowane ze zdrowych tkanek roślin pomidora, które w momencie reinokulacji do siewek pomidora hamowały ich wzrost [Van Peer i wsp. 1990]. Opisywane w literaturze przedmiotu niektóre bakterie endofityczne, izolowane z tkanek zdrowych roślin, są blisko spokrewnione z patogenami ludzi i zwierząt. Wątpliwości wzbudzają m.in. B. cepacia będąca przyczyną zakażeń oportunistycznych [Barac i wsp. 2004; LiPuma 2003; McInroy i Kloepper 1995b] czy Staphylococcus spp. [McInroy i Kloepper 1995b, Reiter i wsp. 2002]. Dlatego US EPA (United States Environmental Protection Agency) sugeruje, aby w biologicznej ochronie roślin wykorzystywać drobnoustroje, których maksymalna temperatura wzrostu nie przekracza 35 o C. Ostatnie badania pokazują, iż bakterie patogeniczne dla ludzi różnią się od bakterii endofitycznych, zasiedlających tkanki roślinne, ekspresją określonych toksyn [Schultz i Boyle 2005]. Badania Barak i wsp. [2005] dowodzą, że geny wirulencji Salmonella enterica są również niezbędne do kolonizacji tkanek roślinnych. Jeżeli nawet niektóre szczepy bakterii endofitycznych różnią się od szczepów patogennych, to ich bliskie pokrewieństwo może sprawić, że poprzez horyzontalny transfer genów może dojść do nabycia genów zjadliwości od krewniaczych patogenów [Rosenbleuth i Martinez-Romero 2006]. 23

24 1.9. Podsumowanie Od momentu kiełkowania nasion aż do osiągnięcia przez roślinę pełnej dojrzałości drobnoustroje rozwijają się w komórkach i przestrzeniach międzykomórkowych gospodarza w ścisłej współzależności [Lynch 1983]. Powiązania pomiędzy roślinami a endofitami są zatem zjawiskiem powszechnym, przynoszącym korzyści obu stronom [Klama 2004]. Wykorzystanie potencjału biologicznego drobnoustrojów w uprawie roślin z wykorzystaniem bakterii stymulujących wzrost wydaje się być uzupełnieniem dla syntetycznych środków chemicznych oraz nawożenia mineralnego. Zastosowanie drobnoustrojów endofitycznych w uprawie pozwoli na zmniejszenie presji rolnictwa na środowisko naturalne. W okresie ostatnich dwudziestu lat w literaturze przedmiotu odnotowujemy narastające zainteresowanie bakteriami endofitycznymi. Istnieje duże zróżnicowanie gatunków roślin, które są zasiedlane przez drobnoustroje, ale również różnorodność ta dotyczy taksonów bakterii kolonizujących rośliny. W literaturze przedmiotu nie podjęto badań nad zróżnicowaniem bakterii endofitycznych pozyskanych z różnych odmian kukurydzy uprawianych w tych samych warunkach glebowych. Nie podjęto również badań nad zróżnicowaniem endfitów tych samych odmian uprawianych na zdecydowanie różnych stanowiskach. 24

25 2. Cel pracy Mając na uwadze powyższy przegląd literatury oraz brak danych na temat zróżnicowania drobnoustrojów endofitycznych w zależności od lokalizacji i odmiany kukurydzy, w niniejszej pracy podjęto próbę oceny składu jakościowego asocjacji bakterii endofitycznych tego gatunku. Ponadto, podjęto próbę określenia źródła pochodzenia hodowalnych bakterii endofitycznych kukurydzy, ich zdolność do wzrostu w obecności kwasów fenolowych, produkcji związków biologicznie czynnych i wiązania wolnego azotu. Oceniono także wpływ wybranych izolatów na kukurydzę w doświadczeniach modelowych. Dodatkowo podjęto próbę wyselekcjonowania hodowalnych bakterii endofitycznych stymulujących wzrost kukurydzy. 25

26 3. Materiały i metody 3.1. Materiały Materiał roślinny Materiał roślinny pochodził z dwóch stacji badawczych: Hodowla Roślin Rolniczych Nasiona Kobierzyce sp. z o.o. zlokalizowanej w Kobierzycach oraz Hodowla Roślin Smolice sp. z o.o. grupa IHAR zlokalizowanej w Smolicach. Badania przeprowadzono na 6 niżej opisanych odmianach kukurydzy. Ziarniaki badanych odmian, dostarczone przez hodowców w kolbach, pochodziły ze zbioru z 2009 roku. W Kobierzycach kukurydzę uprawiano na czarnej ziemi śląskiej na podłożu ilastym, zaliczonej do 1 klasy przydatności rolniczej, o wysokiej zawartości fosforu i potasu, niskiej zawartości magnezu o odczynie zasadowym. W Smolicach kukurydzę uprawiano na glebie brunatnej zaliczonej do kompleksu pszennego dobrego, o bardzo wysokiej zawartości fosforu, wysokiej zawartości potasu, średniej zawartości magnezu o odczynie lekko kwaśnym. Opis odmian: Odmiany stacji badawczej Hodowla Roślin Rolniczych Nasiona Kobierzyce sp. z o.o. KB1902 wpisana do rejestru w 2004, bardzo wczesny (FAO 190) mieszaniec pojedynczy. Odmiana ta jest szczególnie polecana do uprawy na ziarno. Jest bardzo odporna na wyleganie korzeniowe i łodygowe oraz na głownię (na łodygach i kolbach). Odmiana ta cechuje się dużą zawartością suchej masy w czasie zbioru. KB1903 wpisana do rejestru w 2005, jest odmianą bardzo wczesną (FAO 190). Jest to mieszaniec pojedynczy bardzo odporny na wyleganie korzeniowe i łodygowe. Charakteryzuje się bezkonkurencyjną zawartością suchej masy w czasie zbioru oraz wysokim potencjałem plonowania. Zalecany do uprawy na kiszonkę przy opóźnionym terminie siewu. KB2704 wpisana do rejestru w 2006, jest odmianą trójliniową należącą do grupy średniopóźnej (FAO270). Przeznaczona do uprawy na kiszonkę i na ziarno. Wyróżnia się odpornością na wiosenne chłody i dobrze znosi okresowe niedobory wody. 26

27 Odmiany stacji badawczej Hodowla Roślin Smolice sp. z o.o. grupa IHAR KRÓL wpisana do rejestru w 2000 roku, jest mieszańcem trójliniowym należącym do grupy średniopoźnej (FAO270). Przeznaczona do uprawy na kiszonkę. Charakteryzuje się dużą odpornością na głownię, wyleganie korzeniowe i łodygowe. CYRKON wpisana do rejestru w 1999 roku, jest mieszańcem trójliniowym należącym do grupy średniopoźnej (FAO250). Przeznaczona jest do uprawy na kiszonkę. Wyróżnia się bardzo dużą odpornością na głownię oraz wysoką odpornością na wyleganie łodygowe i korzeniowe. Jest mieszańcem tolerancyjnym w stosunku do większości środków chwastobójczych używanych w Polsce. KOSMO230 wpisana do rejestru w 2003 roku, jest mieszańcem trójliniowym należącym do grupy średniowczesnej (FAO240). Przeznaczona do uprawy na ziarno i kiszonkę. Wyróżnia się dużą odpornością na wyleganie łodygowe, korzeniowe i odpornością na głownię (na łodygach i kolbach) Podłoża 1. Podłoże stałe lub płynne organiczne TSA: TSB (Difco, USA) 30g; agar 16g; H 2 O dest ml; ph Podłoże płynne lub stałe LB: bactotryptone (Difco, USA) 10g; ekstrakt drożdżowy (Difco, USA) 5g; NaCl 10g; agar 16g; H 2 O dest. 1000ml; ph Podłoże stałe King B: bactoprotese 20g; ; K 2 HPO 4 1,5 g; MgSO 4 x 7H 2 O 1,5 g; glicerol 10 ml; agar 16 g; H 2 O dest ml; ph Podłoże stałe mineralne Staniera [Stanier i wsp. 1966] 5. Podłoże stałe do oznaczania rozpuszczania fosforanu wapnia NBRIP [Nautiyal, 1999] 6. Podłoże stałe selektywne dla bakterii z rodzaju Pseudomonas wg. Gould'a [Gould, 1985] 7. Podłoże płynne bo oznaczania kwasu indolilo-3-masłowego wg. Khakipour'a [Khakipour i wsp., 2008] 8. Podłoże stałe lub płynne mineralne Syntetyczne Wydzieliny Korzeniowe SWK [Oksińska i wsp., 2011] 9. Podłoże płynne do oznaczania kwasu salicylowego SSM [Meyer i Adballah, 1978] 27

28 10. Podłoże do zamrażania drobnoustrojów: bactotryptone (Difco, USA) 10 g; ekstrakt drożdżowy 5 g; NaCl 0,5 g; K 2 HPO 4 6,3 g; KH 2 PO 4 1,8 g; cytrynian sodu 0,45 g; MgSO 4 x 7H 2 O 0,09 g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,9 g; glicerol 41,7 ml; H 2 O dest ml; ph Podłoże stałe PDA: ziemniaczanka 200 g; dekstroza 20 g; agar 16 g, H 2 O dest ml, ph Roztwór Hoaglanda 21ppm: NH 4 Cl 2 M 0,75 ml; KCl 3 M 1,16 ml; KH 2 PO 4 1 M 1 ml; MgSO 4 x 7H 2 O 2 M 1 ml; CaCl 2 4 M 1,25 ml; NaCl 5 M 8 ml, H 2 O dest 1000 ml mikroelementy (1 ml na 1 l roztworu podstawowego): cytrynian żelaza 5 g, H 3 BO 3 0,6 g; MnCl 2 x 4H 2 O 0,4 g; ZnSO 4 0,05 g; CuSO 4 x 5H 2 O 0,05 g; H 2 MoO 4 x 4H 2 O 0,02 g, H 2 O dest 1000 ml 13. Substrat do doświadczeń doniczkowych: piasek 50%; torf 35%; ziemia (z pola kukurydzy) 15%. Nawożenie mineralne na 10 l substratu: NH 4 NO 3 0,53 g; (NH 4 ) 2 HPO 4 1,6 g; KNO 3 2,46 g; MgO 2,09 g; CaCO 3 28,75 g; ph Podłoża, przy których nie podano nazwy dostawcy zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (USA) w przypadku odczynników organicznych oraz POCh (Polska) w przypadku odczynników nieorganicznych Metodyka badań Izolacja endofitów z roślin z mikropoletek Rośliny do badań zebrano w czerwcu 2009 roku z dwóch mikropoletek doświadczalnych mieszczących się w Kobierzycach i Smolicach w jednodniowym odstępie czasu. Rośliny ścięto w fazie BBCH 18-19, zapakowano do plastikowych worków i przetransportowano na lodzie do laboratorium. Izolację endofitów przeprowadzono po upływie 2-3 godzin od zebrania roślin z pola. Fragment czwartego liścia o powierzchni około 11 cm 2 został odcięty od reszty rośliny, umieszczony w szklanym naczyniu i zdezynfekowany powierzchniowo przez 1 min z wykorzystaniem 70% etanolu. Następnie został trzykrotnie wypłukany sterylną wodą destylowaną. Od zdezynfekowanego fragmentu odcięto boki tak, 28

29 aby powierzchnia izolacji wynosiła ok. 6 cm 2. W aseptyczny sposób próba została przeniesiona do szklanego moździerza i roztarta z 2 ml 0.1 M MgSO 4. Z maceratu wykonano serię kolejnych rozcieńczeń (10 0, 10-1, 10-2 ), z których dokonano posiewów na podłoże 1/3 TSA. Płytki inkubowano 7 dni w 28 o C. Wyrosłe kolonie policzono w celu ustalenia j.t.k. a następnie wybrano losowo dominujących, zróżnicowanych morfologicznie izolatów dla każdej odmiany z danej lokalizacji. Łącznie pobrano 125 izolatów, z których każdy został oczyszczony poprzez trzykrotny posiew redukcyjny na podłożu 1/3 TSA. Izolaty poddano wstępnej selekcji i posiano na podłoże Gould'a w celu identyfikacji bakterii z rodzaju Pseudomonas. Wszystkie szczepy do dalszych badań były przechowywane w 1 ml podłoża do zamrażania w temperaturze -70 o C Uprawa kukurydzy w warunkach in vitro Ziarniaki badanych odmian wyłuskano ręcznie z kolb i powierzchniowo wysterylizowano 1% roztworem NaClO - przez 30 minut. Po czym wypłukano je trzykrotnie sterylną wodą destylowaną (2 x 5min, 1 x 90min.). Następnie ziarniaki zostały umieszczone w probówkach z 0,8% agarem z dodatkiem 21 ppm roztworu Hoaglanda. Rośliny w probówkach umieszczono w fitotronie przy 14 godzinnym dniu świetlnym, temperatura dnia 22 o C, temperatura nocy 16 o C do momentu pojawienia się trzeciego liścia Izolacja endofitów z roślin in vitro Rosnącą w jałowych warunkach w fitotronie kukurydzę, w fazie trzech liści, poddano analizie. Roślinę cięto na trzy części (liście, łodyga, korzeń), każdy z fragmentów dezynfekowano jak opisano w punkcie , przy czym maceracji poddawano osobno każdą część rośliny. Bakterie endofityczne izolowano dokonując posiewów na podłoże 1/3 TSA. 29

30 3.3. Cechy fenotypowe i genotypowe badanych bakterii Identyfikacja izolatów na podstawie genu 16S rrna Przynależność gatunkowa wszystkich izolatów została określona na podstawie sekwencjonowania fragmentu genu 16S rrna. Izolaty zostały namnożone z pojedynczych kolonii na podłożu PDA. Izolacji materiału genetycznego dokonano przy użyciu zestawu Genomic Mini AX Bacteria (AA Biotechnology, Polska) według instrukcji producenta. Amplifikacji 16S rrna dokonano z wykorzystaniem uniwersalnych primerów: FAM27f [5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'] i 1492R [5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'] oraz gotową mieszaniną do reakcji PCR (5x Hot FIREPol Blend Master Mix; Solis Biodyne, Estonia). Produkty reakcji oczyszczono zestawami PureLink TM Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Niemcy) lub ExoSAP-IT (GE Healthcare Life Sciences, USA) według instrukcji producenta. Sekwencjonowania dokonano z parą primerów: FAM27f i 1492R hybrydyzujących do odcinków końcowych oraz parą 704F [5'-TGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA-3'] i 765R [5'-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3'] hybrydyzującą do odcinków środkowych. Sekwencjonowanie przeprowadzono z wykorzystaniem ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, Life Technologies, USA). Otrzymane sekwencje porównano in sillica ze szczepami referencyjnymi dostępnymi w bazach National Center for Biotechnology Information Database (NCBI) i Ribosomal Database Project (RDP) oraz metodą ClustalV w programie DNAStar (DNAStar Lasergene, Inc., USA) Wykorzystanie związków fenolowych jako jedyne źródło węgla i energii Poddano ocenie zdolność szczepów do wykorzystania związków fenolowych (kwas p-kumarowy, o-kumarowy, ferulowy, chlorogenowy, alkohol koniferylowy), wchodzących w skład soku komórkowego kukurydzy [Maksimovic i wsp. 2008], jako jedyne źródło węgla i energii. Uzyskane na stałym podłożu King B 24-godzinne izolaty zawieszono w roztworze 0,1 M MgSO 4. Po ustaleniu gęstości zawiesiny rzędu j.t.k. ml -1 inokulowano podłoża: stałe mineralne Staniera [Stanier i wsp. 1966] lub płynne mineralne SWK [Oksińska i wsp. 2011] zawierające 0,1% ww. substancji. Wzrost szczepów na podłożu stałym oznaczono po 3 dniach w porównaniu do podłoży 30

31 kontrolnych: podłoża minimalnego Staniera (bez źródła węgla) i King B. Wzrost w podłożu płynnym oceniono po 3 dniach dokonując pomiaru gęstości optycznej OD 540 w porównaniu do podłoży kontrolnych SWK (bez źródła węgla) i SWK uzupełnionego ekstraktem drożdżowym 1 mg ml -1. Przyrost gęstości optycznej określono w oparciu o test Duncan'a (p=0,05). Analizę prowadzono w trzech powtórzeniach Wzrost w obecności związków fenolowych Analiza zdolności izolatów do wzrostu w obecności związków fenolowych prowadzona była na podłożu King B. Stężenie kwasu p-kumarowego, o-kumarowego, chlorogenowego, ferulowego oraz alkoholu koniferylowego w sokach komórkowych kukurydzy wynosi odpowiednio 0,36 μg ml -1 ; 0,36 μg ml -1, 0,40 μg ml -1 ; 0,45 μg ml -1 oraz 1,4 μg ml -1 [Maksimovic i wsp. 2008]. Badano zdolność do wzrostu w obecności powyższych związków fenolowych w stężeniach odpowiadających 500, 1000, 2000 i 4000 razy wyższym niż normalnie występujące w sokach komórkowych kukurydzy. Zawiesiny izolatów uzyskano jak opisano w punkcie 3.3.2, następnie naniesiono po 1 ml do inokulatora punktowego i inokulowano podłoża. Zdolność do wzrostu oceniono po 3 dniach w porównaniu do podłoża kontrolnego King B bez badanych związków. Doświadczenie prowadzono w 3 powtórzeniach Produkcja metabolitów przeciwgrzybowych Zdolność bakterii endofitycznych do produkcji związków hamujących wzrost grzybni Fusarium moniliforme IOR 728 oraz Fusarium graminearum IOR 1970, pozyskanych z Instytutu Ochrony Roślin Państwowego Instytutu Badawczego w Poznaniu, określono na podstawie stref zahamowania wzrostu na podłożu PDA. Na szalce umieszczano krążek z 8-dniowej hodowli grzyba o średnicy 10 mm i w odległości 50mm wykonano rysę bakterii z 48-godzinnej hodowli. Całość inkubowano do momentu, aż grzybnia na płytce kontrolnej przekroczyła promień 50 mm. Doświadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach. 31

32 Produkcja związków rozpuszczających fosforan trójwapniowy Analiza zdolności izolatów do produkcji związków zwiększających rozpuszczanie fosforanów prowadzona była na stałym podłożu NBRIP [Nautiyal 1999] z dodatkiem 0,05% ekstraktu drożdżowego. Zawiesiny izolatów uzyskano jak opisano w punkcie , naniesiono 1 ml do inokulatora punktowego i inokulowano podłoże. Strefę przejaśnienia określano po 14-dniowym okresie inkubacji w 28 o C. Doświadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach Identyfikacja genu nifh Identyfikację genu nifh przeprowadzono w wyizolowanym materiale genetycznym. Izolacji materiału genetycznego dokonano jak opisano w punkcie Do reakcji PCR wykorzystano primery PolF & PolR [Poly i wsp. 2001] oraz gotową mieszaninę reakcyjną (5x Hot FIREPol Blend Master Mix; Solis Biodyne, Estonia). Produkt reakcji PCR poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym (60 min, 100V). Następnie kwas nukleinowy wybarwiono roztworem bromku etydyny. Masy prążków zanalizowano przy użyciu programu GelixOne 1D Software (biostep GmbH, Niemcy). Szczep referencyjny stanowił Azospirillum barsieliense 35Bb [Król, Perzyński 2005] Biosynteza enzymów degradujących ścianę komórkową roślin Zdolność do wydzielania enzymów celulolitycznych, ksylanolitycznych, pektynolitycznych oraz proteolitycznych została oceniona na podstawie stref hydrolizy w podłożu według metodyki opisanej przez Cho i wsp. [2007]. Stałe podłoże LB uzupełniono jednym ze związków: 0,5% (w/v) karboksymetylocelulozą; 0,5% (w/v) ksylanem; 0,5% (w/v) mlekiem odtłuszczonym (Difco, USA); 0,7% (w/v) kwasem poligalakturonowym. Zawiesinę drobnoustrojów przygotowano jak opisano w punkcie , po 1 ml naniesiono do inokulatora punktowego i inokulowano podłoża. Kontrolę stanowiło podłoże LB bez analizowanego dodatku. Strefy hydrolizy określono po 72h inkubacji w 28 o C przyjmując następującą skalę: brak strefy -, strefa do 2 mm +, strefa powyżej 2 mm

33 Biosynteza kwasu indolilo-3-octowego Oceniono zdolność do produkcji kwasu indolilo-3-octowego w podłożu LB. Zawiesiny drobnoustrojów przygotowano jak opisano w punkcie i 25 μl wprowadzano do 10 ml podłoża uzupełnionego L-tryptofanem (50 μg ml -1 ). Określono liczebność komórek na podstawie oznaczeń gęstości optycznej OD 540 po 72h inkubacji. Następnie hodowle wirowano (10 min, 4000 x g) a stężenie kwasu IAA oznaczono w supernatancie według metody Gordon'a i Weber'a [1951]. Do 1 ml supernatantu wprowadzono 4 ml odczynnika Salkowskiego (150 ml 96% H 2 SO 4 ; 250 ml H 2 O; 7,5 ml 0,5 M FeCl 3 ). Po 20 min inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzono ekstynkcję badanych prób przy długości fali λ=535nm (spektofotometr UV-VIS Cintra 40) względem próby ślepej odczynnikowej. Ilość IAA wyliczono ze wzoru: x [μg IAA]=0,091 x E ,0011 wyznaczonego na podstawie krzywej standardowej. Doświadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach Biosynteza kwasu indolilo-3-masłowego Oceniono zdolność do biosyntezy kwasu indolilo-3-octowego w podłożach LB i Khakipour'a. Zawiesiny drobnoustrojów przygotowano jak opisano w punkcie Podłoża LB (uzupełnione dawką L-tryptofanu w stężeniu 50 μg ml -1 ) oraz wg. Khakipour'a o objętości 50 ml inokulowno 125 μl zawiesiny bakteryjnej. W sterylnych podłożach kontrolnych L-tryptofan został zastąpiony IBA. Określono liczebność komórek na podstawie oznaczeń gęstości optycznej OD 540 po 72h inkubacji. Następnie hodowle zwirowano (10 min, 4000 x g) i oznaczono obecność kwasu IBA w supernatancie wg. Martinez-Morales i wsp. [2003] z modyfikacjami własnymi. Supernatant zakwaszono do ph 2,7 przy użyciu 1 N HCl. Ekstrakcji dokonano 1 objętością octanu etylu, fazę organiczną odparowano w temp. 37 O C a osad zawieszono w 2 ml metanolu. Próbki przygotowane w ten sposób nanoszono na płytki TLC Silica Gel 60 F254 (Merck, Niemcy) o wielkości 20 x 20 cm. Rozdział prowadzono w układzie propanol:woda (8:2; v/v) w obecności dwóch prób kontrolnych, tj. kwasu IBA rozpuszczonego w metanolu (4 mg ml -1 ) oraz kwasu IBA wyekstrahowanego z płynnych kontroli. Kwas IBA wybarwiono odczynnikiem Vanurk'a (1 część odczynnika Ehrich'a: 1 g p-dimetyloaminobenzaldehyd, 50 ml HCl stęż. 33

34 i 3 części odczynnika Salkowskiego) Biosynteza kwasu salicylowego Oceniono zdolność do biosyntezy kwasu salicylowego w podłożu MSS. Zawiesiny drobnoustrojów przygotowano jak opisano w punkcie i wprowadzono 62,5 μl zawiesiny bakteryjnej do 25 ml podłoża. Określono liczebność komórek na podstawie oznaczeń gęstości optycznej OD 540 po 72h inkubacji. Następnie hodowle zwirowano (10 min, 4000 x g), supernatanty zakwaszono do ph 2,0 przy użyciu 1 N HCl. Ekstrakcję kwasu salicylowego przeprowadzono chloroformem w stosunku 1:1 (v/v) [Mercado-Blanco i wsp. 2001]. Zawartość kwasu salicylowego oznaczono według Meyer i wsp. [1992]. Do 1 ml ekstraktu dodano 1 ml wody i 5 μl 2 M FeCl 3. Ekstynkcję powstałego kompleksu kwas salicylowy - żelazo mierzono przy długości fali λ=527nm względem próby ślepej odczynnikowej. Ilość SA wyliczono ze wzoru: x [μg SA]=1,5628 x E 527 0,0804 wyznaczonego na podstawie krzywej standardowej. Doświadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach Identyfikacja genu acds Izolaty namnożono z pojedynczych kolonii na podłożu 1/3 TSA a izolacji materiału genetycznego dokonano jak opisano w punkcie Do identyfikacji genu acds, kodującego deaminazę ACC, wykorzystano zestaw primerów: F1936f; F1937f; F1938r; F1939r [Blaha i wsp. 2006] oraz gotową mieszaninę reakcyjną (5 x Hot FIREPol Blend Master Mix; Solis Biodyne, Estonia). Kombinacje primerów dawały następującej wielkości produkty: F1936f & F1938r 792 bp F1937f & F1938r 750 bp F1936f & F1939r 558 bp F1937f & F1939r 516 bp Produkty reakcji poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym (45 min, 100V). Następnie kwas nukleinowy wybarwiono roztworem bromku etydyny. Masy prążków określono przy użyciu programu GelixOne 1D Software (biostep GmbH, Niemcy). Szczep referencyjny stanowił Pseudomonas acidovorans 1 [Magnucka, 2005]. 34

35 Wpływ zapraw nasiennych Oceniono wpływ substancji aktywnych zawartych w zaprawach nasiennych Gaucho 350FS i Vitavax 200FS na wzrost bakterii endofitycznych. Nasiona odmian Kosmo230 oraz Cyrkon zostały zaprawione mieszanką Gaucho 350FS oraz Vitavax 200FS zgodnie z zaleceniami producenta przez pracowników firmy Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. Zawiesinę izolatów o liczebności 10 9 j.t.k ml -1 przygotowano jak opisano w punkcie Na stałe podłoże LB wysiano 100 μl zawiesin i rozprowadzono ją po całej powierzchni płytki w celu uzyskania murawy. Zaprawione nasiona macierzystych odmian wykładano na tak przygotowane szalki. Strefę zahamowania wzrostu bakterii wokół nasion określono po 48h inkubacji w 28 o C. Doświadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach Wpływ endofitów na wzrost i procesy fizjologiczne kukurydzy Doświadczenie in vitro Przeprowadzono ocenę wpływu 36 szczepów na wzrost siewek kukurydzy w doświadczeniu in vitro. Selekcji endofitów dokonano w oparciu o uzyskane drzewa filogenetyczne i zestawienie wcześniej analizowanych cech. Do doświadczenia wybrano szczepy z rodzajów Acinetobacter (2 izolaty), Arthrobacter (4 izolaty), Bacillus (7 izolatów), Chryseobacterium (1 izolat), Methylobacterium (1 izolat), Microbacterium (2 izolaty), Pseudomonas (18 izolatów) oraz Rhizobium (1 izolat). Zawiesiny izolatów, zawierające od 10 7 j.t.k. ml -1 do 10 9 j.t.k. ml -1, przygotowano w 0,1 M MgSO 4. Następnie do probówek z 0,9% wodnym agarem dodano zawiesinę bakterii w proporcji 1:9 (v/v). Wysterylizowane nasiona kukurydzy wykładano na tak przygotowane słupki. Sterylizację nasion przeprowadzono 1% NaClO - przez 30 min, następnie wypłukano je trzykrotnie w sterylnej wodzie (2x5 min, 1x90 min). Obiekt kontrolny stanowiły nasiona wykładane na agar wodny bez dodatku badanego szczepu. Doświadczenie prowadzono w 10 powtórzeniach. Ziarniaki inkubowano przez 7 dni w 20 o C. Po inkubacji zmierzono długość korzeni, epikotylu i policzono liczbę korzeni na roślinę. 35

36 Doświadczenie wazonowe Do doświadczenia wazonowego wybrano szczepy PE22, PE50, A51 oraz dwie odmiany kukurydzy: Cyrkon i Kosmo230. Doświadczenie prowadzono w wazonach o pojemności 450 ml. Rośliny uprawiano w fitotronie przy 14 godzinnym dniu świetlnym, temperatura dnia 22 o C, temperatura nocy 16 o C przez 24 dni. Kukurydzę podlewano wodą wodociągową w objętości 30 ml co 3 dni, w jednej doniczce uprawiano 4 rośliny. Po 24 dniach wegetacji oznaczono zawartość chlorofilu w liściach, aktywność enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL) i peroksydazy gwajakolowej (PGOX) w tkankach liści oraz plon świeżej i suchej masy Inokulacja nasion wybranymi izolatami endofitycznymi Nasiona kukurydzy odmiany Cyrkon i Kosmo230 wysterylizowano powierzchniowo jak opisano w punkcie Następnie moczono je w zawiesinach izolatów z wytrząsaniem (150 rpm, amplituda 5.0) przez 45 min. Po okresie inkubacji nasiona wyłożono na bibułę i suszono przez noc w temperaturze pokojowej. Kontrolę stanowiły nasiona obydwu odmian moczone w destylowanej wodzie. Zawiesinę szczepów do zaprawiania nasion uzyskano z 24 godzinnych kultur hodowanych na skosach 1/3 TSA. Drobnoustroje zwieszono w 0,5% (w/v) CMC w 0,1 M MgSO 4 uzyskując zawiesiny izolatów PE22, PE50, A51 oraz mieszaninę wszystkich trzech jednocześnie zawierające 4,92-5, j.t.k. ml -1. Suche nasiona umieszczano w doniczkach po 6 sztuk na głębokości ok.3 cm. Po wschodach dokonywano przerywki siewek i w doniczce zostawiano cztery rośliny Pilotowe doświadczenie polowe Do pilotowego doświadczenia polowego wybrano szczepy PE22, PE50, A51 oraz kukurydzę odmiany P8400. Oprysku mieszaniną izolatów pasa 40-rzędowego dokonano r. Próbki w postaci 9 losowo wybranych roślin pobrano r. Pole doświadczalne mieściło się w Krzepicach (województwo Dolnośląskie). Po 39 dniach wegetacji oznaczono zawartość chlorofilu w liściach oraz aktywność enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL) i peroksydazy gwajakolowej (PGOX) w tkankach łodyg. 36

37 Zawiesinę szczepów do oprysku kukurydzy w doświadczeniu pilotowym uzyskano z hodowli 48h na płynnym TSA. Po odwirowaniu bakterie zwieszono w 0,5% (w/v) CMC w 0,1 M MgSO 4 i tak przygotowaną zawiesinę zawierającą 1,27 x 10 7 j.t.k. ml -1 wykorzystano do oprysku kukurydzy odmiany P Aktywność amoniakoliazy fenyloalaninowej PAL Oznaczenie aktywności enzymu PAL przeprowadzono według zmodyfikowanej metody Peltonena i Karjalainena [1995]. Liście lub łodygi o masie 300 mg były mrożone w ciekłym azocie i przechowywane w -70 o C. W celu oznaczeni aktywności enzymu PAL próbki (9 powtórzeń) dokładnie rozcierano z 4 ml buforu (50 mm Tris ph 8,5; 14,4 mm 2-merkaptoetanol; 5% zawiesina polivinylpolipyrrolidonu PVPP; z dodatkiem piasku kwarcowego). Próbki dokładnie mieszano i wirowano (10 min, x g). Supernatant zlewano do czystych probówek i ponownie wirowano (7 min, x g). Następnie do 2,5 ml mieszaniny reakcyjnej (0,2% L-fenyloalanina, 50 mm Tris-HCl ph 8,5) dodano 0,5 ml supernatantu. W próbie kontrolnej L-fenyloalaninę zastąpiono D-fenyloalaniną, która nie jest substratem dla tego enzymu. Po 20h inkubacji w temp. 30 O C reakcję przerywano dodając 0,5 ml 35% kwasu trójfluorooctowego TFA. Mieszaninę wirowano (10 min, x g) i mierzono absorbancję przy długości fali λ=290nm (spektofotometr UV-VIS Cintra 40). Ilość kwasu trans-cynamonowego powstałego z L-fenyloalaniny obliczono ze wzoru: x [μg tca]=0,084 x E 290 0,007 wyznaczonego na podstawie krzywej standardowej. Aktywność PAL wyrażono w μm kwasu powstałego w ciągu godziny w 1g świeżej masy liści Aktywność peroksydazy gwajakolowej GPOX Oznaczenie aktywności enzymu PGOX przeprowadzono według metody Chancea i Maehlego [1955]. Liście lub łodygi o masie 500 mg były mrożone w ciekłym azocie i przechowywane w -70 o C. W celu oznaczeni aktywności enzymu PGOX próbki (9 powtórzeń) dokładnie roztarto z 4 ml 0,05 M buforu fosforanowego o ph 7,8 z dodatkiem piasku kwarcowego. Próbki dokładnie wymieszano i zwirowano (10 min, x g). Następnie 100 μl supernatanu rozcieńczono 10-krotnie buforem i wprowadzono do 3 ml mieszaniny reakcyjnej (2 ml buforu; 0,5 ml 0,02 M roztworu 37

38 gwajakolu oraz 0,5 ml 0,06 M roztworu H 2 O 2 ). Całość inkubowano 4 min w temperaturze 30 o C i następnie mierzono ekstynkcję przy długości fali λ=470nm względem próby ślepej odczynnikowej (H 2 O 2 zastąpiono H 2 O). Stężenie uwolnionego tetragwajakolu TGW obliczono wiedząc, że milimolowy współczynnik absorbancji tetragwajaloku wynosi 26,6 mm -1 cm -1. Aktywność peroksydazy gwajakolowej wyrażono w μm uwolnionego tetragwajakolu w ciągu 1 minuty przez 1 g świeżej masy liści Zawartości chlorofilu Oznaczenie zawartości chlorofilu przeprowadzono według metody Bruinsma [1963]. Z liści wycięto 3 krążki o łącznej powierzchni 1,91 cm 2 i zalano je na noc 5 ml acetonu (9 powtórzeń). Ekstrakt zlano przez watę w lejku do miarowej probówki, pozostałość przepłukano małą porcją acetonu do całkowitego wypłukania chlorofilu. Probówki uzupełniono acetonem do ostatecznej objętości 10 ml i mierzono absorbancję przy długości fal λ=645nm oraz λ=663nm względem próby ślepej odczynnikowej. Zawartość chlorofilu wyliczono ze wzorów: C a = 12,7xA 663 2,7xA 645 C b = 22,9xA 645 4,7xA 663 C a + C b = 20,2xA ,0xA 663 Zawartość chlorofilu wyrażono w μg na 1,91cm 2 powierzchni liścia Plon świeżej i suchej masy Oznaczono plon świeżej i suchej masy kukurydzy z doświadczenia wazonowego każdej pojedynczej rośliny. Suchą masę oznaczono po wysuszeniu w 105 o C do stałej wagi. 38

39 3.5. Analiza statystyczna Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono w oparciu o test Duncana (p=0,05) z wykorzystaniem programu komputerowego Statistica v.9.0 PL (StatSoft Inc., USA) lub w oparciu o test Bray-Curtis'a z wykorzystaniem programu komputerowego Primer6 (Primer-E Ltd., UK). NIR międzygrupowy dla stref zahamowania wzrostu oraz rozpuszczania fosforanów wyznaczono na postawie testu Fisher'a (p=0,05). W celu eliminacji wyników przypadkowych stosowano test Q Dixona. 39

40 4. Wyniki 4.1. Izolacja i identyfikacja endofitów Izolacja endofitów z ziarniaków kukurydzy Przeprowadzone badania nie wykazały obecności żadnych hodowalnych izolatów bakterii w dniowych siewkach pozyskanych z powierzchniowo dezynfekowanych ziarniaków, skiełkowanych w sterylnym agarze wodnym, badanych sześciu odmian kukurydzy. Na podłożu stałym 1/3 TSA po 3-7 dniach inkubacji nie stwierdzono żadnych kolonii bakterii. Uzyskane wyniki wskazują, że ziarniaki kukurydzy nie są źródłem hodowalnych drobnoustrojów endofitycznych dla badanych odmian kukurydzy Izolacja endofitów z liści kukurydzy Przeprowadzono izolację dominujących hodowalnych bakterii endofitycznych zasiedlających tkanki liści 6 odmian (KB1902, KB1903, KB2704, Król, Cyrkon, Kosmo230) kukurydzy uprawianej w dwóch lokalizacjach. Z badanych odmian izolowano od 0,03 x 10 4 do 0,97 x 10 4 jtk 1 cm -2 zmacerowanej tkanki liści hodowalnych bakterii zdolnych do wzrostu na 1/3 TSA (Tabela 1.). Porównując ilości j.t.k. stwierdzono zróżnicowanie pomiędzy lokalizacjami oraz odmianami. Większe zasiedlenie tkanek przed drobnoustroje endofityczne stwierdzono w odmianach rosnących w Smolicach, od 0,25 x 10 4 do 0,97 x 10 4 j.t.k. 1 cm -2 zmacerowanej tkanki liści. Z każdej badanej rośliny losowo pobrano izolatów do dalszych badań. Łącznie pozyskano 125 izolatów (64 z odmian smolickich, 61 z odmian kobierzyckich). które zostały wykorzystane do dalszych badań (Tabela 1.) Identyfikacja endofitów kukurydzy W oparciu o wyniki sekwencjonowania fragmentów (między 840 a 1430 pz w zależności od rodzaju) genu 16S rrna i ich porównanie in sillica z dostępnymi w NCBI i RDP sekwencjami dokonano wstępnej identyfikacji 125 izolatów bakterii. 40

41 Pozyskane izolaty zaliczono łącznie do 46 gatunków należących do 18 rodzajów, których podobieństwo do najbliższych im pod względem filogenetycznym wzorcowych szczepów przedstawiono na 5 skonstruowanych filogenetycznych drzewach dla poszczególnych gromad lub rodzajów. Diagram 1 przedstawia drzewo filogenetyczne 14 izolatów z gromady Actinobacteria z rodzaju Arthrobacter. Wśród nich 10 izolatów było w największym stopniu podobnych do Ar. nictinovorans DSM 420 T oraz 4 izolaty do Ar. nitroguajacolicus CCM4924 T. Diagram 2 przedstawia drzewo filogenetyczne 12 izolatów z gromady Actinobacteria z rodzaju Microbacterium. Wśród nich 11 izolatów z tego rodzaju było w znacznym stopniu filogenetycznie podobnych do siebie i w największym stopniu podobnych do M. testaceum DSM T. Tylko jeden izolat wykazywał podobieństwo do M. phyllosphaerae DSM T. Diagram 3 przedstawia drzewo filogenetyczne 22 izolatów z gromady Firmicutes z rodzaju Bacillus. Wśród nich 10 izolatów było w znacznym stopniu podobnych do siebie i w największym stopniu spokrewnione z B. megaterium IAM T. Po trzy izolaty z tej grupy były spokrewnione z B. circulans ATCC 4513 T oraz B. aerophilus 28K T. Ponadto, 2 izolaty były w znacznym stopniu filogenetycznie podobne do B. simplex DSM 1321 T a po jednym izolacie odpowiednio do B. circulans T, B. pumilus ATCC 7061 T, B. methylotrophicus CBMB 205 T oraz B. idriensis SMC T. Diagram 4 przedstawia drzewo filogenetyczne 42 izolatów z gromady Proteobacteria z rodzaju Pseudomonas. Izolaty zaliczono łącznie do 12 gatunków, z czego aż 14 izolatów było w znacznym stopniu spokrewnionych z Ps. fluorescens biotyp G a 2 z Ps. fluorescens ATCC Ponadto, zidentyfikowano 3 grupy po 4 izolaty w znacznym stopniu filogenetycznie podobne do Ps. marginalis LMG 2210 T, Ps. orientalis CFML T i Ps. clemancea PR 221 T. Dwie grupy po 3 izolaty wykazały filogenetyczne podobieństwo do Ps. grimontii CFML T oraz Ps. lurida DSM T a 2 grupy po 2 izolaty zidentyfikowano jako Ps. poae DSM T lub Ps. thivervalensis SKB 26 T. Ponadto, wśród przedstawicieli należących do tego rodzaju występowały pojedyncze izolaty spokrewnione z Ps. graminis DSM T, Ps. extremaustralis CT 14-3 T, Ps. migulae CIP T czy Ps. viridiflava ECT 458 T. 41

42 Diagram 5 przedstawia łącznie 35 izolatów, których liczebność (częstość identyfikacji) była niższa niż 6 izolatów dla rodzaju. Wśród nich 18 należało do gromady Proteobacteria, 6 do gromady Bacteroides, 7 do gromady Actinobacteria i 4 do gromady Firmicutes. Oprócz opisanego wcześniej rodzaju Pseudomonas, w gromadzie Proteobacteria, wyszczególniono jeszcze 6 rodzajów. Zidentyfikowano łącznie 4 izolaty z rodzaju Methylobacterium, z czego 2 izolaty były filogenetycznie podobne do M. extorquens JCM 2802 T i 2 do M. aminovorans JCM 8240 T. Zaklasyfikowano 4 izolaty do rodzaju Rhizobium, przy czym 3 z nich wykazały filogenetyczne podobieństwo do Rh. radiobacter IAM T a jeden do Rh. larrymoorei 3-10 T. Zidentyfikowano 2 izolaty z rodzaju Sphingomonas i każdy z nich należał do innego gatunku: Sp. paucimobilis ATCC T lub Sp. glacialis C 16y T. Przyporządkowano 6 izolatów do rodzaju Acinetobacter, z czego 3 były spokrewnione z Ac. lwofii DSM 2403 T, 2 z Ac. calcoaceticus NCCB T a jeden wykazywał filogenetyczne podobieństwo do Ac. schindleri LUH 5832 T. Ponadto, po jednym przedstawicielu miał rodzaj Erwinia oraz Shigella, były to odpowiednio E. persicina ATCC T oraz S. flexneri T. Zidentyfikowano 2 rodzaje w gromadzie Bacteroides. Przyporządkowano 4 izolaty do rodzaju Chryseobacterium, z czego 3 były spokrewnione z Ch. jejuense JS17-8 T a jeden z Ch. indoltheticum ATCC T. Ponadto zidentyfikowano 2 izolaty należące do gatunku P. borealis G-1 T z rodzaju Pedobacter. Oprócz opisanych wcześniej rodzajów Arthrobacter i Microbacterium, do gromady Actinobacteria przyporządkowano dodatkowo 5 rodzajów. Tylko w rodzajach Kocuria i Rothia zidentyfikowano po dwóch przedstawicieli. Wśród pozyskanej kolekcji 2 izolaty zidentyfikowano jako R. amarae J18 T i po jednym jako K. rhizophila DSM T i K. kristinae DSM T. Pozostałe rodzaje, tj. Brachybacterium, Micrococcus i Rhodococcus posiadały po jednym przedstawicielu odpowiednio spokrewnionym z: Br. conglomeratum JCM T, M. yunnanensis YIM T i R. qingshengii djl-6 T. Zidentyfikowano również bakterie z rodzaju Staphylococcus z gromady Firmicutes, oprócz opisanych wcześniej bakterii z rodzaju Bacillus. Wśród 4 izolatów należących do tego rodzaju 2 były blisko spokrewnione z St. haemolyticus CCM 2737 T a po jednym z St. pasteuri ATCC T i St. saprophyticus ATCC T. 42

43 Podsumowanie wyników pod względem źródła pochodzenia poszczególnych izolatów ze względu na odmianę i miejsce uprawy przedstawiono w Tabeli 2A-D. Zróżnicowanie pomiędzy odmianami oraz lokalizacjami przedstawiono na Wykresie 1, gdzie uwzględniono obecne gromady hodowalnych endofitów. We wszystkich odmianach z obydwóch lokalizacji, wśród hodowalnych bakterii wyrosłych na podłożu 1/3 TSA, stwierdzono głównie obecność gatunków z gromady Proteobacteria. Łącznie zidentyfikowano 60 izolatów przynależących do tej grupy, wśród nich przeważały gatunki z rodzaju Pseudomonas. Bakterie z tego rodzaju zostały stwierdzone we wszystkich odmianach dwóch lokalizacji poza odmianą KB2704 uprawianą na poletku doświadczalnym w Kobierzycach. Ponadto, endofity z klasy α-proteobacteria zostały stwierdzone u pięciu odmian kukurydzy rosnących na poletku doświadczalnym w Kobierzycach. Bakterie należące do gromady Actinobacteria zostały stwierdzone u 10 spośród 12 badanych roślin [Wykres 1.]. Wśród gromady Actinobacteria dominowały rodzaje Arthrobacter oraz Microbacterium. Kolejną pod względem liczebności była gromada Firmicutes z dominującym rodzajem Bacillus. Jedyną odmianą, w tkankach której nie stwierdzono bakterii z gromady Firmicutes, była odmiana KB1902 rosnąca na poletkach w obydwóch lokalizacjach. Ponadto stwierdzono nielicznych przedstawicieli gromady Bacteroides występujących sporadycznie. W oparciu o analizę skupień niezgodności procentowej składu gatunkowego dominujących hodowalnych gatunków bakterii wyizolowanych z poszczególnych odmian wyodrębniono 3 klastry [Diagram 6]. W skład klastra α wchodziły izolaty pozyskane z odmian KB1902 oraz KB1903 uprawianych na poletku doświadczalnym w Kobierzycach a odległości wiązania między nimi wyniosły około 0,2. Wśród tych izolatów pozyskanych z lokalizacji kobierzyckiej zidentyfikowano gatunki rzadko izolowane, wspólne dla dwóch odmian, tj. Ar. nitroguajacolicus czy Ps. marginalis jak również gatunki izolowane sporadycznie, charakterystyczne dla danej odmiany, tj. B. methylotrophicus, Br. conglomeratum, Ps. viridiflava, R. qingshengii, R. amarae czy St. saprophyticus. Klaster β zawierał izolaty z odmian KB1903 i Cyrkon z poletek w Smolicach oraz Cyrkon z poletka w Kobierzycach. Odległość wiązania w tym klastrze wyniosła około 0,22. Gatunki charakterystyczne dla tego klastra to Ps. clemancea i Chr. jejuense. Ponadto, wśród izolatów pozyskanym z tych odmian zidentyfikowano B. megaterium 43

44 oraz rzadko izolowany Ar. nitroguajacolicus. Klaster γ zawierał izolaty pozyskane z odmian KB1902, KB2704 i Król uprawianych w Smolicach oraz Kosmo230 i Król uprawianych w Kobierzycach z odległością wiązania około 0,25. Gatunek charakterystyczny dla tego klastra to Ps. fluorescens biotyp G. Ponadto, klaster ten można podzielić na dwa podklastry: γ1 z izolatami pozyskanymi z odmian Król ze Smolic i Kosmo230 z Kobierzyc oraz γ2 z izolatami pozyskanymi z odmian KB1902, KB2704 ze Smolic i Król z Kobierzyc. Odległość wiązania dla klastra γ1 wyniosła 0,22 a charakterystyczny gatunek to B. aerophilus. Ponadto wśród izolatów pozyskanych z tych odmian zidentyfikowano bakterie z rodzaju Acinetobacter. Odległość wiązania dla klastra γ2 wyniosła 0,17 a charakterystyczny gatunek to M. testaceum. Najbardziej zróżnicowane pod względem składu gatunkowego endofitów były odmiany KB2704 z poletka w Kobierzycach oraz Kosmo230 z poletka w Smolicach. Odległości wiązania od pozostałych odmian wyniosły odpowiednio 0,35 oraz 0,28. Bakterie z odmiany Kosmo230, pozyskanej z poletka doświadczalnego w Smolicach, różniły się od pozostałych obecnością izolatów zidentyfikowanych jako E. persicina, S. flexneri, Ps. graminis oraz M. phyllosphaerae. Ponadto, dwa izolaty o największym stopniu pokrewieństwa z Ps. fluorescens ATCC również pozyskano z tej odmiany. Największy stopnień zróżnicowania charakteryzował odmianę KB2704 pozyskaną z Kobierzyc. Wśród izolatów zasiedlających KB2704 nie stwierdzono bakterii z rodzaju Pseudomonas, jak w przypadku pozostałych roślin, tylko sporadycznie izolowane B. idriensis, K. kristinae, P. borealis, M. yunnanensis, Rh. larrymoorei czy Sp. glacialis. Podsumowując wyniki analizy można stwierdzić, iż każda odmiana kukurydzy charakteryzowała się specyficznym dla siebie składem hodowalnych bakterii endofitycznych i asocjacje endofitów zasiedlających tkanki kukurydzy tych samych odmian były również zależne od warunków glebowych. 44

45 4.2. Cechy fenotypowe i genotypowe endofitów Wykorzystanie kwasów fenolowych przez endofity Określono zdolności pozyskanych szczepów do wykorzystywania kwasu parakumarowego, orto-kumarowego, chlorogenowego, ferulowego oraz alkoholu koniferylowego jako jedynego źródła węgla i energii. Te związki fenolowe, o właściwościach bakerio- i grzybobójczych, zostały stwierdzone w soku komórkowym kukurydzy [Maksimovic i wsp. 2008]. Dla szczepów, które nie wykorzystywały badanych kwasów fenolowych wyznaczono Minimalne Stężenia Hamujące (MIC). Wyniki analizy przedstawiono w Tabeli 3A-D. Spośród badanych związków fenolowych alkohol koniferylowy (AK) był wykorzystywany przez największą liczbę pozyskanych szczepów endofitycznych bakterii kukurydzy. Wśród 40 szczepów bakterii wykorzystujących ten związek dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas pozyskane z odmian z dwóch lokalizacji. Jedynie wszystkie szczepy Ps. lurida (PE2, PE4, PE15), Ps. clemancea (PE9, PE21, PE22, PE41) oraz jeden szczep Ps. orientalis (PE14) nie wykorzystywały AK. Oprócz szczepu Ps. clemancea PE41, pozostałe 7 wyizolowano z odmian rosnących na poletku w Smolicach. Ponadto, alkohol koniferylowy był wykorzystywany przez 3 szczepy z rodzaju Acinetobacter (Ac. calcoaceticus A109 i A110; Ac. schindleri PE18), 2 szczepy z rodzaju Arthrobacter (Ar. nitroguajacolicus A22; Ar. nicotinovorans A52) oraz jeden szczep z rodzaju Bacillus (B. megaterium A43). Alkohol koniferylowy wykazał najmniejsze bakteriobójcze oddziaływanie na większość badanych endofitów. Wartości MIC dla AK mieściły się w zakresie od 2,1 do 5,0 mg ml -1. Wartości MIC tego związku na poziomie 2,1 mg ml -1, odpowiadająca stężeniu 1500 x większemu niż w tkankach kukurydzy, hamowała wzrost 27 szczepów, z czego tylko 7 pozyskano z roślin smolickich. Największą wrażliwością na AK cechowały się szczepy z rodzajów Acinetobacter (Ac. lwoffi A79, A83, A84), Methylobacterium (M. aminovorans A3, A6; M. extorquens A4, A5), Pedobacter (P. borealis A81, A104), Rhizobium (Rh. radiobacter A27, A93, A94; Rh. larrymoorei A101) oraz Sphingomonas (Sp. paucimobilis A32; Sp. glacialis A102) pozyskane z odmian rosnących w Kobierzycach. Ponadto, wrażliwe na AK były również niektóre szczepy pozyskane z dwóch lokalizacji z rodzajów Arthrobacter 45

46 (Ar. nicotinovorans A40, A50; Ar. nitroguajacolicus A34), Chryseobacterium (Chr. indoltheticum A111; Chr. jejuense A30, A87, A89), Microbacterium (M. testaceum A67, A38, A39, A29) i Staphylococcus (St. saprophyticus A99). Wartość MIC dla AK na poziomie 3,9 mg ml -1, odpowiadająca stężeniu 2800 x większemu niż w tkankach kukurydzy, hamowała wzrost 43 szczepów (28 z roślin smolickich i 15 z roślin kobierzyckich). Wśród nich to szczepy z rodzajów Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A7, A9, A15, A23, A24, A37, A44; Ar. nitroquajacolicus A18, A90), Bacillus (B. aerophilus A62; B. circulans A60, A64, A68, A78; B. idriensis A103; B. methylotrophicus A17; B. megaterium A33, A45, A53, A54, A55, A58, A66, A7; B. pumilus A112, B. simplex A8) oraz Microbacterium (M. phyllosphaerae A115; M. testaceum A2, A31, A36, A41, A46, A48, A77) pozyskane z dwóch lokalizacji. Wrażliwe na stężenie AK na poziomie 3,9 mg ml -1 były również szczepy sporadycznie izolowane z rodzajów Erwinia (E. persicina A47), Kocuria (K. kristinae A14; K. rhizophila A78), Shigella (S. flexneri A49), Rothia (R. amarae A105), Rhododcoccus (Rh. qingshengii A21) oraz dominującego rodzaju Pseudomonas (Ps. lurida PE2, PE4; Ps. orientalis PE14). Wrażliwość dla AK na poziomie 5,0 mg ml -1, odpowiadająca stężeniu 3600 raza większemu niż w soku komórkowym kukurydzy, charakteryzowała 15 szczepów. Wśród szczepów tolerujących ten charakterystyczny dla kukurydzy związek fenolowy stwierdzono przedstawicieli dominujących rodzajów Pseudomonas (Ps. lurida PE15; Ps. clemancea PE9, PE21, PE22, PE41) oraz Bacillus (B. aerophilus A25, A61; B. megaterium A56; B. simplex A59) jak również izolowanych sporadycznie szczepów z rodzajów Brachybacterium (Br. conglomeratum A20), Micrococcus (M. yunnanensis A16), Rothia (R. amarae A19) oraz Staphylococcus (St. haemolyticus A13, A91; St. pasteuri A28). Kwas ferulowy (FA) wykorzystywany był przez 35 endofitycznych szczepów, z czego dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas pozyskane z odmian z dwóch lokalizacji. Analogicznie jak w przypadku alkoholu koniferylowego, jedynie szczepy Ps. lurida (PE2, PE4, PE15), Ps. clemancea (PE9, PE21, PE22, PE41), jeden szczep P. orientalis (PE14) oraz szczep Ps. graminis (PE24) nie wykorzystywały FA. Dodatkowo, ten charakterystyczny dla kukurydzy związek fenolowy wykorzystywany był przez dwa szczepy pozyskane ze Smolic, tj. Ac. schindleri PE18 (odmiana Król) oraz B. circulans A76 (odmiana KB2704). Wartości MIC dla FA mieściły się w zakresie 46

47 od 0,68 do 1,8 mg ml -1. Wartości MIC kwasu ferulowego na poziomie 0,68 mg ml -1, odpowiadająca stężeniu 1500 x większemu niż w tkankach kukurydzy, hamowała wzrost tylko 2 szczepów. Największą wrażliwość na FA wykazywały M. testaceum A39 i A46 pozyskane z odmian KB1902 i Kosmo230 uprawianych na poletku doświadczalnym w Smolicach. Wartość MIC dla FA na poziomie 1,35 mg ml -1, która odpowiadała 3000 raza większemu stężeniu niż w soku komórkowym kukurydzy, hamowała wzrost 37 szczepów, z czego 21 pozyskano z roślin kobierzyckich a 16 z roślin smolickich. Dominowały wśród nich szczepy wyizolowane z odmiany KB1902. Wśród grupy o wrażliwości na poziomie 1,35 mg ml -1 stwierdzono szczepy z licznie izolowanych rodzajów Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A15, A23, A24, A37, A44; Ar. nitroguajacolicus A34, A90), Bacillus (B. aerophilus A61, A62; B. circulans A60, A68; B. idriensis A103; B. megaterium A33, A71; B. simplex A59) oraz Microbacterium (M. testaceum A2, A29, A31, A36, A38, A39, A41, A48, A67). Ponadto, w grupie tych szczepów znalazły się izolowane rzadko i sporadycznie z rodzajów Acinetobacter (Ac. lwoffi A79, A83, A84), Brachybacterium (Br. conglomeratum A20), Chryseobacterium (Chr. jejuense A30), Micrococcus (M. yunnanensis A16), Pedobacter (P. borealis A81, A104), Rothia (R. amarae A19), Rhodococcus (Rh. qingshengii A21), Sphingomonas (Sp. glacialis A102) i Staphylococcus (St. saprophyticus A99). Wartość MIC dla FA na poziomie 1,8 mg ml -1, odpowiadająca 4000 raza większemu stężeniu niż w tkankach kukurydzy, charakteryzowała aż 51 szczepów, z czego 24 pozyskano z roślin kobierzyckich a 27 z roślin smolickich. Wśród szczepów o wrażliwości na FA na poziomie 1,8 mg ml -1 stwierdzono obecność izolatów z rodzajów Pseudomonas (Ps. clemancea PE9, PE21, PE22, PE41; Ps. graminis PE24, Ps. lurida PE2, PE4, PE15, Ps. orientalis PE14); Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A7, A9, A50, A52; Ar. nitroguajacolicus A18, A22), Bacillus (B. aerophilus A25; B. circulans A64; B. megaterium A43, A45, A53, A54, A55, A56, A58, A66) oraz Microbacterium (M. phyllosphaerae A115; M. testaceum A77). Dodatkowo, taką samą wrażliwością charakteryzowały się szczepy z rodzajów izolowanych rzadko i sporadycznie, tj. Acinetobacter (A. calcoaceticus A109, A110), Chryseobacterium (Ch. indoltheticum A111; Ch. jejuense A87, A89), Kocuria (K. kristinae A14; K. rhizophila A78), Methylobacterium (M. aminovorans A3, A6; M. extorquens A4, A5), Rhizobium (Rh. radiobacter A27, A93, A94; Rh. larrymoorei A101), Rothia 47

48 (R. amarae A105), Sphingomonas (Sp. paucimobilis A32) i Staphylococcus (S. pasteuri A28; S. haemolyticus A13, A91). Kwas para-kumarowy (pca) wykorzystywany był przez 35 endofitycznych szczepów, wśród nich również dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas pozyskane z odmian z dwóch lokalizacji. Kwas pca nie był wykorzystywany przez te same szczepy z rodzaju Pseudomonas co alkohol koniferylowy. Szczep Ac. schindleri PE18 również wykorzystywał pca jako jedyne źródło węgla i energii. Wartości MIC dla pca mieściły się w zakresie od 0,54 do 1,44 mg ml -1. Wartość MIC na poziomie 0,54 mg ml -1, odpowiadająca 1500-krotnemu stężeniu w tkankach kukurydzy, hamowała wzrost tylko jednego szczepu E. persicina (A47) pozyskanego z odmiany Kosmo230 z poletka w Smolicach. Wartość MIC na poziomie 1,08 mg ml -1 hamowała wzrost 29 szczepów, z czego 16 pozyskano z roślin kobierzyckich a 13 z roślin smolickich. Wśród grupy szczepów o tej wrażliwości występowały z często izolowanych rodzajów Arthrobacter (Ar. nitroguajacolicus A34, A90), Bacillus (B. aerophilus A61, A62; B. circulans A60, A64, A68; B, idriensis A103; B. megaterium A33; B. methylotrophicus A17; B. pumilus A112) oraz Microbacterium (M. testaceum A2, A29, A31, A36, A38, A39, A41, A46, A67). Taką samą wrażliwością charakteryzowały się również szczepy z rodzajów Acinetobacter (Ac. lwoffi A79, A83, A84), Chryseobacterium (Ch. jejuense A30), Micrococcus (M. yunnanensis A16), Pedobacter (P. borealis A81, A104), Sphingomonas (Sp. glacialis A102) oraz Staphylococcus (St. saprophyticus A99). Wartość MIC dla pca na poziomie 1,44 mg ml -1, odpowiadająca 4000 raza większemu stężeniu niż w tkankach kukurydzy, charakteryzowała 60 szczepów. Wśród nich 29 pozyskano z poletka doświadczalnego w Kobierzycach a 31 z poletka w Smolicach. Wrażliwością na pca na tym poziomie charakteryzowały się szczepy z rodzajów Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A7, A9, A15, A23, A24, A37, A40, A44, A50, A52; Ar. nitroguajacolicus A18, A22), Bacillus (B. aerophilus A25; B. circulans A76; B. megaterium A43, A45, A53, A54, A55, A56, A58, A59, A66, A71; B. simplex A8), Microbacterium (M. phyllosphaerae A115; M. testaceum A48, A77) oraz Pseudomonas (Ps. clemancea PE9, PE21, PE22, PE41; Ps. lurida PE2, PE4, PE15; Ps. orientalis PE14). Wrażliwość wykazywały także szczepy z rodzajów Acinetobacter (Ac. calcoaceticus A109, A110), Brachybacterium (Br. conglomeratum A20), Chryseobacterium (Ch. indoltheticum A111; Ch. jejuense A87, A89), Kocuria 48

49 (K. kristinae A14), Methylobacterium (M. aminovorans A3, A6; M. extorquens A4, A5), Rhodococcus (Rh. qingshengii A21); Rhizobium (R. radiobacter A27, A93, A94; R. larrymoorei A101); Rothia (R. amarae A19, A105), Shigella (S. flexneri A49), Sphingomonas (Sp. paucimobilis A32) oraz Staphylococcus (S. haemolyticus A13, A91; S. pasteuri A91). Kwas orto-kumarowy (oca) wykorzystywany był przez 34 szczepy bakterii edndofitycznych. Wśród nich również dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas pozyskane z odmian z dwóch lokalizacji. Występujący w tkankach kukurydzy kwas oca nie był wykorzystywany przez Ps. clemancea (PE9, PE21, PE22, PE41), Ps. lurida (PE2, PE4, PE15), Ps. orientalis (PE14), Ps. poae (PE42) oraz Ps. viridiflava (PE31). Zdolność do wykorzystywania oca posiadały również dwa szczepy: Ac. schindleri PE18 i B. circulans A76. Wartości MIC dla oca mieściły się w zakresie od 0,54 do 1,44 mg ml -1. Wartość MIC na poziomie 0,54 mg ml -1, odpowiadająca 1500-krotnemu stężeniu w kukurydzy, hamowała wzrost tylko jednego szczepu P. borealis A104. Wartość MIC o stężeniu 3000-krotnie większym niż w soku komórkowym kukurydzy, na poziomie 1,08 mg ml -1, hamowała wzrost 33 szczepów. Wśród nich 15 pozyskano z roślin kobierzyckich a 18 z roślin smolickich. Szczepy o tej wrażliwości na oca należały do rodzajów Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A24, A37, A40, A44; Ar. nitroguajacolicus A34, A90), Bacillus (B. aerophilus A61, A62; B. circulans A60, A64, A66; B. idriensis A103; B. megaterium A71; B. simplex A59) oraz Microbacterium (M. testaceum A29, A31, A36, A38, A39, A41, A46, A48, A67) pozyskanych z dwóch lokalizacji. Ponadto, na stężenie oca na tym poziomie były również wrażliwe szczepy pozyskane z poletek w Kobierzycach z rzadko i sporadycznie izolowanych rodzajów Acinetobacter (Ac. lwoffi A79, A83, A84), Brachybacterium (Br. conglomeratum A20), Chryseobacterium (Ch. jejuense A30), Micrococcus (M. yunnanensis A16), Pedobacter (P. borealis A81), Rhizobium (Rh. radiobacter A94), Rhodococcus (Rh. qingshengii A21) i Staphylococcus (St. saprophyticus A99). Wartość MIC 4000 x więszka niż stężenie w soku komórkowym kukurydzy, na poziomie 1,44 mg ml -1 hamowała wzrost 57 szczepów, 31 z roślin kobierzyckich i 26 z roślin smolickich. Wśród tej grupy występowały szczepy z rodzajów Arthrobacter (Ar. nicotinovorans A7, A9, A15, A23, A50, A52; Ar. nitroguajcolicus A18, A22), Bacillus (B. aerophilus A8; B. megaterium A33, A43, A45, A53, A54, A55, A56, A58, A66; B. methylotrophicus A17; B. pumilus A112; B. simplex A8), Chryseobacterium 49

50 (Chr. indoltheticum A111; Chr. jejuense A87, A89), Kocuria (K. kristinae A14; K. rhizophila A78), Microbacterium (M. phyllosphaerae A115; M. testaceum A2, A77), Pseudomonas (Ps. clemancea PE9, PE21, PE22, PE41; Ps. lurida PE2, PE4, PE15; Ps. orientalis PE14; Ps. poae PE42; Ps. viridiflava PE31) oraz Staphylococcus (St. haemolyticus A13, A91; St. pasteuri A28) izolowanych z odmian pozyskanych z dwóch lokalizacji. Wrażliwość na oca na tym samym poziomie wykazywały także szczepy z rodzajów Acinetobacter (Ac. calcoaceticus A109, A110), Methylobacterium (M. aminovorans A3, A6; M. exotrquens A4, A5), Rhizobium (Rh. larrymoorei A101; Rh. radiobacter A27, A93) Sphingomonas (Sp. glacialis A102, Sp. paucimobilis A32), Rothia (R. amarae A19, A105) pozyskanych z Kobierzyc oraz szczepy z rodzajów Erwinia (E. persicicina A47) i Shigella (S. flexneri A49) pozyskanych ze Smolic. Kwas chlorogenowy (CHA) wykorzystywany był tylko przez 8 szczepów. Wśród nich 5 szczepów to przedstawiciele Ps. fluorescens izolowane z odmiany KB1902 (PE3, PE5, PE6), KB1903 (PE8) i Kosmo230 (PE25), szczep Ac. schindleri PE18 izolowany z odmiany Król i B. circulans A76 izolowany z odmiany KB2704. Wszystkie 8 szczepów izolowano z poletka doświadczalnego w Smolicach. Wartości MIC dla CHA mieściły się w zakresie od 0,60 do 1,60 mg ml -1. Wartość MIC na poziomie 0,60 mg ml -1, 1500-krotnie większa niż w soku komórkowym kukurydzy, hamowała wzrost tylko 10 szczepów (8 z Kobierzyc i 2 ze Smolic). Wśród nich były szczepy z rodzajów Acinetobacter (Ac. lwoffi A84), Chryseobacterium (Ch. jejuense A89), Methylobacterium (M. aminovorans A3; M. exotrquens A4, A5), Pedobacter (P. borealis A81), Sphingomonas (Sp. glacialis A102) oraz Staphylococcus (St. haemolyticus A91; St. pasteuri A28; S. saprophyticus A99). Wartość MIC na poziomie 1,20 mg ml -1 hamowała wzrost tylko 2 szczepów Ac. calcoaceticus A109 i A110 izolowanych z odmiany KB2704 pozyskanej z Kobierzyc. Wzrost pozostałych 105 szczepów hamowany był przez CHA na poziomie 1,60 mg ml -1, co odpowiadało 4000-krotnemu stężeniu w soku komórkowym kukurydzy. Zdolność do wykorzystywania wszystkich 5 związków fenolowych posiadało tylko 6 szczepów. Wśród nich 5 szczepów to przedstawiciele gatunku Ps. fluorescens izolowane z odmiany KB1902 (PE3, PE5, PE6), KB1903 (PE8) i z odmiany Kosmo230 (PE25) oraz jeden szczep Ac. schindleri PE18 izolowany z odmiany Król. Wszystkie powyższe szczepy izolowano z poletka doświadczalnego w Smolicach. Endofity, które nie wykorzystywały badanych związków fenolowych były zdolne do wzrostu 50

51 w ich obecności w stężeniach wyższych niż stwierdzane naturalnie w sokach komórkowym kukurydzy [Maksimovic i wsp. 2008] Aktywność przeciwgrzybowa, zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia, obecność genu reduktazy nitrogenazy (nifh) badanych endofitów Wyniki analiz wpływu badanych szczepów bakterii na wzrost dwóch fitopatogenicznych dla kukurydzy grzybów Fusarium graminearum szczep IOR1970 oraz F. moniliforme szczep IOR728, wyniki oceny zdolności do rozpuszczania fosforanu trójwapniowego oraz obecności genu nifh przedstawiono w Tabeli 4A-D. Wyniki analiz z aktywności hamowania wzrostu radialnego oraz reakcji pcr z genem nifh udokumentowano dodatkowo na fotografiach 1-8. Zdolność do produkcji związków hamujących wzrost radialny Fusarium graminearum IOR1970 została stwierdzona u 29 szczepów, z czego 14 należało do rodzaju Pseudomonas, 6 do rodzaju Bacillus, 4 do rodzaju Staphylococcus i po jednym do rodzajów Arthrobacter, Chryseobacterium, Erwinia, Methylobacterium oraz Rothia. Szczepy zdolne do wytwarzania substancji przeciwgrzybowych najliczniej obserwowano wśród izolatów pozyskanych z odmiany Kosmos 230 a tylko jeden szczep, St. haemolyticus A13, z odmiany KB2704. Największą zdolność hamowania wzrostu radialnego F. graminearum IOR1970 stwierdzono w przypadku szczepu B. methylotrophicus A17 wyizolowanego z odmiany KB1903 (Tabela 4C, Foto 1). Spośród pozostałych szczepów jedynie u Ps. fluorescens PE43 (Tabela 4D, Foto 2), Ps. fluorescens PE25 (Tabela 4B, Foto 3), Ps. fluorescens PE50 (Tabela 4D, Foto 4), izolowanych z odmiany Kosmo 230 obserwowano strefy zahamowania wzrostu F. graminearum IOR1970 większe niż 6 mm. Pozostałe szczepy w istotnie mniejszym stopniu ograniczały wzrost grzybni F. graminearum IOR1970. Wzrost grzybni F. moniliforme IOR728 hamowany był przez 52 szczepy bakterii, z czego 29 należało do rodzaju Pseudomonas, 7 do rodzaju Bacillus, 4 do rodzaju Microbacterium, 3 do rodzaju Acinetobacter i po 2 do rodzajów Arthrobacter, Chryseobacterium, Rhizobium i Staphylococcus. Szczepy zdolne do wytwarzania substancji przeciwgrzybowych najliczniej obserwowano wśród izolatów pozyskanych z odmian uprawianych w lokalizacji smolickiej. Największą aktywność hamowania wzrostu radialnego F. moniliforme IOR728 stwierdzono w przypadku szczepu 51

52 A. nicotinovorans A40 wyizolowanego z odmiany KB1902 (Tabela 4A, Foto 5). Znaczne strefy zahamowania wzrostu F. moniliforme IOR728, większe niż 10 mm, obserwowano również w obecności szczepu Ac. calcoaceticus A110 wyizolowanego z odmiany KB2704 (Tabela 4C, Foto 6), szczepu Ps. fluorescens PE50 izolowanego z odmiany Kosmo230 (Tabla 4D, Foto 4), szczepu B. aerophilus A61 wyizolowanego z odmiany Król (Tabela 4B), szczepu B. methylotrophicus A17 wyizolowanego z odmiany KB1903 (Tabela 4C, Foto 1) oraz szczepu B. aerophilus A62 wyizolowanego z odmiany Król (Tabela 4B). Pozostałe szczepy w istotnie mniejszym stopniu ograniczały wzrost grzybni F. moniliforme IOR728. Zdolność do produkcji związków hamujących wzrost dwóch patogenów jednocześnie posiadało 21 szczepów, z czego 12 należało do rodzaju Pseudomonas, 4 do rodzaju Bacillus, 2 do rodzaju Staphylococcus i po jednym do rodzajów Arthrobacter, Chryseobacterium i Erwinia. Największą liczbę szczepów zdolnych do wytwarzania substancji przeciwgrzybowych w stosunku do dwóch fitopatogenów stwierdzono wśród szczepów pozyskanych z odmiany Kosmo230. Tej aktywności nie posiadały szczepy pozyskane z odmiany KB2704. Największą aktywność hamowania wzrostu radialnego dwóch fitopatogenów stwierdzono w przypadku B. methylotrophicus A17, wyizolowanego z odmiany KB1903 (Tabela 4C, Foto 1), szczepu Ps. fluorescens PE50, izolowanego z odmiany Kosmo 230 (Tabela 4D, Foto 4), szczepu A. nicotinovorans A40 wyizolowanego z odmiany KB1902 (Tabela 4A, Foto 5) oraz szczepu Ps. fluorescens PE43 wyizolowanego z odmiany Kosmo230 (Tabela 4D, Foto 2). Pozostałe szczepy w istotnie mniejszym stopniu ograniczały wzrost grzybni dwóch fitopatogenów. Zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia została stwierdzona u 54 szczepów, z czego aż 34 szczepy należały do rodzaju Pseudomonas, 6 do rodzaju Arthrobacter, 4 do rodzaju Microbacterium, 3 do rodzaju Staphylococcus, po 2 do rodzajów Acinetobacter, Bacillus i Rothia oraz jeden do rodzaju Kocuria. Szczepy zdolne do rozpuszczania fosforanu najliczniej obserwowano wśród pozyskanych z odmiany KB1902. Odmianą z najmniejszą liczbą szczepów o tej aktywności była odmiana Król. Największą aktywność do rozpuszczania fosforanu stwierdzono w przypadku szczepu Ps. marginalis PE26 wyizolowanego z odmiany Kosmo230 (Tabela 4B), szczepu Ps. fluorescens PE5 i PE6 wyizolowanych z odmiany KB1902 (Tabela 4A). Ponadto, wysoką aktywność wykazywał również szczep Ps. poae PE12, szczep 52

53 Ps. fluorescens PE13 pozyskane z odmiany KB2704 (Tabela 4A) oraz szczep Ps. thivervalensis PE32 wyizolowany z odmiany KB1903 (Tabela 4C). Pozostałe szczepy w istotnie mniejszym stopniu były zdolne do rozpuszczania fosforanu wapnia. Produkt reakcji z primerami dla genu reduktazy nitrogenazowej (nifh) został stwierdzony u 71 izolatów. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w Tabeli 4A-D. oraz na Fotografiach 7. i 8. Szczepy z obecnym produktem pcr dla genu nifh najliczniej obserwowano wśród pozyskanych z odmiany Król. Spośród szczepów generujących produkt 31 należało do rodzaju Pseudomonas, 13 do rodzaju Bacillus, 5 do rodzajów Arthrobacter i Microbacterium. Pozostałe szczepy sklasyfikowano do rodzajów Acinetobacter (4 szczepy), Brachybacterium (1 szczep), Erwinia (1 szczep), Methylobacterium (3 szczepy), Pedobacter (2 szczepy), Rothia (1 szczep), Sphingomonas (1 szczep) oraz Staphylococcus (4 szczepy) Analiza podobieństwa zespołów endofitów Analizę podobieństwa zespołów wykonano w oparciu o badane cechy fenotypowe, tj. aktywność przeciwgrzybową, zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia, obecność genu reduktazy nitrogenazy (nifh). Analiza ilościowa zespołów zasiedlających poszczególne odmiany z wykorzystaniem testu Bray-Curtis'a wykazała, iż istnieje zależność pomiędzy aktywnością asocjacji endofitów a miejscem uprawy danej odmiany [Diagram 7]. Asocjacja endofitów izolowanych z odmiany KB2704 rosnącej na poletkach w Smolicach w największym stopniu różni się od wszystkich pozostałych. Cechą charakterystyczną tej asocjacji jest całkowity brak szczepów zdolnych do hamowania wzrostu F. graminearum IOR1970 w porównaniu do asocjacji szczepów pozyskanych z pozostałych odmian smolickich. Również asocjacja endofitów izolowanych z odmiany Król rosnącej na poletkach w Kobierzycach jest w znacznym stopniu odrębna od wszystkich pozostałych. Cechą charakterystyczną tej asocjacji jest obecność tylko jednego szczepu Ps. fluorescens PE37 zdolnego do rozpuszczania fosforanu wapnia w porównaniu do asocjacji endofitów izolowanych z pozostałych odmian kobierzyckich. Asocjacje endofitów o znacznym stopniu podobieństwa do siebie, izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 oraz Cyrkon z poletka doświadczalnego 53

54 z Kobierzyc zgrupowane są w jednym wspólnym klastrze oznaczonym jako grupa α na Diagramie 7. W odmianach tych występowała niewielka ilość szczepów z aktywnością przeciwgrzybową w stosunku do F. moniliforme IOR728 i F. graminearum IOR1970 w porównaniu do asocjacji zgrupowanej w klastrze β. Również szczepy endofitów pozyskane z odmian KB1903, Kosmo 230 i Cyrkon uprawianych na poletku doświadczalnym w Smolicach oraz izolaty z odmiany Kosmo 230 uprawianej w Kobierzycach, pod względem analizowanych cech, są w znacznym stopniu podobne do siebie i tworzą wspólny klaster beta. Cechą charakterystyczną asocjacji w klastrze beta jest większa liczba szczepów z aktywnością przeciwgrzybową w stosunku do dwóch fitopatogenów w porównaniu z klastrem alfa. Pośredni typ pomiędzy asocjacjami endofitów wchodzących w skład klastra alfa oraz beta tworzy asocjacja bakterii izolowanych z odmiany KB1902 uprawianej na poletku w Smolicach. Cechą charakterystyczną tej asocjacji jest obecność tylko jednego szczepu zdolnego do hamowania wzrostu F. moniliforme IOR728, jak w przypadku szczepów klastra alfa, oraz znaczna liczba szczepów zdolnych do hamowania wzrostu F. graminearum IOR1970, jak w przypadku klastra beta. Na podstawie analizy filogenetycznej oraz zestawienia badanych cech fizjologicznych, do dalszych analiz wybrano 36 izolatów reprezentujących dominujące rodzaje bakterii z poszczególnych odmian kukurydzy Aktywność enzymów pozakomórkowych hydrolzujących białka i polisacharydy Określono zdolności wybranych 36 szczepów, co opisano powyżej w pkt do biosyntezy i pozakomórkowego wydzielania enzymów degradujących biopolimery ścian komórkowych roślin. Wyniki analizy przedstawiono w Tabeli 5A-B. Aktywność ksylanolityczna została stwierdzona u 23 szczepów. Wśród nich 18 szczepów należało do rodzaju Pseudomonas, 2 szczepy do rodzaju Bacillus i Microbacterium a jeden szczep do rodzaju Acinetobacter. Największą liczbę szczepów posiadających aktywność ksylanolityczną pozyskano z odmiany KB1902 a najmniejszą z odmian KB2704 oraz Cyrkon. Aktywność proteolityczną stwierdzono u 21 testowanych szczepów, w tym 18 należało do rodzaju Pseudomonas i po jednym szczepie do rodzajów Chryseobacterium, Bacillus oraz Microbacterium. Największą 54

55 liczbę szczepów ze zdolnością do biodegradacji protein stwierdzono w odmianie KB1903, w porównaniu z odmianami KB2704 i Król, gdzie ich liczba była 3-krotnie mniejsza. Zdolność do biodegradacji celulozy posiadało łącznie 18 szczepów z rodzaju Pseudomonas. Wśród nich po 4 zostały pozyskane z odmian KB1902, KB1903 i Kosmo230 a po dwa z odmian KB2704, Król i Cyrkon. Aktywność pektynolityczna została stwierdzona u 6 badanych izolatów: 5 z rodzaju Pseudomonas i jeden z rodzaju Bacillus. Szczepy o aktywności pektynolitycznej zostały pozyskane z odmian KB1902 (3 szczepy), KB1903 (2 szczepy) oraz KB2704 (1 szczep). Zdolność do biosyntezy i pozakomórkowego wydzielania 4 badanych enzymów jednocześnie posiadało 5 szczepów: Ps. marginalis PE34 i Ps. viridiflava PE31 wyizolowanych z odmiany KB1903 oraz Ps. gromontii PE30, Ps. fluorescens PE6, Ps. lurida PE4, które wyizolowano z odmiany KB Selekcja endofitów stymulujących wzrost siewek kukurydzy w warunkach in vitro Przeprowadzono doświadczenia, których celem było określenie wypływu wybranych 36 szczepów bakterii endofitycznych na parametry biometryczne siewek odmian macierzystych kukurydzy w warunkach in vitro. Wyniki oznaczeń cech biometrycznych tj. liczby korzeni, średniej długości korzenia, długości najdłuższego korzenia oraz średniej długości epikotylu 7-dniowych siewek kukurydzy macierzystych odmian, odpowiednio dla poszczególnych szczepów bakterii, przedstawiono w Tabeli 6A-F. Wśród testowanych szczepów bakterii endofitycznych 18 nie powodowało zmian badanych parametrów biometrycznych siewek kukurydzy rodzimych odmian. Najliczniej wśród tej grupy reprezentowane były bakterie pozyskane z odmian KB1902 (5 szczepów na 6 testowanych) oraz KB2704 (4 szczepy na 4 testowane). Jednocześnie stwierdzono 15 szczepów, które wpływały hamująco na wzrost siewek kukurydzy macierzystej odmiany, co wyrażało się zmianą co najmniej jednego z badanych parametrów. Wyniki badań wskazują, że najczęściej stwierdzono zahamowanie wzrostu długości korzenia głównego, co obserwowano w przypadku 14 szczepów spośród 15-u. Natomiast szczepy te miały stosunkowo niewielki wpływ na liczbę korzeni oraz wzrost epikotylu, odpowiednio 3 i 4 szczepy spośród 15-u. Wśród inhibitorów wzrostu najliczniej reprezentowane były bakterie z rodzaju Bacillus (5 szczepów na 7 testowanych). Najczęściej szczepy hamujące wzrost siewek odmian 55

56 macierzystych izolowano z KB1903 (5 szczepów na 8 testowanych) oraz Król (5 szczepów na 7 testowanych). Wśród badanych endofitów silnymi inhibitorami wzrostu siewek macierzystych odmian okazały się szczepy Ps. viridiflava PE31 oraz Ps. orientalis PE38 wyizolowane odpowiednio z odmian KB1903 i Król, co wyrażało się zahamowaniem wzrostu korzenia (średnia długość, długość korzenia głównego) i epikotylu dla obydwóch szczepów oraz spadkiem liczby korzeni siewek dla szczepu Ps. orientalis PE38 (Tabela 6B i D). Spośród 36 testowanych szczepów tylko trzy: Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz Ps. fluorescens PE50 stymulowały wzrost siewek kukurydzy swoich macierzystych odmian (Cyrkon dla PE22 i A51 oraz Kosmo230 dla PE50), co wyrażało się zmianą przynajmniej jednej z badanych cech. Szczep Ps. clemancea PE22 spowodował wzrost długości korzenia głównego oraz liczby korzeni siewek odmiany Król (Tabela 6D). Szczep Ps. migulae A51, pozyskany z tej samej odmiany, wpłynął stymulująco na liczbę korzeni siewek roślin macierzystych (Tabela 6D) natomiast szczep Ps. fluorescens PE50 stymulował wzrost korzeni siewek odmiany macierzystej Kosmo230 (Tabela 6F). W celu oceny jaki wpływ na wzrost i rozwój siewek kukurydzy innych odmian mają wybrane endofity, przeprowadzono analogiczne doświadczanie w warunkach in vitro z sześcioma izolatami, po dwa izolaty losowo wybrane z trzech odmian (Kosmo 230, Król i KB1903). Wyniki oznaczeń cech biometrycznych 7-dniowych siewek kukurydzy wszystkich odmian dla poszczególnych izolatów bakterii przedstawiono w Tabeli 7A-C. Wpływ szczepów Methylobacterium exotrquens A5 oraz Arthrobacter nicotinovorans A7, pozyskanych z odmiany Król, na wzrost siewek wszystkich badanych odmian kukurydzy przedstawiono w Tabeli 7A. Obydwa szczepy nie powodowały zmian badanych parametrów biometrycznych siewek kukurydzy rodzimej odmiany, ale wpłynęły hamująco na wybrane parametry innych odmian. Inokulacja szczepem M. extorquens A5 spowodowała zahamowanie wzrostu korzenia, wyrażone spadkiem średniej długości oraz długości korzenia głównego odmiany KB1902 (Tabela 7A). Wpływ szczepu Ar. nicotinovorans A7 na wybrane parametry różnych odmian przedstawiono w Tabeli 7A. Inokulacja nasion tym szczepem miała istotnie negatywny wpływ na 4 z 5 testowanych odmian obcych. Po inokulacji A. nicotinovorans A7 zaobserwowano zmniejszenie średniej długości korzenia odmian KB2704 oraz 56

57 Kosmo230. Dla odmian KB1902, KB2704, Cyrkon oraz Kosmo230 zaobserwowano także spadek wartości długości korzenia głównego. Wpływ szczepów Arthrobacter nitroguajacolicus A18 oraz Pseudomonas viridiflava PE31, pozyskanych z odmiany KB1903, na wzrost siewek wszystkich badanych odmian kukurydzy przedstawiono w Tabeli 7B. Inokulacja nasion szczepem Ar. nitroguajacolicus A18 miała neutralny wpływ na siewki odmiany rodzimej, ale hamowała wzrost korzenia głównego oraz epikotylu obcej odmiany Kosmo230. W przypadku szczepu Ps. viridiflava PE31 zaobserwowano negatywny wpływ na rodzimą odmianę ale również na 3 z 5 obcych odmian. Negatywny wpływ szczepu Ps. viridiflava PE31 wyrażał się zmniejszeniem liczby korzeni dla obcej odmiany Król, zahamowaniem wzrostu epikotylu dla odmiany rodzimej KB1903 i obcej Kosmo230, spadkiem średniej długości korzenia dla odmiany rodzimej KB1903 i obcych KB1902, Król, Kosmo230 oraz spadkiem wartości długości korzenia głównego u odmiany rodzimej KB1903 i odmian obcych KB1902, Król i Kosmo230 (Tabela 7B). Wpływ szczepów Pseudomonas graminis PE24 oraz Pseudomonas fluorescens PE50, pozyskanych z odmiany Kosmo230, na wzrost siewek wszystkich badanych odmian kukurydzy przedstawiono w Tabeli 7C. Szczep Ps. fluorescens PE50 stymulował wzrost roślin a Ps. graminis PE24 nie powodował zmian badanych parametrów biometrycznych siewek rodzimej odmiany kukurydzy. Ponadto, inokulacja szczepem Ps. fluorescens PE50 spowodowała spadek długości korzenia głównego siewek odmiany obcej Król. Inokulacja nasion szczepem Ps. graminis PE24 wpłynęła negatywnie na parametry biometryczne 3 z 5 testowanych obcych odmian. Negatywny wpływ tego szczepu wyrażony był w spadku liczby korzeni odmiany KB2704, zahamowaniu wzrostu korzeni odmiany Król, oraz spadku wartości długości korzenia głównego odmian KB2704, Król i Cyrkon (Tabela 7C). W oparciu o uzyskane wyniki do dalszych doświadczeń wybrano trzy szczepy endofitów Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz Ps. fluorescens PE50 stymulujące wzrost siewek macierzystych odmian kukurydzy in vitro. 57

58 4.4. Charakterystyka wybranych szczepów Biosynteza regulatorów wzrostu roślin Przeprowadzono badania ilościowe nad zdolnością do biosyntezy dwóch auksyn, kwasu indolilo-3-octowego i kwasu indolilo-3-masłowego oraz kwasu salicylowego czynnego w indukcji odporności systemicznej rośliny, przez wybrane szczepy Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz Ps. fluorescens PE50, stymulujące wzrost siewek kukurydzy w warunkach in vitro (Pkt. 4.3.). Wyniki oznaczeń ilościowych przedstawiono w Tabeli 8. Obecność kwasu indolilo-3-octowego oraz kwasu salicylowego stwierdzono w płynach pohodowlanych wszystkich trzech badanych szczepów. Największe stężenia IAA (0,22 μg ml -1 ) oraz SA (5,9 μg ml -1 ) stwierdzono w supernatancie szczepu Ps. clemancea PE22. Żaden z badanych szczepów nie wykazywał zdolności do biosyntezy IBA w dwóch badanych podłożach. Równocześnie określono obecność genu acds, deaminazy kwasu 1-aminocyklopropano-1- karboksylowego (ACC). Deaminaza ACC odpowiedzialna jest za hydrolizę tego kwasu, prekursora etyleny, do amoniaku i kwasy ketomasłowego. Identyfikację genu acds przeprowadzono z wykorzystaniem kombinacji 4 par primerów F1936f i F1938r, F1937f i F1938r, F1936f i F1939r oraz F1937f i F1939r (Foto 9). Obecność genu acds po reakcji PCR z wymienionymi parami primerów manifestuje się po elektroforezie odpowiednio prążkami o masie 792bp, 558bp, 750bp oraz 516bp tak jak w przypadku szczepu referencyjnego Ps. acidovorans 1. W wyniku reakcji PCR z powyższymi parami primerów nie stwierdzono specyficznych produktów dla genu deaminazy ACC (Foto 9) Wpływ zapraw nasiennych Przeprowadzono ocenę (w warunkach in vitro) odporności szczepów Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz Ps. fluorescens PE50 na substancje aktywne zawarte w zaprawach nasiennych stosowanych do ochrony kukurydzy przed wysiewem. W doświadczeniu wykorzystano zaprawy owado- i grzybobójcze Gaucho 350FS oraz Vitavax 200FS chroniące rośliny kukurydzy przed ploniarką gnijką i zbożówką (Oscinella frit L.) oraz głownią kukurydzy (Ustilago maydis (D.C.) Corda). Oceniając wpływ badanych zapraw na wzrost wokół ziarniaków po 48h okresie inkubacji, 58

59 nie stwierdzono stref zahamowania testowanych szczepów, co świadczy o braku ich wrażliwości na substancję aktywną imidachloprydu zaprawy Gaucho 350FS oraz substancje aktywne karboksyny i disulfidu tetrametylotiuramu (tiuramu) zaprawy Vitavax 200FS Wpływ wybranych szczepów a procesy fizjologiczne kukurydzy w doświadczeniu wazonowym Przeprowadzono doświadczenia wazonowe z wykorzystaniem dwóch odmian kukurydzy (Cyrkon, Kosmo230) oraz pozyskanych z nich szczepów Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 i Ps. fluorescens PE50, stymulujących wzrost siewek kukurydzy w warunkach in vitro (Pkt. 4.3.). Ponadto, nasiona obydwóch odmian zaprawiano również mieszaniną szczepów (MIX) w celu określenia wpływu interakcji endofitów na procesy fizjologiczne. Po 24 dniach wegetacji w liściach oznaczono aktywność enzymów PAL i GPOX związanych z indukcją odporności systemicznej oraz zawartość chlorofilu. Dodatkowo oznaczono plon suchej i świeżej masy Aktywność amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL) Wpływ zastosowania wybranych endofitów na aktywność PAL w liściach po 24 dniach wegetacji przedstawiono na Wykresach 2A i B. Szczepienie nasion odmiany Cyrkon i Kosmo230 bakteriami endofitycznymi spowodowało wzrost aktywności enzymu PAL w porównaniu do roślin nieszczepionych. Aktywność PAL była wyższa w tkankach odmiany Cyrkon zaprawionych bakteriami, w porównaniu do roślin kontrolnych. Największą aktywność tego enzymu, na poziomie 12,90 µm 1h -1 1g -1 świeżej masy, stwierdzono po szczepieniu szczepem Ps. migulae A51. Najniższą aktywność odnotowano natomiast po szczepieniu mieszaniną izolatów, wyniosła ona 7,02 µm 1h -1 1g -1 świeżej masy. Większą aktywność PAL w tkankach odmiany Kosmo230 obserwowano po zaprawieniu nasion Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz mieszaniną szczepów. Największą aktywność enzymu, na poziomie 22,72 µm 1h -1 1g -1 świeżej masy, odnotowano po zaprawieniu nasion szczepem Ps. migulae A51, analogicznie jak w przypadku odmiany Cyrkon. 59

60 Aktywność peroksydazy gwajakolowej (GPOX) Wpływ zastosowania wybranych endofitów na aktywność GPOX w liściach po 24 dniach wegetacji przedstawiono na Wykresach 3A i B. Zaprawienie nasion odmiany Cyrkon szczepami Ps. clemancea PE22, Ps. fluorescens PE50 oraz Ps. migulae A51 spowodowało wzrost aktywności enzymu GPOX. Aktywność GPOX mieściła się w granicach od 23,96 µm 1min -1 1g -1 świeżej masy po szczepieniu Ps. migulae A51 do 26,43 µm 1min -1 1g -1 świeżej masy po szczepieniu Ps. clemancea PE22. Dla odmiany Kosmo230 po zaprawieniu nasion szczepem Ps. clemancea PE22 stwierdzono spadek aktywności GPOX w porównaniu do roślin kontrolnych Zawartość chlorofilu w liściach Wpływ zastosowania wybranych endofitów na zawartość chlorofilu w liściach po 24 dniach wegetacji przedstawiono na Wykresach 4A i B. Zaprawienie nasion odmiany Cyrkon mieszaniną szczepów spowodowało spadek zawartości chlorofilu A i w konsekwencji chlorofilu całkowitego w liściach 24-dniowych roślin. Nie zaobserwowano natomiast istotnego wpływu na zawartość chlorofilu w momencie, gdy nasiona były szczepione tylko jednym gatunkiem bakterii endofitycznej. Inokulacja nasion odmiany Kosmo230 mieszaniną szczepów spowodowała wzrost zawartości zarówno chlorofilu A i B i w konsekwencji wzrost chlorofilu całkowitego w liściach roślin, w przeciwieństwie do odmiany Cyrkon. Ponadto, wzrost zawartości chlorofilu A oraz całkowitego, zaobserwowano również po zaprawieniu nasion szczepem Ps. clemancea PE Plon świeżej i suchej masy roślin Wpływ zastosowania wybranych endofitów na plon świeżej i suchej masy 24-dniowych roślin przedstawiono na Wykresach 5A i B oraz 6A i B. Szczepienie nasion bakteriami endofitycznymi miało większy wpływ na plon suchej masy niż świeżej. Wpływ na plon świeżej masy roślin odmiany Cyrkon zaobserwowano jedynie po inokulacji izolatem Ps. fluorescens PE50. Plon świeżej masy części nadziemnych roślin odmiany Cyrkon zmniejszył się w porównaniu do roślin kontrolnych. Szczepienie nasion wybranymi szczepami wpłynęło pozytywnie na plon suchej masy. 60

61 Szczepienie nasion mieszaniną izolatów spowodowało wzrost plonu suchej masy korzeni odmiany Cyrkon. Stymulujący wpływ na plon suchej masy korzeni zaobserwowano także dla odmiany Komso230 po zaprawieniu nasion szczepami Ps. fluorescens PE50, Ps. migulae A51 oraz mieszaniną. Szczepienie nasion odmiany Komso230 Ps. migulae A51 wpłynął również stymulująco na plon suchej masy części nadziemnych Wpływ mieszaniny wybranych bakterii na indukcję enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL), peroksydazy gwajakolowej (GPOX) oraz na zawartość chlorofilu w liściach w pilotowym doświadczeniu polowym Przeprowadzono pilotowe doświadczenie polowe z wykorzystaniem mieszaniny trzech szczepów stymulujących wzrost roślin w doświadczeniu in vitro. Doświadczenie pilotowe przeprowadzono z odmianą P8400 w celu określenia wpływu na procesy fizjologiczne odmiany obcej. W łodygach po 39 dniach wegetacji oznaczono aktywność enzymów PAL i GPOX związanych z indukcją odporności systemicznej a w liściach zawartość chlorofilu. Wyniki analiz przedstawiono w Tabeli 9. Oprysk odmiany P8400 mieszaniną szczepów endofitycznych wpłynął na aktywność enzymu PAL, w porównaniu do roślin kontrolnych odnotowano przyrost aktywności tego enzymu o 52,9%. Oprysk dolistny nie miał natomiast w liściach jak również na aktywność enzymu GPOX w łodygach. wpływu na zawartość chlorofilu 61

62 5. Dyskusja 5.1. Zróżnicowanie genotypowe endofiów Koncepcję nasion jako źródła bakterii po raz pierwszy zaproponował Baker i wsp. [1966]. Obecnie uważa się, że wraz z nasionami z pokolenia na pokolenie przenoszone są bakterie endofityczne [Johnston-Monje i Raizada 2011]. Jak do tej pory, obecność bakterii endofitycznych w nasionach została opisana przez kilku badaczy. Drobnoustroje endofityczne związane z nasionami zostały stwierdzone m.in. u świerku pospolitego [Cankar i wsp. 2005], eukaliptusa [Ferreira i wsp. 2008], ryżu [Hardoim i wsp. 2012, Kaga i wsp. 2009]. Według najnowszych doniesień, również ziarniaki kukurydzy stanowią rezerwuar bakterii endofitycznych [Johnston-Monje i Raizada 2011; Liu i wsp. 2012]. Badania Johnston-Monje i Raizada [2011] sugerują, iż skład drobnoustrojów endofitycznych zasiedlających ziarniaki kukurydzy jest ściśle związany z genotypem i pochodzeniem rośliny. Przedstawiciele rodzajów Clostridium oraz Paenibacillus zostały stwierdzone we wszystkich genotypach analizowanej kukurydzy oraz u dzikich przodków. Sugeruje to przetrwanie określonych zespołów pomimo ewolucji i selekcji ze strony człowieka. Badania Liu i wsp. [2012] również potwierdzają wpływ genotypu (odmiany) kukurydzy na skład zespołów drobnoustrojów endofitycznych. Zróżnicowanie endofitów 4 mieszańców kukurydzy uzależnione było od ich genotypu. Przekazywanie określonych zespołów drobnoustrojów endofitycznych wraz z nasionami opisano również w przypadku ryżu, u którego około 45% składu zespołu bakterii stwierdzonych w nasionach ryżu pierwszego pokolenia, została również stwierdzona w nasionach drugiego pokolenia [Hardoim i wsp. 2012]. Nasiona obu generacji były zasiedlone m.in. przez Stenotrophomonas maltophilia oraz Ochrobactrum spp. W badaniach własnych nad zdolnością ziarniaków kukurydzy do przenoszenia endofitów hodowalnych nie uzyskano żadnych kolonii bakterii wyrosłych na podłożu. Można powiązać to faktem, iż do izolacji wykorzystano nasiona, które były ręcznie pozyskane z kolb. W trakcie zbioru mechanicznego w warunkach polowych uszkodzeniu może ulegać okrywa nasienna co powoduje powstanie mikropor potencjalnych siedlisk drobnoustrojów. Bakterie zasiedlające mikropory okrywy nasiennej mogą być efektem kontaktu nasion z cała masą roślin w trakcie omłotu kombajnowego. Autorzy prac, m.in. Rijavec i wsp. [2007], którzy stwierdzają hodowalne bakterie endofityczne w ziarniakach kukurydzy nie podają w jaki sposób 62

63 pozyskali materiał siewny. Jeżeli nasiona testowanych 6 odmian zasiedlone są przez bakterie endofityczne, to ich liczebność nie przekracza poziomu wykrywalności lub należą one do grupy drobnoustrojów niehodowalnych. Mimo doniesień o obecności endofitów we wnętrzu nasion, dalej nie uzyskano odpowiedzi na pytanie czy drobnoustroje te selekcjonowane są przez roślinę w celu zwiększenia żywotności następnego pokolenia nasion, czy to nasiona wykorzystywane są przez bakterie jako wektory do kolonizacji nowych nisz [Hardoim i wsp. 2012]. Asocjacje hodowalnych drobnoustrojów endofitycznych badanych odmian kukurydzy składały się z 18 rodzajów zaklasyfikowanych do 4 typów. Zróżnicowanie to jest porównywalne z opisywanymi w literaturze dla roślin klimatu umiarkowanego lub ciepłego m.in. soi (Glicine sp.willd) [Hung i Annapurna 2004], ziemniaka [Garbeva i wsp. 2001] czy żeń-szenia [Cho i wsp. 2007]. Duże zróżnicowanie hodowalnych drobnoustrojów endofitycznych zostało także zaobserwowane u kukurydzy słodkiej [McInroy i Kloepper 1995b]. Izolaty pozyskane z powierzchniowo zdezynfekowanych korzeni oraz łodyg odmiany Silver queen zostały zaklasyfikowane do 31 rodzajów. Wśród kolekcji pozyskanej z liści 6 odmian kukurydzy, dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas z przedstawicielami 12 gatunków. Bakterie z rodzaju Pseudomonas są jednym z najczęściej opisywanych taksonów, który zasiedla tkanki roślinne [Jacobs i wsp. 1985]. Ich obecność została stwierdzona między innymi w tkankach marchwi zwyczajnej (Daucus carota L.) [Surette i wsp. 2003], soi [Kuklinsky-Sorbal i wsp. 2004] czy żeń-szenia [Cho i wsp. 2007]. Również inne zespoły badawcze stwierdziły obecność bakterii z rodzaju Pseudomonas wśród bakterii endofitycznych pozyskanych z różnych odmian roślin [McInroy, Kloepper 1995b; Rai i wsp. 2007; Lalande i wsp. 1989] oraz ziarniaków kukurydzy [Johnston-Monje i Raizada 2011; Liu i wsp. 2012; Rijavec i wsp. 2007]. Poza drobnoustrojami z rodzaju Pseudomonas znaczną ilość pozyskanych izolatów stanowiły rodzaje Arthrobacter, Bacillus oraz Microbacterium. Bakterie z tych rodzajów również zostały zidentyfikowane wśród endofitów różnych odmian kukurydzy. Przedstawicieli wszystkich trzech rodzajów w korzeniach lub łodygach odmiany Silver queen zaobserwowali McInroy i Kloepper [1995b]. Bakterie z rodzajów Bacillus oraz Microbacterium zostały wyselekcjonowane z 4 odmian skiełkowanych ziarniaków kukurydzy [Rijavec i wsp. 2007]. Rai i wsp. [2007] oraz Lalande i wsp. [1989] również zaobserwowali bakterie z rodzaju Bacillus zasiedlające łodygi lub korzenie kukurydzy. 63

64 Z liści badanych odmian kukurydzy rzadko izolowano bakterie z rodzajów Acinetobacter, Chryseobacterium, Methylobacterium, Rhizobium oraz Staphylococcus. W literaturze przedmiotu opisano kilka szczepów Acinetobacter, które są endofitami. Endofityczne Acinetobacter spp. zostały stwierdzone w roślinach potomnych i rodzicielskich kilku odmian kukurydzy [Liu i wsp. 2012]. Ponadto Acinetobacter spp. zasiedlały korzenie buraka cukrowego [Shi i wsp. 2011], łodygi bawełny [McInroy i Kloepper 1995b], ryżu [Hardoim i wsp. 2012] oraz pnie wierzby (Salix sitchensis Sanson ex Bong.) i topoli kalifornijskiej (Populus trichocarpa Torr. & A.Gray) [Doty i wsp. 2009]. Acinetobacter sp. został również stwierdzony w rizosferze 20 odmian kukurydzy uprawianej w prowincji Quebec, Kanada [Lalande i wsp. 1989]. Bakterie z rodzaju Chryseobacterium zostały wcześniej stwierdzane jako endofity kukurydzy [Liu i wsp. 2012]. Zasiedlały również korzenie roślin wilca (Calystegia soldanella L.) i wydmuchrzycy piaskowej (Elymus mollis L.) porastających wydmy [Park i wsp. 2005] oraz korzenie psianki [Long i wsp. 2004]. Endofityczne bakterie z rodzaju Methylobacterium wyizolowano m.in. z ryżu [Madhaiyan i in. 2007], kukurydzy słodkiej oraz bawełny [McInroy i Kloepper, 1995b]. Również Rhizobium spp. zostały stwierdzone jako endofity kukurydzy [Liu i wsp. 2012, McInroy i Kloepper 1995b], oraz bawełny [McInroy i Kloepper 1995b], marchwi zwyczajnej [Surette i wsp. 2003], wilca [Park i wsp. 2005] i ryżu [Hardoim i wsp. 2012]. Zdziwienie może budzić fakt izolacji z tkanek roślinnych bakterii z rodzaju Staphylococcus. W literaturze przedmiotu Staphylococcus spp. występowały w tkankach słodkiej kukurydzy i bawełny [McInroy i Kloepper 1995b]. Surette i wsp. [2003] stwierdzili również obecność Staphylococcus spp. wśród endofitów marchwi zwyczajnej a Thomas i Soly [2009] banana zwyczajnego (Musa sp.) odmiany Grand Naine. Wśród pojedynczych izolatów pozyskanych z tkanek 6 odmian kukurydzy stwierdzono przedstawicieli rodzajów: Brachybacterium, Erwinia, Kocuria, Micrococcus, Pedobacter, Rhodococcus, Rothia, Shigella oraz Sphingomonas. Wszystkie, przynajmniej raz, zostały opisane jako endofity różnych roślin, m.in. bawełny [McInroy i Kloepper 1995b], banana zwyczajnego [Thomas i Soly 2009], grujecznika japońskiego (Cercidiphyllum japonicum Siebold & Zucc) [Li i wsp. 2008], kukurydzy [McInroy i Kloepper 1995b, Rai i wsp. 2007; Rijavec i wsp. 2007], marchwi zwyczajnej [Surette i wsp. 2003], rzodkwi zwyczajnej (Raphanus sativus L.) [Seo i wsp. 2010] a nawet roślin klimatu arktycznego Oxyria digyna (L.) Hill, Diapensa lapponica 64

65 L. i Juncus trifidus L. [Nissinen i wsp. 2012]. Zróżnicowanie hodowalnych bakterii endofitycznych uzależnione jest od gospodarza, jego genotypu jak również warunków glebowych, co zostało potwierdzone w niniejszej pracy. Być może skład gatunkowy hodowalnych endofitów jest unikalny na poziomie gatunku. Brak hodowalnych endofitów w tkankach siewek kukurydzy wyrosłych z powierzchniowo sterylizowanych, ręcznie łuskanych ziarniaków, może sugerować iż, opisane w literaturze hodowalne endofity kukurydzy przenoszone przez ziarniaki mogą być efektem ich zanieczyszczenia, w trakcie omłotu, bakteriami zasiedlającymi liście i/lub łodygi kukurydzy Zróżnicowanie fenotypwe endofiów Zdolność do zasiedlania tkanek roślin przez bakterie uzależniona jest od szeregu czynników, m.in. metabolitów roślinnych i bakteryjnych, które kształtują wzajemne zależności. Przykładem takich metabolitów są m.in. roślinne flawonoidy regulujące ekspresję bakteryjnych genów (Phillips i Tsai 1992) oraz bakteryjne lipochitooligosacharydy (LCO ang. lipo-chitooligosaccharides) indukujące proces tworzenia brodawek korzeniowych (Schultze i Kondorosi 1996). Kwasy fenolowe i ich pochodne to grupa wielofunkcyjnych metabolitów roślinnych [Mandal i wsp. 2010]. Stanowią istotny czynnik ograniczający rozwój drobnoustrojów w tkankach roślinnych gdyż wykazują właściwości przeciwbakteryjne [Cueva i wsp. 2010; Fernandez i wsp. 1996]. W literaturze przedmiotu do tej pory nie opisano badań nad wykorzystaniem tych substancji jako jedynego źródła węgla i energii przez drobnoustroje endofityczne, nieznane są również minimalne stężenia hamujące związków fenolowych w stosunku do bakterii endofitycznych. W literaturze przedmiotu znajdujemy tylko prace odnoszące się do zdolności wykorzystania związków fenolowych, związanych z procesem lignifikacji, przez mikroorganizmy glebowe [Blum i wsp. 2000; Latha i Mahadevan 1997; Sundman 1964]. W soku komórkowym kukurydzy odnotowano obecność m.in. kwasu chlorogenowego, ferulowego, kumarowego oraz alkoholu koniferylowego [Maksimovic i wsp. 2008]. Zdolność do wykorzystania przynajmniej jednego z tych związków została stwierdzona u 42 szczepów, co stanowiło 1/3 pozyskanej kolekcji. Zdolność szczepów endofitycznych do biodegradacji określonych związków fenolowych może być wykorzystywana w celu własnej ochrony, jak opisano w przypadku komensala 65

66 Lactobacillus johnsonii N6.2 [Birs br.]. Stężenia substancji fenolowych w tkankach kukurydzy uzależnione są od wieku rośliny co odzwierciedla proces lignifikacji i starzenia się tkanek [Maksimovic i wsp. 2008]. Minimalne stężenia hamujące testowanych związków dla badanych szczepów były wyższe niż opisane stężenia w soku komórkowym intensywnie rosnącej kukurydzy. Zdolność szczepów do wykorzystywania lub tolerowania kwasów fenolowych w stężeniach wyższych niż opisywane jako naturalne w sokach komórkowych kukurydzy sugeruje, iż te mikroorganizmy zdolne są do przeżycia we wnętrzu tkanek roślinnych. Zasiedlanie tkanek przez endofity może być również uzależnione od zdolności bakterii do wydzielania substancji przeciwgrzybowych. Czynnik ten sprawia, iż są one bardziej konkurencyjne niż drobnoustroje bez takiej zdolności. W badaniach własnych aktywność przeciwko F. moniliforme i F. graminearum została stwierdzona u przedstawicieli 11 rodzajów: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Chryseobacterium, Erwinia, Methylobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rothia oraz Staphylococcus. Zdolność bakterii z rodzaju Pseudomonas do produkcji substancji przeciwgrzybowych jest licznie opisywana w literaturze co zostało podsumowane m.in. przez Dowling i O'Gara [1994], Leisinger i Margraff [1979] czy Ligon i wsp. [2000]. Badania Nandakumar i wsp. [2002] nad trzema izolatami P. fluorescens wskazały, iż ich aktywność przeciwgrzybowa jest związana nie tylko z produkcją antybiotyku (2,4-diacetylofloroglucyna DAPG) ale również produkcją sideroforów, cyjanowodoru i enzymów litycznych t.j. chitynazy i β-1,3-glukanazy. Również endofityczne bakterie z rodzaju Pseudomonas wykazują aktywność antagonistyczną w stosunku do fitopatogenów. Endofityczne izolaty Pseudomonas sp. GH07 oraz GS08 w testach in vitro hamowały wzrost Rhizoctonia solani oraz F. oxysporum a Ps. poae JA01 również Phytium ultimum i Phytophtora capsici [Cho i wsp. 2007]. Drugą grupą bakterii pod względem liczebności i aktywności przeciwgrzybowej były izolaty z rodzaju Bacillus. W literaturze przedmiotu wiele prac odnosi się do produkcji substancji przeciwgrzybowych przez bakterie z rodzaju Bacillus wyizolowanych z gleby, rizosfery a także tkanek roślinnych. Szczepy B. amyloliquefaciens BNM340 oraz B. cereus BNM343 z rizosfery soi hamowały wzrost 5 różnych grzybów patogenicznych, m.in. F. oxysporum i F. solani [Leon i wsp. 2009]. W doświadczeniu in vitro endofityczne izolaty Bacillus spp. GH02, GH09, 66

67 GS03, GS06 pozyskane z roślin żeń-szenia także hamowały wzrost fitopatogenów, m.in. F. oxysporum czy Rh. solani [Cho i wsp. 2007]. Badania Li i wsp. [2012] nad endofitycznym B. subtilis ZZ120 wykazały jego antagonistyczne oddziaływanie na F. graminearum, Alternaria alternata, Rh. solani, Cryphonectria parasitica oraz Glomerella glycines. W literaturze przedmiotu znajdujemy nieliczne doniesienia o zdolności bakterii z rodzajów Acinetobacter, Arthrobacter, Chryseobacterium, Methylobacterium oraz Rhizobium do produkcji związków aktywnych w stosunku do grzybów. Szczep Acinetobacter baumannii LCH001 pozyskany z łodygi cynamonowca kamforowego (Cinnamomum camphora (L.) Presl) w doświadczeniach in vitro hamował wzrost Cryphonectria parasitica, Glomerella glycines, Phytophthora capsici, F. graminearum, Botrytis cinerea oraz Rh. solani [Liu i wsp. 2007]. Grupę metabolitów produkowanych przez ten izolat, odpowiedzialnych za hamowanie wzrostu grzybów zaklasyfikowano do lipopeptydów (iturin A2, iturin A3, iturin A6). Również szczep Ac. hemolyticus RW19, wyizolowany z rizosfery pszenicy, hamował wzrost szeregu fitopatogenów z rodzaju Fusarium, Alaternaria oraz Ustilago maydis [Huddedar i wsp. 2000]. Zdolność do produkcji związków hamujących wzrost in vitro fitopatogenów przez Arthrobacter spp. oraz Ar. globiformis pozyskanych z rizosfery został opisany tylko przez Glażewską- Maniewską i wsp. [2004] oraz Sachdev i wsp. [2009]. Również Chryseobacterium soldanellicola PSD1-4T w doświadczeniu in vitro hamował wzrost F. oxysporum [Park i wsp. 2006]. Ponadto w doświadczeniach in vitro zdolność do produkcji antybiotyków w stosunku do F. oxysporum and F. udum przez Methylobacterium exotrquens wykazał Poorniammal i wsp. [2009]. Zdolność do produkcji związków hamujących wzrost in vitro fitopatogenów przez Rhizobium radiobacter oraz Rhizobium sp. został opisany przez Charest i wsp. [2005] oraz Drapeau i wsp. [1973]. Dotychczas w literaturze przedmiotu nie opisano aktywności w stosunku do grzybów z rodzaju Fusarium dla szczepów z rodzajów Erwinia, Microbacterium, Rothia oraz Staphylococcus. Zaobserwowane w niniejszej pracy antagonistyczne oddziaływanie pomiędzy izolatami z rodzaju Erwinia, Microbacterium, Rothia oraz Staphylococcus a fitopatogenami może wynikać również ze zmiany właściwości fizykochemicznych podłoża. 67

68 Zdolność bakterii ednofitycznych do pozakomórkowego wydzielania kwasów zwiększających zawartość rozpuszczalnego fosforu powoduje wzrost w środowisku dostępnych jego form dla roślin. Izolacja drobnoustrojów rozpuszczających nieorganiczny fosfor nie jest ograniczona tylko do gleby, ale drobnoustroje o takiej aktywności występują również w innych środowiskach [Rivas i wsp. 2004]. W badaniach własnych rozpuszczanie fosforanów zaobserwowano dla bakterii z rodzajów: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Rothia oraz Staphylococcus. Zdolność bakterii z rodzajów Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus oraz Pseudomonas do rozpuszczania fosforanów jest licznie opisywana w literaturze przedmiotu [Chen i wsp. 2006; Mohammadi 2012; Rodriguez i Fraga 1999]. Zwiększanie dostępności fosforu nieorganicznego przez bakterie z rodzaju Pseudomonas wiąże się z wydzielaniem do środowiska kwasów organicznych, głównie kwasu glukonowego [Babu-Khan i wsp. 1995]. Również dla rodzajów Kocuria, Microbacterium oraz Staphylococcus pojawiają się pojedyncze doniesienia o zdolności do rozpuszczania nieorganicznego fosforu. Izolaty K. rosea oraz M. arborescens pozyskane z rizosfery roślin Ipomea pes-caprae L. oraz Spinifex littoreus L. porastających wydmy posiadały aktywność rozpuszczania fosforu nieorganicznego [Godinho i wsp. 2010]. Również po inkubacji M. ulmi, wyizolowanego z trocin wiązu, na podłożu YED-P pojawiały się strefy przejaśnienia świadczące o zdolności tego izolatu do rozpuszczania fosforu nieorganicznego [Rivas i wsp. 2004]. Badania in vitro Alharbi [2009] wykazały, iż również St. pasteuri zwiększa dostępność fosforu w środowisku. W przypadku bakterii z rodzaju Staphylococcus zdolność ta może być wykorzystywana do rozróżniania patogenicznych i niepatogenicznych gatunków [Alharbi 2009]. Do tej pory w literaturze przedmiotu nie opisano bakterii z rodzaju Rothia zdolnych do rozpuszczania fosforu nieorganicznego. Jest to pierwsze doniesienie o zdolności R. amarae do rozpuszczania fosforu trójwapniowego. Proces asymilacji wolnego azotu przez drobnoustroje endofityczne może być czynnikiem stymulujących wzrost i rozwój roślin. Zdaniem wielu autorów m.in. Kumari Sugitha i Kumar [2009] u wszystkich drobnoustrojów wiążących wolny azot występuje gen nifh, w przeciwieństwie do innych genów strukturalnych tego procesu. Poly i wsp. [2001] w swojej pracy zaprojektowali zdegenerowane primery PolF&PolR i wykazali ich przydatności w identyfikacji genu nifh u wielu szczepów zdolnych do wiązania wolnego azotu w tym symbiotycznych (m.in. Rhizobium, Sinorhizobium, 68

69 Frankia) jak również wolnożyjących (m.in. Azospirillum, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas). W literaturze przedmiotu primery PolF&PolR wielokrotnie wykorzystywano do identyfikacji drobnoustrojów wiążących wolny azot pozyskanych z różnych środowisk. Mirza i wsp. [2006] wykorzystali primery PolF&PolR w detekcji genu nifh u Pseudomonas sp. K1 wyizolowanego z rizosfery ryżu a Mehnaz i wsp. [2007] w detekcji genu nifh u Azospirillum canadense pozyskanego z rizosfery kukurydzy. W badaniach własnych obecność genu nifh, a tym samym potencjalna zdolność do wiązania wolnego azotu, została stwierdzona dla bakterii z rodzajów: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brachybacterium, Erwinia, Methylobacterium, Microbacterium, Pedobacter, Pseudomonas, Rothia, Staphylococcus oraz Sphingomonas. Zdolność do wiązania wolnego azotu przez endofityczne i rizosferowe bakterie niesymbiontyczne jest słabo poznana, jednak została stwierdzona w kilku przypadkach. W literaturze przedmiotu zdolności bakterii z rodzaju Acinetobacter do wiązania wolnego azotu została opisana przez Chaudhary i wsp. [2012] oraz Sachdev i wsp. [2010]. Szczep Ac. oryzae B23 T został pozyskany z powierzchniowo zdezynfekowanych liści ryżu dzikiego (Oryza alta) [Chaudhary i wsp. 2012] a Ac. baumannii LRFN53 z rizosfery pszenicy [Sachdev i wsp. 2010]. Szczep Ac. calcoaceticus WP19, wyizolowany z topoli kalifornijskiej, posiadał genu nifh ale nie wiązał wolnego azotu [Doty i wsp. 2009]. Bakterie z rodzaju Bacillus, u których stwierdzono zdolność asymilacji wolnego azotu, wymagały beztlenowych warunków w trakcie tego procesu [Li i wsp. 1992; Wahab 1975]. Wiązanie wolnego azotu dla rodzaju Brachybacterium zostało opisane tylko przez Gontia i wsp. [2011] oraz Jha i wsp. [2012] odpowiednio u Br. saurashtrense JG06 T i Brachybacterium sp. JG06. Również szczep Methylobacterium nodulans ORS 2060 T posiadał zdolność wiązania wolnego azotu a gen nifh wykazywał podobieństwo do genu Gluconacetobacter diazotrophicus [Jourand i wsp. 2004]. Wiązanie wolnego azotu przez bakterie z rodzaju Microbacterium zostało opisane przez Lin i wsp. [2012] u Microbacterium sp. 16SH pozyskanego z powierzchniowo zdezynfekowanych łodyg trzciny cukrowej. U bakterii z rodzaju Arthrobacter i Rothia stwierdzono odpowiednio aktywność nitrogenazy lub obecność sekwencji nifh podobnej w genomie, jednak funkcjonalnośc tego klastra genów nie została do tej pory wyjaśniona [Gtari i wsp. 2012]. Izolat Pseudomonas sp. K1 pozyskany z rizosfery ryżu posiadał zdolność do 69

70 wiązania wolnego azotu, potwierdzoną metodą redukcji acetylenu, a gen nifh wykazywał 99% i 91% podobieństwa do genów Azotobacter chroococcum oraz Ps. stuzeri, odpowiednio [Mirza i wsp. 2006]. Badania Desnoues i wsp. [2003] nad innym izolatem pozyskanym z rizosfery ryżu, Ps. stutzeri A1501, również wykazały jego zdolność do asymilacji wolnego azotu. Przy czym szczep referencyjny Ps. stutzeri NCIMB T nie posiadał tej zdolności [Hatayama i wsp. 2005]. Izolat Ps. azotifigens 6H33b pozyskany z kompostu także wiązał wolny azot [Hatayama i wsp. 2005]. Pierwszym opisanym izolatem z rodzaju Sphingomonas zdolnym do asymilacji wolnego azotu był Sp. azotifigens Y39 T pozyskany z korzeni ryżu [Xie, Yokota 2006]. Badania Videira i wsp. [2009] nad 46 izolatami Sphingomonas spp. wykazały iż 22 z nich zdolne są do wiązania wolnego azotu. Jednocześnie, analiza genów16s rrna oraz nifh wykazała iż większość z tych 22 izolatów tworzy odrębny klaster niż Sp. azotifigens. Izolaty Sphingomonas spp. pozyskane z wierzby zdolne były do wzrostu w podłożu bezazotowym, połowa z nich posiadała gen nifh ale nie redukowały acetylenu co sugeruje brak zdolności do wiąznaia N 2 [Doty i wsp. 2009]. W literaturze przedmiotu dla rodzajów Erwinia, Pedobacter oraz Staphylococcus nie opisano zdolności wiązania wolnego azotu. Zdolność wiązania wolnego azotu przez bakterie niesymbiontyczne może być cechą charakterystyczną na poziomie szczepu [Hatayama i wsp. 2005] lub wynikiem poziomego dryftu genetycznego klastra genów odpowiedzialnych za asymilację N 2, jak w przypadku rizosferowego izolatu Ps. stutzeri A1501 [Yan i wsp. 2008]. Występowanie markera nifh u drobnoustrojów bez zdolności do asymilacji wolnego azotu sugeruje niekompletny transfer tego klastra. Aktywne wiązania azotu uzależnione jest również od jakości i ilości związków organicznych metabolizowanych przez bakterie, jak w przypadku endofitycznego izolatu Rahnella aquatilis SPb pozyskanego z roślin słodkiego ziemniaka (Ipomoea batatas (L.) Lam.) [Khan, Doty 2009] lub szczepów z rodzaju Azospirillum spp. pozyskanych z 3 roślin [Gałązka i wsp. 2010]. Biosynteza enzymów degradujących ściany komórkowe roślin (CWDE) ułatwia bakteriom endofitycznym zasiedlanie tkanek roślinnych. W badaniach własnych zdolność do biosyntezy CWDE została określona dla 36 szczepów. Największe spektrum aktywności CWDE stwierdzono u bakterii z rodzaju Pseudomonas. Szczepy z rodzajów Acinetobacter, Bacillus, Chryseobacterium oraz Microbacterium zdolne były do biosyntezy jednego lub dwóch rodzajów enzymów. W literaturze przedmiotu 70

71 zdolność do biosyntezy i pozakomórkowego wydzielania CWDE przez drobnoustroje, w tym endofity, jest licznie opisana. Szczepy Ps. fluorescens K-34, Ps. fluorescens 1773/K i Ps. trivalis BIHB745 zdolne były do biosyntezy i pozakomórkowego wydzielania enzymów celulolitycznych i proteolitycznych [Parani, Saha 2012]. Badania Cho i wsp. [2007] nad endofitami żeń-szenia wykazały, iż 60% pozyskanych izolatów zdolnych było do biosyntezy przynajmniej jednego z 4 enzymów. Aktywność pektynolityczna oraz celulolityczna bakterii endofitycznych pozyskanych z soi została stwierdzona odpowiednio u 33% i 70% izolatów [Hung, Annapurna 2004]. Drobnoustroje patogeniczne są także zdolne do biosyntezy CWDE, jednak zróżnicowanie ekspresji i regulacji genów kodujących pomiędzy fitopatogenami a drobnoustojami endofitycznymi jest dotychczas słabo poznane. Cho i wsp. [2007] zwracają uwagę, że znaczna liczba endofitów charakteryzuje się zdolnością do biosyntezy CWDE, i dlatego sugerują, iż biosynteza CWDE może odgrywać istotną rolę w nawiązywaniu asocjacji roślina mikroorganizmy. Podsumowując analizowane cechy badanych endofitów zasiedlających liście kukurydzy można stwierdzić, iż wszystkie z nich wykorzystywały lub tolerowały związki fenolowe w stężeniach wyższych niż naturalnie występujące w soku kukurydzy. Większość z badanych endofitów wykazywała potencjalną zdolność do wiązania wolnego azotu a tylko część zdolna była do rozpuszczania fosforanu trójwapniowego i biosyntezy związków przeciw grzybom z rodzaju Fusarium. Stwierdzoną większą ilość bakterii endofitycznych, wydzielających substancje hamujące wzrost grzybów z rodzaju Fusarium wśród szczepów pozyskanych ze Smolic można powiązać z bardziej zakwaszonym odczynem glebowym tej lokalizacji, co sprzyja rozwojowi grzybów. Zdolność bakterii do produkcji związków przeciwgrzybowych sprawia iż endofity te są lepiej dostosowane do warunków środowiskowych i mogą ograniczać infekcje grzybowe zasiedlanych roślin Wpływ endofitów na wzrost i rozwój roślin W literaturze przedmiotu wiele prac odnosi się do wpływu bakterii endofitycznych na swojego gospodarza. Shi i wsp. [2009] inokulowali buraka cukrowego bakteriami endofitycznymi pozyskanymi z tej rośliny. Plon świeżej i suchej masy roślin oraz liczba liści na roślinę zwiększyła się po inokulacji roślin trzema wybranymi izolatami. W podobnych badaniach, inokulacja buraka cukrowego 71

72 szczepem Ac. johnsonii 3-1 spowodowała wzrost wysokości roślin o 19% oraz masy korzeni o 69% [Shi i wsp. 2011]. Ponadto, inokulacja tym szczepem przyczyniła się do zwiększenia zawartości witamin B i C oraz białka w korzeniach. Badania Rodrigues i wsp. [2008] nad wpływem Azospirillum amazonense na wzrost ryżu wykazały korzystny wpływ na liczbę wiech oraz akumulację suchej masy w ziarnach. Stymulację wzrostu korzeni psianki czarnej obserwowano po inokulacji endofitami wyizolowanymi z tej rośliny [Long i wsp. 2008]. Istotną rolę endofitów opisali Puente i wsp. [2009], którzy stwierdzili bakterie endofityczne w nasionach kaktusa Pachycereus pringlei, co umożliwiało siewkom wzrost na rumoszu skalnym bez nawożenia mineralnego przez rok. Obecność endofitów przyczyniła się do udostępniania związków mineralnych siewkom z rozpuszczonego podłoża. Tylko w kilku pracach opisano próby inokulacji roślin bakteriami endofitycznymi obcego pochodzenia. Badania Madhaiyan i wsp. [2007] wskazują, iż bakterie endofityczne Methylobacterium oryzae oraz Burkholderia sp., wyizolowane z tkanek ryżu, zredukowały toksyczny wpływ kadmu i niklu na nasiona pomidora w warunkach in vitro. Trzy szczepy bakterii endofitycznych, izolowane z trawy Brachiaria CIAT 36062, reinokulowane do roślin trawy Brachiaria hybrid cv. Mulato oraz Brachiaria brizantha CIAT 6294 w warunkach niedoboru składników odżywczych wpłynęły na wzrost zawartość biomasy, chlorofilu oraz azotu ogólnego inokulowanych roślin [Kelemu i wsp. 2010]. Pseudomonas sp. A3R3, pozyskany z rośliny Alyssum serpyllifolium, reinokulowany do nasion Brassica juncea (L.) Czern. zwiększył biomasę tej rośliny [Ma i wsp. 2011]. Badania Rylo Sona Janarthine i Eganathan [2012] nad izolatem Sporosarcina aquimarina SjAM16103 pozyskanym z namorzynu Avicennia marina (Forssk.) Vierh. wykazały jego pozytywny wpływ na wzrost korzeni i pędów innych gatunków roślin rosnących w tych samych warunkach środowiskowych, t.j. Bacopa monnieri (L.) Pennell, Eupatorium triplinerve (Vahl.) oraz Excoecaria agallocha (L). Drobnoustroje endofityczne oraz gospodarzy cechuje wybiórczość. Przykładem na tego typu relacje mogą być niektóre szczepy z rodzaju Pseudomonas, izolowane ze zdrowych tkanek roślin pomidora, które w momencie reinokulacji do siewek pomidora hamowały ich wzrost [Van Peer i wsp. 1990]. Badania Chandrashekhara i wsp. [2007] nad 60 izolatami bakterii endofitycznych pozyskanych z 8 różnych roślin, wykazały iż tylko 10 z nich stymulowało wzrost Pennisetum glaucum (L.) R. Br. Również Faria 72

73 i wsp. [2012] wskazali selektywny wpływ endofitów na gospodarza. Szczepy Paenibacillus maceras oraz Paenibacillus lentimorbus, pozyskane z merystemu orchidei Cymbidium eburneum uprawianej in vitro, wybiórczo promowały wzrost korzeni lub epikotylów inokulowanych siewek. Teorię wybiórczości potwierdzają także badania in vitro oraz doświadczenia doniczkowe przeprowadzone w ramach niniejszej pracy. Szczepy Ar. nicotinovorans A7, Ar. nitroguajacolicus A18, Ps. fluorescens PE50, Ps. graminis PE24, Ps. viridiflava PE31 oraz M. extorquens A5 testowane na 5 obcych odmianach, w wybiórczy sposób hamował wzrost siewek in vitro. Również 14 innych izolatów testowanych tylko na odmianach macierzystych, hamowało ich wzrost w doświadczeniach in vitro. Hamowanie wzrostu siewek kukurydzy odmian macierzystych i obcych przez bakterie endofityczne może wynikać z aktywności metabolicznej roślin w warunkach in vitro oraz/lub produkcji przez drobnoustroje toksycznych metabolitów. Jednakże, efekt kumulacji substancji biologicznie czynnych ograniczających wzrost siewek w doświadczeniach in vitro nie musi wywoływać negatywnego efektu w warunkach naturalnych. Wzrost siewek odmian macierzystych w doświadczeniach in vitro stymulowany było tylko przez 3 szczepy Ps. fluorescens PE50, Ps. clemancea PE22 oraz Ps. migulae A51. Jednak w doświadczeniu doniczkowym zaobserwowano ich zróżnicowany wpływ na dwie odmiany kukurydzy. Zaprawianie nasion odmiany Kosmo230 szczepami Ps. fluorescens PE50, Ps. migulae A51 oraz mieszaniną spowodowała wzrost plonu suchej masy korzeni lub części nadziemnych pojedynczej rośliny. Wzrost plonu suchej masy korzeni zaobserwowano również u roślin odmiany Cyrkon szczepionych mieszaniną. Jednak inokulacja Ps. fluorescens PE50 przyczyniła się do obniżenia plonu świeżej masy części nadziemnych roślin odmiany Cyrkon. W badaniach własnych zaobserwowano również zróżnicowany wpływ testowanych szczepów endofitycznych na zawartość chlorofilu całkowitego w liściach w doświadczeniach doniczkowych. Podobne wyniki otrzymał Shi i wsp. [2010], który opisał wzrost chlorofilu całkowitego w liściach buraka cukrowego po inokulacji endofitycznymi szczepami B. pumilus 2-1 oraz Ac. johnsonii 3-1 i brak wpływu szczepu Chr. indologene 2-2 na zawartość chlorofilu całkowitego 30-sto dniowych roślin buraka cukrowego rosnących w jałowych warunkach. Harish i wsp. [2008] opisali wzrost zawartości chlorofilu całkowitego w liściach banana inokulowanych bakteriami endofitycznymi EPB5 w porównaniu z roślinami kontrolnymi w doświadczeniu 73

74 polowym. W przypadku inokulacji drugim izolatem endofitycznym EPB22, odnotowano spadek chlorofilu całkowitego w liściach w porównaniu do roślin nieinokulowanych [Harish i wsp. 2008]. W badaniach własnych nie odnotowano wpływu szczepów na zawartośc chlorofilu w pilotowym doświadczeniu polowym. Long i wsp. [2008] sugerują, iż mechanizmy stymulowania wzrostu roślin przez bakterie endofityczne są konserwatywne, to jednak mikroorganizmy te nie mają jednakowego, przewidywalnego wpływu na rośliny które zasiedlają. Produkcja fitohormonów, t.j. IAA czy SA przez bakterie z rodzaju Pseudomonas jest szeroko opisywana w literaturze. Zdolność do produkcji IAA u Ps. fluorescens AK1 oraz Ps. aeruginosa AK2 została stwierdzona przez Karnwal [2009]. Ponadto 30 izolatów fluoryzujących Pseudomonas pozyskanych z rizosfery jabłoni (Malus sp.) i gruszy (Pyrus sp.) wykazywało zróżnicowaną zdolność do biosyntezy IAA [Kapoor i wsp. 2012]. Do biosyntezy IAA były również zdolne endofityczne Pseudomonas spp. pozyskane z roślin psianki czarnej [Long i wsp. 2008]. Istotną rolę bakteryjnego IAA w komunikacji roślina drobnoustrój oraz drobnoustrój drobnoustrój opisali Spaepen i wsp. [2007]. Zdolność do biosyntezy SA przez Ps. aeruginosa 7NSK2 opisali De Meyer i Hoffe [1997]. Spośród 25 testowanych izolatów fluoryzujących Pseudomonas 12 z nich zdolnych było do biosyntezy SA [Soltani i wsp. 2012]. Również szczepy Pseudomonas spp. przebadane w niniejszej pracy zdolne były do biosyntezy IAA oraz SA w warunkach in vitro. W badaniach własnych nie stwierdzono zdolności do biosyntezy IBA, jak również w literaturze przedmiotu nie opisano zdolności bakterii z rodzaju Pseudomonas do biosyntezy tej auksyny. Powyższa auksyna została stwierdzona jedynie w pozakomórkowych wydzielinach u A. brasiliense UAP 154 [Martinez-Morales i wsp. 2003]. Zdolność do modyfikacji poziomu etylenu opisano u Ps. brassicacearum Am3 [Belimov i wsp. 2007]. Gen acds, kodujący deaminazę ACC, obecny był w genomie m.in. Pseudomonas sp. 4MKS8 [Babalola i wsp. 2003], Ps. fluorescens TDK1 [Saravanakumar i Samiyappan 2007] oraz Ps. entomophila PS-PJH [Kamala-Kannan i wsp. 2010]. W przeciwieństwie do danych literaturowych, u testowanych szczepów Ps. fluorescens PE50, Ps. clemancea PE22 i Ps. migulae A51 nie stwierdzono obecności produktu dla genu acds. Zastosowanie w uprawie roślin PGPE (ang. Plant Growth Promoting Endophytes) indukuje w roślinie biosyntezę protein uczestniczących w obronie przed patogenami, co zostało opisane w kilku pracach. Inokulacja roślin ryżu szczepem 74

75 Methylobacterium sp. PPFM-Os-07 spowodowała wzrost aktywności enzymów PAL oraz peroksydazy w porównaniu do roślin nieinokulowanych [Madhaiyan i wsp. 2004]. Indukcja odporności systemicznej wyrażona wzrostem aktywności PAL została również zaobserwowana u roślin ostrej papryki (Capsicum annum L.) po inokulacji rizobakteriami Ps. chlororaphis PA23 oraz B. subtilis BSCBE4 [Nakkeeran i wsp. 2006]. Przyrost aktywności enzymów związanych z indukcją odporności systemicznej, t.j. PAL, chitynaza oraz beta-1,3-glukanaza, zaobserwowano również u 3 gatunków roślin (ciecierzycy pospolitej (Cicer arietinum L.), fasoli złotej (Vigna radiata L.) oraz ryżu) po inokulacji izolatem B. cereus S4 pozyskanym z rizosfery trawy Cynodon dactylon (L.) Persoon [Chakraborty i wsp. 2011]. Jha i wsp. [2011] stwierdzili, iż PGPE w większym stopniu indukują odporność systemiczną rośliny niż PGPR. Po inokulacji roślin ryżu endofitycznym szczepem Ps. pseudoalcaligenes odnotowano większy wzrost aktywności enzymu PAL niż po inokulacji rizosferowym izolatem B. subtilis. W badaniach własnych zaobserwowano zróżnicowany wpływ bakterii endofitycznych na aktywność enzymatyczną u rożnych odmian kukurydzy. W doświadczeniach doniczkowych istotny wzrost aktywności enzymu PAL odnotowano we wszystkich badanych obiektach poza odmianą Kosmo230 inokulowaną szczepem Ps. fluorescens PE50. W warunkach polowych inokulacja odmiany Pioneer P8400 mieszaniną szczepów również wpłynęła na wzrost aktywności enzymu PAL w porównaniu do roślin kontrolnych. W podobnych doświadczeniach nad inokulacją roślin endofitycznymi izolatami Pseudomonas uzyskano zbliżone wyniki. Rośliny bawełny, inokulowane endofitycznym Ps. fluorescens Pf1 wykazywały większą aktywność enzymów PAL a także chitynazy i peroksydazy niż rośliny kontrolne [Rajendran i wsp. 2006]. Inokulacja izolatem Ps. fluorescens Pf1 spowodowała wzrost aktywności enzymów związanych z obroną także u roślin pomidora i ostrej papryki [Ramamoorthy i wsp. 2002]. W przypadku drugiego badanego enzymu, peroksydazy gwajakolowej, wzrost aktywności odnotowano w doświadczeniu doniczkowym dla odmiany Cyrkon po zaprawianieniu nasion trzema testowanymi szczepami oddzielnie. Dla odmiany Kosmo230 zaobserwowano ogólny spadek aktywności GPOX po inokulacji badanymi endofitami w porównaniu do roślin kontrolnych, przy czym istotny spadek aktywności GPOX odnotowano po szczepieniu Ps. clemancea PE22. 75

76 Aktywność GPOX uzależniona jest od wielu czynników. Zróżnicowany wpływ czynników biotycznych i abiotycznych na aktywność GPOX w obecności bakterii endofitycznych został opisany w kilku pracach. Wpływ temperatury na aktywność GPOX w obecności endofitycznego izolatu Clavibacter sp. Enf12 zaobserwowali Ding i wsp. [2011]. W przypadku roślin Chorispora bungeana Fisch. & C.A. Mey, inokulowanych endofitycznym izolatem Clavibacter sp. Enf12 i inkubowanych w 0 o C, odnotowano znaczny przyrost aktywności GPOX w porównaniu do roślin nieinokulowanych. Natomiast u roślin inokulowanych i inkubowanych w 20 o C w dniu 2 i 6 odnotowano nieznaczny spadek aktywności enzymatycznej. Na aktywność enzymatyczną GPOX w obecności bakterii endofitycznych ma również wpływ obecność biotycznego czynnika stresogennego. Inokulacja roślin ogórka siewnego (Cucumis sativus L.) endofitycznym izolatem B. thuringensis GS1 nie wpłynęła na aktywność GPOX w porównaniu do roślin kontrolnych. Wzrost aktywności enzymatycznej został zaobserwowany w momencie gdy siewki były inokulowane B. thuringensis GS1 oraz patogenem Rh. solani jednocześnie [Seo i wsp. 2012]. W przypadku roślin ziemniaka Ardanov i wsp. [2011] wykazali, iż inokulacja roślin endofitycznymi izolatami Ps. putida IMBG294 oraz Methylobacterium sp. IMBG290 w obecności patogenicznego szczepu Pectobacterium atrosepticum nie wpłynęła na modyfikacje aktywności peroskydazy gwajakolowej. Wzrost aktywności enzymatycznej został zaobserwowany w momencie, gdy siewki były inokulowane endofitami ale nie wystawione na działanie czynnika stresogennego, tj. szczepu Pec. atrosepticum. Jednocześnie, w przypadku inokulacji roślin izolatem Methylobacterium sp. IMBG290 na indukcję aktywności GPOX miała wpływ gęstość wykorzystanego inokulum. Mechanizmy indukcji odporności systemicznej przez bakterie angażują jasmonidy oraz etylen, jednak wzrost aktywności ISR związany jest ze wzrostem czułości rośliny na te hormony a nie ze wzrostem ich produkcji [Compant i wsp. 2005b]. Aplikacja bakterii endofitycznych może również zwiększać odporność rośliny na biotyczne i abiotyczne czynniki stresogenne poprzez wzmocnienie ścian komórkowych oraz zmianę metabolizmu gospodarza [Compant i wsp. 2005b]. Wyselekcjonowane szczepy Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51 oraz Ps. fluorescens PE50 stymulujące wzrost kukurydzy w doświadczeniach in vitro i wazonowych charakteryzowały się zdolnością do biosyntezy IAA, SA oraz potencjalną zdolnością do wiązania N 2. Ponadto szczepy te zdolne były do 76

77 zahamowania wzrostu przynajmniej jednego z badanych fitopatogenów z rodzaju Fusarium. Przeprowadzone badania sugerują możliwość selekcji bakterii potencjalnie przydatnych w produkcji roślinnej spośród hodowalnych bakterii endofitycznych. Niskie wymagania pokarmowe i potencjalna łatwość namnażania wyselekcjonowanych PGPE z rodzaju Pseudomonas rokują nadzieję na ich wykorzystanie jako biologiczne środki stymulujące wzrost kukurydzy w naszych warunkach klimatycznych. 77

78 6. Wnioski 1. Zidentyfikowano 46 gatunków hodowalnych bakterii endofitycznych kukurydzy, z następujących rodzajów Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brachybacterium, Chryseobacterium, Erwinia, Kocuria Methylobacerium, Microbacterium, Micrococcus, Pedobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Rothia, Shigella, Sphingomonas oraz Staphylococcus. 2. Wśród hodowalnych bakterii endofitycznych kukurydzy dominowały szczepy z rodzaju Pseudomonas. 3. Asocjacie hodowalnych bakterii endofitycznych badanych odmian kukurydzy były specyficzne na poziomie każdej odmiany. 4. Asocjacie hodowalnych bakterii endofitycznych badanych odmian kukurydzy uprawianych w glebie lekko kwaśnej w Smolicach cechowały się większym udziałem szczepów produkujących substancje hamujące wzrost grzybów z rodzaju Fusarium. 5. Stwierdzono, iż ziarniaki kukurydzy odmian KB1902, KB1903, KB2707, Król, Cyrkon oraz Kosmo230 nie są rezerwuarem hodowalnych drobnoustrojów endofitycznych. 6. Związki fenolowe (kwas chlorogenowy, kwas para-kumarowy, kwas ortokumarowy, kwas ferulowy, alkohol koniferylowy) naturalnie występujące w tkankach kukurydzy były wykorzystywane jako jedyne źródło węgla i energii przez część badanych szczepów lub tolerowane w stężeniach większych od naturalnie występujących w sokach komórkowych tego gatunku. 7. Aktywność przeciwgrzybową w stosunku do fitopatogenów in vitro wykazywało łącznie 60 szczepów, wyłącznie z rodzajów Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Chryseobacterium, Erwinia, Methylobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rothia oraz Staphylococcus. 8. Największą aktywność przeciwgrzybową in vitro wykazywał szczep B. methylotrophicus A17 oraz Ar. nicotinovorans A40 odpowiednio w stosunku do F. graminearum IOR1970 oraz F. moniliforme IOR

79 9. Zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia in vitro stwierdzono łącznie u 54 szczepów przedstawicieli wyłącznie rodzajów Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Rothia oraz Staphylococcus. Największą aktywność rozpuszczania fosforanu wapnia wykazywał szczep Ps. marginalis PE Obecność genu nifh została stwierdzona łącznie u 71 szczepów bakterii reprezentujących wyłącznie rodzaje Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brachybacterium, Erwinia, Methylobacterium, Microbacterium, Pedobacter, Pseudomonas, Rothia, Staphylococcus oraz Sphingomonas. 11. Stwierdzono wydzielanie enzymów degradujących polisacharydy roślinne (celulazy, ksylanazy, pektynazy) oraz proteaz jedynie u 25 szczepów, głównie z rodzaju Pseudomonas. 12. Większość spośród badanych 36-ciu endofitycznych szczepów bakterii nie miała wpływu na rozwój siewek macierzystych odmian kukurydzy w doświadczeniu in vitro. Jedynie dwa szczepy Ps. clemancea PE22 oraz Ps. migulae A51 w doświadczeniu in vitro stymulowały wzrost siewek odmiany macierzystej Cyrkon a szczep Ps. fluorescens PE50 stymulował wzrost siewek odmiany macierzystej Kosmo Szczepy stymulujące wzrost kukurydzy Ps. clemancea PE22, Ps. migulae A51, Ps. fluorescens PE50 zdolne były do produkcji kwasu indolilo-3-octowego oraz salicylowego. 14. Zaprawianie nasion kukurydzy szczepami Ps. clemancea PE22, Ps. fluorescens PE50 oraz Ps. migulae A51 spowodowało wzrost aktywności enzymu PAL w tkankach odmian Cyrkon i Kosmo

80 7. Piśmiennictwo 1. Afzal A.J., Wood A.J., Lightfoot D.A Plant receptor-like serine threonine kinases: roles in signaling and plant defense. Mol. Plant. Microbe. Interact. 5: Alharbi S.A In vitro mineral transformations by the human pathogens Staphylococcus aureus and Candida albicans. J. Food. Agr. Environ. 7(2): Andria V., Reichenauer T., Sessitsch A Expression of alkane monooxygenase (alkb) genes by plant-associated bacteria in the rhizosphere and endosphere of Italian ryegrass (Lolium multiflorum L.) grown in diesel contaminated soil. Environ. Pollut. 157: Ardanov P., Ovcharenko L., Zaets I., Kozyrovska N., Pirttilä A.M Endophytic bacteria enhancing growth and disease resistance of potato (Solanum tuberosum L.). Biol. Control. 56: Babalola O.O., Osir E.O., Sanni A.I., Odhiambo G.D., Bulimo W.D Amplification of 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic (ACC) deaminase from plant growth promoting rhizobacteria in Striga-infested soil. African. J. Biotechnol. 2(6): Babu-Khan S., Chia Yeo T., Martin W.L., Duron M.R., Rogers R.D., Goldstein A.H Cloning of a mineral phosphate-solubilizing gene from Pseudomonas cepacia. Appl. Environ. Microbiol. 61(3): Bacilio-Jimenez M., Aguilar-Flores S., Ventura-Zapata E., Perez-Campos E., Bouquelet S., Zenteno E Chemical characterization of root exudates from rice (Oryza sativa) and their effects on the chemotactic responses of endophytic bacteria. Plant Soil. 249: Baker A.J.M., Brooks R.R Terrestrial higher plants which hyperacumulate metallic elements a review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery. 1: Baker K.F., Smith S.H Dynamics of seed transmission of plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 14:

81 10. Barac T., Taghavi S., Borremans B., Provoots A., Oeyen L., Colpaert J.V., Vangronsveld J., Van Der Lelie D Engineered endphytic bacteria improved phyto-remediation of water-soluble, volatile, organic pollutants. Nat. Biotechnol. 22: Barak J.D., Gorski L., Naragi-Arani P., Charkowski A.O Salmonella enterica genes are required for bacterial attachment to plant tissue. Appl. Environ. Microbiol. 71: Belimov A.A., Dodd I.C., Safronova V.I., Hontzeas N., Davies W.J Pseudomonas brassicacearum strain Am3 containing 1-aminocyclopropane-1- carboxylate deaminase can show both pathogenic and growth-promoting properties in its interaction with tomato. J. Exp. Bot. 58(6): Benhamout N., Belanger R.R., Paulitz T Ultrastructutal and cytochemical aspects of the interaction between Pseudomonas fluorescens and Ri T-DNA transformed pea roots: host response to colonization by Pythium ultimum Trow. Planta. 199: Bhore S.J., Nithya R., Loh C.Y Screening of endophytic bacteria isolated from leaves of Sambung nyawa [Gynura procumbens (Lour.) Merr.] for cytokininlike compounds. Bioinformation. 5(5): Birs A. br. Identification of key enzymes in the phenolic degradation pathway of Lactobacillus johnsonii N6.2. Praca magisterska, University of Florida 16. Blaha D., Prigent-Combaret C., Mirza M.S., Moenne-Loccoz Y Phylogeny of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase encoding gene acds in phytobeneficial and pathogenic Proteobacteria and relation with strain biogeography. FEMS Microbiol. Ecol. 56: Blum U., Staman K.L., Flint L.J., Shafer S.R Induction and/or selection of phenolic acid-utilizing bulk-soil and rhizosphere bacteria and their influence on phenolic acid phytotoxicity. J. Chem. Ecology. 26(9): Bruinsma J The quantitative analysis of chlorophylls a and b in plant extracts. Photochem. Photobiol. 2: Brooks D.S., Gonzalez C.F., Appel D.N., Filer T.H Evaluation of endophytic bacteria as potential biocontrol agents for oak wilt. Biol. Control. 4:

82 20. Caballero-Mellado J., Onofre-Lemus J., Estrada-de los Santos P., Martinez- Aguilar L The tomato rhizosphere, an environment rich in nitrogen-fixing Burkholderia species with capabilities of interest for agriculture and phytoremediation. Appl. Environ. Microbiol. 73(16): Cankar K., Kraigher H., Ravnikar M., Rupnim M Bacterial endophytes from seeds of Norway spruce (Picea abies L. Krast). FEMS Microbiol. Lett. 244: Chakraborty U., Roy S., Chakraborty A.P., Dey P., Chakraborty B Plant growth promotion and amelioration of salinity stress in crop plants by a salttolerant bacterium. Res. Res. Scien. Tech. Biochemistry 3(11): Chance B., Maehly S.K Assay of catalase and peroxidases. Meth. Enzymol. 2: Chandrashekhara, Niranjanraj S., Deepak S.A., Amruthesh K.N., Shetty N.P., Shetty H.S Endophytic bacteria from different plant origin enhance growth and induce downy mildew resistance in pearl millet. Asian J. Plant Pathol. 1: Charest M.H, Beauchamp C.J., Antoun H Effects of the humic substances of de-inking paper sludge on the antagonism between two compost bacteria and Pythium ultimum. FEMS Microbiol. Ecol. 52: Chaudhary H.J., Peng G., Hu M.,He Y., Yang L., Luo Y., Tan Z Genetic diversity of endophytic diazotrophs of the wild rice, Oryza alta and identification of the new diazotroph, Acinetobacter oryzae sp. nov. FEMS Microb. Ecol. 63: Chen C., Bauske E.M., Mussion G., Rodriquez-Kabana R., Kloepper J.W Biological control on Fusarium wilt on coton by use of endophytic bacteria. Biol. Control. 5: Chen Y.P., Rekha P.D., Arun A.B., Shen F.T., Lai W.-A.,Young C.C Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Appl. Soil Ecol. 34: Cho S.J., Park S.R., Kim M.K., Lim W.J., Ryu S.K., An C.L., Hong S.Y., Lee Y.H., Jeong S.G., Cho Y.U., Yun H.D Endophytic Bacillus sp. isolated from the interior of ballon flower root. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:

83 30. Cho K.M., Hong S.Y., Lee S.M., Kim Y.H., Kahng G.G., Lim Y.P., Kim H., Yun H.D Endophytic bacterial communities in Ginseng and their antifungal activity against pathogens. FEMS Microbiol. Ecol. 54: Compant S., Reiter B., Sessitsch A., Nowak J., Clement Ch., Barka E.A Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by plant growth promoting bacterium Burkholderia sp. stain PsJN. Appl. Environ. Microbiol. 71: Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement Ch., Barka E.A. 2005b. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71(9): Compant S., Reiter B., Sessitsch A., Nowak J., Clement Ch., Barka E. A Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Burkholderia phytofirmans stain PsJN: from the rhizosphere to inflorescence tissues. FEMS Microbiol. Ecol. 63: Coombs J.T., Franco C.M.M Isolation and identification of actinobacteria isolated from surface-sterilized wheat roots. Appl. Environ. Microbiol. 69: Cueva C., Moreno-Arribas M.V., Martín-Álvarez P.J., Bills G., Vicente M.F., Basilio A., Lopez Rivas C., Requena T., Rodríguez J.M., Bartolome B Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Res. Microbiol. 161(5): De Meyer G., Hofte M Salicylic acid produced by the rhizobacterium Pseudomonasa eruginosa 7NSK2 induces resistance to leaf infection by Botrytis cinerea on bean. Phytopathol. 87(6): De Matos Nogueira E., Vinagre F., Masuda H.P., Vargas C., De Padua V.L.M., Da Silva F.R., Dos Santos R.V., Baldani J.I., Gomes Ferreira P.C., Hemerley A.S Expression of sugarcane genes induced by inoculation with Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum rubrisubalbicans. Genet. Mol. Biol 24: Desnoues N., Lin M., Guo X., Ma L., Carreno-Lopez R., Elmerich C Nitrogen fixation genetics and regulation in a Pseudomonas stutzeri strain associated with rice. Microbiology 149:

84 39. De Souza A.O., Pamphile A., De Mello Sartori C.L., Da Rocha C, Azevedo J.L Plant-microbe interactions between maize (Zea mays L.) and endophytic microorganisms observed by scanning electron microscopy. Acta Scientiarum, Biol. Sci. 26: Ding S., Huang C.L., Sheng H.M., Song C.L., Li Y.B., An L.Z Effect of inoculation with the endophyte Clavibacter sp. strain Enf12 on chilling tolerance in Chorispora bungeana. Physiologia Plantarum. 141: Dix N.J., Webster J Fungal ecology. London, Glasgow, Weinheim, new York, Tokyo, Melbourne, Madras: Chapman Hall, s Dong Z., Canny M.J., McCully M.E., Roborendo M.R., Cabadilla C.F., Ortega E., Rodes R A nitrogen fixing endophyte of sugarcane stems. Plant Physiol. 105: Doty S.L., Oakley B., Xin G., Kang J.W., Singelton G., Khan Z., Vajzovic A., Staley J.Y Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis 47: Dowling D.N., O'Gara F Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease. Trends Biotechnol. 12(4): Drapeau R., Fortin J.A., Gagnon C Antifungal activity of Rhizobium. Can. J. Bot. 51: Elbeltagy A.,Nishioka K., Suzuki H., Sato T., Sato Y., Morisaki H., Mitsui H., Minamisawa. K Isolation and characterization of endophytic bacteria from wild and traditionally cultivated rice varieties. Soil Sci. Plant Nutr. 46: Faria D.C., Dias A.C.F., Melo I.S., de Carvalho Costa F.E Endophytic bacteria isolated from orchid and their potential to promote plant growth. World J. Microbiol. Biotechnol. on line DOI /s Fernandez M.A., García M.D., Saenz M.T Antibacterial activity of the phenolic acids fractions of Scrophularia frutescens and Scrophularia sambucifolia. J. Ethnopharmacol. 53(1): Ferreira A., Quecine M.C., Lacava P.T., Oda S., Azevedo J.L., Araujo W.L Diversity of endophytic bacteria from Eucalyptus species seeds and colonization of seedlings by Pantoea agglomerans. FEMS Microbiol. Lett. 287: Fisher P.J., Retrini O., Scott H.M.L The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize (Zea mays L.). New Phytol. 122:

85 51. Forchetti G., Masciarelli O., Alemano S., Alvarez D., Abdala G Endophytic bacteria in sunflower (Helianthus annuus L.): isolation, characterization, and production of jasmonates and abscisic acid in culture medium. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: Forchetti G., Masciarelli O., Izaguirre M.J., Alemano S., Alvarez D., Abdala G Endophytic bacteria improve seedling growth of sunflower under water stress, produce salicylic acid, and inhibit growth of pathogenic fungi. Curr. Microbiol. 61: Freitas H., Prasad M.N.V., Pratas J Analysis of serpentinophytes from north-east of Portugal for trace metal accumulation relevance to the management of mine environment. Chemosphere. 54: Gagne S., Richard C., Lousseau H., Btoun H Xylem residing bacteria in alfalfa roots. Can. J. Microbiol. 33: Gałązka A., Król M., Perzyński A., Wykorzystanie kwasów fenolowych jako jedynego źródła węgla przez bakterie z rodzaju Azospirillum wiążące azot. Nauka Przyr. Technol. 4(6): Garbeva P., Van Overbeek L.S., Van Vuurde J.W.L., Van Elsas J.D Analysis of endophytic bacterial communities of potato by plating and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of 16S rdna based PCR fragments. FEMS Microbiol. Ecol. 41: Germaine K., Liu X., Cabellos G., Hogan J., Ryan D., Dowling D.N Bacterial endophyte-enhanced phyto-remediation of the organochlorine herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. FEMS Microbiol. Ecol. 57: Glick B.R., Todorovic B., Czarny J., Cheng Z., Duan J Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase. Crit. Rev. Plant Sci. 26: Głażewska-Maniewska R., Maciejewska A., Melech A Occurrence of soil bacteria of Arthrobacter ssp. genus on winter rye plantation, and their enzymatic and antagonistic activity. Acta Sci. Pol., Agricultura. 3(1): Godinho A., Ramesh R., Bhosle S Bacteria from sand dunes of Goa promoting growth in eggplant. World J. Agricultural Sci. 6(5): Gontia I., Kavita K., Schmid M., Hartmann A., Jha B Brachybacterium saurashtrense sp. nov., a halotolerant root-associated bacterium with plant growth-promoting potential. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61:

86 62. Gordon A.H., Weber R.P Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol. 26: Gottlieb M Czynniki determinujące zdolność bakterii z rodzaju Pseudomonas do kolonizacji systemu korzeniowego roślin. Post. Mikrobiol. 41: Gtari M., Ghodhbane-Gtari F., Nouioui I., Beauchemin N., Tisa L.S Phylogenetic perspectives of nitrogen-fixing actinobacteria. Arch. Microbiol. 194: Gurjao de Carvalho T.L., Ferreira P.C.G., Hemerly A.S Sugarcane genetic controls involved in the association with beneficial endophytic nitrogen fixing bacteria. Tropical Plant Biol. 4: Hallmann J., Quadt-Hallman A., Mahaffee W.F., Kloepper J.W Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43: Hallmann J Plant interactions with endophytic bacteria. Biotic interactions in plant-pathogen association, Jeger M.J., Spence N.J. (eds.) CAB International Hardoim P.R., Van Ovebeek L.S., Van Elsas J.D Properties of bacterial endophytes and their role in plant growth. Trends Mircobiol. 16; Hardoim P.R., Hardoim C.C.P., Van Ovebeek L.S., Van Elsas J.D Dynamics of Seed-borne rice endophytes on early plant growth stages. PlosOne 7(2):e30438 on line. 70. Harish S., Kavino M., Kumar N., Saravanakumar D., Soorianathasundaram K., Samiyappan R Biohardening with plant growth promoting rhizosphere and endophytic bacteria induces systemic resistance against Banana bunchy top virus. Appl. Soil Ecology 39: Hatayama K., Kawai S., Shoun H., Ueda Y., Nakamura A Pseudomonas azotifigens sp. nov., a novel nitrogen-fixing bacterium isolated from a compost pile. Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 55: Holliday P A Dictionary of Plant Pthology, Cambridge University Press, Cambridge. 86

87 73. Huddedar S.B., Gore S.D., Chopade B.A Studies on distribution and characterization of Acinetobacter genospecies isolated from rhizosphere of wheat exhibiting antifungal and antibacterial activity. Proceedings of International Conference on Microbial Biotechnology, Trade and Public Policy, Hyderabad, India. Str Hung P.Q., Annapurna K Isolation and characteryzation of endophytic bacteria in soybean (Glicine sp.). Omornice. 12: Hurek T., Reinhold-Hurek B., Van Montagu M., Kellenberger E Root colonization and systemic spreeding of Azoarcus sp. stain BH72 in grasses. J. Bacteriol. 176: Jacobs M.J., Bugbee W.M., Gabrielson D.A.,1985, Enumeration, location and characterization of endophytic bacteria within sugar beet roots. Can. J. Botany 63: James D.W., Suslow T.V., Steinback K.E Relationship between rapid, firm adhesion and long-term colonization of roots by bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 50: James E.K., Reis V.M., Olivares F.L., Baldini J.L., Dobereiner J Infection of sugarcane by the nitrogenfixing bacterium Acetobacter diazothropus. J. Exp. Bot. 45; James E.K.,Gyaneshwar P., Mathan N., Barraquio W.L., Reddy P.M., Iannetta P.P., Olivares F.L., Ladha J.K Infection and colonization or rice seedlings by the plant growth-promoting bacterium Herbaspirillum seropedicae Z67. Mol. Plant- Microbe Interact. 15; Jha Y.,Subramanian R.B., Patel S Endophytic bacteria induced enzymes against M. grisea in O. satavia under biotic stress. African J. Basic & Appl. Science 3(4): Jha B., Gontia I., Hartmann A The roots of the halophyte Salicornia brachiata are a source of new halotolerant diazotrophic bacteria with plant growth-promoting potential. Plant Soil. 356: Johnston-Monje D., Raizada M.N Conservation and diversity of seed associated endophytes in Zea across boundaries of evolution, ethnography and ecology. PlosOne 6(6):e20396 on line. 87

88 83. Jourand P., Giraud E., Bena G., Sy A., Willems A., Gillis M., Dreyfus B., de Lajudie P Methylobacterium nodulans sp. nov., for a group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume root-nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria. Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 54: Kado C.I Plant pathogenic bacteria. In: The Prokaryotes, edited by Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.H., Springer-Verlag, New York, Kaga H., Mano H., Tanaka F., Watanabe A., Kaneko S., Morisaki H Rice seeds as a sources of endophytic bacteria. Microbes Environ. 24: Kamala-Kannan S., Lee K.J., Park S.M., Chae J.C., Yun B.S., Lee Y.H., Park Y.J., Oh B.T Characterization of ACC deaminase gene in Pseudomonas entomophila strain PS-PJH isolated from the rhizosphere soil. J. Basic Microbiol. 50(2): Kapoor R., Ruchi, Kumar A., Kumar A., Patil S., Pratush A., Kaur M Indole acetic acid production by fluorescent Pseudomonas isolated from the rhizospheric soils of Malus and Pyrus. Rec. Res. Sci. Tech. 4(1): Karnwal A Production of indole acetic acid by fluorescent Pseudomonas in the presence of l-tryptophan and rice root exudates. J. Plant Pathol. 91(1): Kelemu S., Fory P., Zuleta C., Ricaurte J., Rao I., Lascano C Detecting bacterial endophytes in tropical grasses of the Brachiaria genus and determining their role in improving plant growth. African J. Biotechnol. 10(6): Khakipour N., Khavazi K., Mojallali H., Pazira E., Asadirahmani H Production of auxin hormone by florescent Pseudomonas. American-Eurasian J. Agric.&Environ. Sci. 4(6): Khammas K.M., Kaiser P Characterization of a pectinolytic activity in Azospirillum irakense. Plant Soil. 137: Khan Z., Doty S.L Characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants. Plant Soil. 322: Klama J Współżycie endofitów bakteryjnych z roślinami (artykuł przeglądowy). Acta Scient. Polon. 31: Kobayashi D.Y., Palumbo J.D Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture, In: C.W. Bacon i J.F. White (ed.), Microbial Endophytes. Marcel Dekker, Inc., New York,

89 95. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into plant tissues. Plant Soil. 215: Król M.J., Zielewicz-Dukowska J Genetyczne aspekty wiązania N 2 bakterii z rodzaju Azospirillum. Post. Mikrobiol. 44: Kuklinsky-Sorbal J., Araujo W.L., Mendes R., Geraldi I.O., Pizzirani-Kleiner A.A., Azevedo J.L., 2004, Isolation and characterization of soybean assocaited bacterial and their potential for plant growth promotion. Environ. Microbiol. 6: Lalande R., Bissonnette N., Coutlee D., Antoun H Identification of rhizobacteria from maize and determination of their plant-growth promoting potential. Plant Soil. 115: Latha S., Mahadevan A Role of rhizobia in the degradation of aromatic substances. World J. Microbiol. Biotechnol. 13: Larran S., Perello A., Simon M.R., Moreno V Isolation and analysis of endophytic microorganisms in wheat (Triticum aestivum L.). Worl J. Microbiol. Biotechnol. 18: Leisinger T., Margraff R Secondary metabolites of the fluorescent Pseudomonads. Microbiol. Rev. 43(3): Leon M., Yaryura P.M., Montecchia M.S., Hernandez A.I., Correa O.S., Pucheu N.L., Kerber N.L., Garcıa A.F Antifungal activity of selected indigenous Pseudomonas and Bacillus from the soybean rhizosphere. Int. J. Microbiol. ID , doi: /2009/ on line Li C.Y., Massicote H.B., Moore L.V.H Nitrogen-fixing Bacillus sp. associated with Douglas-fir tuberculate ectomycorrhizae. Plan Soil. 140: Li J., Zhao G.Z, Chena H.H, Qina S., Xua L.H., Jiang C.L., Li W.J Rhodococcus cercidiphylli sp. nov., a new endophytic actinobacterium isolated from a Cercidiphyllum japonicum leaf. Sys. Appl. Microbiol. 31: Li H., WangX., Han M., Zhao Z., WangM., Tang Q., Liu C., Kemp B., Gu Y., Shuang J., Xue Y Endophytic Bacillus subtilis ZZ120 and its potential application in control of replant diseases. African J. Biotechnol. 11(1): Ligon J.M., Hill D.S., Hammer P.E., Torkewitz N.R., Hofmann D., Kempf H.J., van Pee K.H Natural products with antifungal activity from Pseudomonas biocontrol bacteria. Pest. Manag. Sci. 56:

90 107. Lin L., Guo W., Xing Y., Zhang X., Li Z., Hu Ch., Li S., Li Y., An Q The actinobacterium Microbacterium sp. 16SH accepts pbbr1-based pprobe vectors, forms biofilms, invades roots, and fixes N 2 associated with micropropagated sugarcane plants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93: LiPuma J.J Burkholderia cepacia complex as human pathogen. J. Nematology. 35: Liu Y., Zuo S., Xu L., Zou Y., Song W Study on diversity of endophytic bacterial communities in seeds of hybrid maize and their parental lines. Arch Microbiol. doi: /s On line Liu C.H., Chen X., Liu T.T., Lian B., Gu Y., Caer V., Xue Y.R., Wang B.T Study of the antifungal activity of Acinetobacter baumannii LCH001 in vitro and identification of its antifungal components. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: Long H.H., Furuya N., Kurose D., Tekashita M., Takanami Y Isolation of endophytic bacteria from Solanum sp. and their antibacterial activity against plant pathogenic bacteria. J. Fac. Agric. Kyushu Univ. 48: Long H.H., Furuya N., Kurose D., Yamamoto I., Takeshita M., Takanami Y Identification of the endophytic bacteria isolates and their in vitro and in vivo antagonism against Ralstonia solanacearum. J. Fac. Agric. Kyushu Univ. 49(2): Long H.H., Schmidt D.D., Baldwin I.T Native bacterial endophytes promote host growth in a species-specyfic manner, phytohormone manipulations do not result in common growth responses. PLoS ONE. 3: e2702 on line Lynch J.M Soil Biotechnology: Microbiological factors in crop productivity, Blackwell Sci. Publ. Ltd., Oxford Ma Y., Rajkumar M., Luo YM., Frietas H Inoculation of endophytic bacteria on host and non-host plants Effects on plant growth and Ni uptake. J. Hazardous Material 195: Madhaiyan M., Poonguzhali S., Senthilkumar M., Seshadri S., Chung H., Yang J., Sundaram J., Sa T Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp. Bot. Bull. Acad. Sin. 45:

91 117. Madhaiyan M., Poonguzhali S Metal tolerating methylotrophic bacteria reduces nickel and cadmium toxicity and promotes plant growth of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Chemosphere. 69: Maksimovic J.D., Maksimovic V., Zivanovic B., Sukalovic V.H.T., Vuletic M Peroxidase activity and phenolic compounds content in maize root and leaf apoplast, and their association with growth. Plant Science. 175: Mandal S.M., Chakraborty D., Dey S Phenolic acids act as signaling molecules in plant-microbe symbioses. Plant Signal Behav. 5(4): Martinez-Morales L.J., Soto-Urzua L., Baca B.E., Schanchez-Ahedo A Indole-3-butyric acid (IBA) production in culture medium by wild stain Azospirillum brasilenese. FEMS Micriobiol. Lett. 228: Mastretta Ch., Taghavi S., Van Der Lelie D., Mengoni A., Galardi F., Gonnelli Ch., Barac T., Boulet J., Weyens N., Vangronsveld J Endophytic bacterium from seeds of Nicotiana tabacum can reduce cadmium phytotoxicity. Int. J. Phytoremediation. 11: McInroy J.A., Kloepper J.W. 1995a. Population dynamic of endophytic bacteria in field-grown sweet corn and cotton. Can. J. Microbiol. 41: McInroy J.A., Kloepper J.W. 1995b. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. Plant Soil. 173: Mehnaz S., Wesolowski B., Lazarovits G Azospirillumm canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: Meyer J.M., Adballah M.A The fluorescent pigment of Pseudomonas fluorescens: biosynthesis, purification and physicochemical properties. J. Gen. Microbiol. 107: Meyer J.M., Azelvandre, P., and Georges, C Iron metabolism in Pseudomonas: salicylic acid, a siderophore of Pseudomonas fluorescens CHA0. BioFactors. 4: Mercado-Blanco J., Van Der Drift K.M.G.M., Olsson P.E., Thomas-Oates J.E., Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M Analysis of the pmsceab gene cluster involved in biosynthesis of salicylic acid and the siderophore pseudomonine in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS374. J. Bacteriol. 183(6):

92 128. Michiels K.W., Croes C.L, Vanderleyden J Two different models of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots. J. Gen. Microbio. 137: Mohammadi K Phosphorus solubilizing bacteria: occurrence, mechanisms and their role in crop production. Resources Environment 2(1): Mundt J.O., Hinkle N.F Bacterial within ovules and seeds. Appl. Environ. Microbiol. 32: Muthukumarasamy R., Revathi G., Seshadri S., Lakshminarasimhan C Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics. Current Science. 83(2): Nakkeeran S., Kavitha K., Chandrasekar G., Renukadevi P., Fernando W.G.D Induction of plant defence compounds by Pseudomonas chlororaphis PA23 and Bacillus subtilis BSCBE4 in controlling damping-off of hot pepper caused by Pythium aphanidermatum. Biocontrol Sci. Technol. 16(4): Nandakumar R., Babu S., Radjacommare R., Raguchander T., Samiyappan R Pseudomonas fluorescens mediated antifungal activity against Rhizoctonia solani causing sheath blight in rice. Phytopathol. Mediterr. 41: Nautiyal C.S An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol. Lett. 170: Nejad P., Johnson P.A Endophytic bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression in oilseed rape and tomato. Biol. Control. 18: Nissinen R.M., Mannisto M.K., Van Elsas J.D Endophytic bacterial communities in three arctic plants from low arctic fell tundra are cold-adapted and host-plant specific. FEMS Microbial Ecol Olivares F.L., Baldani V.L.D., Reis V.M., Baldani J.L., Dobereiner J Occurrence of the endophyic diazotrophs Herbaspirillum spp. in roots, stems, and leaves, predominantly of gramineae. Biol. Fertil. Soil. 21: Oksińska M.P., Wright S.A.I., Pietr S.J Colonization of wheat seedlings (Triticum aestivum L.) by strains of Pseudomonas spp. with respect to their nutrient utilization profiles. Eur. J. Soil Biol. 47: Parani K., Saha B.K Prospects of using phosphate solubilizing Pseudomonas as bio fertilizer. Eur. J. Biol. Sci. 4(2):

93 140. Park M.S., Jung S.R., Lee M.S., Kim K.O., Do J.O., Lee K.H., Kim S.B., Bae K.S Isolation and characterization of bacteria associated with two sand dune plant species, Calystegia soldanella and Elymus mollis. J. Microbiol. 43(3): Park M.S., Jung S.R., Lee K.H., Lee M.S., Do J.O., Kim S.B., Bae K.S Chryseobacterium soldanellicola sp. nov. and Chryseobacterium taeanense sp. nov., isolated from roots of sand-dune plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: Peltonen S., Karjalainen R., Phenyloalanine ammonia-lyase activity in barley after infection with Bipolaris sorokiniana or treatment with its purified xylanase: J. Phytopathol. 143: Peterson C.A., Emanuel M.E., Humphreys G.B Pathways of movement of apoplastic fluorescent dye tracers through the endodermis at the site of secondary root formation in corn and broad bean. Can. J. Bot. 59: Phillips D.A., Tsai S.M Flavonoids as plant signals to rhizosphere microbes. Mycorrhiza. 1: Piccoli P., Travaglia C., Cohen A., Sosa L., Cornejo P., Masuelli R., Bottini R An endophytic bacterium isolated from roots of the halophyte Prosopis strombulifera produces ABA, IAA, gibberellins A1 and A3 and jasmonic acid in chemically-defined culture medium. Plant Growth Regul. 64: Pietr S Wpływ saprofitycznej mikroflory ryzosfery na wzrost roślin. Post. Nauk Rol. 3: Poorniammal R., Sundaram S.P., Kumutha K In vitro biocontrol activity of Methylobacterium extorquens against fungal pathogens. Int. J. Plant Prot. 2(1): Prieto P., Schiliro E., Mercedes Maldonado-Gonzalez M., Valderrama R., Bautista Barroso-Albarracin J., Mercado-Blanco J Root hairs play a key role in the endophytic colonization on olive roots by Pseudomonas spp. with biocontrol activity. FEMS Microb. Ecol. 62: Puente M.E., Li C.Y., Bashan Y Enophytic bacteria in cacti seeds can improve the development of cactus seedlings. Eniron. Experiment. Botany 66:

94 150. Quadt-Hallmann A., Hallmann J., Kloepper J.W Bacterial endophytes in cotton: location and interaction with other plant-associated bacteria. Can. J. Microbiol. 43: Quadt-Hallmann A., Benhamou N., Kloepper J.W. 1997b Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant. Can. J. Microbiol. 43: Rai R., Dash P.K., Prasanna B.M Endophytic bacteral flora in the stem tissue of tropical maize (Zea mays L.) genotype: isolation, identyfication and enumeration. World J. Microbiol. Biotechnol. 23: Rajendran L., Saravanakumar D., Raguchander T., Samiyappan R Endophytic bacterial induction of defence enzymes against bacterial blight of cotton. Phytopathol. Mediterr. 45: Ramamoorthy V., Raguchander T., Samiyappan R Enhancing resistance of tomato and hot pepper to Pythium diseases by seed treatment with fluorescent pseudomonads. Eur. J. Plant Pathol. 108: Ramesh R., Joshi A.A., Ghanekar M.P Pseudomonas: major antagonistic endphytic bacteria to suppress bacterial wilt pathogen, Ralstonia solanacearum in the eggplant. World J. Microbiol. Biotechnol. 25: Ran L.X., Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M., No role for bacterially produced salicylic acid in rhizobacterial induction of systemic resistance in Arabidopsis. Biological Control. 95(11): Reinhold-Hurek B., Hurek T Life in grasses: diazotrophic endophytes. Trends Micorbiol. 6: Reinhold-Hurek B., Maes T., Gemmer S., Van Montagu M., Hurek T An endoglucanase is involved in infection of rice roots by the not-cellulosemetabolizing endophyte Azoarcus sp. stain BH72. Mol. Plant-Microbe Interact. 19: Reiter B., Pfeifer U., Schwab H., Sessitsch A Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia carotowora subsp. atrospetica. Appl. Environ. Microbiol. 68: Reuhs B.L., Relic B., Forsberg L.S., Marie C., Ojanen-Reuhs T., Stephens S.B., Wong C.H., Jabbouri S., Broughton W.J Structural characterization of flavonoid-inducible Pseudomonas aeruginosa a-band-like O antigen of Rhizobium sp. stain NGR234, required for the formation of nitrogen-fixing nodules. J. Bacteriol. 187:

95 161. Rijavec T., Lapanje A., Dermastia M., Rupnik M Isolation of bacterial endophytes from germinated maize kernels. Can. J. Microbiol. 53: Rivas R., Trujillo M.E., Sanchez M., Mateos P.F., Martynez-Molina E., Velazquez E Microbacterium ulmi sp. nov., a xylanolytic, phosphate-solubilizing bacterium isolated from sawdust of Ulmus nigra. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: Rodriguez H., Fraga R Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnol. Adv. 17: Rodrigues E.P., Rodrigues L.S., Martinez de Oliveira A.L., Baldani V.L.D., Dos Santos Teixeira K.R., Urquiaga S., Reis V.M Azospirillum amazonense inoculation: effects on growth, yield and N 2 fixation of rice (Oryza sativa L.). Plant Soil. 302: Roncato-Maccari L.D.B., Ramos H.J.O., Pedrosa F.O., Alquini Y., Chubatsu L.S., Yates M.G., Rigo L.U., Steffens M.B.R., Souza E.M Endophytic Herbaspirillum seropedicae express nif genes in gramineous planst. FEMS Microbiol. Ecol. 45: Rosenbleuth M., Martinez-Romero E Bacterial endophytes and their interaction with host. Mol. Plant-Microbe Interact. 19: Rouws L.F.M., Meneses C.H.S.G., Guedes H.V., Vadil M.S., Baldani J.I., Schwab S Monitoring the colonization of sugarcane and rice plants by the endophytic diazotrophic bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus marked with gfp and gusa reported genes. Lett. Appl. Microbiol. 5: Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett. 278: Rylo Sona Janarthine S., Eganathan P Plant Growth promoting of endophytic Sporosarcina aquimarina SjAM16103 isolated from the pneumatophores of Avicennia marina L. Int. J. Microbiol. ID , Doi: /2012/ on line Sachdev D.P., Agarwal V.A., Verma P., Shouche Y.S., Dhakephalkar P.K., Chopade B.A Assessment of microbial biota associated with rhizosphere of wheat (Triticum aestivum) during flowering stage and their plant growth promoting traits. Internet J. Microbiol. 7(2) on line. 95

96 171. Sachdev D., Nema P., Dhakephalkar P., Zinjarde S., Chopade B Assessment of 16S rrna gene-based phylogenetic diversity and promising plant growth-promoting traits of Acinetobacter community from the rhizosphere of wheat. Microbiol. Res. 165: Saravanakumar D., Samiyappan R ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline resistance in groundnut (Arachis hypogea) plants. J. Appl. Microbiol. 102(5): Saravanan V.S., Madhaiyan M., Thangaraju M Solubilization of zinc compounds by the diazotrophic, plant growth promoting bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Chemosphere. 66: Schultz B., Boyle C The endophytic continuum. Mycol. Res. 109: Schulz B., Boyle C., Sieber T Soil Biology, Volume 9: Microbial root endophytes. Wyd. Spinger Verlag Berlin, Schultze M., Kondorosi A The role of lipochitooligosaccharides in root nodule organogenesis and plant cell growth. Curr Opin Genet Dev. 6(5): Seo W.T., Lim W.J., Kim E.J., Yun H.D., Lee J.H., Cho K.M Endophytic bacterial diversity in the young radish and their antimicrobial activity against pathogens J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 53(4): Seo D.J., Nguyen D.M., Song Y.S., Jung W.J Induction of defense response against Rhizoctonia solani in cucumber plants by endophytic bacterium Bacillus thuringiensis GS1. J. Microbiol. Biotechnol. 22(3): Shawn L.J Perception and modification of plant flavonoid signals by rhizosphere microorganisms. Environ. Microbiol. 8: Sheng X.F., Xia J.J., Jiang C.Y., He L.Y., Qian M Characterization of heavy metal-resistant endophytic bacteria from rape (Brassica napus) roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape. Environ. Pollut. 156: Shi Y., Lou K., Li Ch Promoting of plant growth by phytohormoneproducing endophytic microbes of sugar beet. Biol. Fertil. Soil. 45: Shi Z., Lou K., Li C Growth and photosynthetic efficiency promotion of sugar beet (Beta vulgaris L.) by endophytic bacteria. Photosynth. Res. 105: Shi Z., Lou K., Li C Growth promotion effects of the endophyte Acinetobacter johnsonii strain 3-1 on sugar beet. Symbiosis. 54:

97 184. Soltani A.A., Khavazi K., Asadi-Rahmani H., Alikhani H.A., Omidvari M.,Dahaji P.A Evaluation of biological control traits in some isolates of fluorescent Pseudomonads and Flavobacterium. J. Agr. Sci. 4(1): Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol. Rev. 31(4): Stanier R.Y., Palleroni N.J., Doudoroff M The aerobic pseudomonads : a taxonomic study. J. Gen. Microbiol. 43: Steenhoudt O., Vanderleyden J Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 24: Strobel G.A Endophytes as sources of bioactive products. Microbes Infect. 5: Strobel G., Daisy B., Castillo U., Harper J Natural products from endophytic microorganisms. J. Nat. Prod. 67: Sundman V A Description of some lignanolytic soil bacteria and their ability to oxidize simple phenolic compounds. J. Gen. Microbiol. 36: Sturz A.V., Christie B.R., Matheson B.G., Arsenault W.J., Buchanan N.A Endophytic bacteria communities in the periderma of potato tubers and their potential to improve resistance to soil borne plant pathogens. Plant Pathol. 48: Sturz A.V., Christie B.R., Mathenson B.G., Nowak J Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover noudles, roots, stems and foliage and their influence on host growth. Biol. Fertil. Soil. 25: Surette M.A., Sturz A.V., Lada R.R.., Nowak J., 2003, Bacterial endophytes in processing carrots (Daucus carota L. var. sativus): Their localization, population density, biodiversity and their effects on plant growth. Plant Soil. 253: Toklikishvili N., Dandurishvili N., Vainstein A., Tediashvili M., Giorgobiani N., Lurie S., Szegedi E., Glick B.R., Chernin L Inhibitory effect of ACC deaminase-producing bacteria on crown gall formation in tomato plants infected by Agrobacterium tumefaciens or A. vitis. Plant Pathol. 59: Thomas P., Soly T.A Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana (Musa sp.) cv. Grand Naine and the affinity of endophytes to the host. Microb. Ecol. 58:

98 196. Van Aken B., Yoon J.M., Schnoor J.L Biodegradation of nitro-substituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine, and octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5-tetrazocine by a phytosymbiotic Methylobacterium sp. associated with poplar tissues (Populus deltoides nigra DN34). Appl. Enivron. Micorbiol. 70: Van Oevelen S., De Wachter R., Vandamme P.,Robbrecht E., Prinsen E Identification of the bacterial endosymbionts in leaf galls of Psychotria (Rubiaceae, angiosperms) and proposal of Candidatus burkholderia kirkii sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: Van Peer R., Punte H.L.M., De Weger L.A., Schippers B Characterization of root surface and endorhizosphere Pseudomonas in relation to their colonization of roots. Appl. Environ. Microbiol. 56: Vargas C., De Padua V.L.M., Nogueira E.M., Vinagre F., Masuda H.P., Da Silva F.R., Baldani J.I., Ferreira P.C.G., Hemerly A Signaling pathways mediating the association between sugarcane and endophytic diazotrophic bacteria: a genomic approach. Symbiosis. 35: Videira S.S., Simoes de Araujo J.L., da Silva Rodrigues L., Divan Baldani V.L., Baldani J.I Occurrence and diversity of nitrogen-fxing Sphingomonas bacteria associated with rice plants grown in Brazil. FEMS Microbiol. Lett. 293: Vinagre F., Vargas C., Schwarcz K., Cavalcante J., Nogueira E.M., Baldani J.I., Ferreira P.C., Hemarly A.S SHR5: a novel plant receptor kinase involved in plant-n 2 -fixing endophytic bacteria association. J. Exp. Botany. 57: Wahab A.M.A Nitrogen fixation by Bacillus strains isolated from the rhizosphere of Ammophila arenaria. Plant Soil. 42: Whitesides S.K., Spotts R.A Frequency, distribution, and characteristics of endophytic Pseudomonas syringe in pear trees. Phytopathol. 81: Xie Ch.H., Yokota A Sphingomonas azotifigens sp. nov., a nitrogenfixing bacterium isolated from the roots of Oryza sativa. Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 56:

99 205. Yan Y., Yang J., Dou Y., Chen M., Ping S., Peng J., Lu W., Zhang W., Yao Z., Li H., Liu W., He S., Geng L., Zhang X., Yang F., Yu H., Zhan Y., Li D., Lin Z., Wang Y., Elmerich C., Lin M., Jin Q Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501. PNAS, 105(21): Ziedan E.H.E Manipulating endophytic bacteria of biological control to soil-borne diseases of peanut. J. Appl. Sci. Res. 2: Zinniel D.K., Lambrecht P., Harris N.B., Feng Z., Kuczmarski D., Higley P., Ishimaru C.A., Arunakumari A., Barletta R.G., Vidavera A.K Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl. Environ. Microbiol. 68:

100 8. Załączniki 8.1. Tabele Tabela 1. Liczebność jednostek tworzących kolonie hodowlanych bakterii na podłożu stałym 1/3 TSA izolowanych z tkanek liści badanych odmian kukurydzy w 2009 roku uprawianych w dwóch lokalizacjach oraz liczba pozyskanych izolatów Tabela 2. Lista endofitów wyizolowanych z poszczególnych odmian kukurydzy oraz lokalizacji wraz z listą gatunków o największym stopniu podobieństwa w oparciu o porównanie in sillica sekwencji genu 16S rrna Tabela 3. Zdolność do wykorzystywania kwasów fenolowych jako jedyne źródło węgla i energii oraz minimalne stężenia hamujące [mg ml -1 ] (w/v) Tabela 4. Aktywność przeciwgrzybowa, zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia oraz obecność genu nifh Tabela 5. Aktywność pozakomórkowych enzymów hydrolizujących białka i polisacharydy roślinne wybranych endofitów Tabela 6. Ocena wpływu wybranych szczepów na określone parametry biometryczne siewek kukurydzy w doświadczeniu in vitro Tabela 7. Ocena wpływu wybranych szczepów na określone parametry siewek 6 odmian kukurydzy w doświadczeniu in vitro Tabela 8. Zdolności wybranych szczepów do biosyntezy kwasu indolilo-3- octowego (IAA), kwasu indolilo-3-masłowego (IBA), kwasu salicylowego (SA) oraz obecność genu acds Tabela 9. Wpływ mieszaniny wybranych szczepów endofitycznych na indukcję enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL), peroksydazy gwajakolowej (GPOX) oraz na zawartość chlorofilu w liściach w pilotowym doświadczeniu polowym 100

101 Tabela 1. Liczebność jednostek tworzących kolonie hodowlanych bakterii na podłożu stałym 1/3 TSA izolowanych z tkanek liści badanych odmian kukurydzy w 2009 roku uprawianych w dwóch lokalizacjach oraz liczba pozyskanych izolatów Odmiana SMOLICE Liczba kolonii (j.t.k. / 1 cm 2 liścia) LOKALIZACJA POLETEK KOBIERZYCE Liczba pozyskanych izolatów KB1902 0,41 x ,03 x KB1903 0,25 x ,09 x KB2704 0,25 x ,06 x KRÓL 0,31 x ,03 x KOSMO230 0,97 x ,39 x CYRKON 0,46 x ,23 x Liczba pozyskanych izolatów

102 Tabela 2. Lista endofitów wyizolowanych z poszczególnych odmian kukurydzy oraz lokalizacji wraz z listą gatunków o największym stopniu podobieństwa w oparciu o porównanie in sillica sekwencji genu 16S rrna A. Lista endofitów wyizolowanych z tkanek liści odmian KB1902, KB1903 oraz KB2704 pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. ODMIANA IZOLAT Gatunek o najbliższym pokrewieństwie (numer referencyjny szczepu) Procent podobieństwa KB1902 PE2 Pseudomonas lurida DSM T (AJ581999) 100 PE3 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) 99,9 PE4 Pseudomonas lurida DSM T (AJ581999) 100 PE5 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) 99,5 PE6 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) 99,5 A36 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 98,1 A37 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,7 A38 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 98 A39 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,5 A40 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,7 A41 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,7 KB1903 PE7 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) PE8 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 99,9 PE9 Pseudomonas clemancea PR221 T (AM419155) 98,9 A43 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,6 A44 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,8 A87 Chryseobacterium jejuense JS17-8 T (EF591303) 97,3 A89 Chryseobacterium jejuense JS17-8 T (EF591303) 97,6 A90 Arthrobacter nitroguajacolicus CCM 4924 T (AJ512504) 99,8 A91 Staphylococcus haemolyticus CCM2737 T (X66100) 99,2 KB2704 PE10 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) PE11 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 99,9 PE12 Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 PE13 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 PE14 Pseudomonas orientalis CFML T (AF064457) 99,7 PE15 Pseudomonas lurida DSM T (AJ581999) 99,9 PE16 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) 99,9 A67 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,8 A68 Bacillus circulans ATCC 4513 T (AY724690) 99,6 A71 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,7 A76 Bacillus circulans ATCC 4513 T (AY724690) 99,7 A77 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99 A78 Kocuria rhizophila DSM11926 T (Y16264) 97,3

103 Tabela 2B. Lista endofitów wyizolowanych z tkanek liści odmian Król, Kosmo230 oraz Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. ODMIANA IZOLAT Gatunek o najbliższym pokrewieństwie (numer referencyjny szczepu) Procent podobieństwa KRÓL PE17 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) 99,5 KOSMO 230 PE18 Acinetobacter schindleri LUH5832 T (AJ278311) 98,3 PE19 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 PE20 Pseudomonas extremaustralis CT 14-3 (AJ583501) 99,9 A58 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,6 A59 Bacillus simplex DSM 1321 T (AJ439078) 98,9 A60 Bacillus circulans T (AY043084) 99,7 A61 A62 Bacillus aerophilus 28K T (AJ831844) Bacillus altitudinis 41KF2b T (AJ831842) Bacillus stratosphericus 41KF2a T (AJ831841) Bacillus aerophilus 28K T (AJ831844) Bacillus altitudinis 41KF2b T (AJ831842) Bacillus stratosphericus 41KF2a T (AJ831841) 99,4 99,7 A64 Bacillus circulans ATCC 4513 T (AY724690) 99,5 A66 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,6 PE24 Pseudomonas graminis DSM T (Y11150) 99,8 PE25 Pseudomonas fluorescens ATCC (AF094729) 99,9 PE26 Pseudomonas marginalis LMG2210 T (Z76663) 99,4 PE27 Pseudomonas fluorescens ATCC (AF094729) Pseudomonas reactans PSR21 (GQ354527) 99,9 A45 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,6 A46 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,7 A47 Erwinia persicina ATCC T (U80205) 99,2 A48 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 98,5 A49 Shigella flexneri T (X96963) 98,1 A115 Microbacterium phyllosphaerae DSM T (AJ277840) CYRKON PE21 Pseudomonas clemancea PR221 T (AM419155) 98,7 98,4 PE22 Pseudomonas clemancea PR221 T (AM419155) 99,5 A50 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,6 A51 Pseudomonas migulae CIP T (AF074383) 99,7 A52 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,6 A53 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,1 A54 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 98,7 A55 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99 A56 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,6 A112 Bacillus pumilus ATCC 7061 T (AY876289) 97,9

104 Tabela 2C. Lista endofitów wyizolowanych z tkanek liści odmian KB1902, KB1903 oraz KB2704 pobranych z poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. ODMIANA IZOLAT Gatunek o najbliższym pokrewieństwie (numer referencyjny szczepu) KB1902 PE28 Pseudomonas grimontii CFML T (AF268029) Procent podobieństwa 99,9 PE29 Pseudomonas marginalis LMG2210 T (Z76663) 99,4 PE30 Pseudomonas grimontii CFML T (AF268029) 99,9 A19 Rothia amarae J18 T (AY043359) 99,4 A20 Brachybacterium conglomeratum JCM T (AB537169) A21 Rhodococcus qingshengii djl-6 T (DQ090961) 99,6 A22 Arthrobacter nitroguajacolicus CCM 4924 T (AJ512504) A23 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,8 A24 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,7 A105 Rothia amarae J18 T (AY043359) 99,9 KB1903 PE31 Pseudmonas viridiflava CECT 458 T (AY180972) 99,8 PE32 Pseudomonas thivervalensis SBK26 T (AF100323) 99,5 PE33 Pseudomonas thivervalensis SBK26 T (AF100323) 99,5 PE34 Pseudomonas marginalis LMG2210 T (Z76663) 99,4 PE35 Pseudomonas marginalis LMG2210 T (Z76663) 99,4 A17 Bacillus methylotrophicus CBMB205 T (EU194897) 99,5 A18 Arthrobacter nitroguajacolicus CCM 4924 T (AJ512504) A93 Rhizobium radiobacter IAM T (AB247615) ,9 A94 Rhizobium radiobacter IAM T (AB247615) 97,1 A99 Staphylococcus saprophyticus ATCC T (AP008934) KB2704 A13 Staphylococcus haemolyticus CCM2737 T (X66100) 99,2 99,3 A14 Kocuria kristinae DSM T (X80749) 99,4 A15 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,7 A16 Micrococcus yunnanensis YIM T (FJ214355) 99,9 A101 Rhizobium larrymoorei 3-10 T (Z30542) 98,7 A102 Sphingomonas glacialis C16y T (GQ253122) 98 A103 Bacillus idriensis SMC T (AY904033) 99,9 A104 Pedobacter borealis G-1 T (EU030687) 99 A109 A110 Acinetobacter calcoaceticus NCCB T (AJ888983) Acinetobacter calcoaceticus NCCB T (AJ888983) 98,6 98,6

105 Tabela 2D. Lista endofitów wyizolowanych z tkanek liści odmian Król, Kosmo230 oraz Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. ODMIANA IZOLAT Gatunek o najbliższym pokrewieństwie (numer referencyjny szczepu) KRÓL PE37 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) KOSMO 230 Procent podobieństwa 99,9 PE38 Pseudomonas orientalis CFML T (AF064457) 99,7 PE39 Pseudomonas orientalis CFML T (AF064457) 99,6 A2 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 98,9 A3 Methylobacterium aminovorans JCM 8240 T (AB175629) 99,1 A4 Methylobacterium extorquens JCM 2802 T (D32224) 99,6 A5 Methylobacterium extorquens JCM 2802 T (D32224) 99,6 A6 Methylobacterium aminovorans JCM 8240 T (AB175629) 99,1 A7 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,8 A8 Bacillus simplex DSM 1321 T (AJ439078) 98,6 A9 Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 T (X80743) 99,7 PE43 PE50 Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) Pseudomonas fluorescens biotype G (AJ308307) Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) 99,9 99,9 PE45 Pseudomonas orientalis CFML T (AF064457) 99,7 A79 Acinetobacter lwoffii DSM 2403 T (X81665) 99,4 A25 Bacillus aerophilus 28K T (AJ831844) Bacillus altitudinis 41KF2b T (AJ831842) Bacillus stratosphericus 41KF2a T (AJ831841) A27 Rhizobium radiobacter IAM T (AB247615) 96,9 A81 Pedobacter borealis G-1 T (EU030687) 98,8 A83 Acinetobacter lwoffii DSM 2403 T (X81665) 99,1 A84 Acinetobacter lwoffii DSM 2403 T (X81665) 99,5 A111 Chryseobacterium indoltheticum ATCC T (AY468448) CYRKON PE40 Pseudomonas grimontii CFML T (AF268029) 99, ,1 PE41 Pseudomonas clemancea PR221T (AM419155) 99,2 PE42 Pseudomonas poae DSM T (AJ492829) Pseudomonas trivialis DSM T (AJ492831) 99,9 A28 Staphylococcus pasteuri ATCC T (AB009944) 99,3 A29 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,4 A30 Chryseobacterium jejuense JS17-8 T (EF591303) 97,6 A31 Microbacterium testaceum DSM T (X77445) 99,8 A32 Sphingomonas paucimobilis ATCC T (U37337) 99,5 A33 Bacillus megaterium IAM13418 T (D16273) 99,7 A34 Arthrobacter nitroguajacolicus CCM 4924 T (AJ512504) 100

106 Tabela 3. Zdolność do wykorzystywania kwasów fenolowych jako jedyne źródło węgla i energii oraz minimalne stężenia hamujące [mg ml -1 ] (w/v) A. Szczepy izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. SZCZEP Odmiana KB1902 Kwas ferulowy Kwas p-kumarowy Kwas o-kumarowy Kwas chlorogenowy Alkohol koniferylowy Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Ps. lurida PE2-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Ps. fluorescens PE3 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. Ps. lurida PE4-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Ps. fluorescens PE5 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. Ps. fluorescens PE6 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. M. testaceum A36-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 Ar. nicotinovorans A37-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 M. testaceum A38-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 M. testaceum A39-0,68-1,08-1,08-1,6-2,1 Ar. nicotniovorans A40-1,35-1,44-1,08-1,6-2,1 M. testaceum A41-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 Odmiana KB1903 Ps. fluorescens PE7 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescens PE8 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. Ps. clemancea PE9-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 B. megaterium A43-1,8-1,44-1,44-1,6 + n.o. Ar. nicotinovorans A44-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 Chr. jejuense A87-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 Ch. jejuense A89-1,8-1,44-1,44-0,6-2,1 Ar. nitroguajacolicus A90-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 St. haemolyticus A91-1,8-1,44-1,44-0,6-5,0 Odmiana KB2704 Ps. fluorescens PE10 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescens PE11 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. poae PE12 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescens PE13 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. orientalis PE14-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Ps. lurida PE15-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 Ps. fluorescens PE16 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. M. testaceum A67-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 B. circulans A68-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 B. megaterium A71-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 B. circulans A76 + n.o. - 1,44 + n.o. + n.o. - 3,9 M. testaceum A77-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 K. rhizophila A78-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9

107 Tabela 3B. Szczepy izolowane z odmian Król, Kosmo230, Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. SZCZEP Kwas ferulowy Kwas p-kumarowy Odmiana Król Kwas o-kumarowy Kwas chlorogenowy Alkohol koniferylowy Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Ps. fluorescens PE17 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ac. schindleri PE18 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. Ps. fluorescens PE19 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. extremaustralis PE20 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. B. megaterium A58-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 B. simplex A59-1,35-1,44-1,08-1,6-5,0 B. circulans A60-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 B. aerophilus A61-1,35-1,08-1,08-1,6-5,0 B. aerophilus A62-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 B. circulans A64-1,8-1,08-1,08-1,6-3,9 B. megaterium A66-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Odmiana Kosmo230 Ps. graminis PE24-1,8 + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescns PE25 + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. + n.o. Ps. marginais PE26 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescens PE27 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. B. megaterium A45-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 M. testaceum A46-0,68-1,08-1,08-1,6-3,9 E. persicina A47-1,8-0,54-1,44-1,6-3,9 M. testaceum A48-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 S. flexneri A49-1,35-1,44-1,44-1,6-3,9 M. phyllosphaerae A115-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Odmiana Cyrkon Ps. clemancea PE21-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 Ps. clemancea PE22-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 Ar. nicotinovorans A50-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 Ps. migulae A51 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ar. nicotinovorans A52-1,8-1,44-1,44-1,6 + n.o. B.megaterium A53-1,8-1,44-1,44 + n.o. - 3,9 B. megaterium A54-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 B. megaterium A55-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 B. megaterium A56-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 B. pumilus A112-1,8-1,08-1,44-1,6-3,9

108 Tabela 3C. Szczepy izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. pobranych z SZCZEP Odmiana KB1902 Kwas ferulowy Kwas p-kumarowy Kwas o-kumarowy Kwas chlorogenowy Alkohol koniferylowy Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Ps. grimontii PE28 + n.o + n.o + n.o - 1,6 + n.o Ps. marginalis PE29 + n.o. + n.o + n.o - 1,6 + n.o Ps. grimontii PE30 + n.o. + n.o + n.o - 1,6 + n.o R. amarae A19-1,35-1,44-1,44-1,6-5,0 Br. conglomeratum A20-1,35-1,44-1,08-1,6-5,0 Rh. qingshengii A21-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 Ar. nitroguajacolicus A22-1,8-1,44-1,44-1,6 + n.o. Ar. nicotniovorans A23-1,35-1,44-1,44-1,6-3,9 Ar. nicotinovorans A24-1,35-1,44-1,08-1,6-3,9 R. amarae A105-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Odmiana KB1903 Ps. viridiflava PE31 + n.o + n.o - 1,44-1,6 + n.o Ps. thievervalensis PE32 + n.o + n.o + n.o - 1,6 + n.o Ps. thievervalensis PE33 + n.o + n.o + n.o - 1,6 + n.o Ps. marginalis PE34 + n.o + n.o + n.o - 1,6 + n.o Ps. marginalis PE35 + n.o + n.o + n.o - 1,6 + n.o B. methylotrophicus Ar. nitroguajacolicus A17-1,8-1,08-1,44-1,6-3,9 A18-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 R. radiobacter A93-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 R. radiobacter A94-1,8-1,44-1,08-1,6-2,1 St. saprophyticus A99-1,35-1,08-1,08-0,6-2,1 Odmiana KB2704 St. haemolyticus A13-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 K. kristinae A14-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Ar. nicotinovorans A15-1,35-1,44-1,44-1,6-3,9 M. yunnanensis A16-1,35-1,08-1,08-1,6-5,0 R. larrymoorei A101-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 Sp. glacialis A102-1,35-1,08-1,44-0,6-2,1 B. idriensis A103-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 P. borealis A104-1,35-1,08-0,54-1,6-2,1 Ac. calcoaceticus A109-1,8-1,44-1,44-1,2 + n.o. Ac. calcoaceticus A110-1,8-1,44-1,44-1,2 + n.o.

109 Tabela 3D. Szczepy izolowane z odmian Król, Kosmo230, Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. SZCZEP Kwas ferulowy Kwas p-kumarowy Odmiana Król Kwas o-kumarowy Kwas chlorogenowy Alkohol koniferylowy Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Wzrost MIC Ps. fluorescens PE37 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. orientalis PE38 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. orientalis PE39 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. M. testaceum A2-1,35-1,08-1,44-1,6-3,9 M. aminovorans A3-1,8-1,44-1,44-0,6-2,1 M. extorquens A4-1,8-1,44-1,44-0,6-2,1 M. extorquens A5-1,8-1,44-1,44-0,6-2,1 M. aminovorans A6-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 Ar. nicotinovorans A7-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 B. simplex A8-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Ar. nicotinovorans A9-1,8-1,44-1,44-1,6-3,9 Odmiana Kosmo230 Ps. fluorescens PE43 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. fluorescens PE50 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. orientalis PE45 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ac. lwoffii A79-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 B. aerophilus A25-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 R. radiobacter A27-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 P. borealis A81-1,35-1,08-1,08-0,6-2,1 Ac. lwoffii A83-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 Ac. lwoffii A84-1,35-1,08-1,08-0,6-2,1 Chr. indoltheticum A111-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 Odmiana Cyrkon Ps. grimontii PE40 + n.o. + n.o. + n.o. - 1,6 + n.o. Ps. clemancea PE41-1,8-1,44-1,44-1,6-5,0 Ps. poae PE42 + n.o. + n.o. - 1,44-1,6 + n.o. St. pasteuri A28-1,8-1,44-1,44-0,6-5,0 M. testaceum A29-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 Chr. jejuense A30-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 M. testaceum A31-1,35-1,08-1,08-1,6-3,9 Sp. paucimobilis A32-1,8-1,44-1,44-1,6-2,1 B. megaterium A33-1,35-1,08-1,44-1,6-3,9 Ar. nitroguajacolicus A34-1,35-1,08-1,08-1,6-2,1 + wrost; - brak wzrostu; n.o. nie określono

110 Tabela 4. Aktywność przeciwgrzybowa, zdolność do rozpuszczania fosforanu wapnia oraz obecność genu nifh A. Szczepy izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. SZCZEP Odmiana KB1902 Strefa zahamowania wzrostu [mm] * F. graminearum IOR1970 F. moniliforme IOR728 Rozpuszczanie Ca 3 (PO 4 ) 2 [mm]* Produkt PCR nifh ** Ps. lurida PE2 0,0 N 1,5 STUVW 2,0 OPQRS + Ps. fluorescens PE3 0,0 N 6,3 FGH 6,2 EFG + Ps. lurida PE4 0,0 N 2,7 PQRST 4,8 HI + Ps. fluorescens PE5 0,0 N 4,3 JKLMN 9,5 B + Ps. fluorescens PE6 0,0 N 4,5 JKLM 9,0 B + M. testaceum A36 0,0 N 3,3 MNOPQ 0,0 T - Ar. nicotinovorans A37 0,0 N 0,0 X 0,0 T + M. testaceum A38 0,0 N 0,0 X 0,0 T - M. testaceum A39 0,0 N 5,0 IJK 1,0 ST - Ar. nicotniovorans A40 2,3 GHI 18,0 A 0,0 T - M. testaceum A41 0,0 N 0,0 X 1,2 RS - Odmiana KB1903 Ps. fluorescens PE7 0,0 N 2,0 RSTUV 5,7 FGH + Ps. fluorescens PE8 0,0 N 2,2 QRSTUV 3,2 JKLMN + Ps. clemancea PE9 3,0 G 6,0 GHI 2,3 MNOPQ - B. megaterium A43 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ar. nicotinovorans A44 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Chr. jejuense A87 1,5 JKL 6,0 GHI 0,0 T - Ch. jejuense A89 0,0 N 8,7 E 0,0 T - Ar. nitroguajacolicus A90 0,0 N 4,0 KLMN 1,3 QRS + St. haemolyticus A91 1,7 IJK 1,2 UVWX 3,7 JKL + Odmiana KB2704 Ps. fluorescens PE10 0,0 N 0,0 X 2,7 LMNOP + Ps. fluorescens PE11 0,0 N 0,0 X 4,2 IJ + Ps. poae PE12 0,0 N 0,0 X 7,7 CD + Ps. fluorescens PE13 0,0 N 0,0 X 7,5 D + Ps. orientalis PE14 0,0 N 1,5 STUVW 2,0 OPQRS + Ps. lurida PE15 0,0 N 1,3 TUVW 1,0 ST + Ps. fluorescens PE16 0,0 N 0,0 X 0,0 T + M. testaceum A67 0,0 N 4,7 JKL 0,0 T - B. circulans A68 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. megaterium A71 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. circulans A76 0,0 N 0,0 X 0,0 T - M. testaceum A77 0,0 N 0,0 X 0,0 T + K. rhizophila A78 0,0 N 0,0 X 0,0 T -

111 Tabela 4B. Szczepy izolowane z odmian Król, Kosmo230, Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych HR Smolice Sp. z o.o. SZCZEP Odmiana Król Strefa zahamowania wzrostu [mm]* F. graminearum IOR1970 F. moniliforme IOR728 Rozpuszczanie Ca 3 (PO 4 ) 2 [mm]* Ps. fluorescens PE17 5,3 D 6,0 GHI 1,8 PQRS + Ac. schindleri PE18 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ps. fluorescens PE19 0,0 N 4,0 KLMN 8,7 BC + Ps. extremaustralis PE20 0,0 N 1,5 STUVW 2,2 NOPQR + B. megaterium A58 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. simplex A59 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. circulans A60 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. aerophilus A61 0,0 N 10,7 CD 0,0 T + B. aerophilus A62 4,3 EF 10,0 D 1,3 QRS + B. circulans A64 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. megaterium A66 0,0 N 8,7 E 0,0 T + Odmiana Kosmo230 Ps. graminis PE24 4,3 EF 5,3 HIJ 6,8 DE + Ps. fluorescns PE25 7,3 C 6,7 FG 3,8 IJK - Ps. marginais PE26 3,8 F 1,0 VWX 10,8 A - Ps. fluorescens PE27 0,0 N 3,8 KLMNO 2,3 MNOPQ - B. megaterium A45 0,0 N 0,0 X 0,0 T + M. testaceum A46 0,0 N 5,3 HIJ 1,5 QRS - E. persicina A47 2,7 GH 1,3 TUVW 0,0 T + M. testaceum A48 0,0 N 0,0 X 0,0 T - S. flexneri A49 0,0 N 0,0 X 0,0 T - M. phyllosphaerae A115 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Odmiana Cyrkon Ps. clemancea PE21 1,0 KLM 0,0 X 0,0 T - Ps. clemancea PE22 0,0 N 2,3 QRSTU 1,3 QRS + Ar. nicotinovorans A50 0,0 N 0,0 X 1,7 PQRS - Ps. migulae A51 0,8 LM 4,0 KLMN 0,0 T + Ar. nicotinovorans A52 0,0 N 0,0 X 3,0 KLMNO - B.megaterium A53 2,0 HIJ 3,2 NOPQR 0,0 T + B. megaterium A54 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. megaterium A55 1,8 IJ 2,7 OPQRS 0,0 T - B. megaterium A56 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Produkt PCR nifh** B. pumilus A112 0,0 N 11,7 C 0,0 T -

112 Tabela 4C. Szczepy izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 pobranych z poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. SZCZEP Strefa zahamowania wzrostu [mm]* Rozpuszczanie Ca 3 (PO 4 ) 2 [mm]* Odmiana KB1902 F. graminearum IOR1970 F. moniliforme IOR728 Produkt PCR nifh** Ps. grimontii PE28 0,0 N 0,7 WX 4,0 IJK - Ps. marginalis PE29 0,0 N 0,0 X 3,5 JKL - Ps. grimontii PE30 0,0 N 0,7 WX 1,7 PQRS + R. amarae A19 0,0 N 0,0 X 1,8 PQRS - Br. conglomeratum A20 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Rh. qingshengii A21 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Ar. nitroguajacolicus A22 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Ar. nicotniovorans A23 0,0 N 0,0 X 1,0 ST - Ar. nicotinovorans A24 0,0 N 0,0 X 0,0 T + R. amarae A105 2,7 GH 0,0 X 2,3 MNOPQ + Odmiana KB1903 Ps. viridiflava PE31 0,0 N 0,0 X 5,3 GH + Ps. thievervalensis PE32 0,5 MN 0,0 X 7,3 D - Ps. thievervalensis PE33 0,0 N 0,0 X 5,3 GH - Ps. marginalis PE34 0,0 N 1,7 STUVW 1,7 PQRS + Ps. marginalis PE35 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. methylotrophicus A17 11,7 A 10,3 D 0,0 T + Ar. nitroguajacolicus A18 0,0 N 0,0 X 1,0 ST + R. radiobacter A93 0,0 N 0,0 X 0,0 T - R. radiobacter A94 0,0 N 0,0 X 0,0 T - St. saprophyticus A99 4,0 F 2,7 OPQRS 0,0 T + Odmiana KB2704 St. haemolyticus A13 5,0 DE 0,0 X 4,2 IJ + K. kristinae A14 0,0 N 0,0 X 3,2 JKLMN - Ar. nicotinovorans A15 0,0 N 0,0 X 1,2 RS - M. yunnanensis A16 0,0 N 0,0 X 0,0 T - R. larrymoorei A101 0,0 N 4,7 JKL 0,0 T - Sp. glacialis A102 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. idriensis A103 0,0 N 0,0 X 0,0 T - P. borealis A104 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ac. calcoaceticus A109 0,0 N 6,0 GHI 5,7 FGH - Ac. calcoaceticus A110 0,0 N 14,7 B 6,2 EFG -

113 Tabela 4D. Szczepy izolowane z odmian Król, Kosmo230, Cyrkon pobranych z poletek doświadczalnych Nasiona Kobierzyce Sp. z o.o. SZCZEP Zahamowanie wzrostu [mm]* Rozpuszczanie Ca 3 (PO 4 ) 2 [mm]* Odmiana Król F. graminearum IOR1970 F. moniliforme IOR728 Ps. fluorescens PE37 0,0 N 0,0 X 6,7 DEF + Ps. orientalis PE38 5,0 DE 2,3 QRSTU 0,0 T + Ps. orientalis PE39 4,3 EF 1,7 STUVW 0,0 T + M. testaceum A2 0,0 N 0,0 X 0,0 T + M. aminovorans A3 0,0 N 0,0 X 0,0 T - M. extorquens A4 0,0 N 0,0 X 0,0 T + M. extorquens A5 2,0 HIJ 0,0 X 0,0 T + M. aminovorans A6 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ar. nicotinovorans A7 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. simplex A8 1,5 JKL 0,0 X 0,0 T + Ar. nicotinovorans A9 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Odmiana Kosmo230 Ps. fluorescens PE43 9,3 B 8,7 E 5,3 GH + Ps. fluorescens PE50 6,7 C 14,0 B 6,0 EFG + Ps. orientalis PE45 5,0 DE 7,3 F 0,0 T + Ac. lwoffii A79 0,0 N 0,0 X 0,0 T + B. aerophilus A25 4,0 F 0,0 X 3,3 JKLM + R. radiobacter A27 0,0 N 3,7 LMNOP 0,0 T - P. borealis A81 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ac. lwoffii A83 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ac. lwoffii A84 0,0 N 6,7 FG 0,0 T + Chr. indoltheticum A111 0,0 N 0,0 X 0,0 T - Odmiana Cyrkon Ps. grimontii PE40 0,0 N 1,3 TUVW 0,0 T - Ps. clemancea PE41 4,3 EF 2,0 RSTUV 5,3 GH - Ps. poae PE42 0,0 N 0,0 X 3,0 KLMNO + St. pasteuri A28 5,0 DE 0,0 X 3,2 JKLMN + M. testaceum A29 0,0 N 0,0 X 2,0 OPQRS + Chr. jejuense A30 0,0 N 0,0 X 0,0 T - M. testaceum A31 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Sp. paucimobilis A32 0,0 N 0,0 X 0,0 T - B. megaterium A33 0,0 N 0,0 X 0,0 T + Ar. nitroguajacolicus Produkt PCR nifh** A34 0,0 N 0,0 X 0,0 T + ** + stwierdzono produkt PCR dla genu hifh * wartości w kolumnach w całej Tabeli 4 oznaczone tymi samymi literami nie są istotnie różne wg testu Fishera (p = 0,05)

114 Tabela 5. Aktywność pozakomórkowych enzymów hydrolizujących białka i polisacharydy roślinne wybranych endofitów A. Szczepy izolowane z odmian KB1902, KB1903, KB2704 SZCZEP Lokalizacja Aktywność proteaz Aktywność celulaz Aktywność ksylanaz Aktywność pektynaz Odmiana KB1902 Ar. nicotinovorans A23 K Ps. grimontii PE30 K M. testaceum A41 S Ps. lurida PE4 S Ps. fluorescens PE3 S Ps. fluorescens PE6 S Odmiana KB1903 Ar. nitroguajacolicus A18 K B. methylotrophicus A17 K Ps. marginalis PE34 K Ps. thivervalensis PE32 K Ps. viridiflava PE31 K R. radiobacter A93 K Chr. jejuense A87 S Ps. fluorescens PE8 S Odmiana KB2704 Ac. calcoaceticus A110 K B. circulans A76 S Ps. fluorescens PE11 S Ps. fluorescens PE16 S

115 Tabela 5B. Szczepy izolowane z odmian Król, Kosmo230, Cyrkon SZCZEP Lokalizacja Aktywność proteaz Aktywność celulaz Aktywność ksylanaz Aktywność pektynaz Odmiana Król Ar. nicotinovorans A7 K B. simplex A8 K M. extorquens A5 K Ps. orientalis PE38 K B. aerophilus A62 S B. megaterium A66 S Ps. fluorescens PE19 S Odmiana Kosmo230 Ac. lwoffii A83 K Ps. fluorescens PE43 K Ps. fluorescens PE50 K Ps. graminis PE24 S Ps. fluorescens PE25 S Odmiana Cyrkon M. testaceum A29 K Ar. nicotinovorans A50 S B. megaterium A53 S B. megaterium A54 S Ps. clemancea PE22 S Ps. migulae A51 S strefa powyżej 2 mm; + strefa do 2 mm; - brak strefy S odmiana uprawiana na poletkach w Smolicach, K - odmiana uprawiana na poletkach w Kobierzycach

116 Tabela 6. Ocena wpływu wybranych szczepów na określone parametry biometryczne siewek kukurydzy w doświadczeniu in vitro A. Odmiana KB1902 Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 28,9a* 46,0a 2,6a 21,8a Ps. fluorescens PE3 34,2a 45,6a 2,2a 24,3a Ps. lurida PE4 23,7a 29,8a 2,2a 16,5a Ps. fluorescens PE6 24,5a 32,9a 2,2a 16,1a Ps. grimontii PE30 21,3a 27,7b 2,2a 13,7a KONTROLA 63,4a 97,9a 3,3a 61,8a M. testaceum A41 48,1a 68,0a 3,6a 60,1a Ar. nicotinovorans A23 49,8a 72,8a 3,6a 59,0a B. Odmiana KB1903 Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 28,5a* 41,6a 2,2a 17,0a Ps. fluorescens PE8 29,7a 29,7b 1,0a 12,2a Ps. thivervalensis PE32 21,2b 29,7b 2,7a 17,0a Ps. marginalis PE34 26,1a 36,9a 2,6a 16,1a KONTROLA 50,9a 92,3a 4,1a 55,3a B. methylotrophicus A17 31,7a 43,2b 4,0a 47,2a Chr. jejuense A87 36,4a 58,8b 4,0a 38,1a Rh. radiobacter A93 45,3a 66,2a 3,9a 38,4a KONTROLA 33,8a 32,9a 1,3a 14,4a Ar. nitroguajacolicus A18 22,7a 27,0a 1,2a 15,2a KONTROLA 27,2a 42,2a 2,3a 18,7a Ps. viridiflava PE31 8,9b 9,1b 1,3a 9,9b

117 C. Odmiana KB2704 Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 21,6a* 21,6a 1,0a 9,8a Ps. fluorescens PE11 20,0a 20,0a 1,0a 10,0a Pse. fluorescens PE16 23,7a 23,7a 1,0a 11,9a KONTROLA 65,4a 109,9a 4,0a 67,4a B. circulans A76 54,1a 87,0a 4,0a 63,8a Ac. calcoaceticus A110 62,1a 88,6a 3,8a 60,5a D. Odmiana Król Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 34,0a* 59,7a 3,5a 24,8a Ps. fluorescens PE19 24,9b 33,3b 2,3b 17,5b Ps. orientalis PE38 18,8b 24,1b 2,0b 13,0b KONTROLA 83,9a 120,3a 3,3a 62,2a B. simplex A8 50,9b 64,6b 3,1a 43,2a B. aerophilus A62 57,2b 73,0b 3,4a 40,8a B. megaterium A66 65,6a 82,6b 4,1a 55,2a KONTROLA 32,3a 51,4a 3,4a 22,7a M. extorquens A5 27,6a 39,5a 3,0a 21,3a KONTROLA 63,1a 88,5a 4,0a 54,8a Ar. nicotinovorans A7 66,3a 107,7a 3,8a 61,1a

118 E. Odmiana Cyrkon Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 20,2a* 21,4b 1,2b 12,1a Ps. clemancea PE22 25,5a 38,7a 2,8a 17,7a Ps. migulae A51 24,8a 35,7b 2,8a 16,7a KONTROLA 79,4a 128,5a 3,7a 58,0a B. megaterium A53 66,8a 102,3a 4,0a 43,5a B. megaterium A54 61,7a 82,3b 3,8a 50,7a KONTROLA 86,7a 132,5a 4,5a 65,1a Ar. nicotinovorans A50 59,7b 82,9b 3,9a 43,5b M. testaceum A29 60,4b 96,2b 4,4a 48,7a F. Odmiana Kosmo230 Szczep Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Liczba korzeni Średnia długość epikotylu [mm] KONTROLA 34,2a* 51,2a 3,3a 35,8a Ps. fluorescens PE25 26,7a 40,0a 2,6a 19,7a Ps. fluorescens PE43 30,4a 35,3a 1,7b 17,6a KONTROLA 63,2a 97,8a 3,7a 58,2a Ac. lwoffii A83 63,6a 90,8a 3,8a 59,1a KONTROLA 29,3a 53,7a 2,7a 11,3a Ps. graminis PE24 24,7a 41,5a 3,5a 14,4a KONTROLA 39,3b 59,6a 4,3a 49,2a Ps. fluorescens PE50 60,0a 86,0a 4,2a 63,1a *wartości w kolumnach w całej Tabeli 6 oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana (p=0,05)

119 Tabela 7. Ocena wpływu wybranych szczepów na określone parametry siewek 6 odmian kukurydzy w doświadczeniu in vitro A. Inokulacja Methylobacterium extorquens A5 oraz Arthrobacter nicotinovorans A7 KRÓL KB1902 KB1903 KB2704 CYRKON KOSMO230 woda A5 woda A5 woda A5 woda A5 woda A5 woda A5 Liczba korzeni 3,4 a* 3,0 a 1,6 a 1,0 a 1,7 a 1,4 a 1,2 a 1,0 a 2,8 a 2,8 a 2,5 a 2,4 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Średnia długość epikotylu [mm] 32,3 a 27,6 a 39,4 a 26,3 b 21,3 a 21,6 a 28,4 a 27,5 a 28,4 a 21,0 a 24,6 a 21,2 a 51,4 a 39,5 a 47,0 a 27,5 b 30,0 a 23,8 a 30,9 a 27,5 a 55,2 a 30,8 b 38,0 a 33,7 a 22,7 a 21,3 a 18,4 a 14,3 a 13,6 a 9,0 a 11,1 a 12,0 a 22,2 a 19,1 a 16,7 a 15,0 a woda A7 woda A7 woda A7 woda A7 woda A7 woda A7 Liczba korzeni 4,0 a* 3,8 a 3,4 a 3,8 a 3,5 a 3,4 a 3,9 a 4,2 a 4,2 a 3,8 a 4,1 a 4,0 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] 63,1 a 66,3 a 47,3 a 34,2 a 35,5 a 43,5 a 71,4 a 49,8 b 63,5 a 51,9 a 79,9 a 61,3 b 88,5 a 107,7 a 75,9 a 47,8 b 58,9 a 71,0 a 103,9 a 70,8 b 103,6 a 69,6 b 112,1 a 77,63 b Średnia długość 54,8 a 61,1 a 53,7 a 39,8 a 34,0 a 39,8 a 74,2 a 54,1 a 61,5 a 52,0 a 70,6 a 62,4 a epikotylu [mm]

120 Tabela 7B. Inokulacja Arthrobacter nitroguajacolicus A18 oraz Pseudomonas viridiflava PE31 KB1903 KB1902 KB2704 KRÓL CYRKON KOSMO230 woda A18 woda A18 woda A18 woda A18 woda A18 woda A18 Liczba korzeni 1,3 a* 1,2 a 2,6 a 2,4 a 1,6 a 1,6 a 3,9 a 3,4 a 3,7 a 2,7 a 3,1 a 3,5 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Średnia długość epikotylu [mm] 33,8 a 22,7 a 34,6 a 23,7 a 34,3 a 23,4 a 40,8 a 33,1 a 28,5 a 28,9 a 40,5 a 29,9 a 32,9 a 27,0 a 52,9 a 38,4 a 42,1 a 28,6 a 69,9 a 51,5 a 53,0 a 44,3 a 64,1 a 42,0 b 14,4 a 15,2 a 25,6 a 20,7 a 17,3 a 14,3 a 31,0 a 26,8 a 21,6 a 20,0 a 38,0 a 25,9 b woda PE31 woda PE31 woda PE31 woda PE31 woda PE31 woda PE31 Liczba korzeni 2,3 a 1,3 a 1,8 a 1,4 a 1,0 a 1,5 a 3,2 a 1,0 b 1,8 a 2,3 a 3,0 a 1,8 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] 27,2 a 8,9 b 34,3 a 10,5 b 17,0 a 13,0 a 32,3 a 13,0 b 16,5 a 11,5 a 27,0 a 12,4 b 42,2 a 9,1 b 40,3 a 10,9 b 17,0 a 13,8 a 56,1 a 13,0 b 25,3 a 12,7 a 45,9 a 13,2 b Średnia długość 18,7 a 9,9 b 20,8 a 13,4 a 8,4 a 14,0 a 25,3 a 18,7 a 12,6 a 14,7 a 24,5 a 13,5 b epikotylu [mm]

121 Tabela 7C. Inokulacja Pseudomonas graminis PE24 oraz Pseudomonas fluorescens PE50 KOSMO230 KB1902 KB1903 KB2704 KRÓL CYRKON woda PE24 woda PE24 woda PE24 woda PE24 woda PE24 woda PE24 Liczba korzeni 2,7 a* 3,5 a 2,3 a 1,7 a 2,0 a 1,4 a 3,2 a 1,9 b 3,0 a 3,3 a 3,4 a 3,0 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Średnia długość epikotylu [mm] 29,3 a 24,7 a 26,8 a 26,2 a 29,5 a 20,9 a 30,1 a 25,5 a 42,6 a 28,0 b 33,0 a 23,6 a 53,7 a 41,5 a 36,1 a 30,8 a 40,3 a 24,0 a 55,0 a 33,4 b 65,0 a 39,5 b 64,4 a 41,0 b 11,3 a 14,4 a 17,9 a 18,1 a 17,6 a 11,3 a 19,9 a 13,9 a 9,4 a 4,1 a 7,8 a 4,9 a woda PE50 woda PE50 woda PE50 woda PE50 woda PE50 woda PE50 Liczba korzeni 4,3 a 4,2 a 3,7 a 4,7 a 3,3 a 4,2 a 4,7 a 3,9 a 4,8 a 4,4 a 4,2 a 4,8 a Średnia długość korzenia [mm] Długość korzenia głównego [mm] Średnia długość epikotylu [mm] 39,3 b 60,0 a 52,6 a 46,0 a 34,3 a 40,7 a 47,8 a 46,3 a 64,2 a 46,6 a 58,7 a 43,0 a 59,6 a 86,0 a 89,6 a 77,9 a 55,8 a 67,2 a 75,0 a 71,9 a 126,0 a 69,2 b 94,6 a 77,0 a 49,2 a 63,1 a 66,8 a 58,0 a 28,5 a 44,3 a 50,4 a 44,0 a 66,0 a 54,3 a 42,8 a 38,1 a *wartości w wierszach całej Tabeli 7 dla poszczególnych szczepów z danego rodzaju oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana (p=0,05)

122 Tabela 8. Zdolności wybranych szczepów do biosyntezy kwasu indolilo-3- octowego(iaa), kwasu indolilo-3-masłowego (IBA), kwasu salicylowego (SA) oraz obecność genu acds Szczep IAA [μg ml -1 ] SA [μg ml -1 ] IBA [μg ml -1 ] Ps. clemancea PE22 0,22 A * 5,9 A * 0,0 - Ps. fluorescens PE50 0,15 B 1,1 B 0,0 - Gen acds Ps. migulae A51 0,08 C 2,5 B 0,0 - *wartości w kolumnach oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Fishera (p=0,05) Tabela 9. Wpływ mieszaniny wybranych szczepów endofitycznych na indukcję enzymu amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL), peroksydazy gwajakolowej (GPOX) oraz na zawartość chlorofilu w liściach w pilotowym doświadczeniu polowym PAL (mm h -1 g -1 świeżej masy) GPOX (μm min -1 g -1 świeżej masy) Chlorofil (μg 1,91cm 2 ) Chlorofil A Chlorofil B Chlorofil A+B Kontrola 1,53b* 63,55a 74,8a 24,9a 99,7a Mix 2,34a 62,59a 81,9a 24,7a 106,6a *wartości w kolumnach oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana (p=0,05)

123 8.2. Wykresy Wykres 1. Procentowy udział gromad hodowalnych bakterii endofitycznych u różnych odmian kukurydzy Wykres 2A. Aktywność enzymu PAL w liściach odmiany Cyrkon indukowana wybranymi szczepami Wykres 2B. Aktywność enzymy PAL w liściach odmiany Kosmo230 indukowana wybranymi szczepam Wykres 3A. Aktywność enzymu GPOX w liściach odmiany Cyrkon indukowana wybranymi szczepami Wykres 3B. Aktywność enzymu GPOX w liściach odmiany Kosmo230 indukowana wybranymi szczepami Wykres 4A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na zawartość chlorofilu w liściach Wykres 4B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na zawartość chlorofilu w liściach Wykres 5A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na plon świeżej masy pojedynczej rośliny Wykres 5B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na plon suchej masy pojedynczej rośliny Wykres 6A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na plon świeżej masy pojedynczej rośliny Wykres 6B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na plon suchej masy pojedynczej rośliny

124 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Firmicutes Actinobateria Bacteroides Proteobacteria 20% 10% 0% Wykres 1. Procentowy udział gromad hodowalnych bakterii endofitycznych u różnych odmian kukurydzy

125 Wykres 2A. Aktywność enzymu PAL w liściach odmiany Cyrkon indukowana wybranymi szczepami Wykres 2B. Aktywność enzymy PAL w liściach odmiany Kosmo230 indukowana wybranymi szczepam

126 Wykres 3A. Aktywność enzymu GPOX w liściach odmiany Cyrkon indukowana wybranymi szczepami Wykres 3B. Aktywność enzymu GPOX w liściach odmiany Kosmo230 indukowana wybranymi szczepami

127 Wykres 4A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na zawartość chlorofilu w liściach

128 Wykres 4B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na zawartość chlorofilu w liściach

129 Wykres 5A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na plon świeżej masy pojedynczej rośliny

130 Wykres 5B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Cyrkon wybranymi szczepami na plon suchej masy pojedynczej rośliny

131 Wykres 6A. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na plon świeżej masy pojedynczej rośliny

132 Wykres 6B. Wpływ zaprawiania nasion odmiany Kosmo230 wybranymi szczepami na plon suchej masy pojedynczej rośliny