PL B1. LEN PHARMA SPÓŁKA Z OGRANICZONĄ ODPOWIEDZIALNOŚCIĄ, Malbork, PL BUP 08/10

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 15/52 ( ) C12N 15/29 ( ) C12N 15/82 ( ) C08L 67/04 ( ) C08L 23/12 ( ) C08L 25/06 ( ) A61L 27/14 ( ) (54) Biokompozyt i jego zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: LEN PHARMA SPÓŁKA Z OGRANICZONĄ ODPOWIEDZIALNOŚCIĄ, Malbork, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/10 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 07/15 (72) Twórca(y) wynalazku: JAN SZOPA-SKÓRKOWSKI, Wrocław, PL MAGDALENA WRÓBEL-KWIATKOWSKA, Wrocław, PL ANNA KULMA, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy biokompozyt zawierający zmodyfikowany genetycznie len i jego zastosowanie. Biokompozyty mają zastosowanie w przemyśle, w rolnictwie i w medycynie, w szczególności do wytwarzania implantów. Polipropylen, polistyren i polihydroksymaślan są polimerami termoplastycznymi znajdującymi szerokie zastosowanie w przemyśle włącznie z przemysłem tekstylnym a w szczególności w produkcji opakowań. Polipropylen i polistyren są polimerami ropopochodnymi natomiast polihydroksymaślan jest produkowany przez bakterie. Polipropylen i polistyren nie są biodegradowalne w przeciwieństwie do polihydroksymaślanu, który jest całkowicie biodegradowalny. Jednakże, w przeciwieństwie do polipropylenu i polistyrenu polimer 3-hydroksymaślanu jest materiałem kruchym. W stanie techniki, ze względu na potencjalne zwiększenie biodegradowalności polipropylenu i polistyrenu, podejmowano liczne próby wytworzenia kompozytów składających się z PP lub PS i włókna pochodzącego z różnych roślin w tym lnu. Okazało się jednak, że tak wytworzony kompozyt ma obniżone właściwości mechaniczne w porównaniu z czystym PP i PS. W ostatnich latach, ze względu na całkowitą biodegradowalność PHB podjęto kilka prób obniżenia jego kruchości (zwiększenia twardości) przez wytworzenie kompozytów z hydroksyapatytem, włóknem ceramicznym lub włóknem szklanym z zamiarem ich wykorzystania jako implantów zamienników obecnie stosowanych implantów stalowych. Jakkolwiek, zastosowanie włókna nieorganicznego zmniejsza bioaktywność kompozytu. Problemem nierozwiązanym w stanie techniki pozostaje opracowanie biokompozytu o wysokich właściwościach biomechanicznych. Istotny wpływ na własności mechaniczne kompozytów ma możliwość przenoszenia naprężeń z osnowy do włókien, o czym w głównej mierze decyduje połączenie na granicach fazowych osnowa/włókna. Dobre połączenie pozwala na przenoszenie głównie poprzez naprężenia styczne obciążeń z osnowy do włókien umacniających i parametr ten w dużej mierze decyduje o własnościach materiałów kompozytowych. Warunkiem niezbędnym w tworzeniu efektywnego kompozytu jest zapewnienie kompatybilności osnowy i wypełnienia. Celem wynalazku jest uzyskanie kompozytu posiadającego opisane powyżej pożądane właściwości mechaniczne. Biokompozyty znajdują zastosowanie w medycynie, począwszy od nici chirurgicznych po implanty. Wszędzie tam gdzie implant kontaktuje się z pełną krwią wymagana jest ocena agregacji płytek krwi na kompozycie. Korzystnym jest, aby nie dochodziło do agregacji skutkującej tworzeniem zakrzepów. Dotychczasowe kompozyty tworzono z włókna niemodyfikowanego i PP. Tak przygotowany kompozyt odznacza się bardzo zmniejszoną wytrzymałością na rozciąganie, co wynika ze słabej adhezji włókna do osnowy oraz powodują agregację płytek krwi. Zarówno polipropylen czysty jak i w kompozycie z włóknami niemodyfikowanymi lub niemodyfikowanymi wzbogaconym w PHB powoduje agregację płytek krwi (Fig. 7). Nieoczekiwanie problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek. Przedmiotem wynalazku jest biokompozyt charakteryzujący się tym, że zawiera: osnowę zawierającą polimer wybrany spośród: polipropylenu, polistyrenu lub polihydroksymaślanu, oraz zmodyfikowane włókno lniane otrzymane z lnu posiadającego komórki zawierające polinukleotyd kodujący -ketotiolazę obejmujący SEKW NR ID 1, polinukleotyd kodujący reduktazę acetoacetylo-coa obejmujący SEKW NR ID 2, polinukleotyd kodujący syntazę polihydroksymaślanu obejmujący SEKW NR ID 3, lub komórki transformowane wielogenowym konstruktem kodującym -ketotiolazę, reduktazę acetoacetylo-coa i syntazę polihydroksymaślanu obejmującym SEKW NR ID 4. Biokompozyt według wynalazku wyposażony jest we włókno, w którym osnową jest polipropylen (PP), polistyren (PS) lub polihydroksymaślan (PHB) a wypełnienie stanowią włókna lniane wyposażone metodami inżynierii genetycznej w polihydroksymaślan (PHB). W biokompozycie według wynalazku zastosowano włókna modyfikowane, w których celuloza jest połączona chemicznie z PHB w procesie wzrostu roślin. PHB tworzy kompleks z celulozą włókien powiązanych wiązaniami chemicznymi. Kompleks jest kompatybilny z osnową polipropylenową i odznacza się dobrą adhezją. Kompozyt jest elastyczniejszy od jego składowych i nie agreguje płytek krwi. Wchodzący w skład biokompozytu według wynalazku len z podwyższonym poziomem polihydroksymaślanu może być uzyskany sposobem, który polega na tym, że do genomu komórek lnu wprowadza się wielogenowy konstrukt zawierający trzy cdna kodujące trzy bakteryjne enzymy szlaku biosyntezy polihydroksymaślanu, którymi są -ketotiolaza, reduktaza acetoacetylo-coa i syntaza polihydroksymaślanu. Wielogenowy konstrukt wytwarza się przez wprowadzenie do wektora pbinar Hyg trzech genów zawierających kolejno cdna kodujący -ketotiolazę z Ralstonia eutropha pod kontrolą

3 PL B1 3 promotora (16R) i terminatora Nos, cdna kodujący reduktazę acetoacetylo-coa z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 35S CaMV i terminatora Nos oraz cdna kodujący syntazę polihydroksymaślanu z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 35S CaMV i terminatora Ocs. Wielogenowy konstrukt wprowadza się do genomu komórek lnu przez inkubację z kulturą Agrobacterium tumefaciens, zawierającą ten konstrukt. Wielogenowy konstrukt, użyty w sposobie i nazwany skrótowo pbinar Hyg ABC , pozwala na jednoczesny transfer do rośliny lnu wszystkich trzech genów niezbędnych do syntezy polihydroksymaślanu. Trzy cdna kodujące niezbędne trzy enzymy pochodzą z bakterii Ralstonia eutropha. Bakteria ta syntetyzuje polihydroksymaślan przez kondensację dwóch cząsteczek acetylo-coa do acetoacetylo-coa, przy udziale -ketotiolazy, który jest następnie redukowany przez reduktazę acetoacetylo-coa do 3-hydroksybutyrylo-CoA, a ten ulega polimeryzacji przy udziale syntazy polihydroksymaślanu do polihydroksymaślanu. W korzystnej realizacji wynalazku biokompozyt zawiera od 10% do 50% zmodyfikowanego włókna lnianego i od 90% do 50% polimeru. W bardziej korzystnej realizacji wynalazku, biokompozyt zawiera 20% zmodyfikowanego włókna lnianego. W innej korzystnej realizacji wynalazku, biokompozyt zawiera 50% zmodyfikowanego włókna lnianego. Nieoczekiwanie okazało się, że PHB syntetyzując się w łodygach lnu tworzy nie tylko połączenie fizyczne z celulozą włókien, ale również wiązania wodorowe i estrowe. Istnienie wiązań chemicznych między polimerami ustalono na podstawie analizy widm w podczerwieni. Dla włókna normalnego pasmo przy 3400 cm -1 można rozłożyć na cztery komponenty Lorenza (fig. 2 insert) natomiast w widmie transgenicznego PHB (fig. 1 insert) daje się wyróżnić sześć komponent w większości przesuniętych w kierunku krótszych długości fal. Przesunięcie pasm w kierunku niższych długości fal świadczy o silnych wiązaniach wodorowych między PHB i celulozą. Fakt, że takie pasmo występuje w widmie syntetyzowanego w transgenicznym lnie PHB i jego złożoność świadczy o tym, że PHB koekstrahuje się z celulozą, co oznacza silne wiązania chemiczne między tymi polimerami. Analiza widm w przedziale cm -1 bakteryjnego PHB i transgenicznego ekstrahowanego chloroformem pokazuje, że ten pierwszy zawiera dwie komponenty (1740 i 1724 cm -1 ), podczas gdy drugi posiada cztery składowe (fig. 3). Nieoczekiwanie zatem syntetyzowany w Inie transgenicznym PHB tworzy kompleks z celulozą w procesie wzrostu roślin i kompleks jest połączony wiązaniami wodorowymi i estrowymi. Synteza PHB we włóknach i tworzenie kompleksu z celulozą powoduje, że włókna są bardziej czyste, zawierają mniej zanieczyszczeń pektynowych i ligninowych (fig. 4). Wyposażenie włókna lnianego w PHB osiągnięto przez nadprodukcję w łodygach roślin trzech genów bakteryjnych, których produkty są enzymami zdolnymi do syntezy PHB. Analizie poddano kompozyty zawierające od 10% do 50% włókna i od 90% do 50% polimeru. Kompozyty złożone z czystego PP miały najgorszą elastyczność (fig. 6). Najlepszą elastyczność, 85% większą od czystego PP, miały materiały złożone z 20% włókien transgenicznych. Inny mierzony parametr a mianowicie maksymalna wytrzymałość na rozciąganie była mniejsza o 23% od czystego PP jednak dużo większa (dwukrotnie) niż kompozyty z włókien niemodyfikowanych. Nieoczekiwanym było również to, że zmieszanie włókien niemodyfikowanych z PP i dodanie PHB nie zmienia parametrów mechanicznych kompozytu z włóknem niemodyfikowanym. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie lnu posiadającego komórki zawierające polinukleotyd kodujący -ketotiolazę obejmujący SEKW NR ID 1; polinukleotyd kodujący reduktazę acetoacetylo-coa obejmujący SEKW NR ID 2; polinukleotyd kodujący syntazę polihydroksymaślanu obejmujący SEKW NR ID 3; lub komórki transformowane wielogenowym konstruktem kodującym -ketotiolazę, reduktazę acetoacetylo-coa i syntazę polihydroksymaślanu, obejmującym SEKW NR ID 4 do produkcji biokompozytu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie biokompozytu jak określono powyżej do wytwarzania materiałów medycznych, zwłaszcza implantów medycznych. Wyposażenie w drodze inżynierii genetycznej włókna lnu w PHB powoduje jego zwiększoną hydrofobowość i lepszą adhezję z PP, PS i PHB. Ze względu na te właściwości kompozyt nadaje się do produkcji opakowań i innych materiałów na potrzeby rolnictwa, przemysłu farmaceutycznego, a w szczególności implantów medycznych. Przedmiot wynalazku uwidoczniono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia widma w podczerwieni PHB ekstrahowanego z włókien lnianych chloroformem PHB czystego z bakterii dostępnego komercyjnie oraz włókna lnianego.

4 4 PL B1 Fig. 2 przedstawia widmo włókien celulozowych z roślin kontrolnych (wt) i transgenicznych (numerowane) oraz jego rozkład na komponenty Lorenza (insert). Fig. 3 przedstawia składowe Lorenza pasma cm -1 bakteryjnego PHB i izolowanego z roślin transgenicznych. Fig. 4 przedstawia skaningową mikroskopię elektronową włókien roślin kontrolnych (lewa strona) i transgenicznych (prawa strona) bezpośrednio po roszeniu (A), traktowanych 5% NaOH (B) i ekstrahowanych chloroformem (C). Fig. 5 przedstawia etapy technologiczne otrzymywania kompozytów umacnianych włóknami lnianymi. Fig. 6 przedstawia parametry mechaniczne czystego polipropylenu i kompozytów z różną zawartością włókien lnianych pochodzących z roślin transgenicznych M50. Fig. 7 przedstawia skaningową mikroskopię elektronową przełamów kompozytów złożonych z PP i włókien naturalnych (lewy panel) i włókien transgenicznych (prawy panel). Strzałkami oznaczono nieciągłości. Fig. 8 przedstawia skaningową mikroskopię elektronową kompozytów inkubowanych z ludzkimi płytkami krwi. A- czysty PP; B- PP z włóknami niemodyfikowanymi; PP z włóknami niemodyfikowanymi i dodatkiem bakteryjnego PHB; C- PP z włóknami modyfikowanymi. Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania. P r z y k ł a d 1 Przygotowanie konstruktu wielogenowego. W celu przygotowania wielogenowego konstruktu, z wektora pblprpa2 wycięto enzymem Bam HI promotor prpl, pod kontrolą którego znajdował się gen phb A (Sekw. nr: 1) wyposażony w sekwencję TPSS i Nos terminator. Uzyskano w ten sposób wektor pbi Mag TPSSA, z którego przy udziale enzymów Xbal i EcoRI wycięto fragment zawierający sekwencje TPSS-phb A-Nos o długości 1821 bp. Inny wektor pbinar Hyg BC zawierający geny phb B (Sekw. nr: 2) i phb C (Sekw. nr: 3) wraz z odpowiednimi sekwencjami umożliwiającymi ich ekspresję zlinearyzowano przez cięcie restrykcyjne enzymem Hindlll i wypełniono lepkie końce powstałe po trawieniu endonukleazą. Następnie przeprowadzono ligację liniowego wektora pbinar Hyg BC z fragmentem zawierającym sekwencje TPSS- phb A-Nos, uzyskując wektor pbinmag ABC o długości bp. Otrzymany plazmid zlinearyzowano przy udziale enzymu Spel i wypełniono lepkie końce, jednocześnie z innego wektora pbi przy użyciu enzymów BamHI i Sall wycięto promotor (16R) i wypełniono lepkie końce. W kolejnym etapie przeprowadzono ligację liniowego wektora pbin Mag ABC i promotora (1084 bp), otrzymując wielogenowy konstrukt: (Sekw. nr: 4) umieszczony w plazmidzie pbinar Hyg ABC zawierający trzy geny pochodzące z Ralstonia eutropha: phba (EMBL/GenBank J04987), phbb (EMBL/GenBank J04987) oraz phbc (EMBL/GenBank J05003). Geny te zostały umieszczone pod kontrolą specyficznego dla wiązek przewodzących promotora izoformy 16R z Solanum tuberosum (phba) lub wirusowego promotora 35 S (phbb i phbc) oraz zawierały sekwencję kierującą do plastydów pochodzącą z genu Rubisco. Konstrukt zawierał ponadto gen nptil kodujący fosfortransferaze neomycyny warunkującą odporność na antybiotyk jako marker selekcyjny. Wprowadzenie konstruktów genowych do bakterii Wprowadzenie do komórek roślinnych konstruktu wielogenowego dokonuje się przez inkubację (przez 2 dni w ciemności) liścieni i hypokotyli lnu z 50 l kultury Agrobacterium tumefaciens zawierających wielogenowy lub jednogenowy konstrukt. Po inkubacji i odpłukaniu w sterylnej wodzie liścienie i hypokotyle przenosi się na stałe podłoże (pożywka indukująca kallus i zawierająca antybiotyk, jako marker selekcyjny, kanamycynę lub hygromycynę) w celu uzyskania niezróżnicowanej tkanki kallusowej. Uzyskaną tkankę kallusową hoduje się na podłożu regeneracyjnym (pożywka indukująca pęd i zawierająca kanamycynę lub hygromycynę), które stymuluje różnicowanie się komórek i uzyskuje się wykształcone łodygi. Otrzymane pędy hoduje się do osiągnięcia odpowiedniej wielkości i przenosi na podłoże indukujące tworzenie korzeni i niezawierające antybiotyków, finalnie ukorzenione rośliny przenosi się do ziemi. Wbudowanie konstruktów do genomu lnu i stabilność ich ekspresji sprawdza się technikami PCR i Northern blottingu z użyciem sondy, którą stanowi wyznakowany radioaktywnie cdna kodujący -ketotiolazę. Wpływ konstruktów na poziom polihydroksymaślanu dokonuje się na podstawie analizy w chromatografie gazowym z detektorem masowym (GC-MS), w której oznaczany jest ester etylowy kwasu 3-trimetylosilylooxybutanowego jako produkt końcowy gromadzony w transgenicznych roślinach lnu. Transgeniczny len wytwarzany wyżej opisanym sposobem zawiera do 4,62 g PHB/g FW w przypadku transformacji konstruktem wielogenowym.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d 2 Technologia otrzymywania kompozytów umacnianych włóknami lnianymi i lnianymi modyfikowanymi wg wynalazku (fig. 5). Włókna segreguje się pod względem długości i te najdłuższe stosuje się do wytworzenia przędzy a pozostałość suszy się i mieli w młynie Retscha. Mieszanina włókien modyfikowanych z polimerem biodegradowalnym (PHB) lub syntetycznym (polistyren, polipropylen) przygotowuje się w procesie mieszania w celu wytworzenia homogenicznego materiału a włókna lniane wprowadza się i rozprasza w stopionym termoplaście biodegradowalnym lub syntetycznym w procesie wytłaczania. Istotnym etapem procesu technologicznego jest zbadanie adhezji osnowy (PHB, polistyren, polipropylen) na granicy fazowej z włóknami lnianymi i lnianymi modyfikowanymi. Celem poprawy adhezji zastosowano obróbkę mechaniczną włókien lnianych (rozdrobnienie w młynie Retscha). Transgeniczne włókna lniane miesza się z 3 wybranymi osnowami polimerowymi poli- -hydroksymaślanem (PHB), polistyrenem i polipropylenem. Kompozyty polimerowe umacniane włóknami naturalnymi wytwarza się z użyciem standardowych maszyn tj. wtryskarek ze zwykłym ślimakiem i wtryskarek z klasyczną formą do wtryskiwania. Komercyjnie dostępne preparaty PP i PS mieszano ze zmielonymi włóknami w temperaturze 170 C natomiast z PHB w temperaturze 158 C. Mieszaninę uformowano w pasma w prasie mechanicznej. Pasma cięto na fragmenty i formowano w wytłaczarce 1-ślimakowej między płytami teflonowymi w temperaturze 175 C przez 1.15 min i ciśnieniem 20 t, w ten sposób uzyskuje się kompozyt w formie płytki o dowolnej wielkości i grubości. Analiza mechaniczna kompozytów. Analizę wykonuje się w maszynie wytrzymałościowej Instron (model 5542, High Wycombe, UK) i z użyciem oprogramowania Merlin (Instron, UK). Istotnym parametrem oznaczanym powszechnie oceniającym właściwości kompozytu jest skaningowa mikroskopia elektronowa (aparat firmy JEOL JSM-5800LV) przełamów płytek kompozytowych. Zdjęcia takich przełamów dla kompozytów z włóknem niemodyfikowanym i modyfikowanym przedstawia fig. 7. Przełamy kompozytów z włókna niemodyfikowanego wykazują nieciągłości (dziury), których obecność świadczy, że raczej są wyrywane z osnowy niż zrywane czyli ich obecność świadczy o niekompatybilności (słabej adhezji) włókna i osnowy. Nieoczekiwanie włókna modyfikowane nie mają takich dziur, są zatem kompatybilne z osnową.

6 6 PL B1

7 PL B1 7

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11 Zastrzeżenia patentowe 1. Biokompozyt, znamienny tym, że zawiera: osnowę zawierającą polimer wybrany spośród: polipropylenu, polistyrenu lub polihydroksymaślanu, oraz zmodyfikowane włókno lniane otrzymane z lnu posiadającego komórki zawierające polinukleotyd kodujący -ketotiolazę obejmujący Sekw. nr 1; polinukleotyd kodujący reduktazę acetoacetylo- CoA obejmujący Sekw. nr 2; polinukleotyd kodujący syntazę polihydroksymaślanu obejmujący Sekw. nr 3; lub komórki transformowane wielogenowym konstruktem kodującym -ketotiolazę, reduktazę acetoacetylo-coa i syntazę polihydroksymaślanu, obejmującym Sekw. nr Biokompozyt według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera od 10% do 50% zmodyfikowanego włókna lnianego i od 90% do 50% polimeru. 3. Biokompozyt według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera 20% zmodyfikowanego włókna lnianego. 4. Biokompozyt według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera 50% zmodyfikowanego włókna lnianego. 5. Zastosowanie lnu posiadającego komórki zawierające: polinukleotyd kodujący -ketotiolazę obejmujący Sekw. nr 1; polinukleotyd kodujący reduktazę acetoacetylo-coa obejmujący Sekw. nr 2; polinukleotyd kodujący syntazę polihydroksymaślanu

12 12 PL B1 obejmujący Sekw. nr 3; lub komórki transformowane wielogenowym konstruktem kodującym -ketotiolazę, reduktazę acetoacetylo-coa i syntazę polihydroksymaślanu, obejmującym Sekw. nr 4. do produkcji biokompozytu. 6. Zastosowanie biokompozytu jak określono w zastrz. od 1 4 do wytwarzania materiałów medycznych, zwłaszcza implantów medycznych. Rysunki

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1

17 PL B1 17

18 18 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)