PL B1. Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1 z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 5/071 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1 z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae) (73) Uprawniony z patentu: STEM CELLS SPIN SPÓŁKA AKCYJNA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/07 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/12 (72) Twórca(y) wynalazku: MAREK CEGIELSKI, Wrocław, PL IRENEUSZ CAŁKOSIŃSKI, Wrocław, PL MAREK BOCHNIA, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał WTS Rzecznicy Patentowi PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1 z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae), które znajdują zastosowanie zwłaszcza w leczeniu ubytków kostnych i chrzestnych u ludzi i zwierząt, szczególnie w przypadkach, gdy występuje utrudniony proces gojenia. Komórki te mogą ponadto znaleźć zastosowanie jako modele do testowania aktywności hormonów kostnych. Embrionalne pluripotencjalne komórki macierzyste ES embrional stem cells, z których powstają 3 listki zarodkowe wykazują nieskończoną ilość symetrycznych podziałów bez różnicowania się. Mają one zdolność do kolonizowania linii zarodkowej wywędrowując do grzebieni gonadalnych, gdzie różnicują się w EG embrional germ cells. Populacja ich tworzy się podczas kształtowania gastruli, w prawidłowych warunkach rozwijają się w dojrzałe gamety. EC embrional carcinoma cells wywodzą się z grzebieni gonadalnych, a ich cechami charakterystycznymi są heteroploidalność i duża aktywność czynnika transkrypcyjnego Oct-4 i telomeraza. Są odpowiedzialne za powstawanie teratocarcinoma - nowotworu składającego się z różnorodnych tkanek pochodzących z 3 listków zarodkowych. Dojrzałe komórki macierzyste wytwarzają identyczną kopię siebie przez długi okres oraz komórkę potomną, zróżnicowaną, o charakterystycznych funkcjach i morfologii. Odnaleziono je w takich narządach jak szpik kostny, krew obwodowa, rogówka, siatkówka, miazga zęba, wątroba, skóra, trzustka oraz w jelitach, a także w płucach. Komórki macierzyste w tkankach występują rzadko, np. w szpiku kostnym 1-10/15000, a migrujące ze szpiku do krwi obwodowej w liczbie 1/ Wykazują plastyczność, to znaczy, że komórki macierzyste jednej tkanki mogą się różnicować w dojrzałą komórkę innej tkanki in vitro. Obecnie istnieje wyraźne zainteresowanie komórkami wykazującymi dużą zdolność podziałową, które mogą być modyfikowane genetycznie i stosowane w odnowie wielu tkanek. Alternatywą dla komórek ludzkich, z których stosowaniem związane są problemy natury etycznej, niebezpieczeństwo powstania defektów genetycznych oraz zagrożenie transferem chorób wirusowych i nowotworowych, mogłyby być zmodyfikowane komórki obcogatunkowe. Spośród komórek obcogatunkowych zwrócono uwagę na poroże jeleniowatych, charakteryzujące się szczególnym procesem odnowy i wzrostu. Wyniki przeprowadzonych badań dowodzą, że wśród tych, które uczestniczą w corocznej odnowie poroża obecna jest pula komórek obdarzonych dużym potencjałem proliferacyjnym. Komórki porożogenne są pochodzenia mezenchymalnego, część z nich można zaliczyć do dorosłych somatycznych komórek macierzystych. Każdego roku poroże jeleniowatych (Cervidae), zbudowane z tkanki kostnej, jest zrzucane i odrasta, szybko, w krótkim czasie. Rozwija się ono po urodzeniu, jako przedłużenie zawsze obecnych szypuł i wypustek pnia znajdujących się na kości czołowej. Centra wzrostu, blastema pni i poroża, powstają z wyspecjalizowanego regionu kości czołowej, tak zwanej okostnej antlerogenicznej. Szypuły i wzrastające poroże buduje specyficzna tkanka kostnochrzęstna będąca mieszaniną chrząstki i kości. Poroża występują u wszystkich samców z 39 gatunków rodziny jeleniowatych. Wzrost poroża u jelenia szlachetnego, jego kształt i późniejsza mineralizacja, jest wieloetapowym, skomplikowanym, szybko przebiegającym procesem. Poroże rozrasta się dzięki zmodyfikowanemu kostnieniu śródchrzęstnemu, tak zwanej ossyfikacji endochondralnej. W naszej szerokości geograficznej wzrost poroża jest wyjątkowo gwałtowny w okresie trzech miesięcy, to jest od kwietnia do czerwca. Dwu centymetrowe przyrosty dzienne powodują, że wzrastające poroże jest jednym z najszybciej rosnących organów u ssaków. Wymaga to uaktywnienia i współuczestnictwa wielu typów komórek, a szczególnie istotną rolę w inicjacji i kontynuacji procesu wzrostu mają komórki macierzyste. Nasze badania, którymi objęliśmy wycinki tkanki pochodzącej z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroża jelenia szlachetnego (Cervus Elaphus), pokazują, że wraz ze wzrostem poroża ich część z okostnej antlerogenicznej zmienia swoją lokalizację przemieszczając się stopniowo ku górze. Przeprowadzona analiza i badania nad komórkami macierzystymi prowadzą do wniosku, że wskazane jest wyprowadzenie tych linii, które mogą posłużyć do leczenia tkanek ludzkich i zwierzęcych. Wynalazek dotyczy sposobu wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1 z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae). Istota wynalazku polega na tym, że w płytkiej narkozie przeprowadzonej systemem zdalnej iniekcji, wielokrotnie stosowanej w zabiegach pielęgnacyjnych, pobiera się jałowo wycinki o grubości od 0,4 cm do 1,0 cm i o powierzchni od 1 cm 2 do 2 cm 2 z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego

3 PL B1 3 poroża jeleniowatych (Cervidae). Następnie rozdrabnia się je mechanicznie, aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów. Proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko migracji. Z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej. Hodowlę prowadzi się w standardowych warunkach w atmosferze 5% CO 2 i temperaturze 37 C, przez czas co najmniej trzech pasaży. Wyhodowaną linię komórkową zamraża się i przechowuje w ciekłym azocie w standardowych naczyniach mrożeniowych. W przypadku konieczności zwiększenia zasobów linii komórkowej rozmraża się ją, a następnie poddaje dalszej hodowli w ten sam sposób, w czasie potrzebnym do wytworzenia niezbędnej ilości komórek macierzystych. Zalety sposobu wyprowadzania linii komórek macierzystych według wynalazku, to przede wszystkim standardowe warunki hodowli, duży potencjał proliferacyjny oraz brak problemów natury etycznej, jakie są formułowane wobec badań na ludzkich komórkach embrionalnych. Praktyczna nieśmiertelność komórek hodowlanych, brak cech różnicujących związanych z morfologią badanych komórek oraz dodatnie wyniki niektórych reakcji immunocytochemicznych dowodzą, że wśród badanej populacji komórek występują komórki macierzyste. Wykazujące dużą zdolność podziałową, wyhodowane komórki mogą być modyfikowane genetycznie i stosowane wówczas w odnowie wielu innych tkanek. Stanowią one alternatywę dla komórek ludzkich, z których stosowaniem związane są nie tylko problemy etyczne, lecz także niebezpieczeństwo transferu chorób wirusowych i nowotworowych oraz defektów genetycznych. Ze względu na to, że pozyskiwanie poroża jeleniowatych możliwe jest w około trzymiesięcznym okresie wzrostowym występującym jeden raz w roku, z wyhodowanych, zamrożonych komórek macierzystych należy utworzyć pewien zapas, po czym proces hodowli można w dowolnym okresie roku wznowić, dostosowując ich ilość do aktualnego zapotrzebowania. W badaniach za pomocą mikroskopii elektronowej określano ultrastrukturę, tak komórek hodowlanych, jak i tych pochodzących z wycinków poroża. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę małych owalnych komórek niezróżnicowanych. Okazało się, że w obu przypadkach cechuje je obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości siateczki śródplazmatycznej ziarnistej, mitochondria, wakuole i ziarna glikogenu. Na powierzchni błony komórkowej obserwuje się mikrokosmki. Badania te wykazały, że wśród komórek otrzymanych z hodowli są zawsze obecne małe nieprzytwierdzone, niezróżnicowane, owalne, opalizujące komórki obdarzone dużym potencjałem proliferacyjnym. Komórki te cechują się dużą przeżywalnością, po przetrzymywaniu w ciekłym azocie i późniejszym rozmrożeniu są ponownie aktywne, czyli podejmują swoje życiowe funkcje. Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania zilustrowanym rysunkiem, na którym fig. 1 przedstawia elektronogram komórki macierzystej w bezpośrednim preparacie z poroża, a fig. 2 elektronogram komórki macierzystej uzyskanej drogą hodowli. P r z y k ł a d. Z końcowych bocznych fragmentów wzrastającego poroża jelenia szlachetnego (Cervus Elaphus), w okresie najintensywniejszego wzrostu, w miesiącu maju, pobrano jałowo, w narkozie przeprowadzonej systemem zdalnej iniekcji, podczas zabiegów pielęgnacyjnych we Wrocławskim Ogrodzie Zoologicznym, wycinki o grubości średnio 0,5 cm i powierzchni od 1 do 2 cm 2 o masie 2-3 gramów. Pobrane wycinki rozdrobniono mechanicznie do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach około mikrometrów. Połowę rozdrobnionej tkanki pozostawiono do badań mikroskopowych i mikroskopowo-elektronowych. Z drugiej połowy przeznaczonego do hodowli rozdrobnionego poroża wyizolowano proliferujące komórki, wykorzystując zjawisko migracji. Wyizolowane komórki umieszczono w butelkach hodowlanych. Jako płyn wzrostowy zastosowano medium: SmGM-2 SingleQuots firmy CAMBREX, z dodatkiem L-Glutaminy w ilości 1 mm/ml, penicyliny w ilości 100 j/ml, streptomycyny w ilości 0,1 mg/ml firmy SIGMA. Komórki umieszczono w cieplarce, gdzie rosły w standardowych warunkach w 5% CO 2 i temperaturze +37 C. Linię prowadzano przez cztery miesiące, z wydajnością około 5 milionów komórek w okresie jednego tygodnia. Wyhodowaną linię komórkową poddano zamrożeniu i umieszczono w naczyniach mrożeniowych w ciekłym azocie w temperaturze -176 C. Następnie przeprowadzono badania porównawcze i identyfikacyjne. Badania na części rozdrobnionej tkanki. Do badań mikroskopowych, pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodniony i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych

4 4 PL B1 barwiono hematoksyliną i eozyną (H+E). Na skrawkach parafinowych wykonano reakcje immunocytochemiczne przy użyciu następujących przeciwciał: anty-ki-67 i anty-pcna (markery proliferacji), anty- CD-31 i anty-cd-34 (markery naczyń krwionośnych) oraz anty-cx-cr4, anty-c-kit, anty-thy-1 i anty- Bcrp-1 (markery komórek macierzystych). Materiał do badań mikroskopowo elektronowych utrwalano 2,5% aldehydem glutarolowym w buforze cacodylowym (0,1 M) ph 7,4, a następnie odwoniono i zatopiono w Eponie 812. Skrawki kontrastowano metodą rutynową i oglądano w mikroskopie elektronowym JEM-100 B. Na podstawie badań w mikroskopie świetlnym stwierdzono, że centralną cześć badanych wycinków zajmują naczynia krwionośne, w sąsiedztwie których znajdują się liczne, małe, gęsto ułożone obok siebie komórki. Obwodowo ilość komórek znacznie się zwiększa. Część z nich jest większa i bardziej dojrzała morfologicznie i przypomina komórki chrzęstne (chondroblasty, chondrocyty). Między tymi komórkami pojawia się istota podstawowa z rosnącą ilością włókien kolagenowych. Zewnętrzną warstwą rosnącego poroża jest natomiast unerwiona, unaczyniona skóra owłosiona, tak zwany aksamit. Reakcje immunocytochemiczne przeprowadzone na preparatach histologicznych wykazały dużą ilość komórek proliferujących, z ekspresją antygenów Ki-67 i PCNA. Wyznakowane komórki znajdowały się obok i w obrębie naczyń krwionośnych położonych centralnie w rosnącym porożu. Duża ich część o wyraźnie strefowej lokalizacji znajduje się bardziej obwodowo i położona jest bezpośrednio pod odcinkami wydzielniczymi gruczołów skóry. Wyznakowane komórki obserwuje się zarówno w obrębie samych gruczołów, jak i w warstwie rozrodczej naskórka. Reakcja na obecność markerów proliferacji naczyń CD31, CD34 była negatywna. Pozytywne znakowanie z użyciem specyficznych przeciwciał anty-bcrpl i anty-c-kit, znakujących komórki macierzyste uzyskano natomiast w strefie intensywnych podziałów komórkowych między skórą, a bezpośrednio leżącą pod nią ochrzęstną. Badania na wyprowadzonej linii komórek macierzystych. Po kilku dniach obserwacji hodowli komórkowej w mikroskopie odwróconym kontrastowofazowym, zaobserwowano spontaniczne podziały i różnicowanie się komórek. Podobne obrazy uzyskano na preparatach mikrohodowli barwionych metodą H+E. W hodowli zawsze obecne są małe nieprzytwierdzone, niezróżnicowane, owalne, opalizujące komórki. Z czasem rosnąc stają się większe, uzyskując obwodowe wypustki, którymi niejednokrotnie łączą się między sobą, a także z podłożem. Wzrost komórek jest nieograniczony i po wielu pasażach zachowują one swą aktywność podziałową. Na preparatach mikrohodowli wykonano reakcje immunocytochemiczne, podejmując próbę wyznakowania komórek macierzystych. Zastosowano specyficzne przeciwciała znakujące je: anty- CXCR4, anty c-kit, anty-thy-1 i anty-bcrp-1. Specyficzną dodatnią reakcję błonową uzyskano tylko w małych, owalnych, często dzielących się komórkach z przeciwciałami anty c-kit i anty-thy-1. Nie obserwowano ekspresji antygenów-bcrp-1 i CXCR4. Nie wykazano także ekspresji żadnych ww. antygenów w komórkach bardziej zróżnicowanych, posiadających wypustki. Mikroskopią elektronową badano ultrastrukturę tak komórek hodowlanych jak i tych pochodzących z wycinków poroża. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę małych owalnych komórek niezróżnicowanych. W obu przypadkach cechuje je obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości siateczki śródplazmatycznej ziarnistej, mitochondria, wakuole i ziarna glikogenu. Na powierzchni błony komórkowej obserwuje się mikrokosmki (fig. 1 i fig. 2). Po założeniu hodowli komórkowej okazało się, że wśród nich są zawsze obecne małe, nieprzytwierdzone, niezróżnicowane, owalne, opalizujące komórki obdarzone dużym potencjałem proliferacyjnym. Komórki te cechują się dużą przeżywalnością, po przetrzymywaniu w ciekłym azocie i późniejszym rozmrożeniu są nadal aktywne w związku z tym, na preparatach mikrohodowli wykonano reakcje immunocytochemiczne, stosując specyficzne przeciwciała znakujące je: anty-cxcr4, anty c-kit, anty-thy-1 inty-bcrp-1. Specyficzną dodatnią reakcję błonową uzyskano tylko w małych, owalnych, często dzielących się komórkach z przeciwciałami anty c-kit i anty-thy-1. Nie obserwowano ekspresji antygenów-bcrp-1 i CXCR4. Nie wykazano także ekspresji żadnych badanych antygenów w komórkach bardziej zróżnicowanych posiadających wypustki. Pozytywny wynik reakcji immunocytochemicznej uzyskano również na skrawkach parafinowych, używając specyficznych przeciwciał znakujących komórki macierzyste z przeciwciałami anty-bcrpl i anty-c-kit. Badania ultrastrukturalne małych, owalnych, niezróżnicowanych komórek hodowlanych oraz pochodzących z wycinków poroża potwierdziły ich duże podobieństwo morfologiczne. Komórki te w obu przypadkach cechuje obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem.

5 PL B1 5 Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości siateczki śródplazmatycznej ziarnistej, mitochondria i wakuole. Obecność ziaren glikogenu w cytoplazmie upodabnia je do komórek embrionalnych. Na powierzchni błony komórkowej obserwuje się mikrokosmki. Komórki te jako niezróżnicowane nie posiadają żadnych cech charakterystycznych, a występujące w nich organelle komórkowe predysponują je do podjęcia aktywnej syntezy białek. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wyprowadzenia stabilnej linii komórek macierzystych z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae), znamienny tym, że z końcowych bocznych fragmentów wzrastających poroża jeleniowatych (Cervidae), pobiera się jałowo wycinki, korzystnie o grubości od 0,4 cm do 1,0 cm i o powierzchni od 1 cm 2 do 2 cm 2, które następnie rozdrabnia się mechanicznie, korzystnie aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów, zaś proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko ich migracji, natomiast z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej i roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej, przy czym hodowlę prowadzi się w standardowych warunkach, zwłaszcza w 5% CO 2 i temperaturze 37 C, przez czas potrzebny do co najmniej trzech pasaży, po czym wyhodowaną linię komórkową zamraża się i przechowuje w ciekłym azocie, standardowych naczyniach mrożeniowych, przy czym uzyskiwana jest stabilna i nieśmiertelna linia komórek macierzystych. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku konieczności zwiększenia zasobów linii komórkowej rozmraża się ją a następnie poddaje hodowli w ten sam sposób, w czasie potrzebnym do wytworzenia niezbędnej ilości komórek macierzystych.

6 6 PL B1 Rysunki Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)