Wrocław, 19 maja 2018 r.

Transkrypt

1 Prof. zw. dr hab. inż. Stanisław J. Pietr Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Katedra Ochrony Roślin Zakład Mikrobiologii Rolniczej ul. Grunwaldzka 53, Wrocław Wrocław, 19 maja 2018 r. Recenzja rozprawy doktorskiej przedstawionej przez Panią mgr Małgorzatę Pawlik Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji gleb skażonych związkami ropopochodnymi Niewinniejsza recenzja dotyczy przesłanej przez Radę Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach rozprawy doktorskiej pt Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji gleb skażonych związkami ropopochodnymi przedstawionej przez Panią mgr Małgorzatę Pawlik przygotowanej kierunkiem promotora Pani Prof. dr hab. Zofii Piotrkowskiej-Seget. Przedmiotowa rozprawa została opracowana w ramach grantu PRELUDIUM NR 2013/09/NZ9/01606 oraz przy wsparciu stypendialnym programu - Uniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzy oraz DoktoRIS współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Przesłana rozprawa doktorska jest próbą udzielenia odpowiedzi na jedno z istotnych pytań dotyczących roli bakterii endofitycznych w procesach adaptacji roślin do wzrostu i rozwoju w środowiskach skażonych produktami działalności gospodarczej człowieka. Problematyka podjęta w przedłożonej pracy doktorskiej ma istotne znaczenie z poznawczego jak również z praktycznego punktu widzenia. Dlatego też warto było podjąć trud przeprowadzenia takich badań, aby określić jaki wpływ ma długotrwałe skażenie gleb na zespoły endofitycznych bakterii porastających gleby długotrwale skażone produktami ropopochodnymi oraz czy celowa introdukcja bakterii endofitycznych ma wpływ na procesy fitoremediacji. Przedstawiona do recenzji praca pod względem formalnym jest opracowana bez zarzutów Jest napisana poprawnym językiem polskimi, zawiera wszystkie elementy rozprawy doktorskiej. Praca obejmuje 129 numerowanych stron. W pracy znajdujemy wykaz stosowanych skrótów wraz z ich angielskojęzycznymi tłumaczeniami. Bardzo czytelne i w pełni odzwierciedlające istotę przeprowadzonych badań streszczenie w języku polskim oraz S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 1

2 angielskim. Wstęp do prac zawarty na stronach od 10 do 35 jest bardzo obszerny i w wielu aspektach wybiega poza merytorycznie zakres problematyki pracy doktorskiej. We wstępnie znajdujemy omówienie aktualnego stanu wiedzy, w oparciu o większość publikacji spośród 248 cytowanych w rozprawie. Autorka podzieliła omówienie aktualnego stanu wiedzy na sześć podrozdziałów. W poszczególnych rozdziałach uwzględniła najważniejsze publikacje dotyczące zagadnień oddziaływania produktów ropopochodnych, możliwości ich detoksykacji oraz roli bakterii endofitycznych w rozwoju roślin. W podrozdziale 1.1. opisała zróżnicowania zanieczyszczeń środowiska produktami ropopochodnymi, ich wpływie na procesy biologiczne zachodzące w glebie oraz na roślinność oraz organizmy glebowe. W podrozdziałach 1.2. i 1.3. znajdujemy bardzo obszerny opis metod bioremediacji oraz fitoremediacji oraz analizę efektywności tych metod w porównaniu do metod fizykochemicznych. Cennym uzupełnieniem informacji zawartych w tych podrozdziałach byłoby uwzględnię roli grzybów i pseudogrzybów oraz mieszanych asocjacji mikroorganizmów glebowych w procesach biodegradacji przedmiotowych zanieczyszczeń w technologiach bioremediacji i fitoremediacji. Brakuje w tych podrozdziałach informacji na temat szlaków metabolizmu głównych składników zanieczyszczeń ropopochodnych, produktów pośrednich oraz możliwości wspomagania tych procesów poprzez odpowiednie nawożenie mineralne jak i organiczne. Cennym jest porównanie przez doktorantkę omawianych metod usuwania zanieczyszczeń ropopochodnych wskazując na ich zalety i ograniczenia jak również porównanie kosztów tych metod. Doktorantka w kolejnych pododdziałach podjęła próbę podsumowania aktualnego stanu wiedzy na temat, roli bakterii endofitycznych w rozwoju roślin oraz czynników warunkujących procesy zasiedlania tkanek roślin głównie w oparciu o badania roślin uprawnych. Powyższe podsumowanie w znacznym stopniu przekracza zakres problematyki przedmiotowej pracy doktorskiej. Jednakże, pewien niedosyt budzi fakt, że doktorantka nie dokonała analizy aktualnego potencjalnych zależności pomiędzy procesami wiązania wolnego azotu, udostępniania fosforu, biosyntezą substancji biologicznie czynnych (fitohormonów, substancji antybiotycznych), odpornością endofitów na roślinne substancje przeciwbakteryjne a procesami degradacji zanieczyszczeń ksenobiotycznych. Tak obszerna analiza mechanizmów zasiedlania jak i kolonizacji tkanek roślin przez bakterie endofityczne oraz ich interakcji z procesami metabolicznym roślin stanowić może samodzielne opracowanie w formie artykułu przeglądowego. Powyższe podrozdziały są moim zdaniem próbą zamieszczenia w pracy doktorskiej wszystkich informacji nawet luźno związanych merytorycznie z zakresem rozprawy. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że w przypadku zagadnień na temat których literatura przedmiotu jest wyjątkowo uboga, tak jak to mamy w odniesieniu problematyki S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 2

3 będącej przedmiotem rozprawy, doktorantka chciała udokumentować swój zakres wiedzy. W ostatnim podrozdziale wstępu 1.6. doktorantka przeprowadziła krótką analizą literatury przedmiotu dotyczącej roli bakterii endofitycznych w fitoremediacji zanieczyszczeń ksenobiotycznych opisując procesy metabolizmu zachodzące w tzw. zielonej wątrobie. Jest to bardzo interesujące i dobrze udokumentowany przegląd literatury przedmiotu W omawianym przeglądzie literatury doktorantka nie uniknęła drobnych nieoprawnych sformułowań. Użycie terminu populacja w stwierdzenie w całej populacji mikroorganizmów (strona 14) jest niepoprawne ponieważ ten termin dotyczy wyłącznie osobników jednego gatunku. Ponadto autorka używa sformułowania ph gleby (strony 12, 14) lub ph wewnątrz tkani roślinnej (strona 19), gdzie powinno być określenie odczyn ponieważ ph jest jedynie miarą odczynu. Podsumowując przedłożony opis aktualnego stanu wiedzy w omawianym rozdziale należy podkreślić, że w literaturze naukowej znajdujemy tylko nieliczne prace dotyczące ocena roli bakterii endofitycznych w procesach fitoremediacji zanieczyszczeń antropogenicznych a badania nad fitoremediacji zanieczyszczeń ropopochodnych na terenach silnie zanieczyszczonych są wręcz unikatowym opracowaniem i fakt ten doktorantka, chyba w poczuciu nadmiernej skromności pomija. Równocześnie należy stwierdzić, że przeprowadzona analiza stanu wiedzy pozwoliła autorce na zdefiniowanie problemu naukowego dotychczas nie rozstrzygniętego w literaturze przedmiotu jak również stanowi uzasadnienie przyjętego modelu badawczego. W oparciu o dokonana analizę literatury przedmiotu we wstępie w rozdziale II. Cel pracy na stronie 36 kandydatka dokładnie i jasno zdefiniowała cele swojej rozprawy. Rozdział III rozprawy Materiały i Metody zawarty na stronach został przygotowany bardzo starannie i dokładnie. Doktorantka rozdział ten podzieliła na 2 główne podrozdziały, w których wyodrębniła dodatkowo szereg podrozdziałów niższego rzędu opisujących szczegółowo materiały, stosowane podłoża, metody izolacji hodowlanych drobnoustrojów degradujących związki ropopochodne, molekularne i biochemiczne metody charakterystyki zespołów drobnoustrojów endofitycznych, opis doświadczeń fitoremediacyjnych, metody analizy zmian w zespołach bakterii oraz poziomu zanieczyszczeń jak również opis poszczególne metody analiz statystycznych. Pewnym mankamentem opisu metod badań jest brak podsumowania cechy wybranych szczepów Rhodococcus erythropolis 5WK oraz Rhizobium sp. 10WK, które uzasadniały ich wybór do modelowych doświadczeń fitoremediacyjnych. Doktorantka pisze, że dokonano wyboru na podstawie badań biochemicznych i genetycznych, jednakże nie wskazała w oparciu o jakie cechy dokonała wyboru tych dwóch szczepów pochodzących z korzeni wiesiołka dwuletniego. Analizując S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 3

4 wyniki badań przedstawionych w rozprawie możemy stwierdzić, iż szereg innych szczepów cechowało się podobnymi właściwościami. Ponadto "olej diesla" powinien być zastąpiony terminem "olej napędowy" zarówno w opisie metod jak i w dalszych rozdziałach. Podsumowując rozdział Materiały i Metody należy stwierdzić, że w pełni spełnia on kryterium weryfikowalności naukowej. Wyniki badań autorka zamieściła na stronach od 54 do 84 w rozdziale IV w 8 podrozdziałach poświęconych poszczególnym zagadnieniom będących przedmiotem badań. Przyjęty układ wraz dokumentacją wyników badań zamieszczona bezpośrednio w tekście w postaci tabel, wykresów i dokumentacji fotograficznej w znacznym stopniu ułatwia bezpośrednie śledzenie toku myślowego autorki. Dokumentacja wyników badań jest czytelna i z reguły nie wzbudza zastrzeżeń, jednakże brak uogólnień poszczególnych podrozdziałów stwarza pewien niedosyt poznawczy. Charakterystyka wyizolowanych bakterii endofitycznych z komonicy zwyczajnej, wiesiołka dwuletniego oraz jastrzębca wysokiego zawarta jest w podrozdziałach Doktorantka, przestawia wyniki ich identyfikacji genotypowej oraz charakterystyki fenotypowe. Opis badań w poszczególnych podrozdziałach cechuje zróżnicowany poziom szczegółowości. Wyniki identyfikacji taksonomicznej, ich pozycja filogenetyczna oraz występowanie w tkankach badanych roślin są bardzo dobrze udokumentowane. Wyniki badań nad wykorzystaniem węglowodorów ropopochodnych, oznaczaniem genów czynnych w procesach transformacji węglowodorów (alkb, alkh, P450, pah, C230), genu dezaminzy ACC (acds) oraz cech fenotypowych odpowiedzialnych za stymulację roślin omówione bardzo lakonicznie. Opisując wykorzystanie węglowodorów ropopochodnych, oleju napędowego oraz n-heksadenu, autorka pisze o udziale w badanych zespołach bakterii zdolnych do degradacji tych związków bez prób powiązania tych cech z oznaczonymi genów czynnych w procesach transformacji węglowodorów oraz nie podjęła próby wskazania specyficznych cech fizjologicznych zespołów bakterii zasiedlających tkanki badanych roślin. Pewien niedosyt w analizie tak bogatych i cennych wyników wzbudza brak próby określenia wzajemnych zależności pomiędzy potencjałem do degradacji badanych węglowodorów, poszczególnymi cechami genotypowymi i fenotypowymi np. poprzez dokonanie analizy skupień. Przykładem takich możliwości może być analiza wyników przedstawionych w Tabeli 4. Na podstawie przedstawionych wyników stosunkowo łatwo można wyodrębnić pewne wspólne cech dla grup badanych izolatów różniących się zdolnościami do degradacji badanych związków. Przykładem tego może być 11 szczepów zdolnych do degradacji oleju napędowego i n-heksadenu, których wspólna cechą było jest S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 4

5 obecność genu P450 wraz z innymi genami kodującymi degradację węglowodorów. Wśród tych szczepów dwa izolaty z komonicy zwyczajnej z rodzaju Tsukamorella (1XL, 5XL) cechowała obecność dodatkowo genu alkh, podobnie u 5 izolatów z wiesiołka dwuletniego z rodzaju Rhodococcus (4WK, 5WK, 6.1.WK, 7WK) stwierdzono również obecność genu alkh i dodatkowo genu alkb, równocześnie w przypadku 4 izolatów, dwa z rodzaju Microbacterium (2CJK, 3RJKA) dwa z rodzaju Pseudomonas (6RJK, 7RJS) z jastrzębca wysokiego dodatkowo do genu P450 wykazano obecność genu pah (oraz u 3 izolatów genu C230. Analogicznie można wskazać specyficzne cechy izolatów zdolnych do degradacji surowej ropy naftowej i oleju napędowego izolowanych z jastrzębca wysokiego (gen C230) odróżniających je od izolatów z dwóch pozostałych badanych roślin. Wykonanie takich analiz pozwoliłoby to na dokonanie precyzyjniejszych uogólnień jak i w dyskusji wyników umożliwiłaby przedstawienie koncepcji opisujących odmienne szlaki degradacji zanieczyszczeń ropopochodnych przez bakterie endofityczne oraz ocenę roli bakterii endofitycznych w adaptacji badanych roślin do rozwoju na skażonych glebach w powiązaniu do badanych cech biochemicznych. Powyższe badania stanowiły podstawę wyboru szczepów zdolnych do wykorzystania surowej ropy naftowej jako jedynego źródła energii do dalszych badań, jednakże brak jest w omówieniu wyników badań poszczególnych cech fizjologicznych i genotypowych uzasadnienia wyboru Rhodococcus erythropolis 5WK oraz Rhizobium sp. 10WK do badań fitoremediacyjnych. Bardzo cenne są wyniki badań bioróżnorodności zespołów bakterii endofitycznych w łodygach, liściach oraz korzeniach komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca wysokiego uzyskane w oparciu o metody pirosekwencjonowania 454. Drobnym mankamentem jest brak na wykresach przedstawionych na rysunku 14 opisu krzywej dla korzeni komonicy. Szczegółowa opis wyników analiz bakteryjnych sekwencji w oparciu o indeksy bioróżnorodności, udziału OTU na poziomie typu, klasy, rzędu czy rodziny ze wskazaniem dominujących jak i charakterystycznych taksonów dla badanych gatunków roślin i poszczególnych tkanek jest bardzo szczegółowy i bardzo dobrze opracowany. Jedynie omówienie wyników analiz PCoA zarówno jakościowej jak i ilościowej wymagało by wskazania komponentów składowych zarówno PC1 i PC2 w powiązaniu z wcześniejszymi opisami bioróżnorodności. Wyniki tych analiz można je uznać za unikalne w literaturze przedmiotu i mogą podstawę do odrębnej publikacji naukowej. Wyniki badań fitoremediacyjnych z wykorzystaniem wybranych szczepów uwzględniają ocenę możliwości wykorzystania wybranych szczepów zarówno do inokulacji gleby jak i zaprawiania nasion. Drobnym mankamentem jest brak opisu użytych skrótów w S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 5

6 opisie tabelach oraz rysunkach Opisy tabel i rysunków powinny spełniać zasadę samodzielnie objaśniających, co nie wymagałyby ponownego powrotu przez czytelnika do opisów zawartych w materiałach i metodach. W opisie wyników użycie sformułowań "nieistotny statystycznie spadek" należy uznać za niefortunne. Jeżeli różnice są statystycznie nieistotne to znaczy, że różnic żadnych nie stwierdzono. Pewne wątpliwości budzi brak wyjaśnienia jak rozróżniano sczep 5WK rif od szczepu 10WK rif w przypadku inokulacji mieszaniną tych dwóch szczepów. Opis wpływu wybranych szczepów bakterii na biomasę życicy trwałej nastręcz pewnych problemów z ich odniesieniem do przedstawionych wyników na rysunku 20 oraz opisu metod w podrozdziałach i Doktorantka pisze, że oznaczano świeżą masę roślin w 14, 31 i 75 dniu doświadczenia (strona 51 i 52), następnie opisuje, jak wyznaczano współczynnik wzrostu roślin, który to omawiany jest w tekście. Równocześnie na rysunku 20 na osi Y mamy opis - biomasa oraz na osi X wyniki oznaczeń biomasy z 14 i 75 dnia doświadczenia po inokulacji gleby jak i nasion i gleby. Brak jest wyjaśnienia w tekście czy jest to biomasa zebrana z jednego wazonu czy biomasa jednej rośliny. Ponadto brak jest wyników po 32 dniach fitoremediacji jak również wyników oznaczeń biomasy i współczynnik wzrostu roślin w wazonach bez inokulacji chociaż takie obiekty uwzględnione są w prezentowanych wynikach oznaczeń liczby kopii genu 16S rrna oraz genu alkh. Opis wyników analiz oznaczeń liczby kopii powyższych genów oraz ocena czynników wpływających na te wskaźniki jest prawidłowa i nie wzbudza zastrzeżeń. Analiza zmian zawartości TPH w glebie w doświadczeniu modelowym, przyrost biomasy życicy, zmiany liczebności badanych genów potwierdzają możliwość wykorzystania wybranych szczepów endofitycznych do inokulacji nasion i gleb w celu intensyfikacji procesów fitoremediacji oraz ich zdolność do zasiedlania tkanek życicy trwałej. Pani mgr M. Pawlik dyskusję wyników swoich badań zamieściła w V rozdziale na stronach podzielonym na sześć podrozdziałów. Według mojego rozeznania autorka uwzględniła wszystkie ważniejsze opublikowane do czasu przygotowania rozprawy prace. W pierwszym z podrozdziałów (5.1.) doktorantka przeprowadza bardzo interesującą dyskusję wyników swoich badań nad bioróżnorodnością hodowalnych i niehodowalnych bakterii endofitycznych na tle literatury przedmiotu. Analiza wyników własnych w podrozdziale 5.2. pod katem wykorzystania węglowodorów przez wyizolowane bakterie endofityczne cechuje nadmierna ogólnikowość. Brakuje moim zdaniem nawiązania do grup bakterii różniących się zdolnościami do degradacji oleju napędowego oraz oleju i n-heksadekanu, które charakteryzowały się podobnymi cechami genetycznymi. W oparciu o taką analizę możliwe było zaproponowanie odmiennych szlaków metabolizmu lub wykorzystania odmiennych S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 6

7 składników ropy przez endofity poszczególnych roślin. Byłoby intersującym przedstawienie przez doktorantkę rozważań nad możliwością degradacji przez wyizolowane endofity różnych frakcji ropy naftowej lub wybranych frakcji ropy naftowej poprzez różne szlaki metabolicznych w oparciu o występowanie lub brak genów oznaczanych w niniejszej rozprawie (alkb, alkh, P450, pah, C230). W kolejnym podrozdziale 5.3. autorka analizuje izolaty pod kątem cech biochemicznych odpowiedzialnych za efekt stymulacji wzrostu roślin, wskazując w wielu punktach, że szereg z tych cecha powiązana jest z możliwością rozwoju w warunkach stresowych. W kolejnych trzech podrozdziały 5,4., 5.5. oraz 5.6. mamy krótkie, lecz rzeczowe analizy wyników badań własnych na tle aktualnych publikacji naukowych. Dyskusja wyników badań własnych wskazuje na bardzo szeroki zakres wiedzy i dobrą znajomość aktualnych publikacji naukowych z zakresu biologicznych metod remediacji gleb skażonych produktami ropopochodnymi. Na podkreślenie zasługuje fakt, że w oparciu o własne wyniki badań dokonała uzupełniającej interpretacji wyników wcześniejszych badań opublikowanych przez innych autorów. Podsumowaniem rozprawy jest ostatni rozdział zawierający wnioski. Autorka na podstawie przedstawionej rozprawy sformułowała 5 wniosków, które w pełni odzwierciedlają wyniki badań własnych doktorantki. W przedstawionej do oceny rozprawie zakres badań obejmował wiele różnorodnych, ale ściśle powiązanych, żmudnych i wymagających dużej wiedzy oraz umiejętności prac eksperymentalnych jak również metod analizy uzyskanych wyników. Przedłożona do recenzji rozprawa doktorska Pani mgr Małgorzaty Pawlik jest ważnym ogniwem w badaniach nad wyjaśnieniem roli bakterii endofitycznych w procesach degradacji ropy naftowej i produktów ropopochodnych oraz możliwości wykorzystania wybranych szczepów w intensyfikacji procesów fitoremediacji. Wymienione uwagi oraz usterki nie mają istotnego wpływu na jakość ocenianej rozprawy. Dodatkowo na podkreślenie zasługuje dorobek naukowy doktorantki. Pani mgr Małgorzata Pawlik jest współautorem 3 oryginalnych prac naukowych opublikowanych w renomowanych międzynarodowych czasopismach naukowych (Environmental Science and Pollution Research, International Journal of Phytoremediation, Journal of Toxicology and Environmental Health) oraz pracy przeglądowej opublikowanej w Postępach Mikrobiologii. Podsumowując ocenę rozprawy doktorskiej Pani mgr Małgorzaty Pawlik w świetle artykułu 13, pkt. 1 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. Nr 65, poz. 595, ze zm. w Dz.U. z 2005 r. nr 164, S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 7

8 poz. 1365) stwierdzam, że przedłożona rozprawa spełnia wymogi ustawowe i w pełni uzasadnia nadanie stopnia naukowego doktora nauk biologicznych. W związku z powyższym wnioskuję do Rady Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego zgodnie z artykułem 14 pkt. 2, ppkt. 3 w/wym ustawy o przyjęcie rozprawy i dopuszczenie jej do publicznej obrony. UZASADNIENIE Rozprawa doktorska Pani mgr Małgorzaty Pawlik stanowi oryginalne rozwiązanie problemu naukowego oraz wykazuje wysoki poziom wiedzy teoretycznej kandydatki w zakresie mikrobiologii i ochrony środowiska jak również umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Jednocześnie biorąc pod uwagę zakres pracy, jej opracowanie, duże znaczenie badanych zagadnień jak i uzyskanych wyników zarówno o charakterze poznawczym jak i stosowanym dla rozwoju tej dziedziny nauki oraz ogólnospołecznym stawiam wniosek o wyróżnienie rozprawy nagrodą. Prof. dr hab. Stanisław J. Pietr S.J. Pietr - Recenzja pracy doktorskiej mgr Małgorzaty Pawlik strona 8