Załącznik III AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM

Transkrypt

1 Dr inż. Dorota Banaszewska Katedra Metod Hodowlanych, Hodowli Drobiu i Małych Przeżuwaczy Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach ul. Bolesława Prusa Siedlce Załącznik III AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM

2 1. Imię i Nazwisko Dorota Banaszewska 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. magister inżynier zootechniki, Wydział Rolniczy, Wyższa Szkoła Rolniczo- Pedagogiczna w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo- Humanistyczny w Siedlcach), r. doktor nauk rolniczych w zakresie zootechniki, Wydział Rolniczy, Akademia Podlaska w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo- Humanistyczny w Siedlcach), na podstawie rozprawy doktorskiej pt. Ocena dojrzałości rozpłodowej i przydatności do inseminacji knurów różnych ras na podstawie zmian jakości ejakulatów, r., promotor: prof. dr hab. Stanisław Kondracki. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych. asystent, Katedra Zoohigieny i Profilaktyki Weterynaryjnej, Wydział Rolniczy, Akademia Podlaska w Siedlcach, r r. adiunkt, Katedra Rozrodu i Higieny Zwierząt, Wydział Przyrodniczy, Akademia Podlaska w Siedlcach (od 2010 roku Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach), r r. adiunkt, Katedra Metod Hodowlanych, Hodowli Drobiu i Małych Przeżuwaczy, Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, r. do chwili obecnej. 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a. tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego. Cykl sześciu publikacji naukowych pod tytułem: Rola techniki barwienia w ocenie plemników ssaków. b. Wykaz prac (autor/autorzy, rok wydania, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa) dokumentujący osiągnięcie naukowe: O.1. Andraszek K., Banaszewska D., Wójcik E., Szostek M., Czubaszek M., Walczak- Jędrzejowska R. 2014, The use of silver nitrate for the assessment of seminologic semen parameters in selected farm and wild animal species. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 58,

3 O.2. Banaszewska D., Andraszek K., Zdrowowicz E., Danielewicz A. 2015, The effect of selected staining techniques on stallion sperm morphometry. Livestock Science, 175, , DOI: /j.livsci O.3. Banaszewska D., Andraszek K., Szostek M., Wójcik E., Danielewicz A., Walczak- Jędrzejowska R Analysis of stallion seminologic semen parameters. Medycyna Weterynaryjna, 71 (9), O.4. Banaszewska D., Czubaszek M., Walczak-Jędrzejowska R., Andraszek K. 2015, Morphometric dimensions of the stallion sperm head depending on the staining method used. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 59, O.5. Banaszewska D., Andraszek K., Czubaszek M., Biesiada-Drzazga B The effect of selected staining techniques on bulls sperm morphometry. Animal Reproduction Science, 159, 17-24, DOI: O.6. Banaszewska D., Zdrowowicz E., Czubaszek M. Walczak-Jędrzejowska R., Andraszek K. 2015, The role of staining techniques in seminological analysis of mammalian semen. Folia Pomeranae Universitatis Technologiae Stetinensis, Agricultura Alimentaria Piscaria et Zootechnica, 320 (35), 3, Wkład wnioskodawcy w wyżej wymienione prace przedstawiono w załączniku V, natomiast oświadczenia współautorów w załączniku VII. c. omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Dokładana ocena nasienia jest niezbędna w przewidywaniu płodności samców i ma bardzo duże znaczenie w maksymalizacji ich wydajności reprodukcyjnej, zarówno w naturalnych warunkach, jak i w technikach wspomaganego rozrodu (Rodriguez i in., 2001). Podstawowymi parametrami nasienia, uwzględnianymi podczas analiz laboratoryjnych są koncentracja plemników, ich ruchliwość i morfologia. Przy prawidłowej zdolności rozrodczej samca wszystkie trzy parametry powinny charakteryzować się optymalnymi wartościami, jednak kluczowe znaczenie ma morfologiczna budowa plemnika (Keel i in., 2002; Oral i in., 2002; Maree i in., 2010; Singh i in., 2011; Lasiene i in., 2013). Plemnik morfologicznie nieprawidłowy może mieć widoczne nieprawidłowości w obrębie główki, wstawki, bądź witki. Czasami zdarza się, że plemnik ma więcej niż jeden defekt, co sprawia że taka komórka nie posiada odpowiednich możliwości do pokonania drogi do oocytu i w efekcie nie ma zdolności zapładniającej (Tasdemir i in., 2002). Przy określaniu zdolności zapładniającej osobnika wykazano, że nawet plemniki wykazujące prawidłowy ruch, ale mające np. defekty główki nie są zdolne do zapłodnienia (Morales i in., 1988). Plemniki są wyjątkowym typem komórek, ponieważ w przeciwieństwie do innych komórek tkankowo specyficznych, u ssaków występują w zróżnicowanych rozmiarach i kształtach (Gage, 1998; Gage i Freckleton, 2003). Mikroskopowe badanie nasienia pokazuje, że morfologia plemników w jednym ejakulacie jest wyraźnie niejednorodna. Identyfikowane są plemniki różniące się rozmiarem i nieznacznie kształtem, wykazujące przy tym prawidłową budowę morfologiczną. To zróżnicowanie plemników w ejakulacie jest 2

4 dodatkowym utrudnieniem podczas diagnostyki płodności (Gago i in., 1998; Banaszewska i in., 2011). Wskazane i konieczne jest więc poszukiwanie, odpowiedniej dla poszczególnych gatunków zwierząt, metody oceny morfologii nasienia i jej standaryzacja. Rozszerzona analiza morfologiczna nasienia powinna wyraźnie wskazywać na jego zdolność do zapłodnienia, którego za wyjątkiem np. asthenozoospermii, azoospermii lub teratozoospermii rutynowa ocena morfologii nie dostarcza (Menkveld i in., 2003). Z morfologią plemnika nierozerwalnie jest związana jego morfometria, traktowana w najnowszych badaniach i opisywana w literaturze przedmiotu, jako istotny wyznacznik zdolności reprodukcyjnej samca (Gosz i in., 2010). Plemniki uważane są za prawidłowe, jeżeli mieszczą się w klasyfikacji dla konkretnego gatunku, obejmującej kształt i wielkość główki, wstawki i witki (Haidl i Schill, 1993). W tej dziedzinie bardzo zaawansowane są badania obejmujące diagnostykę płodności u ludzi. Bowiem testy mające na celu identyfikację plemników znajdowanych w kobiecych drogach rodnych, w śluzie wewnątrzszyjkowym oraz na powierzchni osłonki przejrzystej pozwoliły na wypracowanie przybliżonego modelu plemnika. Przypuszcza się, że plemniki, które zdołają pokonać taką drogę mają większe możliwości zapłodnienia komórki jajowej. Nie bezpodstawnie więc, wielu autorów doszukuje się związków morfometrii plemników z płodnością samców (Casey i in., 1997; Chan i in., 1999; Hirai i in., 2001; Esteso i in., 2006; Nunez- Martinez i in., 2007). Według badań klinicznych plemniki mężczyzn niepłodnych mają główki o większych wymiarach. Stwierdzono również wyższy współczynnik długości do szerokości główki plemnika u mężczyzn z zaburzeniami płodności w porównaniu do mężczyzn płodnych (Katz i in., 1986). Wyniki badań na plemnikach ludzkich pokrywają się z danymi otrzymanymi w medycynie weterynaryjnej, co potwierdza celowość diagnostyki nasienia poszerzoną o dodatkową ocenę morfometryczną plemników. Plemniki ssaków cechują się małymi wymiarami i zwartą strukturą, co czasami powoduje trudności w dostrzeżeniu szczegółów ich budowy morfologicznej w badaniach z użyciem mikroskopu świetlnego (Bielańska-Osuchowska i Sysa, 1998; Andraszek i Smalec, 2011). Dlatego też stale poszukuje się technik umożliwiających możliwie najdokładniejszą ocenę nasienia pod względem jego cech funkcjonalnych. Używając niektórych prostych technik przygotowania i barwienia preparatów przedstawionych w dalszej części niniejszego opracowania można uchwycić pewne szczegóły budowy plemnika, których analiza jest utrudniona przy zastosowaniu rutynowych technik oceny nasienia na przykład przy zastosowaniu barwienia różnicowego (eozyna, nigrozyna) lub kompleksu eozyny z barwnikiem gencjanowym. Jednak problemem w ocenie morfologii i morfometrii nasienia jest brak standaryzacji w odniesieniu do stosowanych technik barwienia. Procedura barwienia oraz zastosowane odczynniki mogą w istotny sposób wpływać na wartość parametrów morfometrycznych plemnika. Stosowanie barwników o różnym ph, osmolarności oraz czas trwania procedury może wpływać na kształt i rozmiar plemników, a tym samym na wynik oceny morfologicznej nasienia. Zasadniczym problemem jest to, że wykorzystanie różnych technik barwienia w odniesieniu do określonego materiału lub typu analizy może wpłynąć na określenie liczby prawidłowych morfologicznie plemników i powodować rozbieżności dotyczące ich wymiarów. Konieczne więc wydaje się opracowanie procedury oceny 3

5 morfologii i morfometrii plemników, która w minimalnym stopniu zmienia strukturę plemnika ocenianego (najczęściej już po utrwaleniu) w stosunku do plemnika z nasienia świeżego, zwiększając tym samym trafność postawionej diagnozy. Ponadto powinien być także opracowany standard przygotowania preparatów do oceny morfologicznej plemników konkretnego gatunku zwierząt. Umożliwiłoby to porównywanie wyników między laboratoriami, a tym samym zwiększenie wartości analizy morfologii plemników w przewidywaniu i ocenie płodności samca. 1. Rola techniki barwienia w ocenie morfologicznej plemnika ssaków. W praktyce laboratoryjnej prognozowanie płodności samców wykonuje się na podstawie oceny morfologii plemników analizując barwione preparaty. Najpopularniejsze techniki barwienia wykorzystywane do oceny morfologii plemników wymagają jedynie zastosowania mikroskopu świetlnego. Poszukiwania jak najlepszej metody do diagnostyki nasienia na podstawie oceny budowy plemników, czyli morfologii, doprowadziły do stosowania różnych technik barwienia plemników. Żadna z nich nie jest jednak metodą pozbawioną błędów przede wszystkim w interpretacji wyników, co dotyczy zarówno błędnej interpretacji już końcowego wyniku, co związane jest z wykorzystywaniem różnych technik barwienia, jak i błędnej kwalifikacji plemnika do prawidłowych lub nieprawidłowych form w czasie analizy, co może skutkować błędnym wynikiem końcowym. Rozbieżności w wynikach oceny wynikają między innymi z różnic podczas przygotowania materiału, jego utrwalenia, stosowanej techniki barwienia, temperatury, staranności wykonywania badania, osoby oceniającej oraz jakości sprzętu, ponieważ ma to wpływ na morfometrię główki i całego plemnika (Davis i Gravance, 1993; Meschede i in., 1993; Menkveld, 2007; Łukaszewicz i in., 2008). Poziom zróżnicowania oceny tego samego ejakulatu w różnych warunkach może wahać się w granicach od 30 do nawet 60% (Iguer-Ouada i Verstegen, 2001, Rijsselaere i in., 2004, 2007). Fakt ten podnosi rangę wyboru techniki barwienia preparatu, ponieważ stosowana metoda powinna jak najmniej ingerować w barwione komórki (Maree i in., 2010), jednocześnie pokazując wyraźne granice główki i pozostałych elementów budowy plemnika w celu dokładnej identyfikacji każdej z tych części. W przypadku diagnostyki nasienia ludzkiego preferowane jest przygotowanie preparatów do oceny budowy morfologicznej plemników według metody barwienia Papanicolaou (Menkveld i in., 1990; WHO, 1999, 2010). Do oceny budowy plemników zwierząt zwykle stosuje się prostą metodę barwienia preparatów kompleksem eozyny z barwnikiem gencjanowym (Kondracki i in., 2005; Banaszewska i in., 2011), natomiast do analizy plemników zarówno ludzi, znacznie rzadziej zwierząt wykorzystuje się barwienie SpermBlue (Van der Horst i Maree, 2009). Do oceny plemników różnych gatunków zwierząt preferencje nie są jednolite. Dla przykładu według wytycznych Society for Theriogenology (SFT) zalecane jest wykonanie analizy morfologii plemników ogiera na mokro, na nie barwionych preparatach z zastosowaniem mikroskopu świetlnego wyposażonego w kontrast fazowy (Kenney i in., 1983). W medycynie ludzkiej w celu lepszej diagnostyki płodności wielu autorów zajmowało się poszukiwaniem najbardziej obiektywnej metody barwienia plemników. Niektórzy badacze 4

6 porównywali również wybrane techniki na nasieniu różnych zwierząt. Ja jednak chciałam się skupić najbardziej na nasieniu gatunków zwierząt gospodarskich użytkowanych inseminacyjnie. Porównując wybrane przeze mnie wraz z zespołem techniki wzięłam pod uwagę metodę barwienia Papanicolaou, ponieważ mimo pracochłonności wykonania preparatu, WHO na podstawie tej techniki ustaliło wartości referencyjne dla nasienia ludzkiego (Menkveld, 2010) i w dalszym ciągu jest to metoda najczęściej stosowana w ocenie plemników u ludzi. Kolejną wybraną przeze mnie do porównania techniką było barwienie SpermBlue, które jest metodą stosunkowo nową, bo wprowadzoną i szczegółowo opisaną w 2009 roku przez Van der Horst i Maree (2009), którzy w cytowanej pracy tą techniką wykonali próby barwienia plemników różnych gatunków zwierząt i człowieka. Obie z tych technik nie są metodami rutynowo stosowanymi dla oceny plemników zwierząt. Stąd moje porównanie wymienionych technik z popularną metodą barwienia kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy, często stosowaną do barwienia nasienia knurów, czy buhajów. Dodatkowo jako nowy element diagnostyczny zastosowałam do porównania bardzo ciekawą, a jednocześnie prostą w wykonaniu, metodę stosowaną do barwienia chromosomów, zmodyfikowaną przez Andraszek i Smalec (2011), jako że metoda ta do oceny plemników, jak dotąd nie była na szeroką skalę stosowana. Porównanie wpływu tych czterech metod na plemniki zwierząt gospodarskich nie było jak dotąd analizowane, co potwierdza celowość moich doświadczeń. 2. Eksperymentalne barwienie plemników z wykorzystaniem AgNO 3. Jedną z metod, którą wykorzystałam eksperymentalnie w swoich badaniach do oceny budowy plemników jest barwienie z wykorzystaniem roztworu azotanu srebra - AgNO 3. Technika ta, nieznacznie zmodyfikowana, umożliwia obserwację tych elementów budowy plemnika, które podczas najczęściej stosowanych metod barwienia plemników zwierząt gospodarskich nie są widoczne (Andraszek i Smalec, 2011). Azotan srebra jest barwnikiem o charakterze zasadowym. Wykorzystuje się go przede wszystkim do identyfikacji kwaśnych białek chromatynowych oraz chromatyny organizatorów jąderkotwórczych i jąderek (Goodpasture i Bloom, 1975; Howell i Black, 1980; Andraszek i Smalec, 2007; Andraszek i in., 2009). Zastosowanie tej techniki ujawnia więcej szczegółów w budowie morfologicznej plemnika, w porównaniu do badań z użyciem najczęściej stosowanych barwników o charakterze kwaśnym dla przykładu eozyny i barwnika gencjanowego (Andraszek i Smalec, 2011). Białka znajdujące się w główce plemnika mają charakter alkaliczny, dlatego po zastosowaniu azotanu srebra akrosomalna część główki wybarwia się w mniejszym stopniu niż jej część dystalna. Barwienie azotanem srebra pokazuje, że chromatyna jądra plemnika ma inny skład w części akrosomalnej niż w regionie postakrosomalnym główki, który zawiera pozostałości kwaśnych białek i jąderka, pozytywnie reagujące z solami srebra (Andraszek i Smalec, 2011). Biochemiczne podstawy barwienia azotanem srebra przypisuje się również obecności białek sulhydrylowych (tiolowych) oraz bogatych w wiązania disiarczkowe białek chromatynowych (Elder i Hsu, 1981; Bongso, 1983). Jedną z ważniejszych funkcjonalnie struktur morfologii plemnika jest akrosom. Rozmiar akrosomu i diagnoza jego zasięgu na 5

7 podstawie techniki barwienia, która umożliwia jego wyraźną identyfikację stanowi znaczący postęp w ocenie morfologii plemników (Menkveld i in., 1996), a jest to możliwe właśnie przy zastosowaniu barwienia AgNO 3. W badaniach na nasieniu ludzkim stwierdzono, że nawet jeśli w nasieniu występują plemniki o prawidłowych wymiarach główki, ale za małych akrosomach, to gamety takie mają niską żywotność i nie są w stanie prawidłowo przejść reakcji akrosomalnej (Menkveld i in., 2003). Niewiele badań z tego zakresu jest prowadzonych na zwierzętach, a jak wiadomo akrosom jest strukturą spełniającą bardzo ważną funkcję w procesie zapłodnienia, co podnosi wagę prawidłowości jego budowy, zwłaszcza u zwierząt używanych w inseminacji. Dlatego zastosowałam zmodyfikowane barwienie azotanem srebra, które wyraźnie identyfikuje tę strukturę. Ponadto dzięki tej metodzie daje się wyraźnie zaobserwować różnice w integralności akrosomu (dzięki możliwości obserwacji wielu szczegółów jego budowy). Zaburzenia integralności akrosomu mogą występować w wyniku uszkodzenia, starzenia się komórki rozrodczej na poziomie cytogenetycznym, jak również różnego rodzaju morfologicznych nieprawidłowości plemnika (Elder i Hsu, 1981; Bongso, 1983). W odniesieniu do plemników technika ta nie jest jeszcze stosowana w szerokim zakresie, o czym świadczy mała liczba publikacji opisujących zastosowanie tej metody w analizie plemników. Warto docenić tą metodę w diagnostyce nasienia. Jest to metoda uniwersalna. Może być stosowana jako metoda samodzielna lub jako uzupełnienie rutynowej diagnostyki. Największą jej zaletą jest prosta procedura i krótki czas barwienia. Przygotowanie i ocena preparatu tą metodą sprawdza się zarówno do oceny plemników z nasienia świeżego, bezpośrednio po pobraniu, jak i materiału utrwalonego. Metoda ta nie wymaga również specjalistycznego sprzętu, jedynie mikroskopu świetlnego, co daje większą możliwość do zastosowania jej w codziennej praktyce. 3. Zastosowanie ścisłych kryteriów Tygerberg w doprecyzowaniu oceny parametrów główki plemnika. Zainteresowanie oceną morfologii plemników u ludzi, jako narzędziem diagnostyki potencjału płodności zapoczątkowano już w 1900 roku, kiedy odkryto, że w jednym ejakulacie pojawiają się formy prawidłowe oraz patologiczne (Menkveld i Kruger, 1996). Diagnostyka nasienia zarówno u ludzi, jak i u zwierząt jest tematem ciągłych badań. Ciągle poszukuje się dokładniejszych metod oceny, które pozwalałyby na precyzyjniejszą diagnostykę nasienia. Jedną z takich metod jest zastosowanie ścisłych kryteriów Tygerberg, które zostały wprowadzone i szczegółowo opisane przez Menkveld i in. w 1990 roku (1990). Ponadto Menkveld i in. (1990) pokazał, że ocena morfologii plemników poprzez bardziej rygorystyczne kryteria zwiększa obiektywizm i zmniejsza zmienność wewnątrz laboratorium. Podstawowa ocena morfologii plemników opierająca się jedynie na obserwacji zmian w budowie lub wykonaniu podstawowych pomiarów morfometrycznych nie odzwierciedla subtelnych różnic w główkach plemników. Obserwowane plemniki wydają się mieć budowę prawidłową i klasyfikowane są jako normalne, podczas gdy w późniejszej analizie na podstawie rygorystycznych kryteriów okazuje się, że wśród nich są subpopulacje o subtelnych odchyleniach kształtu, wyrażonego między innymi wydłużeniem czy 6

8 chropowatością, co wiąże się z selekcją takich komórek podczas kontaktu z osłonką przejrzystą. Niektórzy autorzy potwierdzają czułość i przydatność oceny morfologicznej plemnika jako prognostycznego czynnika w diagnozowaniu płodności zwłaszcza przy zastosowaniu ścisłych kryteriów Tygerberg, które w najbardziej precyzyjny sposób charakteryzują główkę plemnika (Kruger i in., 1986; Menkveld i in., 1990; Coetzee i in., 2001; Kruger i in., 2004; Van der Merve i in., 2005). Ocena morfologii plemników według ścisłych kryteriów Tygerberg wykorzystywana jest między innymi przy zastosowaniu technik wspomaganego rozrodu, rozpoznawaniu biomarkerów dysfunkcji plemników oraz przewidywaniu potencjału płodności samca. Thurston i in., (2001) wnioskują, że kształt główki plemnika jest uwarunkowany genetycznie. Badania niektórych autorów wskazują, że kształt główki plemnika może być uzależniony od pewnych czynników, które mogą oddziaływać w trakcie spermatogenezy. Stwierdzono, że podczas procesu spermatogenezy dochodzi do powstania różnych pod względem morfologicznym gamet, kiedy to między innymi czynnik genetyczny w sposób istotny wpływa na strukturę i wielkość komórki (Pĕna i in., 2005). Wartości referencyjne niektórych zmian kształtu zostały określone u ludzi. Takich danych brak jest dla zwierząt. Na podstawie różnych technik barwienia i wyboru odpowiedniej metody dla danego gatunku można byłoby ustalić pewne normy plemników, w których określano by kształt jako mieszczący się w normie oraz kształt nieprawidłowy, czyli taki, który mógłby rokować o mniejszej zdolności zapładniającej. Z tego punktu widzenia jest to bardzo ważne, gdyż udowodniono, że wydłużonej główce plemnika towarzyszy znaczne strukturalne uszkodzenie DNA. Ponadto wydłużone główki plemnika mogą mieć zniekształcone jądro komórkowe, a anomalie jądra plemnika mogą być również związane z nieprawidłowościami w budowie w regionie szyjki, występowaniem kropli cytoplazmy i zaburzeniami kondensacji chromatyny (Prisant i in., 2007). Nieprawidłowości kształtu główki, które mogą powstawać między innymi podczas spermatogenezy mogą skutkować obecnością w nasieniu plemników z główką wydłużoną i zwężoną. Zaburzenia kształtu główki plemnika mogą być też związane z zaburzoną kondensacją chromatyny, fragmentacją DNA oraz obecnością wakuoli jądrowych. Wady te wpływają bezpośrednio na zapładniającą zdolność plemnika i potencjalnie na rozwój zarodka (Dadoune i in., 1988; Gandini i in., 2000; Prisant i in., 2007; Auger, 2010). W badaniach wielu autorów wykazano większe średnie wymiary główek plemników w nasieniu o nieprawidłowej morfologii w porównaniu do komórek rozrodczych z ejakulatów prawidłowych (Katz i in., 1986; Casey i in., 1997). W tym kontekście szczególnego znaczenia nabiera określenie prawidłowości budowy główki plemnika, bowiem wielkość i kształt główki jest ważnym kryterium przy klasyfikacji plemników o prawidłowej budowie morfologicznej lub przy określaniu nieprawidłowości w ich budowie w celu określania ich zdolności zapładniającej. 4. Cel naukowy Celem naukowym opracowania jest analiza morfologii i morfometrii plemników samców różnych gatunków zwierząt oraz określenie wpływu techniki barwienia na strukturę plemnika. 7

9 W badaniach szczególnie uwzględniono morfometrię główki. Z uwagi na brak standaryzacji w odniesieniu do stosowanych technik barwienia plemników różnych gatunków ssaków, w badaniach szczególnie skoncentrowano się na: 1. Określeniu wpływu barwienia nasienia różnymi technikami na morfometrię plemnika wybranych gatunków zwierząt - O.2., O.4., O.5., O Przedstawieniu możliwości wykorzystania barwienia AgNO 3 do analizy morfologicznej i morfometrycznej plemników wybranych gatunków zwierząt gospodarskich i dzikich - O.1., O.2., O.3., O.5., O Analizie struktury główki plemnika i doprecyzowaniu jej parametrów morfologicznych i morfometrycznych wg ścisłych kryteriów Tygerberg - O.2., O.3., O.4., O.5. Szczegółowe cele naukowe zostały sformułowane w publikacjach dokumentujących osiągnięcie naukowe Wprowadzenie metodyczne W analizowanych pracach materiałem poddanym analizie były plemniki wybranych gatunków zwierząt gospodarskich i dzikich. Plemniki pochodzące z ogona najądrza izolowano post mortem według metodyki opisanej przez Evans i in. (1964) od samców następujących gatunków: świnia domowa rasa wielka biała polska, koza domowa - rasa polska biała uszlachetniona, koń rasa polski koń szlachetny półkrwi, dzik europejski, sarna europejska (O.1., O.2., O.3.). Badania opisane w pracach O.4. i O.5. wykonano na nasieniu świeżym pobieranym od buhajów rasy holsztyno-fryzyjskiej odmiany czarno-białej oraz od ogierów rasy polski koń szlachetny półkrwi. W celu wychwycenia różnic w wymiarach i kształcie plemników poddanych działaniu różnych substancji chemicznych zawartych w barwnikach, wykonane preparaty mikroskopowe barwiono różnymi technikami: a. Barwienie kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy według metodyki opisanej w pracy Kondracki i in. (2005) - O.2., O.4., O.5. b. Barwienie Papanicolaou według metodyki WHO (2010) - O.4., O.5. c. Barwienie SpermBlue według metodyki opisanej przez Van der Horst i Maree (2009) - O.4., O.5. d. Barwienie AgNO 3 według zmodyfikowanej przez Andraszek i Smalec (2011) metodyki barwienia kwaśnych białek chromatynowych zaproponowanej przez Howell i Black (1980) - O.1., O.2., O.3., O.5. e. Materiałem referencyjnym były preparaty z nasienia świeżego wykonane techniką rozmazu na szkiełkach mikroskopowych podgrzanych do temperatury 37 C - O.4. Plemniki oceniano pod mikroskopem Olympus BX50 stosując stukrotne powiększenie obiektywu. Do oceny preparatów wykorzystano system analizy obrazu i program pomiarowy MultiScan firmy Computer Scanning Systems. W przypadku oceny plemników w preparatach niebarwionych zastosowano kontrast fazowy. Od każdego osobnika objętego badaniem 8

10 analizowano losowo wybrane plemniki o prawidłowej budowie morfologicznej, dobrze widoczne w polu widzenia mikroskopu. Pomiary morfometryczne obejmowały: długość, szerokość, obwód i pole powierzchni główki plemnika, pole akrosomu, długość wstawki, długość witki oraz łączną długość plemnika. Ocenę plemników rozszerzono o określenie zasięgu akrosomu i charakterystykę witki, ze szczególnym zwróceniem uwagi na wstawkę. Ponadto w celu doprecyzowania kształtu główki plemnika zastosowano ścisłe kryteria Tygerberg, które obejmują cztery dodatkowe indeksy kształtu główki: eliptyczność, wydłużenie, pofałdowanie (niekiedy określane jako amorficzność) i regularność. Parametry według Tygerberg wyznaczono z podstawowych pomiarów główki plemnika stosując formuły przedstawione w pracy Maree i in. (2010). Dodatkowo określono również frekwencję wakuoli jądrowych w główce plemnika pod kątem możliwości ich identyfikacji przy zastosowaniu różnych odczynników chemicznych. Wyniki pomiarów poddano analizie statystycznej (STATISTICA version 10.0, StatSoft Inc., PL) Przedstawienie wyników 1. Określenie wpływu barwienia nasienia różnymi technikami na morfometrię plemnika wybranych gatunków zwierząt - O.2., O.4., O.5., O.6. Analizowano plemniki ogiera wybarwione trzema różnymi metodami (barwienie Papanicolaou, SpermBlue, kompleks eozyna i barwnik gencjanowy) w porównaniu do grupy kontrolnej. Jednym z czynników wpływających na ocenę komórek była analiza łatwości ich identyfikacji. Prowadząc obserwacje mikroskopowe wskazano na pewne różnice w wybarwieniu i ostrości obrazu komórek pomiędzy stosowanymi technikami barwienia. W przypadku metody Papanicolaou, główki plemników ogierów wybarwiały się na jasnofioletowy kolor. Część akrosomowa była jaśniejsza, gradientowo wybarwiona, a zasięg akrosomu dosyć trudny do dokładnej identyfikacji. Kontur główki był dostatecznie wyraźnie zaznaczony, gładki, łatwy do oznaczenia. Wakuole jądrowe były wyraźnie widoczne, łatwe do identyfikacji. Wstawka i witka plemnika była bladoróżowa z trudną do wychwycenia częścią końcową witki oraz niewykrywalną granicą wstawki i witki. Tło preparatu było jasne, niewybarwione, nieutrudniające oceny. Technika SpermBlue wybarwiała główki plemników na niebiesko. Część akrosomowa była jaśniejsza. W niektórych komórkach widać było wyraźną granicę zasięgu akrosomu. Zarys główki był wystarczająco wyraźny do identyfikacji. Identyfikacja wakuoli była na poziomie dostatecznym. Zasięg wstawki i pozostałej części witki był trudny do odróżnienia, obie struktury były w szaroniebieskiej, bladej barwie. Tło preparatu było jaśniejsze, nie utrudniające analizy. W przypadku barwienia preparatów kompleksem eozyny i barwnika gencjanowego główki plemników ogiera były bardzo wyraźnie wybarwione na ciemnofioletowy kolor. Część akrosomowa była jaśniejsza, o nieco zatartej granicy. Kontur główki był bardzo wyraźnie zaznaczony, łatwy do identyfikacji. Wakuole były widoczne, ale nie były tak wyraźne jak w przypadku barwienia Papanicolau i SpermBlue. Wstawka i witka plemnika 9

11 były bardzo dobrze wybarwione, o fioletowej barwie, lecz o trudnej, ale możliwej do wychwycenia granicy zasięgu wstawki. Tło preparatu było jaśniejsze, nieutrudniające analizy. W przypadku próby kontrolnej, jaką stanowiły preparaty niebarwione, analizowane w kontraście fazowym, główki plemników były blade, o nie do końca wyraźnym konturze w części akrosomowej. Wakuole jądrowe były słabo widoczne. Również wstawka i witka były blade, słabo widoczne. Tło preparatu było dosyć ciemne, utrudniające analizę komórek. Każda z zastosowanych technik barwienia dawała nieco inny obraz, co utrudniało dokładną analizę poszczególnych struktur plemnika. Na podstawie szczegółowej analizy preparatów i wykonanych pomiarów, zaobserwowano, że metoda barwienia, a tym samym użyte odczynniki chemiczne wpływają na wymiary główki plemnika ogiera. Plemniki o najmniejszych wymiarach główki stwierdzono przy barwieniu preparatów Papanicolaou. Wymiary te wynikały z najmniejszej długości główki plemnika i jej szerokości oraz pola powierzchni i obwodu główki plemnika. Plemniki barwione Papanicolaou miały główki krótsze od główek plemników barwionych kompleksem eozyny i barwnika gencjanowego oraz krótsze od główek plemników barwionych SpermBlue (P 0,01). Główki plemników barwionych Papanicolaou były również węższe od główek plemników barwionych pozostałymi metodami (P 0,01). Zdecydowanie największe wymiary główek plemników stwierdzono przy barwieniu kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy. Obwód główki plemnika w przypadku barwienia kompleksem eozyny i barwnika gencjanowego był aż o 1,16 µm większy niż przy użyciu Papanicolaou i o 0,19 µm większy niż przy barwieniu SpermBlue (P 0,01). Podobne zależności obserwowano w przypadku pola powierzchni główki plemnika. Pole powierzchni główki plemników barwionych kompleksem eozyny i barwnika gencjanowego było największe i wynosiło 18,66 µm 2. Było to aż o 2,24 µm 2 więcej niż pole powierzchni główki plemników barwionych Papanicolaou i o 1,18 µm 2 więcej niż pole powierzchni główki przy barwieniu SpermBlue (P 0,01). W porównaniu do grupy kontrolnej wykonanej z nasienia świeżego, niebarwionego wynika, że każda z metod barwienia w różnym stopniu wpływa na zmiany wymiarów główki plemnika. Zarówno szerokość, obwód, jak i pole powierzchni główki plemnika mają mniejsze wartości w obserwacjach pod kontrastem fazowym niż w przypadku plemników barwionych. Jedynie długość główki plemnika była większa niż przy zastosowaniu barwienia Papanicolaou i SpermBlue. Zależności te potwierdzono również w badaniach przeprowadzonych na plemnikach buhajów. Najmniejsze wymiary główek plemników obserwowano w przypadku barwienia Papanicolaou. Plemniki barwione tą techniką miały krótsze i węższe główki w porównaniu do plemników barwionych innymi technikami (SpermBlue, kompleks eozyna i barwnik gencjanowy, AgNO 3 ) (P 0,05). Z tych wymiarów wynikał również mniejszy obwód i pole powierzchni główki tych plemników. W tym przypadku dodatkowo do barwienia zastosowano AgNO 3 (barwienie AgNO 3 zostanie szczegółowo omówione w podpunkcie 2), po którego zastosowaniu stwierdzono zdecydowanie największe wymiary główek plemników. Plemniki barwione kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy, rekomendowanym dla nasienia buhaja, miały pośrednie wartości wymiarów morfometrycznych najbardziej zbliżone do plemników barwionych SpermBlue i w większości przypadków o mniejszym odchyleniu 10

12 standardowym w porównaniu do plemników barwionych innymi metodami. Pomiędzy wszystkimi wymiarami plemników barwionych czterema technikami stwierdzono różnice statystyczne na poziomie P 0,05. Dodatkowe badania porównawcze z zastosowaniem techniki barwienia AgNO 3 i kompleksu eozyna i barwnik gencjanowy na plemnikach ogiera również potwierdziły, że metoda barwienia oraz użyte odczynniki chemiczne mają znaczący wpływ na wymiary i kształt plemników ogiera. W tym przypadku również stwierdzono istotne różnice w odniesieniu do wymiarów główki plemnika. Przy barwieniu AgNO 3 obserwowano plemniki, których główki były dłuższe od główek plemników barwionych metodą tradycyjną kompleksem: eozyna i barwnik gencjanowy (P 0,01). Podobną zależność zaobserwowano w przypadku wymiarów akrosomu plemnika. Przy barwieniu AgNO 3 wykazano większe wartości pomiarów akrosomu niż przy barwieniu kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy. Zarówno pole powierzchni akrosomu (P 0,05), jak i jego zasięg (P 0,01) były większe w przypadku zastosowanego barwienia AgNO 3. Nieco inaczej kształtowały się wymiary wstawki plemnika. Na preparatach, do barwienia których zastosowano AgNO 3, obserwowano plemniki o wstawkach nieco krótszych (P 0,01), ale również o zdecydowanie mniejszym aż o 6,56% zasięgu niż w przypadku barwienia tradycyjnego (P 0,01). Różnice potwierdzone statystycznie wykazano również w przypadku długości witki plemnika oraz łącznej długości całego plemnika. Przy zastosowaniu barwienia AgNO 3 obserwowano plemniki o dłuższych witkach i o większej łącznej długości (P 0,01). 2. Wykorzystanie barwienia AgNO 3 do analizy morfologicznej i morfometrycznej plemników wybranych gatunków zwierząt gospodarskich i dzikich O.1., O.2., O.3., O.5., O.6. Zastosowane barwienie AgNO 3, o którym wspomniano w podpunkcie 1 miało przede wszystkim na celu precyzyjną identyfikację poszczególnych struktur plemnika (akrosomu i wstawki), które są trudne do analizy przy użyciu innych technik przygotowania i barwienia preparatów. Barwienie AgNO 3 jako jedyne bardzo wyraźnie zróżnicowało główkę plemnika na część akrosomową (jasne zabarwienie) i część postakrosomową (ciemne zabarwienie). W witce natomiast, w postaci jasnego zabarwienia, została uwidoczniona wstawka. Pozostała część witki miała bardzo wyraźny ciemny odcień. Wyraźne zróżnicowanie w obrębie główki i witki plemnika umożliwiło wykonanie szczegółowych pomiarów morfometrycznych plemników. Ponadto wykazano, że plemniki cechują się dużą zmiennością osobniczą w obrębie poszczególnych wymiarów. Wśród analizowanych zwierząt w obrębie jednego gatunku są osobniki charakteryzujące się plemnikami o mniejszych wymiarach, jak i samce, u których stwierdzono znacząco większe plemniki. Barwienie to pozwoliło na precyzyjne określenie rozmiaru akrosomu i wstawki plemnika. Okazało się, że największą zmienność odnotowano w przypadku pola powierzchni akrosomu główki plemnika, a długość wstawki charakteryzowała się najmniejszą zmiennością. Na przykładzie dzika, który jest spokrewniony ze świnią domową stwierdzono, że plemniki zwierząt obu gatunków różnią się wymiarami. Plemniki dzika mają nieco mniejsze główki, ale dłuższe wstawki i witki w porównaniu do plemników knura. Eksperymentalne 11

13 barwienie AgNO 3 zastosowane w pracach wymienionych w punkcie 4.1d również potwierdza tezę wpływu użytych odczynników na morfometrię poszczególnych struktur plemnika. Dokładne wybarwienie poszczególnych struktur plemnika pozwoliło również na potwierdzenie tezy zmienności plemników, co zaobserwowano także na plemnikach ogierów. Analizując długość witki i wstawki plemników nie można jednoznacznie określić, że plemniki o dłuższych witkach mają również dłuższe wstawki. Wskazuje na to analiza nasienia jednego z ogierów, którego plemniki charakteryzowały się najdłuższymi witkami (84,40 µm), podczas gdy wstawki tych plemników przekraczały niewiele ponad 14 µm długości i zasięgu 16,65%. Z kolei inny ogier charakteryzujący się plemnikami o najkrótszych witkach (76,06 µm) miał plemniki o wstawkach prawie 13,50 µm długości, o zasięgu wstawki wynoszącym 17,76%. Analiza porównawcza plemników samców różnych gatunków, barwionych różnymi technikami wskazuje również na większe wymiary główek plemników oraz większą długość witek plemników barwionych omawianą metodą AgNO Struktura główki plemnika i doprecyzowanie jej parametrów morfologicznych i morfometrycznych wg ścisłych kryteriów Tygerberg O.2., O.3., O.4., O.5. W celu doprecyzowania oceny główki plemnika w pracach zestawiono parametry uwzględniające standardowe pomiary główek plemników (długość, szerokość, obwód i pole powierzchni) w formie wskaźników, według ścisłych kryteriów Tygerberg wskazujących na względny kształt główki plemnika. Pozwala to na klasyfikację plemników nie tylko morfometrycznie, ale również morfologicznie. Cztery wskaźniki wyznaczone według ścisłych kryteriów Tygerberg określają zmiany kształtu główek plemników. Eliptyczność wskazuje na stopień, w jakim główki plemników są owalne, wąskie lub stożkowe. Ponieważ eliptyczność jest wyrażona jako stosunek długości do szerokości główki plemnika, więc zwiększenie szerokości główki bezpośrednio wpływa na jej eliptyczność. Wyższe wskaźniki eliptyczności oznaczają, że główki plemników są bardziej okrągłe, natomiast niższe wartości wskaźnika wskazują, że główki są węższe. Wydłużenie wskazuje na zaokrąglenie główki plemnika. Indeks pofałdowania identyfikuje główki o nierównej powierzchni błony komórkowej, główki chropowate i bezpostaciowe. Im niższa wartość wskaźnika, tym główki są bardziej pofałdowane. Regularność natomiast określa prawidłowość kształtu główki i identyfikuje główki plemnika o tzw. gruszkowatym kształcie. Im wyższa wartość tego wskaźnika, tym główki plemników są bardziej symetryczne. Dzięki zastosowanej klasyfikacji według ścisłych kryteriów Tygerberg precyzyjnie określono kształt i wymiary główki plemnika, co pozwoliło na wykazanie zmienności występującej nie tylko w obrębie gatunku, czy rasy, ale również zmienności pomiędzy osobnikami. Zaobserwowano, że plemniki różnych osobników różnią się wymiarami i kształtem w obrębie główki plemnika. Na przykładzie ogierów zaobserwowano, że nie zawsze u tych ogierów, w nasieniu których główki plemników są dłuższe, są one również szersze, co świadczy o ich różnym kształcie. Analiza według ścisłych kryteriów Tygerberg plemników ogiera barwionych różnymi metodami, potwierdziła różnice w kształcie główki plemników. Plemniki ogiera barwione 12

14 metodą Papanicolaou charakteryzowały się znacznie większą eliptycznością i wydłużeniem niż plemniki barwione SpermBlue i kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy (P 0,01). Z kolei główki plemników barwionych SpermBlue odznaczały się największymi wartościami indeksu pofałdowania w porównaniu do barwienia Papanicolaou i kompleksu eozyna i barwnik gencjanowy (P 0,01). Regularność kształtu główki różniła się tylko w przypadku barwienia kompleksem eozyna i barwnik gencjanowy, gdzie wskaźnik ten był o 0,01 mniejszy niż w przypadku główek plemników barwionych Papanicolaou i SpermBlue (P 0,01). Porównując wskaźniki charakteryzujące główkę plemnika ogiera w przypadku poszczególnych metod barwienia i grupy kontrolnej wynika, że główki plemników nie poddanych wpływowi żadnych barwników mają kształt bardziej owalny i zaokrąglony, na co wskazują wyższe wartości eliptyczności i wydłużenia. Główki plemników z próby kontrolnej są również bardziej symetryczne, o czym świadczy wyższa wartość indeksu regularności. Natomiast mniejsza wartość indeksu pofałdowania w plemnikach niebarwionych wskazuje na mniejszą chropowatość główki, co sugeruje mniejszą ingerencję i uszkodzenia plazmolemy główki wynikające z wpływu poszczególnych barwników i związków chemicznych. Z badań prowadzonych na nasieniu buhajów również wynika, że metoda barwienia wpływa na wymiary i kształt główki plemnika. Plemniki buhaja barwione Papanicolaou, tak jak w przypadku plemników ogiera, charakteryzowały się największym wskaźnikiem eliptyczności w porównaniu do plemników barwionych innymi metodami. Z kolei na bardziej symetryczne główki wskazuje użycie metody SpermBlue i kompleksu eozyna i barwnik gencjanowy, przy czym największą symetrię główki plemników obserwowano w nasieniu barwionym azotanem srebra AgNO 3. Wskaźnik ten był w tym przypadku największy i różnił się istotnie w porównaniu do innych technik barwienia preparatów (P 0,05). Stwierdzono również dodatnie istotne korelacje przede wszystkim pomiędzy długością i obwodem główki plemnika, a eliptycznością i wydłużeniem. Wskazują one, że wraz ze zwiększaniem się długości główki plemnika, główki są bardziej owalne i zaokrąglone. Ponadto wykazano ujemną zależność w przypadku długości główki plemnika i indeksu pofałdowania, co oznacza, że im główka plemnika jest dłuższa, tym jest ona mniej regularna i wykazuje większą amorficzność kształtu Komentarz do wyników Związek morfometrii plemnika z płodnością jest tematem badań związanych przede wszystkim z płodnością u ludzi (Chan i in., 1999). Wiele prac wskazuje na związek wymiarów plemnika z płodnością u koni (Casey i in., 1997; Hirai i in., 2001; Peña i in., 2005; Hidalgo i in., 2008; Phetudomsinsuk i in., 2008), u których zaburzenia płodności są skorelowane dodatnio z powiększonymi główkami plemników (Gravance i in., 1996). Temat podejmowany był także w związku z płodnością knurów (Peña i in., 2005; Saravia i in., 2007), buhajów (Boersma i in., 1999; Kondracki i in., 2012), czy psów (Nuñez-Martinez i in., 2007). Różnice w wielkości główek u samców płodnych w stosunku do niepłodnych odkryto u samców różnych gatunków zwierząt (Katz i in., 1986; Casey i in., 1997; Antończyk, 2012). Wykazano, że samce w nasieniu, których plemniki miały mniejsze główki charakteryzowały 13

15 się lepszą płodnością. Gravance i in., (1996) oceniając nasienie ogierów płodnych i o obniżonej płodności stwierdził, że wymiary główek plemników różnią się pomiędzy tymi dwiema grupami. W nasieniu ogierów z zaburzeniami płodności odnotowano plemniki o większych główkach oraz o większym odsetku główek o nieprawidłowej morfologii. Podczas badań wnioskowano, iż nie tylko wielkość główki wpływa na jakość zapłodnienia, istotne są też wymiary witki i wstawki. Plemniki o dłuższej witce mają większe możliwości zapłodnienia ze względu na zwiększone możliwości ruchowe (Antończyk, 2012). Są również badania opisujące różnice w wielkości i kształcie główek plemników nie tylko ogierów (Ball i Mohammed, 1995; Hidalgo i in., 2008; Phetudomsinsuk i in., 2008), ale i buhajów (Boersma i in., 1999; Kondracki i in., 2012) czy knurów (Saravia i in., 2007; Banaszewska i in., 2011). Taka zmienność występuje nie tylko pomiędzy poszczególnymi gatunkami, rasami, ale również w różnych ejakulatach tego samego osobnika. Zmienność wymiarów plemników może wynikać z efektu genotypowego (Ward, 1998). Stwierdzone na podstawie obserwacji własnych różnice w wymiarach i kształcie plemników w obrębie różnych gatunków, ras i osobników oraz fakt, że w tym samym ejakulacie plemniki są zawsze niejednorodne i nasienie zawiera zarówno funkcjonalnie prawidłowe, jak i uszkodzone plemniki jest główną przeszkodą dla właściwej analizy ejakulatu. Ponadto, to właśnie metoda barwienia preparatów oraz sposób ich oceny znacząco może wpływać na wyniki pomiarów morfometrycznych (Brito i in., 2011). W wielu przypadkach już samo utrwalenie nasienia na szkiełku mikroskopowym może zmienić strukturę plemnika. Często stosowany alkohol w różnych stężeniach może powodować odwodnienie i tym samym obkurczenie główki plemnika. Wstępna inkubacja preparatów w roztworze fizjologicznym może działać na zasadzie roztworu hipotonicznego i powodować puchnięcie główki, wstawki i witki. Odczynniki i woda poprzez przenikanie przez membrany plemnika w celu osiągnięcia równowagi osmotycznej, mogą powodować obrzęk lub skurcz komórki (Jeyendran i in., 1984; Maree i in., 2010), dlatego mogą występować pewne różnice w wymiarach plemników przy użyciu różnych technik barwienia. Wyniki opisane w tym opracowaniu są potwierdzeniem tej tezy. Oczywistym jest fakt, że każdy użyty odczynnik czy to w procesach konserwacji, czy barwienia nasienia, może powodować zmiany w wymiarach plemników, a im tych związków jest więcej, tym większe jest prawdopodobieństwo ingerencji i uszkodzenia komórki. Dla przykładu przy barwieniu Papanicolaou używa się ponad 12 różnych substancji chemicznych, których wpływu jak dotąd dokładnie nie określono (Maree i in., 2010). Wykazano, że niektóre substancje na przykład ksylen i alkohol mają właściwości odwadniające i są przyczyną skurczu komórek, a preparaty utrwalające powodują zmiany wymiarów główek plemników (Gao i in., 1993; Sancho i in., 1998). Badania Aksoy i in. (2012) potwierdzają wpływ metody barwienia na rozmiary główek plemnika (długość i szerokość). Inne badania wskazują, że niektóre techniki barwienia prowadzą do zwiększania lub zmniejszania wymiarów główki plemnika (Katz i in., 1986; Meschede i in., 1993; Franken i in., 2000; Hidalgo i in., 2006). Według Maree i in. (2010) barwienie plemników ludzkich techniką Papanicolaou powoduje kurczenie się długości główek plemników w porównaniu do komórek płciowych z nasienia świeżego, co znajduje potwierdzenie w badaniach własnych prowadzonych na plemnikach zwierząt. Na uwagę zasługuje szybka i prosta, dwustopniowa procedura barwienia nasienia 14

16 SpermBlue. Z badań Maree i in. (2010) i McAlister (2010) wynika, że wymiary plemników ludzkich barwionych SpermBlue były najbardziej zbliżone do wymiarów plemników z nasienia świeżego, niebarwionego. Są badania sugerujące, że metoda ta jest skuteczniejsza od skomplikowanego barwienia nasienia Papanicolaou (Van der Horst i Maree, 2009). Obserwacje Van der Horst i Maree (2009) wskazują, że przy barwieniu SpermBlue nie zaobserwowano wyraźnych objawów pęcznienia plemników różnych gatunków zwierząt i człowieka, prawdopodobnie ze względu na substancje wpływające izoosmotycznie na nasienie. Dodatkową zaletą barwienia plemników SpermBlue jest to, że podczas tego barwienia nie barwi się tło, co mogłoby maskować pewne granice plemników, utrudniając ich analizę (Van der Horst i Maree, 2009). Dlatego też wraz z zespołem postanowiliśmy wykonać taką próbę badań na większym materiale w celu sprawdzenia tej metody u zwierząt gospodarskich. Obserwacje własne potwierdzają zalety tej metody barwienia w kontekście łatwości oceny preparatu i stosunkowo niewielkiej ingerencji barwnika w komórkę, co skłania do wniosku, że metoda ta może być techniką rekomendowaną również do oceny nasienia samców inseminacyjnych. Zważywszy na fakt, że o ile dla nasienia ludzkiego są rekomendowane pewne metody barwienia preparatów, o tyle dla nasienia zwierząt, ciągle poszukuje się optymalnych technik, które pozwalałyby w wiarygodny sposób ocenić płodność samca. Niektórzy autorzy sugerują, że pomiary plemników stanowią bardzo ważny aspekt procesu oceny morfologii, jednakże zakres ustalony na przykład dla plemników ludzkich wymaga ponownej oceny, gdyż jest zbyt szeroki. W tym kontekście ważne jest, aby taki przedział ustalić dla zwierząt dobierając odpowiednią technikę barwienia, optymalną dla gatunku. Zaawansowane techniki mikroskopowania wyposażone w programy do analizy obrazu pozwalają na dokonanie precyzyjnych manualnych pomiarów często bardziej wiarygodnych niż przy stosowaniu analiz automatycznych. Natomiast rozbieżności w reakcji nasienia na barwniki użyte do przygotowania preparatu mogą wynikać z różnic pomiędzy gatunkami w odporności nasienia na działanie czynników zewnętrznych (WHO, 2010; Brito i in., 2011). Dlatego też ważnym aspektem jest dostosowanie metody barwienia do gatunku zwierząt. W przypadku niektórych gatunków ssaków są pewne opracowane klasyfikacje odnoszące się do morfologii plemników (Barth i Oko, 1989; WHO, 2010). Do oceny nasienia ludzkiego opracowano dwa podstawowe systemy klasyfikacji morfologii plemników. Pierwszy z nich został opracowany przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) dla plemników człowieka i jest podstawą podobnych analiz na nasieniu zwierząt. Drugi system to klasyfikacja Tygerberg, wyznaczająca dużo bardziej surowe kryteria przede wszystkim w stosunku do główki plemnika, gdzie formy graniczne uznawane są za nieprawidłowe (Kruger i in., 2004), co obniża udział w nasieniu plemników o prawidłowej budowie morfologicznej. W przypadku zwierząt nie istnieją takie ścisłe kryteria. Wynika to z dużej dowolności stosowania technik przygotowania preparatów i barwienia plemników konkretnego gatunku. Ponadto dla większości gatunków zwierząt, dla których prowadzi się ocenę nasienia, nie określono tzw. modelowego plemnika oraz form plemników uznawanych jako morfologicznie nieprawidłowe. Spermiogram w pojęciu kryteriów klasyfikacji nieprawidłowości plemników, oszacowano dla nasienia buhaja (Blom, 1981, 1983; Rosłanowski, 1987). Ten system klasyfikacji często stosowany jest również do oceny plemników knura (Kondracki i in., 2006). Nieco inną klasyfikację zmian plemników 15

17 opracowano dla nasienia ogiera (Kosiniak-Kamysz i Wierzbowski, 2004). Zdefiniowano również ważniejsze wady plemników ptaków domowych (Chełmońska i Dymkowska, 1993). Z biegiem lat ocena morfologii została udoskonalona i opiera się nie tylko na ustaleniu udziału procentowego plemników o prawidłowej budowie morfologicznej. Dodatkowe parametry oceny morfologii plemników zostały opracowane w celu poprawy diagnostyki zdolności takich plemników do zapłodnienia (Menkveld, 2010). Dlatego ważnym czynnikiem, który należy brać pod uwagę przy wyborze techniki barwienia jest porównanie jak procedura barwienia zmienia morfologię i wymiary plemników w porównaniu z tymi plemnikami, które znajdują się w nasieniu świeżym (Maree i in., 2010). Z obserwacji Brito i in. (2011) wynika, że rekomendowana przez WHO do oceny nasienia ludzkiego metoda Papanicolaou, nie zawsze przynosi oczekiwane wyniki. Trudności w interpretacji preparatu wynikają z dosyć słabego wybarwienia komórek, co utrudnia identyfikację bardziej subtelnych wad plemników. Potwierdzają to badania własne na przykładzie plemników ogiera i buhaja, zwłaszcza w przypadku wstawki i witki plemnika, które to struktury były słabo widoczne na preparacie. Z kolei preparaty z nasienia ogiera barwione SpermBlue charakteryzowały się dosyć dobrze wybarwionymi główkami plemników, ale tak jak w przypadku Papanicolaou analiza wstawki i witki nadal była utrudniona z uwagi na słabe wybarwienie tych struktur plemnika. Innym przykładem są podejmowane przez niektórych autorów próby barwienia nasienia gąsiorów (Chełmońska, 1972) i kogutów (Łukaszewicz, 1988) metodą według Bloma (1981) dedykowaną głównie dla nasienia buhajów, która również nie przyniosła zadowalających rezultatów. Okazało się, że barwione tą metodą plemniki mają skłonność do obrzęków główek, co dyskwalifikuje tę metodę do oceny nasienia drobiu (Łukaszewicz i in., 2008), a jednocześnie potwierdza tezę jak ważna jest trafność wyboru odpowiedniej techniki barwienia dla konkretnego gatunku zwierząt. Bardzo prostą i od lat stosowaną techniką w ocenie nasienia ssaków jest barwienie preparatów kompleksem eozyny i barwnika gencjanowego (Kondracki i in., 2005; Kondracki i in., 2012). Metoda ta bardzo wyraźnie wybarwia główki plemników, ale utrudnia obserwację zasięgu akrosomu, czy wstawki, co znajduje potwierdzenie w przeprowadzonych przeze mnie badaniach. Wyjątek stanowią plemniki ogierów, w których granice akrosomu oraz wstawki plemnika przy tej metodzie były widoczne nieco wyraźniej niż u samców innych gatunków, ale nie na poziomie takiej ostrości jak w przypadku barwienia AgNO 3. Metoda ta sprawdza się w ocenie morfologicznej, natomiast nie nadaje się do precyzyjnej oceny parametrów morfometrycznych odnoszących się do akrosomu i wstawki plemnika. Wykorzystanie różnych barwników niesie za sobą określone konsekwencje w zakresie możliwości oceny poszczególnych struktur plemnika (Graves i in., 2005). Chociaż niektóre badania wskazują, że alternatywne techniki barwienia są skuteczne, inne z kolei badania donoszą, że istnieją znaczące różnice w zróżnicowaniu, intensywności i kontraście, a co ważniejsze w rozmiarze i kształcie plemników, z czego każda z tych cech może mieć wpływ na ostateczny wynik oceny morfologii nasienia w prognozowaniu płodności samca (Coetzee i in., 2001). Wynika to z wpływu poszczególnych odczynników chemicznych na barwione komórki płciowe. Używane barwniki mogą powodować skurcz lub obrzęk główki plemnika. Zmiany takie nie powstają w sposób jednolity, gdyż jedna technika barwienia może 16