Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Marii Rutkiewicz pt. Badania strukturalne β-d-galaktozydaz z antarktycznych bakterii z rodzaju Paracoccus

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Wojciech Rypniewski Instytut Chemii Bioorganicznej PAN Zakład Struktury i Funkcji Biomolekuł wojtekr@ibch.poznan.pl tel: fax: Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Marii Rutkiewicz pt. Badania strukturalne β-d-galaktozydaz z antarktycznych bakterii z rodzaju Paracoccus i Arthrobacter Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska została wykonana pod kierunkiem promotorskim dr hab. inż. Anny Bujacz z Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. W rozprawie badane są struktury krystalograficzne dwóch galaktozydaz i ich kompleksów z ligandami. Oba białka pochodzą z zimnolubnych antarktycznych bakterii glebowych. W tematyce rozprawy nakładają się dwa zagadnienia. Jedno dotyczy natury samych galaktozydaz, które ogólnie zostały już scharakteryzowane pod kątem mechanizmu reakcji enzymatycznej, ale szczegóły reakcji mogą być nadal zgłębiane. Poza tym enzymy należące do tej samej rodziny różnią się specyficznością substratową i różną zdolnością do reakcji transglikozylacji. Drugim zagadnieniem jest adaptacja enzymów psychrofilnych do wydajnej pracy w niskich temperaturach. Enzymy zimnolubne mimo niesprzyjających warunków termodynamicznych często wykazują aktywność zbliżoną do ich mezofilnych analogów. Cel badań został zdefiniowany na początku rozprawy. Doktorantka podjęła się zbadania struktur obu wymienionych w tytule galaktozydaz, aby wyjaśnić ich nietypową, w porównaniu z pokrewnymi enzymami, oligomeryzację, dokonać szczegółowej analizy mechanizmu reakcji enzymatycznej oraz, przez porównanie struktur enzymów zimnolubnych z ich mezofilnymi i termofilnymi analogami, przybliżyć nas do odpowiedzi, co sprawia, że enzymy zimnolubne są wydajne katalitycznie w niskiej temperaturze. Stwierdzam, że problem jaki doktorantka podjęła się rozwiązać jest interesujący z poznawczego punktu widzenia i dotyczy ważnego obszaru badań. Zatem teza naukowa postawiona przez doktorantkę jest wartościowym tematem rozprawy doktorskiej. Układ i edycja rozprawy. Rozprawa liczy 180 stron wraz z obszerną bibliografią i jest podzielona na rozdziały w sposób tradycyjny. Po polskim i anglojęzycznym streszczeniu i zdefiniowanym celu badań następuje wstęp, materiały i metody, część eksperymentalna, dyskusja, podsumowanie, spis rysunków, tabel i bibliografia. Tekst kończy wykaz dorobku naukowego doktorantki. Rozprawa napisana jest poprawną polszczyzną w sposób przystępny, stylistycznie na dobrym poziomie. Jako nieistotne pomijam drobne błędy językowe. Tekst jest starannie ilustrowany. Podsumowując stwierdzam, że doktorantka wykazuje umiejętność właściwego przedstawienia uzyskanych wyników. Dobrze oceniam styl i przejrzystość rozprawy oraz jej poziom edytorski. Część literaturowa. Wstęp jest treściwym wprowadzeniem w tematykę rozprawy. Najpierw opisane są ekstremofile, a szczególnie psychrofile. Doktorantka zwraca uwagę, że w większości biosfery panują temperatury poniżej 5 C i właśnie w takich warunkach wytwarzana jest większość biomasy. Wymienia te ogólne cechy enzymów zimnolubnych, które wg badaczy odpowiedzialne są za ich przystosowanie do aktywności w niskich

2 temperaturach. Jest to szeroko zdefiniowana elastyczność konformacyjna czy mobilność strukturalna cząsteczki, z czym związane są takie cechy, jak obniżona hydrofobowość rdzenia, zwiększona hydrofobowość powierzchni, wydłużone, względem mezofili i termofili pętle łączące elementy struktury drugorzędowej, zmniejszona ilość reszt proliny, a zwiększona glicyny, lub też zmniejszona ilość oddziaływań elektrostatycznych. Następnie doktorantka opisuje galaktozydazy, ich mechanizm reakcji enzymatycznej i rolę w organizmie, a także ich zastosowania w przemyśle. Zwraca uwagę na substraty tych enzymów, a na koniec przedstawia wybrane struktury krystalograficzne. Bibliografia liczy 143 pozycji literaturowych i obejmuje prace zarówno badawcze jak i metodologiczne w zakresie stosownym do tematyki rozprawy. Po zapoznaniu się z częścią literaturową dobrze oceniam teoretyczną wiedzę doktorantki w zakresie dyscypliny naukowej, której dotyczy temat rozprawy. Metodyka badań opisuje zastosowane metody, jak klonowanie i ekspresja wybranych genów, oczyszczanie białek, krystalizacja, pomiary dyfrakcyjne, procesowanie danych, rozwiązywanie struktur krystalograficznych, z uwzględnieniem takich metod, jak podstawienie izomorficzne, podstawienie cząsteczkowe i anomalne rozpraszanie promieni Rentgena. Następnie opisuje budowanie i udokładnianie modelu cząsteczkowego i jego walidację. Podsumowując, doktorantka w rozdziale poświęconym metodyce badań demonstruje ogólne zrozumienie warsztatu, którym się posługuje. Rozdział Część eksperymentalna opisuje prace, jakie zostały wykonane, począwszy od doczyszczania preparatów białek z bakterii Paracoccus i Arthrobacter oraz ich mutantów otrzymanych od współpracowników z Politechniki Gdańskiej. Dla białka i mutantów z Arthrobacter doktorantka wykonała testy termofluorowe w celu określenia temperatury topnienia białka w różnych roztworach. W niektórych warunkach białko i jego mutanty były stabilne do około 40 C (dla większości warunków było to ok. 25 C). Nie znalazłem informacji na temat żywotności tego szczepu bakterii w różnych temperaturach, ale badane białko może być bardziej stabilne niż organizm, z którego pochodzi. Warto pamiętać, że tolerancja czy odporność całego organizmu na warunki zewnętrzne może być znacznie niższa niż dla niektórych jego białek. Wówczas wnioski wyciągnięte na podstawie badania tych białek mogą być mylące. Dobrze, że doktorantka zbadała termostabilność badanych przez siebie preparatów. Następnie doktorantka wykrystalizowała i zoptymalizowała warunki krystalizacji dla obu badanych galaktozydaz i ich mutantów, a także kompleksów tych białek z ligandami, i przeprowadziła pomiary dyfrakcyjne na synchrotronach w Berlinie i w Hamburgu. Dla białka z bakterii Paracoccus otrzymała dane dla formy bez ligandu i w kompleksie z galaktozą. Natomiast dla galaktozydazy z Arthrobacter pomiary zostały wykonane dla samego białka w temperaturze 100K i w temperaturze pokojowej, 293K, a także w warunkach kriogenicznych dla czterech mutantów punktowych, w których zmieniono pojedyncze reszty aminokwasowe biorące udział w katalizie bądź wiązaniu substratu, aby lepiej określić ich funkcję. Następnie doktorantka uzyskała kolejnych 12 zbiorów danych dyfrakcyjnych kompleksów białka lub jego mutantów z ligandami, takimi jak laktoza (substrat), galaktoza (produkt) i z innymi ligandami, jak IPTG, ONPG (ortho-nitrophenyl-β-galactoside), laktuloza i sacharoza. Rozwiązanie struktury galaktozydazy z Paracoccus metodą podstawienia cząsteczkowego nie było proste ze względu na to, że dostępne struktury homologiczne cechowały się niskim podobieństwem sekwencji aminokwasowej. Jednak powiodło to się dzięki zastosowaniu automatycznego trybu w programie BALBES. Ostatecznie najlepszym modelem początkowym okazała się galaktozydaza z Bacteroides vulgatus, zdeponowana w bazie PDB, ale nieopublikowana w literaturze naukowej. Z kolei strukturę enzymu z

3 Arthrobacter doktorantka rozwiązała używając struktury pokrewnej galaktozydazy z innego szczepu Arthrobacter, o dość wysokim podobieństwie sekwencji. Następnie wszystkie struktury enzymów, ich mutantów i kompleksów z ligandami zostały wymodelowane i udokładnione standardowymi metodami, a końcowe statystyki nie budzą zastrzeżeń. Galaktozydazy z rodziny drugiej zwykle są tetrametyczne, ewentualnie heksameryczne. Niespodzianką było odkrycie, że formą fizjologiczną badanych enzymów zimnolubnych jest dimer. Dimeryzacji towarzyszy zmienione wzajemne ułożenie niektórych z pięciu domen podjednostki białka. Domena katalityczna (trzecia z kolei) ma budowę baryłki TIM, typową dla glikozydaz i wielu innych enzymów. Doktorantka pisze na str. 111, że pozostałe domeny posiadają zwój typu immunoglobuliny. Tymczasem w literaturze domena 1 określona jest jako jelly-roll (nie jery-roll), domeny 2 i 4 mają fałd FN3 (Fibronectin-type III), a domena 5 to kanapka-β. Proszę doktorantkę o wyjaśnienie w jaki sposób ustaliła pofałdowanie badanego białka. Analizując miejsce aktywne enzymu z bakterii Paracoccus doktorantka zauważa, że w odróżnieniu od tetramerycznych i heksamerycznych galaktozydaz, w badanym przez niej dimerycznym białku centrum aktywne nie jest osłanianie przez sąsiednie domeny, ale otwarte na środowisko zewnętrzne. Czy możliwe jest, że to wyeksponowanie miejsca wiązania substratu jest cechą adaptacyjną dla niskich temperatur? Czy takie otwarcie na substrat mogłoby sprzyjać aktywności katalitycznej przy zmniejszonym powinowactwie do substratu? Analizując kompleks ParβDG doktorantka pisze: W łańcuchu B cząsteczka galaktozy została udokładniona w konformacji pół-krzesełkowej z wydłużonym wiązaniem glikozydowym. Zważywszy na niską rozdzielczość danych dyfrakcyjnych i mapy gęstości elektronowej trudno udokładniać szczegóły struktury. Rozumiem, że konformację pierścienia cukrowego doktorantka ustaliła częściowo pośrednio, przez obserwację położenia sąsiadujących reszt aminokwasowych. Czy jednak przy rozdzielczości 3,2Å naprawdę można stwierdzić wydłużenie wiązania glikozydowego? Analogiczny enzym z Arthrobacter także jest dimerem i posiada podobną strukturę domen. Jednak porównując obie struktury doktorantka zauważyła bardziej ograniczoną przestrzeń miejsca wiązania substratu w białku z bakterii Paracoccus, na podstawie czego wysunęła hipotezę, że jest to przyczyną dlaczego to białko oprócz aktywności hydrolitycznej nie wykazuje aktywności transglikozylacyjnej. Nie ma tam miejsca na większą cząsteczkę niż woda, która mogłaby wypełnić funkcję wtórnego nukleofila. To ciekawa obserwacja. Doktorantka porównała strukturę galaktozydazy z Arthrobacter z porównywalnymi enzymami z organizmów mezo- i psychrofilnych. Niestety nie jest dostępna podobna struktura z termofila. Porównanie homologicznych enzymów dostosowanych do różnych biegunów temperaturowych dałoby dobrą szansę na wyodrębnienie cech odpowiedzialnych za te szczególne adaptacje. Porównując dostępne struktury doktorantka wpierw zidentyfikowała te ich części, które determinują dlaczego badane przez nią białka są dimeryczne, choć inne z reguły mają wyższy stopień oligomeryzacji. Następnie przeszła do bardziej szczegółowej analizy i odnotowała ogólną zachowawczość reszt aminokwasowych odpowiedzialnych za aktywność katalityczną. Doktorantka poddała analizie struktury czterech mutantów białka, wygenerowanych, aby sprawdzić rolę w katalizie wybranych reszt aminokwasowych, a także aby móc otrzymać kompleksy białka z ligandami, które byłyby niemożliwe do zbadania w przypadku białka natywnego, gdyż zostałyby zbyt szybko zhydrolizowane. Najpierw zbadała struktury mutantów bez ligandów i stwierdziła, że mutacje w miejscu katalitycznym same w sobie nie spowodowały znaczących zmian w strukturze białka. Natomiast mutacje w miejscu wiązania substratu mogą zmienić specyficzność substratową. Kompleksy białka ze zmutowanymi resztami katalitycznymi, nasączane laktozą i inhibitorem IPTG pozwoliły doktorantce opisać sposób wiązania substratu, bądź analogu substratu, we wczesnej fazie oddziaływania, czyli

4 przed hydrolizą. Zauważa dwa stany wiązania ligandu: płytkie, przypuszczalnie zachodzące we wczesnej fazie oddziaływania, oraz głębokie, gdzie substrat jest już bliski reakcji. Doktorantka zauważa też różnice w wiązaniu substratu, które mogą mieć wpływ na zwiększona aktywność katalityczną w przypadku psychrofila. Kompleks z laktulozą pokazał, w jaki sposób wiąże się ten dwucukier, który może być produktem transglikozylacji galaktozydazy z bakterii Arthrobacter. Kompleks z galaktozą ujawnił sześć miejsc wiązania tego cukru na powierzchni enzymu. Doktorantka typuje jedno z nich jako allosteryczne miejsce wiązania, w którym galaktoza działa na enzym inhibująco. Skąd wiadomo, że galaktoza jako inhibitor działa allosterycznie, a nie kompetycyjnie w miejscu wiązania substratu? Z kolei kompleks z sacharozą ukazał, że ten ligand, mogący uczestniczyć w transglikozylacji, wiąże się w pobliżu miejsca aktywnego. W ostatniej części rozprawy doktorantka zajmuje się elementami struktury, które mogą być odpowiedzialne za przystosowanie enzymu do niskich temperatur i na początek zauważa, że skład aminokwasowy zimnolubnych galaktozydaz odbiega od przyjętego, jako typowy dla adaptacji do niskich temperatur. Zwłaszcza zawartość reszt lizyny jest dużo niższa niż w mezofilnych homologach, czyli pod tym względem jest odwrotnie niż by wynikało z ogólnych obserwacji. Podobnie jest z zawartością reszt proliny, których w zimnolubnych galaktozydazach jest więcej niż w homologach mezofilnych. Odnośnie postulowanej podwyższonej elastyczności doktorantka pisze: Najczęściej atrybuowaną enzymom zimnolubnym cechą strukturalną jest zwiększona elastyczność cząsteczki. Jest to jednak ogromne uproszczenie [ ] dla właściwego funkcjonowania enzymów zimnolubnych niezbędne jest odpowiednie połączenie elementów usztywnionych oraz elementów o podwyższonej elastyczności. To bardzo ciekawy głos w dyskusji o enzymach zimnolubnych. Porównanie enzymu a Arthrobacter badanego w temperaturze 100K, a także w temperaturze pokojowej, pokazało, że struktury są podobne i w obu przypadkach te same części struktury charakteryzują się podwyższoną mobilnością, mierzoną czynnikiem temperaturowym B, chociaż w niskiej temperaturze ta mobilność relatywnie spada. Doktorantka analizuje też powierzchnię białka i znajduje tam zwiększony udział reszt hydrofobowych w enzymach psychrofilnych. Zauważa, że jest to zgodne w wcześniejszymi obserwacjami dla enzymów zimnolubnych, co było rozważane jako strukturalne przystosowanie enzymu do zimna. Zastanawiam się, czy te łatki hydrofobowe nie mogłyby posiadać powinowactwa do substratu, zwiększając lokalne stężenie, a zatem dostępność substratu do reakcji enzymatycznej. Hydrofobowe pierścienie aromatyczne mogą oddziaływać warstwowo z pierścieniami cukrowymi. Część wyników badań wchodzących w skład niniejszej rozprawy została opublikowana w kilku artykułach, w uznawanych międzynarodowych czasopismach naukowych. Najnowsza praca ukazała się w tym roku w Biochimica et Biophysica Acta - Proteins & Proteomics (Impact Factor 2,5). Poprzednio ukazały się jeszcze dwie prace w tematyce rozprawy. Jedna w Acta Crystallographica D (IF 3,2), w 2016 roku, i jedna w Acta Crystallographica A (IF 1,9), w 2017 r.. We wszystkich trzech publikacjach doktorantka jest autorem wiodącym. Pani Maria Rutkiewicz jest współautorem jeszcze jednej publikacji w Acta Crystallographica D, niezwiązanej z niniejszą rozprawą, ale dotyczącej pokrewnego tematu enzymów psychrofilnych. Doktorantka jest też współautorem 12 modeli strukturalnych zdeponowanych w banku danych PDB. Podsumowując, oceniam niniejszą rozprawę bardzo pozytywnie. Doktorantka dobrze sprostała wyzwaniom, dysponuje pogłębioną wiedzą w obszarze krystalografii, rozwiązała postawiony problem samodzielnie i przy użyciu właściwej do danego zadania metody. Wykazała się starannością i wnikliwością w dążeniu do naukowego celu. Rozprawa w pełni

5 spełnia wymogi formalne stawiane w tej mierze pracom doktorskim, dlatego wnoszę do Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o dopuszczenie kandydatki do dalszych etapów przewodu. Z uwagi na szeroki zakres badań poparty sukcesem w publikowaniu wyników wnoszę o wyróżnienie tego doktoratu. Załączam osobne uzasadnienie. Poznań, 23 sierpnia 2019 roku