Cell cultures for tissue engineering Hodowle komórkowe w inżynierii tkankowej

Transkrypt

1 Artroskopia i Chirurgia Stawów, 2006; 2(4): X-X Arthroscopy and Joint Surgery, 2006; 2(4): X-X Received: 2006.XX.XX Accepted: 2006.XX.XX Published: 2006.XX.XX Cell cultures for tissue engineering Hodowle komórkowe w inżynierii tkankowej Anna Kaźnica 1, Tomasz Rawo 2, Jarosław Deszczyński 2, Konrad Słynarski 2 1 Department of Tissue Engineering, CM Bydgoszcz UMK Toruń, Toruń, Poland 2 Department of Orthopedic Surgery and Rehabilitation, 2 nd Medical Faculty of Warsaw Medical University, Warsaw, Poland Summary The regenerative potential of the hyaline articular cartilage is restricted. The problem is caused by the histological properties of the tissue, which has neither blood supply, nerves nor lymphatic drainage, the number of cells is also small. The modern, widely used techniques usually have unsatisfactory outcomes. Methods based on cell transplantation are believed to be most promising. In vitro monolayer cell culture and multiplying of the cells are the most important parts of whole procedure. Harvested tissue is transported to the laboratory. It s a technique performed in laboratory. The sequence of the stages: cell isolation with enzymes, primary cell culture with use of medium, cell culture needs regular passage. The multiplied cells may be frozen and stored, as well as may be delivered as a suspension to the operating room. The suspension fills the defect. We believe this article would be a short review of cell culture techniques, and equipment of the cell culture laboratory, addressed to the surgeons who are curious what happens with harvested cartilage samples in laboratories key words: słowa kluczowe: tissue engineering articular cartilage chondrocytes culture autologous chondrocyte implantation inżynieria tkankowa chrząstka stawowa hodowla chondrocytów przeszczepianie autologicznych chondrocytów Word count: XXX/XXX Tables: / Figures: 11 References: 37 Author s address: Adres autora: Department of Tissue Engineering, CM Bydgoszcz UMK Toruń, Toruń, Poland, a.kaznica@wp.pl 1

2 Artroskopia i Chirurgia Stawów, 2006; 2(4): X-X Kaźnica A i wsp. Hodowle komórkowe w inżynierii tkankowej WPROWADZENIE Problem naprawy ubytków chrzęstnych stawu przyciąga uwagę wielu badaczy, nie tylko ortopedów. Chrząstka stawowa nie posiada zdolności regeneracyjnych, a nie leczone uszkodzenia w konsekwencji prowadzą do degeneracji stawu [1 5]. Problem ten jest znany od czasów Hipokratesa [6]. Dotychczasowe tradycyjne metody leczenia uszkodzeń są niewystarczające. Ostatnio coraz większą popularnością cieszy się inżynieria tkankowa. Metody oparte na niesteroidowych lekach przeciwzaplanych (NLPZ), steroidach, preparatach glukozaminy mają ograniczone zastosowanie i skuteczność. Bentley w 1981 stwierdził brak różnicy pomiędzy preparatami aspiryny a placebo zastosowanymi u pacjentów z chondromalacją rzepki [7]. Hunt udowodnił, iż metody artroskopowe (mikrozłamania, nawiercanie podchrzęstnej, abrazja) mają ograniczoną efektywność, a wskazania są ograniczone jedynie do grupy pacjentów z ostrym bólem, uszkodzeniami łąkotek, prawidłową osią kończyny i minimalnymi zmianami w radiogramach. [8]. Największe nadzieje wiąże się z implantacją autologicznych chondrocytów (ACI). Oryginalna procedura przeszczepów autologicznych opiera się na [9 11]: 1. biopsja zdrowej tkanki ( mg), 2. uwolnienie chondrocytów z macierzy pozakomórkowej, 3. hodowla komórkowa, 4. po osiągnięciu liczby 1 miliona komórek/cm 2, wyhodowane komórki są gotowe do implantacji, 5. przeszczepienie autologicznych chondrocytów po łatę z okostnej. BIOPSJA LUDZKIEJ CHRZĄSTKI STAWOWEJ Procedura pobrania próbek chrząstki w Klinice Ortopedii i Rehabilitacji II Wydziału Lekarskiego Akademii Medycznej w Warszawie opiera się na artroskopii. Chrząstka jest pobierana w trakcie zabiegu artroskopii stawu kolanowego. Dojście pokazano na Rycinie 1. Zwykle wykorzystuje się dojścia typowe przednio-boczne i przednio-przyśrodkowe. Biopsja powinna zostać wykonana na powierzchni nie obciążanej kłykcia kości udowej (Rycina 2) lub z dołu międzykłykciowego. Pobierak wykorzystywany do pobierania wycinków chrząstki pokazano na Rycinie 3. Uzyskaną próbkę przedstawiono na Rycinie 4. Pobranie chrząstki pełnej grubości z małym fragmentem kości podchrzęstnej umożliwia wygojenie miejsca pobrania [9 11]. Pobraną próbkę umieszcza się w medium transportowym (PBS Phosphate Buffered Saline Buforowany roztwór soli fizjologicznej, z antybiotykami i lekami przeciwgrzybiczymi). Ostatnim stadium jest pobranie krwi pacjenta celem izolacji ludzkiej surowicy. Próbka krwi po izolacji surowicy jest przedstawiona na Rycinie 5. Próbka chrząstki oraz surowica są wysyłane do laboratorium. IZOLACJA Zewnątrzkomórkowa macierz składa się z kilku makromolekuł (Rycina 6): proteoglikanów, hialuronianu i białek zatopionych w szkielecie fibryli kolagenowych zawierających głównie kolagen typu II (90%) i niewielkie ilości kolagenu typu IX i XI [1 2,12,15 20]. 2 BACKGROUND The problem of cartilage repair draws researchers attention, not only the orthopeadic surgeons. Articular cartilage has a very limited capacity to regenerate and untreated defects lead to degeneration of joints [1 5]. The problem has been well known since Hippocrates [6]. Current traditional methods of cartilage repair are not good enough. Tissue engineering methods have gained popularity recently. Cartilage engineering for reconstruction may provide alternative solutions. Methods based on use of nonsteroid antiinflammatory agents (NSAID), steroids, glucosamine have limited indications and effectiveness. Bentley in 1981 poved, that is no difference between aspirin and placebo, after 3-month of pharmacotherapy in patients with chondromalacia of the patella. [7]. Hunt proved that arthroscopic procedures (microfracture, subchondral drilling, abrasion arthroplasty), have limited effectiveness, and the indications are limited to the cases with acute onset of pain, meniscal lesions, normal lower extremity alignment and minimal radiographic changes [8]. The greatest hopes are connected with autologous chondrocyte implantation (ACI) [9 14]. Original Brittberg s conception of autologous graft is based on [9 11]: 1. biopsy of health human cartilage ( mg), 2. chondrocytes release from extracellular matrix, 3. cell culture, 4. after obtain 1 million of cells/1 cm 2, cultured chondrocytes are ready to implantation, 5. autologous chondrocyte are injected under a flap of periosteum. BIOPSY OF THE HUMAN ARTICULAR CARTILAGE The procedure of cartilage samples collection in Department of Orthopedic Surgery and Rehabilitation. 2 nd Medical Faculty of Warsaw Medical University is based on arthroscopy. A sample of the tissue is harvested during the arthroscopic surgery. Typical arthroscopic approach to the knee joint is showed on Figure 1. We usually use antero-lateral and antero medial portal for the biopsy. The biopsy should be taken from non-bearing surface of the femoral condyle (Figure 2) or intercondyllar fossa. A ring curette used for harvesting of the cartilage is showed on Figure 3. A sample of the cartilage harvested during the arthroscopy is showed on Figure 4. Taking the full thickness specimen with small sample of subchondral bone allows healing of the biopsy site [9 11]. Harvested specimen is placed into transportation medium (PBS Phosphate Buffered Saline, with antibiotics and atimycotics). Taking the patient s blood sample for serum isolation is the last stage of the biopsy process. A blood sample after serum isolation is showed on Figure 5. The sample and serum are sent to the laboratory. ISOLATION Articular cartilage is an avascular tissue with chondrocytes embedded within extracellular matrix (Figure 6). Hyaline cartilage chondrocyte are surrounded with an abundant

3 Arthroscopy and Joint Surgery, 2006; 2(4): X-X Kaźnica A et al Cell cultures for tissue engineering Rycina 4. Pobrana próbka chrząstki. Próbka: Pełnej grubości, wymiary, 5 8 mm. Figure 4. Harvested sample of the cartilage. The specimen: Full thickness specimen, 5 8 mm. Rycina 1. Artroskopia dojście przednio-boczne. Figure 1. Arthroscopy antero-lateral portal. Rycina 5. Wyizolowana surowica. Próbka krwi pobranej od pacjenta jest odwirowywana celem izolacji surowicy. Figure 5. Isolated serum. Blood sample taken from the patient is centrifuged for serum isolation. Rycina 2. Biopsja zdrowej ludzkiej chrząstki stawowej. W trakcie artroskopii, próbkę pobiera się z powierzchni nie obciażanej kłykci kości udowej. Figure 2. Biopsy of health human cartilage. During the arthroscopy, a sample is taken from the non-bearing surface of the femoral condyles. Rycina 6. Chondrocyty otoczone macierzą pozakomórkową. Figure 6. Chondrocytes embedded within extracellular matrix Rycina 3. Pobierak. Figure 3. A ring curette. Podstawowym zadaniem jest uwolnienie chondrocytów z otaczającej macierzy. Dotychczasowe metody izolacji chondrocytów bazują na enzymatycznej degradacji zewnątrzkomórkowej macierzy [21,22]. Jest to najbardziej wydajny proces uzyskiwania komórek. Najbardziej popularne enzymy to: kolagenaza degradująca sieć kolagenową, najczęściej stosuje się kolagenazę bakteryjną z Clostridium histolyticum, proteinaza lub trypsyna trawiąca proteoglikany, hialuronidaza, która degraduje kwas hialuronowy, matrix that mediates in nutritious and respiratory processes of the cartilage. The extracellular matrix is composed of macromolecules: proteoglycan or aggrecan, hyaluronan and collagen fibrils that consist mainly of type II collagen (90%) and smaller amounts of types IX and XI collagens [1,2,12,15 20]. Basic task is to relase the chondrocyte from surrounding matrix. Current researches of chondrocyte isolation are based on degrading the extracellular matrix [21,22]. That is the most eficcient way for obtaining the cells. The most common enzymes are: collagenase that digests the collagen network, pronase or trypsin to digests protein of proteoglycans, hyaluronidase which degrades hyaluronic acid, DNAse to digests DNA relasing from dead cells [19]. 3

4 Artroskopia i Chirurgia Stawów, 2006; 2(4): X-X Kaźnica A i wsp. Hodowle komórkowe w inżynierii tkankowej Rycina 7. Wyizolowane chondrocyty w trakcie oceny żywotności. Chondrocyty wyizolowano w trakcie 24-godzinnego procesu trawienia enzymatycznego z użyciem kolagenazy w stężeniu 1,5 mg/ml. Do zawiesiny dodano błękit trypanu celem oceny żywotnosci. Błękit trypanu przedostaje się do martwych komórek, nadając im niebieski kolor. Komórki żywe są jasne. Na zdjęciu widać ponadto linie komory Neubauera. Figure 7. Isolated chondrocytes during the viability count. Chondrocytes have been isolated after 24-hour enzymatic bath in 1,5 mg/ml collagenase. A trypane blue has been added into cell suspension for evaluation of the cell vivacity. Trypane blue enters the dead cells and causes a blue pigmentation. Living cells are fair, white. Lines of Neubauer chamber are also seen on the picture Rycina 9. Hodowla chondrocytów 24 godziny po wysianiu. Figure hours chondrocytes culture. Rycina 10. Surowica autologiczna. Figure 10. The autologous serum. Rycina 8. Inkubator z warunkami hodowli (temperatura z lewej 37 C, stężenie 5% CO 2 po prawej). Figure 8. Incubator with cultures conditions (temp on the left 37 C, 5% CO 2 on the right). DNAza w celu usunięcia DNA uwalniającego się z martwych komórek. Generalnie izolację chondrocytów przeprowadza się w dwóch etapach: preinkubację z enzymami proteolitycznymi (trypsyną lub pronazą), właściwa inkubacja z kolagenazą typu II w medium pozbawionym surowicy w temperaturze 37 stopni z wstrząsaniem [20]. Hialuronidaza może być dodana do każdego etapu izolacji. Protokoły różnią się stężeniami enzymów, ich kombinacją i czasem inkubacji [19]. Uważa się, że z 1 g chrząstki można wy- 4 Rycina 11. Zawiesina chondrocytów gotowa do implantacji. Figure 11. Suspension of chondrocytes ready to injection. In general chondrocyte isolation protocol is carried out in two stages: 1. predigestion with proteolytic enzyme (protease or trypsin), 2. and digestion with a collagenase type II into serum free medium at 37 C with shaking [20]. Hyaluronidases may be added in any step of isolation. Protocols differ with respect to enzymes, concentrations,

5 Arthroscopy and Joint Surgery, 2006; 2(4): X-X Kaźnica A et al Cell cultures for tissue engineering izolować chondrocytów [19]. Wyizolowane komórki w trakcie oceny żywotności przedstawiono na rycinie7 HODOWLA PIERWOTNA Uzyskane w ten sposób żywe chondrocyty, zawieszone w medium, przenosi się do naczyń hodowlanych i hoduje w sterylnych warunkach inkubatora w temperaturze 37 C i 5% CO 2 [23]. Inkubator przedstawiono na Rycinie 8. Komórki rozpłaszczają się na dnie naczynia i zaczynają proliferować. Na Rycinie 9 przedstawiono hodowlę przyklejoną do dna butelki hodowlanej. Hodowle trójwymiarowe mogą być prowadzone przy wykorzystaniu bioreaktora i biowchłanialnych rusztowań (scaffolds) [24 29]. Komórki, aby rosnąć, potrzebują dostarczania substancji odżywczych. Media, które dostarczają komórkom składników odżywczych wymienia się co 2 dni. Najczęściej stosowanym medium do hodowli chondrocytów to DMEM lub HAM S F- 12. Media te zawierają witaminy, aminokwasy, glukozę i azotany żelaza [30]. Do prowadzenia hodowli należy dodać jednak jeszcze inne substancje: surowicę, zawierającą czynniki i hormony stymulujące wzrost i funkcje komórek, czynniki adhezyjne. Zawiera ona białka nośnikowe wielu hormonów, buforuje hodowlę i neutralizuje efekty toksyczne. Aby uzyskać zadowalający wzrost komórek potrzebne jest dodanie 10 20% surowicy do pożywki. Stosuje się różne surowice. Najlepsza jednak jest surowica autologiczna, gdyż eliminuje ryzyko zainfekowania prionami. Surowicę autologiczną przedstawiono na Rycinie 10, antybiotyki i leki przeciwgrzybicze celem ochrony przed zakażeniem bakteryjnym lub grzybiczym, inne substancje jak: czynniki wzrostu, kwas askorbinowy, lipidy [20]. Wzrost komórek kontynuowany jest do momentu uzyskania 1 miliona chondrocytów/cm 2 ubytku. Ilość ta jest wystarczająca do implantacji [31]. Komórki mogą zostać zamrożone i przechowywane lub dostarczone do Sali operacyjnej w postaci zawiesiny. Rycina 11 przedstawia strzykawkę z zawiesiną komórkową, gotową do implantacji. PODSUMOWANIE Technika ACI jest akceptowaną metodą leczenia ubytków chrząstki stawowej dla wielu pacjentów. Hodowla jednowarstwowa umożliwia przeprowadzenie tej procedury. Dalsze badania skupiają się na prowadzeniu hodowli trójwymiarowych z wykorzystaniem alginatu, matryc z kwasu hialuronowego lub kolagenu oraz bioresorbowalnych rusztowań (scaffolds) [24 29,32 37]. Prowadzenie badań z wykorzystaniem ludzkiej chrząstki stawowej jest zadaniem dość trudnym. Izolacja i utrzymanie chondrocytów w warunkach hodowli przysparza problemów [20]. Jednakże, szybki rozwój inżynierii tkankowej umożliwia poprawę warunków prowadzenia hodowli i daje nowe możliwości leczenia ubytków chrząstki. Inżynieria tkankowa jest bardzo użytecznym narzędziem w rękach ortopedy. Chondrocyty wykorzystano również w badaniach nad skutecznością leków przeciwzapalnych i chondroprotekcyjnych [20]. combinations and incubations times. Ones consider that it s possible to isolate cells/gram of cartilage [19]. Isolated cells, during the vivacity count are showed on picture 7 PRIMARY CULTURE The obtained chondrocytes are resuspended in media and transferred into sterile culture flasks. The bottles with cells are maintained in sterile conditions of incubator, at 37 C and 5% carbon dioxide [23]. The incubator is showed on Figure 8. Cells are flattening at the bottom of the bottle and start to proliferate. On the Figure 9 we can see the culture flattened on the bottom of the flask. A 3-D culture may be lead with use of bioreactor and biodegradable scaffolds [24 29]. Medium, which supplies cells in nutrients, should be exchanged every 2 days. Most popular culture media for chondrocyte are DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Media) and Ham F-12 (Nutrient Mixture F-12). They consist of vitamins, amino acids, glucose and inorganic salts [30]. To maintain the growth of cells it s necessary to add other substances: serum which is mixture of proteins, growth factors and hormones. Serum buffers the culture of cells and neutralizes toxic effects. Fetal Bovine Serum (FBS) is used most commonly, but the best serum is an autologous since eliminates the risk of prion s infection. The autologous serum is showed on the Figure 10. antibiotics and antimycotics which prevent contamination with bacteria and/or fungus. and other substances like: growyh factors, ascorbid acid, lipids [20]. The growth of cells is being continued till achiving 1 million of chondrocytes/cm 2. That amount is enough for implantation [31]. The cells may be frozen and stored, or may be delivered to the operating room as a suspension. Figure 11 shows the syringe with cell suspension ready for injection. SUMMARY ACI technique in cartilage repair is accepted method of treatment for many patients. A monolayer cell cultures makes this procedure possible. The further research should focus on 3D cultures with alginate, hyaluronic or collagen matrices and bioresorbable scaffolds [24 29,32 37]. Researching with human cartilage is quite difficult, it s not easy to isolate and maintain chondrocytes in culture [20]. However a quick development of tissue engineering allows improving of culture condition and gives new opportunities of treating cartilage defects. Tissue engineering is a very useful tool in orthopedics. Recently human chondrocytes have been tested in pharmacology studies to verify the effects of anti-inflammatory and chondroprotective drugs [20]. 5

6 Artroskopia i Chirurgia Stawów, 2006; 2(4): X-X Kaźnica A i wsp. Hodowle komórkowe w inżynierii tkankowej PIŚMIENNICTWO: 1. Wirth, C, Rudert, M: Techniques of Cartilage Growth Enhancement: A Review of the Literature. Arthroscopy, 1996; 12(3): Marlovits S, Zeller P, Singer P et al: Cartilage repair: Generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur J Radiol, 2006; 57: Hunziker E: Articular cartilage repair: are the intrinsic biological constraints undermining this process insuperable? Osteoarthritis and Cartilage, 1999; 7: Darling E, Hu J, Athanasiou K: Zonal and topographical differences in articular cartilage gene expression. J Orthop Res, 2004; 22: Barnewitz D, Endres M, Kruger I et al: Treatment of articular cartilage defects in horses with polymer-based cartilage tissue engineering grafts. Biomaterials, 2006; 27: Hunter W: On the structure, and diseases of articulating cartilage. 1743: Clin Orthop Relat Res, 1995; (317): Bentley G, Leslie IJ, Fischer D: Effect of aspirin treatment on chondromalacia patellae. Ann Rheum Dis, 1981; 40(1): Hunt SA, Jazrawi LM, Sherman OH: Arthroscopic management of osteoarthritis of the knee. J Am Acad Orthop Surg, 2002; 10(5): Brittberg M et al: Clonal growth of human articular cartilage and the functional role of the periosteum in chondrogenesis. Osteoarthritis Cartilage, 2005; 13(2): Brittberg M et al: Articular cartilage engineering with autologous chondrocyte transplantation. A review of recent developments. J Bone Joint Surg Am, 2003; 85-A(Suppl.3): Brittberg M: Autologous chondrocyte transplantation. Clin Orthop Relat Res, 1999; (367 Suppl.): S Wu, W, Lyu, S, Hsieh W: Cryopreservation and biophysical properties of articular cartilage chondrocytes. Cryobiology, 2005; 51: Minas T, Peterson L: Chondrocyte transplantation. Operative Techniques in Orthopaedics, 1997; 7(4): Jakob R, Mainil-Varlet P, Gautier E: Isolated articular cartilage lesion: repair or regeneration. Osteoarthritis and Cartilage, 2001; 9: S3 S5 15. Garimella R, Bi X, Camacho N et al: Primary culture of rat growth plate chondrocytes: an in vitro model of growth plate histotype, matrix vesicle biogenesis and mineralization. Bone, 2004; 34: Dharmavaram R, Huynh A, Jimenez S: Characterization of Human Chondrocyte and Fibroblast Type XII Collagen cdnas. Matrix Biology, 1998; 16: Guilak F, Jones, W Beall et al: The deformation behavior and mechanical properties of chondrocytes in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage, 1999; 7: Almqvist KF, Wang L, Broddelez C et al: Biological freezing of human articular chondrocytes. Osteoarthritis and Cartilage, 2001; 9: Hidvegi NC, Sales KM, Izadi D et al: A low temperature method of isolating normal human articular chondrocytes. Osteoarthritis and Cartilage, 2006; 14: REFERENCES: 20. Patti AM, Gabriele A, Della Rocca C: Human chondrocyte cell lines from articular cartilage of metatarsal phalangeal joints. Tissue and Cell, 1999; 31(6): Nixon AJ, Lust G, Vernier-Singer M: Isolation, propagation, and cryopreservation of equine articular chondrocytes. Am J Vet Res, 1992; 53(12): Hu DN et al: Isolation and cultivation of human articular chondrocytes. Kaohsiung J Med Sci, 2002; 18(3): Brodkin KR, Garcia AJ, Levenston ME: Chondrocyte phenotypes on different extracellular matrix monolayers. Biomaterials, 2004; 25: Wang X et al: Tissue engineering of biphasic cartilage constructs using various biodegradable scaffolds: an in vitro study. Biomaterials, 2004; 25: Nagel-Heyer S, Goepfent Ch, Feyerabend F et al: Bioreactor cultivation of three-dimensional cartilage-carrier-constructs. Bioprocess Biosyst Eng, 2005; 27: Meyer U, Büchter A, Nazer N, Wiesmann HP: Design and performance of a bioreactor system for mechanically promoted three-dimensional tissue engineering. J Oral Maxillofac Surg, 2006; 44: Pisu M, Lai N, Cincotti A et al: Modeling of engineered cartilage growth in rotating bioreactors. Chemical Engineering Science, 2004; 59: Martin I, Wendt D, Heberer M: The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol, 2004; 22(2): Pörtner R, Nagel-Heyer S, Goepfert Ch et al: Bioreactor Design for Tissue Engineering. J Biosci Bioeng, 2005; 100(3): Schantz JT: A Manual for Primary Cell Culture. World Scientific, Brittberg M et al: Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transpalantation. N Engl J Med, 1994; 331(14): Klompmaker J et al: Porous polymer implants for repair of full-thickness defects of articular cartilage: an experimental study in rabbit and dog. Biomaterials, 1992; 13(9): Oxley HR et al: Macroporous hydrogels for biomedical applications: methodology and morphology. Biomaterials, 1993; 14(14): van Susante JL et al: Chondrocyte-seeded hydroxyapatite for repair of large articular cartilage defects. A pilot study in the goat. Biomaterials, 1998; 19(24): Nehrer S et al: Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials, 1998; 19(24): Cohen SB et al: The use of absorbable co-polymer pads with alginate and cells for articular cartilage repair in rabbits. Biomaterials, 2003; 24(15): Barnewitz D et al: Treatment of articular cartilage defects in horses with polymer-based cartilage tissue engineering grafts. Biomaterials, 2006; 27(14):