Załącznik nr 2 Autoreferat w j. polskim

Transkrypt

1 1. IMIĘ I NAZWISKO Ewelina Warzych-Plejer (z domu Warzych) 2. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE Stopień doktora nauk biologicznych nadany przez Uniwersytet Warmińsko- Mazurski w Olsztynie w dniu Tytuł rozprawy doktorskiej: Ekspresja genów regulujących proces apoptozy oraz potencjał rozwojowy zarodków bydlęcych in vitro. Promotorem w przewodzie doktorskim była prof. dr hab. Dorota Cieślak Dyplom magistra inżyniera na kierunku Biotechnologia, Akademia Rolnicza w Poznaniu (obecnie Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu). 3. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH. - od 1 października 2007 roku do chwili obecnej adiunkt w Katedrze Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu (w tym: urlopy macierzyńskie w okresach oraz ) pracownik techniczny w Katedrze Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Akademii Rolniczej w Poznaniu (obecnie Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu) w laboratorium biotechnologii rozrodu. 4. WSKAZANIE OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCEGO Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DNIA 14 MARCA 2003R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ. U. NR 65, POZ. 595 ZE ZM.). 4.1 TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO Wpływ środowiska pęcherzyka jajnikowego na jakość oocytów bydlęcych. 4.2 PUBLIKACJE WCHODZĄCE W SKŁAD OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO, ZE SZCZEGÓLNYM OMÓWIENIEM INDYWIDUALNEGO WKŁADU WNIOSKODAWCY Ewelina Warzych, Adam Cieslak, Zofia E. Madeja, Piotr Pawlak, Anna Wolc, Dorota Lechniak Multifactorial analysis of the follicular environment is predictive of 1

2 oocyte morphology in cattle. Journal of Reproduction and Development, 60(1), 1-8. DOI: /jrd Wydawnictwo Society of Reproduction and Development. IF ,515; IF 5-letni 1,591; punkty MNiSW ; liczba cytowań (do ) 3. Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pozyskaniu finansowania badań (grant nr N N ), planowaniu doświadczenia, wykonaniu większości doświadczeń (pozyskiwanie materiału, analiza apoptozy, pomiar poziomu glukozy), przygotowaniu manuskryptu, odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój udział procentowy szacuję na 70% Ewelina Warzych, Adam Cieslak, Anna Wolc, Dorota Lechniak Cathepsins mrna level in bovine cumulus cells fails to be a good marker of oocyte quality. Animal Science Papers and Reports 34(4), Wydawnictwo Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN. IF ,718; IF 5-letni 1,017; punkty MNiSW ; liczba cytowań (do ) 0. Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pozyskaniu finansowania badań (grant nr N N ), planowaniu doświadczenia, wykonaniu większości doświadczeń (pozyskiwanie materiału, ekspresja genów, ilościowa analiza mtdna), przygotowaniu manuskryptu, odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój udział procentowy szacuję na 75% Ewelina Warzych, Piotr Pawlak, Marcin Pszczola, Adam Cieslak, Dorota Lechniak Prepubertal heifers versus cows the differences in the follicular environment. Theriogenology. DOI: /j.theriogenology Wydawnictwo Elsevier. IF ,798; IF 5-letni 2,154; punkty MNiSW ; liczba cytowań (do ) 0. Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pozyskaniu finansowania badań (grant nr N N ), planowaniu doświadczenia, wykonaniu większości doświadczeń (pozyskiwanie materiału, ekspresja genów, barwienie kropli lipidowych), przygotowaniu manuskryptu, odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój udział procentowy szacuję na 70% Ewelina Warzych, Piotr Pawlak, Marcin Pszczola, Adam Cieslak, Zofia E. Madeja, Dorota Lechniak Interactions of the bovine oocytes with follicular elements with respect to lipid metabolism. Animal Science Journal, DOI: /asj Wydawnictwo Wiley Online Library. 2

3 IF ,96, IF 5-letni 0,993, MNiSW , liczba cytowań (do ) 0. Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pozyskaniu finansowania badań (grant nr N N ), planowaniu doświadczenia, wykonaniu większości doświadczeń (pozyskiwanie materiału, ekspresja genów, barwienie kropli lipidowych), przygotowaniu manuskryptu, odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój udział procentowy szacuję na 70%. PODSUMOWANIE DANYCH NAUKOMETRYCZNYCH OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO Publikacja Impact factor (IF)* Punktacja MNiSW Liczba cytowań** J Reprod Dev , Anim Sci Pap Rep , Theriogenology , Anim Sci J , SUMA 4, * - w przypadku prac z 2016 i 2017 roku wykorzystano ostatnią dostępną wartość IF 2015 ** - Web of Science Core Collection, do r. 4.3 OMÓWIENIE CELU NAUKOWEGO WW. PRAC I OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW WRAZ Z OMÓWIENIEM ICH EWENTUALNEGO WYKORZYSTANIA. Pozyskiwanie zarodków zwierząt gospodarskich w warunkach in vitro stanowi uznaną na całym świecie technikę, która w niepodważalnym zakresie przyczyniła się do przyśpieszenia postępu hodowlanego (np. międzynarodowy handel zarodkami, diagnostyka przedimplantacyjna, pozyskiwanie większej liczby zarodków od cennych genetycznie samic itp). Należy podkreślić również znaczenie takich badań w kontekście rozwoju techniki pozaustrojowego pozyskiwania zarodków człowieka. Niemniej jednak ponad 60-letnie doświadczenia nadal nie pozwalają na przekroczenie pewnych barier, gdyż najbardziej zaawansowane stadium przedimplantacyjne zarodka w warunkach in vitro (tj. stadium blastocysty) uzyskuje najwyżej 30-40% z wyjściowej puli oocytów bydlęcych poddawanych zapłodnieniu. Wielu naukowców poszukuje przyczyn tak wysokiego odsetka niepowodzeń. Jedno z pierwszych doświadczeń w tym temacie dowiodło, iż warunki hodowli zarodków bydlęcych (in vivo vs. in vitro) mają wpływ na ich jakość, natomiast udział uzyskiwanych zarodków w stadium blastocysty jest w istotnym stopniu determinowany jakością oocytów 3

4 (Rizos i wsp. 2002). Dlatego też jakość oocytów stanowi w ostatnich latach jeden z wiodących nurtów w badaniach mających na celu poprawę skuteczności hodowli in vitro zarodków. Na jakość oocytów wpływa szereg czynników, przy czym środowisko pęcherzyka jajnikowego, w jakim oocyt wzrasta, wydaje się mieć znaczenie kluczowe. Szereg doświadczeń wskazuje na istotny wpływ płynu pęcherzykowego na kompleks oocyt-komórki pęcherzykowe, ze szczególnym uwzględnieniem kwasów tłuszczowych. Różna koncentracja pojedynczych kwasów tłuszczowych, a nawet odmienne proporcje pomiędzy nimi w płynie pęcherzykowym, mają istotny wpływ na metabolizm lipidów w obrębie oocytów czy komórek pęcherzykowych. Co ważne istotne zmiany obserwuje się również na dalszym etapie rozwoju zarodkowego, nawet w stadium blastocysty (np. Carro i wsp. 2013; Aardema i wsp. 2011; Marei i wsp. 2009, 2010, 2012; Leroy i wsp. 2005). Na podstawie powyższych informacji w swoich badaniach postawiłam sobie za cel: - określenie, który element środowiska pęcherzykowego powinien być brany pod uwagę przy ocenie jakości oocytu (publikacja 4.2.1); - wykazanie, w jakim stopniu ekspresja wybranych genów (badana na etapie transkrypcji) w komórkach pęcherzykowych może mieć związek z jakością oocytów (publikacja 4.2.2); - charakterystykę wpływu dojrzałości płciowej samic na środowisko pęcherzykowe, ze szczególnym uwzględnieniem wybranych komponentów metabolizmu kwasów tłuszczowych (publikacja 4.2.3); - charakterystykę wybranych etapów przemian metabolicznych kwasów tłuszczowych w obrębie pęcherzyka jajnikowego w powiązaniu z metabolizmem glukozy (publikacja 4.2.4). Wspólnym mianownikiem powyższych badań była charakterystyka środowiska pęcherzyka jajnikowego oraz poszukiwanie w jego obrębie potencjalnych markerów jakości oocytów. Obecnie standardowa procedura pozyskiwania kompleksów oocyt komórki pęcherzykowe (COC ang. cumulus oocyte complexes) zwierząt gospodarskich obejmuje selekcję oocytów głównie na podstawie ich morfologii (jednolitość ooplazma, liczba warstw zwartych komórek pęcherzykowych; Gordon 2003). Badania pokazują, że takie podejście metodyczne jest niewystarczające, gdyż COC gorszej jakości mogą również wykazywać wysoki potencjał rozwojowy (de Witt i wsp. 2000, Blondin i Girard 1995). Dlatego też poszukuje się innych nieinwazyjnych technik selekcji COC. Na szczególne zainteresowanie zasługuje analiza czynników środowiska pęcherzykowego, a w szczególności płynu 4

5 pęcherzykowego (FF). Wykazano, iż skład płynu pęcherzykowego ma wpływ na jakość COC (Matoba i wsp. 2014, Bender i wsp. 2010, Sinclair i wsp. 2008, Leroy i wsp. 2005), przy czym analizie poddawano m.in. kwasy tłuszczowe (FA), aminokwasy czy glukozę. Co ciekawe, Sinclair i wsp. (2008) wykazali związek pomiędzy koncentracją poszczególnych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym bydła a morfologią COC. Związek ten nie został niestety potwierdzony przy uwzględnieniu dalszego rozwoju zarodkowego (% osiągnięcie stadium blastocysty). Odmienne wyniki zaprezentowali Matoba i wsp. (2014), opisując istotny związek pomiędzy składem płynu pęcherzykowego (kwasy tłuszczowe, aminokwasy, steroidy) a poziomem mrna w komórkach pęcherzyka jajnikowego oraz rozwojem zarodków do stadium blastocysty. Owe sprzeczności potwierdzają wysoki stopień złożoności procesu kształtowania jakości oocytów i fakt zaangażowania wielu czynników. Dlatego też celem pracy Warzych i wsp Multifactorial analysis of the follicular environment is predictive of oocyte morphology in cattle (publikacja 4.2.1) było określenie, który z wybranych komponentów środowiska pęcherzykowego może mieć kluczowe znaczenie w determinacji jakości oocytów bydła. Doświadczenie opierało się na materiale biologicznym pozyskiwanym z indywidualnych pęcherzyków jajnikowych jajników krów rzeźnych, a każda próba składała się z następujących elementów: komórki pęcherzykowe (CC), oocyt oraz płyn pęcherzykowy. Dla każdej próby gromadzono następujące dane: średnica pęcherzyka jajnikowego (<6mm, 6-8mm, >8mm), morfologia COC (skala 4-stopniowa; od klasy 1 jakość bardzo dobra, do klasy 4 jakość bardzo zła), indeks apoptotyczny komórek pęcherzykowych oraz poziom glukozy i zawartość poszczególnych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym. U podstaw analizy leżało założenie, że istnieje związek pomiędzy składem płynu pęcherzykowego lub indeksem apoptotycznym w komórkach pęcherzykowych a uznanymi markerami jakości oocytu (morfologia COC, średnica pęcherzyka jajnikowego). Uwzględnienie morfologii COC nie dało jednoznacznych wyników jedynie koncentracja glukozy w płynie pęcherzykowym była istotnie niższa w pęcherzykach, z których pozyskano COC klasy 4, w porównaniu z klasą 3. W odniesieniu do średnicy pęcherzyka, związek takowy wykazano jedynie z koncentracją wybranych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym. Dlatego też w kolejnym etapie badań podjęto próbę stworzenia wieloczynnikowego modelu uwzględniającego jednocześnie większą liczbę danych charakteryzujących indywidualny pęcherzyk jajnikowy. Analiza statystyczna wykazała, iż kluczowe w tym modelu są następujące parametry: aktywność enzymu delta 9 desaturazy oraz aktywność enzymu elongazy w płynie pęcherzykowym, a także stężenie czterech 5

6 kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym (C16:0, C16:1, C18:1cis9, C22:5n3). Powstały model, stanowiący osiągnięcie naukowe prezentowane w omawianym artykule (4.2.1), pozwolił na predykcję jakości COC z prawdopodobieństwem 0,72 [przyporządkowanie COC do klasy 1 i 2 (jakość dobra) lub 3 i 4 (jakość zła)]. Uzyskane wyniki sugerują, że poszukiwanie indywidualnych markerów jakości w środowisku pęcherzykowym może być dyskusyjne, gdyż cecha ta jest prawdopodobnie zagadnieniem wieloczynnikowym i złożonym. Szereg doświadczeń związanych z nieinwazyjnymi procedurami oceny jakości oocytów skupia się na analizie komórek pęcherzykowych otaczających oocyt. Podjęte próby wykazania związku pomiędzy indeksem apoptotycznym tych komórek, a jakością oocytu, przyniosły niejednoznaczne wyniki (Yuan i wsp. 2005, Ikeda i wsp 2003, Warzych i wsp. 2013). Znacznie bardziej obiecujące dane pochodzą z analizy poziomu mrna. Wyznaczono szereg genów kandydujących jako potencjalne markery jakości oocytu u różnych gatunków, m.in. u człowieka (np. Kordus i LaVoie, 2017), a także u bydła (np. Melo i wsp. 2017). Jedno z ciekawszych obserwacji dotyczących bydła odnosiło się do poziomu mrna genów kodujących katepsyny enzymy proteolityczne, hydrolazy peptydowych lizosomów (Bettegowda i wsp. 2008). Wykazano różną ekspresję mrna genów katepsyn B, K, S i Z w komórkach pęcherzykowych niedojrzałych płciowo jałówek w porównaniu z dojrzałymi płciowo krowami. Ponadto wyższy poziom mrna genów katepsyn B, S i Z stwierdzono w komórkach pęcherzykowych z COC o niższym potencjale rozwojowym. Bazując na tych przesłankach, w omawianej pracy podjęto próbę wykazania związku pomiędzy ekspresją mrna genów katepsyn w komórkach pęcherzykowych a wybranymi markerami jakości oocytu (morfologia COC, średnica pęcherzyka jajnikowego, liczba kopii mtdna). Wyniki przedstawiono w pracy Warzych i wsp Cathepsin mrna level in bovine cumulus cells fails to be a good marker of oocyte quality (publikacja 4.2.2). Badania obejmowały próby zawierające oocyt, komórki pęcherzykowe (zewnętrzne warstwy COC) oraz płyn pęcherzykowy, pozyskane z indywidualnych pęcherzyków jajnikowych. W oocytach analizowano liczbę kopii mtdna, w komórkach pęcherzykowych poziom mrna genów katepsyn B, K i Z, natomiast w płynie pęcherzykowym koncentrację glukozy oraz skład kwasów tłuszczowych. Nie wykazano jednoznacznego związku pomiędzy ekspresją mrna genów katepsyn a badanymi markerami jakości COC. Zanotowano natomiast pozytywną korelację pomiędzy liczbą kopii mtdna w oocycie, a poziomem mrna dla katepsyny B w komórkach pęcherzykowych. W świetle dotychczasowych 6

7 publikacji jest to wynik niejednoznaczny, gdyż wcześniejsze prace opisują wysoką ekspresję katepsyny B jako marker obniżonej jakości COC, natomiast większa liczba kopii mtdna opisywana jest jako wyznacznik lepszej jakości oocytu. Również pozytywna korelacja pomiędzy ekspresją katepsyn B i K w komórkach pęcherzykowych a poziomem wybranych kwasów tłuszczowych (C18.3n3 i grupą n3) w płynie pęcherzykowym jest trudna do interpretacji, gdyż wymienione kwasy tłuszczowe ponownie są opisywane w literaturze jako czynniki pozytywnie wpływające na kompetencję oocytów. Podsumowując, osiągnięcie naukowe prezentowane w omawianym artykule (publikacja 4.2.2) dotyczy ograniczonej przydatności analizy poziomu mrna katepsyn w komórkach pęcherzykowych jako markerów jakości COC. Może to w głównej mierze wynikać z zastosowanej metodyki. Eksperyment Bettegowda i wsp. (2008), który stanowił punkt wyjścia dla niniejszego doświadczenia, obejmował próby złożone z komórek pęcherzykowych pozyskanych od łączonych kilku kompleksów COC. W niniejszej pracy analizę oparto tylko na zewnętrznych warstwach komórek pęcherzykowych pozyskanych z indywidualnych COC. Hussain i wsp. (2006) jednoznacznie wykazali, iż komórki pęcherzykowe otaczające oocyt są heterogenne i obserwuje się zmienną ekspresję genów w zależności od odległości komórki do oocytu. Stąd można wnioskować, iż analizy ekspresji mrna genów w komórkach pęcherzykowych są wątpliwym źródłem wiarygodnych informacji na temat jakości oocytu. Głównym źródłem oocytów w pracy eksperymentalnej są jajniki zwierząt rzeźnych. Niestety niesie to za sobą konsekwencje w postaci braku jakichkolwiek informacji na temat dawczyń oocytów. Badania pokazują, że szereg czynników pochodzenia matecznego ma wpływ na jakość oocytów, a jednym z kluczowych jest dojrzałość płciowa samicy. Oocyty pochodzące od samic niedojrzałych płciowo charakteryzują się m.in. odmienną ultrastrukturą, aktywnością enzymatyczną, metabolizmem glukozy, pirogronianu, a także odmiennym wzorem ekspresji zarówno na poziomie mrna jak i białek (Kauffold i wsp. 2005, Rizos i wsp. 2005). Różnice zaobserwowano również w środowisku pęcherzykowym np. pod względem ilości poszczególnych kwasów tłuszczowych, koncentracji LH czy estradiolu (Bender i wsp. 2010). Ponieważ środowisko pęcherzykowe, a w szczególności metabolizm kwasów tłuszczowych, wydaje się mieć kluczowe znaczenie w determinacji jakości oocytu, w kolejnej pracy będącej częścią niniejszego osiągnięcia habilitacyjnego (Warzych i wsp Prepubertal heifers versus cows the differences in the follicular environment, pozycja 4.2.3), podjęto próbę porównania wybranych elementów metabolizmu kwasów tłuszczowych w pęcherzyku jajnikowym dojrzałych i niedojrzałych płciowo samic bydła 7

8 domowego. Analizie poddano następujące parametry: liczba kropli lipidowych w cytoplazmie oocytów przed i po dojrzewaniu in vitro (IVM), ekspresja mrna wybranych genów kontrolujących metabolizm kwasów tłuszczowych w komórkach pęcherzykowych (CC) oraz granulozy (GC), a także skład kwasów tłuszczowych i koncentracja glukozy w płynie pęcherzykowym. Osiągnięciem habilitacyjnym wynikającym z omawianej pracy jest opisanie jednoznacznych różnic w środowisku pęcherzykowym samic dojrzałych i niedojrzałych płciowo, ze szczególnym uwzględnieniem metabolizmu kwasów tłuszczowych. Samice niedojrzałe płciowo charakteryzowały się: niższą liczbą kropli lipidowych w oocytach zarówno przed jak i po IVM, mniejszą średnicą oocytu, niższą koncentracją glukozy oraz poszczególnych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym oraz wyższą ekspresją mrna genu SCD (desaturaza stearylo-coa) w komórkach GC. Ponadto wykazano odmienną ekspresję mrna genów ELOVL5, FADS2, SCD, GLUT8 oraz GLUT3 w komórkach CC w porównaniu z komórkami GC. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, iż pęcherzyk jajnikowy samic niedojrzałych płciowo charakteryzuje się środowiskiem niekorzystnym dla rozwoju oocytu, co w konsekwencji daje obniżony potencjał rozwojowy i mniejszą przydatność takiego materiału do procedury in vitro. Wyniki opisane w publikacji stanowiły podstawę do poszukiwania kolejnych powiązań wybranych elementów środowiska pęcherzykowego bydła. Szczególny nacisk w tej części osiągnięcia habilitacyjnego położono na zależności pomiędzy metabolizmem lipidów a metabolizmem glukozy. Literatura pokazuje, że już oocyty znajdujące się w pierwotnych pęcherzykach jajnikowych zawierają krople lipidowe, które w powiązaniu z mitochondriami tworzą tzw. jednostki metaboliczne mające znaczenie dla komórkowego metabolizmu i homeostazy komórki. Ich liczba wzrasta wraz z rozwojem oocytu (Paulini i wsp. 2014). Ponieważ na metabolizm kwasów tłuszczowych w oocytach kluczowy wpływ ma m.in. płyn pęcherzykowy (np. Matoba i wsp. 2014, Uzbekova i wsp. 2015, Lolicato i wsp. 2015), w pracy Warzych i wsp Interactions of the bovine oocytes with follicular elements with respect to lipid metabolism (pozycja 4.2.4) poddano analizie liczbę kropli lipidowych w oocycie, skład płynu pęcherzykowego oraz dodatkowo ekspresję mrna wybranych genów w komórkach CC i GC. Wykazano pozytywną korelację pomiędzy koncentracją większości analizowanych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym, a liczbą kropli lipidowych w oocycie. Ponadto liczba kropli była negatywnie skorelowana z ekspresją mrna genu GLUT1 zarówno w komórkach CC jak i GC. Wykazano również pewne istotne związki pomiędzy 8

9 koncentracją niektórych kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym a ekspresją mrna genu SCD w CC i GC oraz genów FADS2, ELOVL5 i GLUT8 jedynie w komórkach GC. Wnioski płynące z artykułu i będące częścią osiągnięcia habilitacyjnego pokazują, iż ścieżki dotyczące metabolizmu kwasów tłuszczowych wiążą ze sobą wszystkie elementy środowiska pęcherzykowego oocyt, komórki pęcherzyka (CC, GC) czy płyn pęcherzykowy. Korelacje pomiędzy analizowanymi parametrami komórek pęcherzykowych czy płynu pęcherzykowego a liczbą kropli lipidowych w oocycie wskazują, jak ważne jest owe środowisko w kontekście kształtowania jakości oocytu. Opisany związek pomiędzy metabolizmem kwasów tłuszczowych a ekspresją genów zaangażowanych w metabolizm (transport) glukozy potwierdza istniejącą między tymi dwoma szlakami homeostazę niezbędną dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Podsumowując, przedstawione powyżej osiągnięcie habilitacyjne wskazuje na istotne zależności pomiędzy poszczególnymi komponentami środowiska pęcherzykowego, co w konsekwencji może mieć istotny wpływ na determinację jakości oocytu. Dowodem na taką tezę jest np. odmienna charakterystyka środowiska pęcherzykowego samic dojrzałych i niedojrzałych płciowo, które są źródłem oocytów o różnej kompetencji rozwojowej. Nie uzyskano natomiast zadowalającej odpowiedzi na pytanie, czy w pęcherzyku istnieje indywidualna cecha, która może być wiarygodnym, nieinwazyjnym markerem jakości oocytu. Analiza ekspresji mrna wybranych genów w komórkach pęcherzykowych, ze względu na swą specyfikę (analiza jedynie zewnętrznej warstwy CC z indywidualnych COC), nie dała jednoznacznych wniosków. Natomiast wyniki pozyskane z analizy płynu pęcherzykowego pozwalają wyznaczyć wieloczynnikowy model, który może stanowić podstawę predykcji kompetencji rozwojowe COC. Należy również podkreślić, iż istotny wpływ na kształtowanie jakości oocytu ma profil kwasów tłuszczowych, w ścisłym powiązaniu z metabolizmem glukozy i właśnie te komponenty powinny być przedmiotem dalszych poszukiwań markera jakości COC. Literatura: 1. Aardema H, Vos PL, Lolicato F, Roelen BA, Knijn HM, Vaandrager AB, Helms JB, Gadella BM Oleic acid prevents detrimental effects of saturated fatty acids on bovine oocyte developmental competence. Biol Reprod 85(1),

10 2. Bender K, Walsh S, Evans AC, Fair T, Brennan L Metabolite concentrations in follicular fluid may explain differences in fertility between heifers and lactating cows. Reproduction 139(6), Bettegowda A, Patel OV, Lee KB, Park KE, Salem M, Yao J, Ireland JJ, Smith GW Identification of novel bovine cumulus cell molecular markers predictive of oocyte competence: functional and diagnostic implications. Biol Reprod 79(2), Blondin P, Sirard MA Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Mol Reprod Dev 41(1), Carro M, Buschiazzo J, Ríos GL, Oresti GM, Alberio RH Linoleic acid stimulates neutral lipid accumulation in lipid droplets of maturing bovine oocytes. Theriogenology 79(4), de Witt AA, Wurth YA, Kruip TA Effect of ovarian phase and follicle quality on morphology and developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte complexes. J Anim Sci 78, Gordon I Laboratory production of cattle embryos, 2 nd edition. CABI Publishing. 8. Hussein TS, Thompson JG, Gilchrist RB Oocyte-secreted factors enhance oocyte developmental competence. Dev Biol 296(2), Ikeda S, Imai H, Yamada M Apoptosis in cumulus cells during in vitro maturation of bovine cumulus-enclosed oocytes. Reproduction 125(3), Kauffold J, Amer HA, Bergfeld U, Weber W, Sobiraj A The in vitro developmental competence of oocytes from juvenile calves is related to follicular diameter. J Reprod Dev 51(3), Kordus RJ, LaVoie HA Granulosa cell biomarkers to predict pregnancy in ART: pieces to solve the puzzle. Reproduction. 153(2), R69-R Leroy JL, Vanholder T, Mateusen B, Christophe A, Opsomer G, de Kruif A, Genicot G, Van Soom A Non-esterified fatty acids in follicular fluid of dairy cows and their effect on developmental capacity of bovine oocytes in vitro. Reproduction 130(4), Leroy JL, Vanholder T, Mateusen B, Christophe A, Opsomer G, de Kruif A, Genicot G, Van Soom A Non-esterified fatty acids in follicular fluid of dairy cows and 10

11 their effect on developmental capacity of bovine oocytes in vitro. Reproduction 130(4), Lolicato F, Brouwers JF, de Lest CH, Wubbolts R, Aardema H, Priore P, Roelen BA, Helms JB, Gadella BM The cumulus cell layer protects the bovine maturing oocyte against fatty acid-induced lipotoxicity. Biol Reprod 92(1), Marei WF, Wathes DC, Fouladi-Nashta AA Differential effects of linoleic and alpha-linolenic fatty acids on spatial and temporal mitochondrial distribution and activity in bovine oocytes. Reprod Fertil Dev 24(5), Marei WF, Wathes DC, Fouladi-Nashta AA Impact of linoleic acid on bovine oocyte maturation and embryo development. Reproduction 139(6), Marei WF, Wathes DC, Fouladi-Nashta AA The effect of linolenic Acid on bovine oocyte maturation and development. Biol Reprod 81(6), Matoba S, Bender K, Fahey AG, Mamo S, Brennan L, Lonergan P, Fair T Predictive value of bovine follicular components as markers of oocyte developmental potential. Reprod Fertil Dev 26(2), Melo EO, Cordeiro DM, Pellegrino R, Wei Z, Daye ZJ, Nishimura RC, Dode MA Identification of molecular markers for oocyte competence in bovine cumulus cells. Anim Genet 48(1), Rizos D, Burke L, Duffy P, Wade M, Mee JF, O'Farrell KJ, Macsiurtain M, Boland MP, Lonergan P Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitro. Theriogenology 63(3), Rizos D, Ward F, Duffy P, Boland MP, Lonergan P Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol Reprod Dev 61(2), Sinclair KD, Lunn LA, Kwong WY, Wonnacott K, Linforth RS, Craigon J Amino acid and fatty acid composition of follicular fluid as predictors of in-vitro embryo development. Reprod Biomed Online 16(6), Uzbekova S, Elis S, Teixeira-Gomes AP, Desmarchais A, Maillard V, Labas V MALDI Mass Spectrometry Imaging of Lipids and Gene Expression Reveals Differences in Fatty Acid Metabolism between Follicular Compartments in Porcine Ovaries. Biology (Basel) 4(1),

12 24. Warzych E, Pers-Kamczyc E, Krzywak A, Dudzińska S, Lechniak D Apoptotic index within cumulus cells is a questionable marker of meiotic competence of bovine oocytes matured in vitro. Reprod Biol 13(1), Yuan YQ, Van Soom A, Leroy JL, Dewulf J, Van Zeveren A, de Kruif A, Peelman LJ Apoptosis in cumulus cells, but not in oocytes, may influence bovine embryonic developmental competence. Theriogenology 63(8), OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH. Przed uzyskaniem stopnia naukowego doktora 5.1 Ekspresja mrna genu hormonu wzrostu z zarodkach bydlęcych. W ramach projektu naukowego pt. Analiza ekspresji genu hormonu wzrostu w zarodkach bydlęcych wyprodukowanych in vitro finansowanego przez KBN ( , grant autorski) analizowałam ekspresję genu hormonu wzrostu w oocytach i zarodkach bydlęcych w zależności od genotypu (polimorfizm Leu127Val). Wykazałam, iż obserwowany we wszystkich niedojrzałych oocytach heterozygotyczny układ alleli podlegających ekspresji, zmienia swój charakter w oocytach po dojrzewaniu in vitro oraz w zygotach. W przypadku 70% dojrzałych oocytów i 20% zygot zaobserwowałam ekspresję tylko jednego z alleli. Doświadczenie sugeruje, iż warunki dojrzewania i zapłodnienia in vitro mogą wpływać na wzór ekspresji, a konkretnie mogą mieć wpływ na poliadenylację mrna, co w konsekwencji zmienia stabilność cząsteczek mrna poszczególnych alleli (Warzych i wsp. 2004, Reproductive Biology). W tych badaniach wiodącym autorem była prof. dr hab. Dorota Cieślak. 5.2 Wpływ warunków stresu świetlnego na metabolizm komórkowy roślin. W trakcie 9-miesięcznego stażu naukowego w ETH (Swiss Federal Institute of Technology) w Zurychu (Szwajcaria, prof. Klaus Apel) w 2003 roku badałam wpływ warunków stresu świetlnego i wolnych rodników tlenowych na proces fotosyntezy oraz śmierci komórkowej. W ramach powyższego eksperymentu przeprowadzałam analizy ekspresji genów zaangażowanych w odpowiedź na warunki stresu świetlnego. Ponadto zajmowałam się pozyskiwaniem kolejnych pokoleń roślin (Arabidopsis thaliana) poddawanych stresowi oksydacyjnemu (Laloi i wsp. 2007, Proceedings of the National Academy of Science; Titiz i wsp. 2006, The Plant Journal). 12

13 W tych badaniach wiodącym autorem był prof. Christophe Laloi. 5.3 Wpływ składu pożywki do dojrzewania oocytów in vitro na jakość oocytów i blastocyst bydlęcych. Celem pracy było określenie wpływu dodatków do pożywki do dojrzewania oocytów in vitro (FBS, fafbsa, PVP40) na jakość oocytów i blastocyst bydlęcych. Przeprowadzone przeze mnie badania pokazały, iż surowica, albumina i syntetyczny polimer PVP40 obecne w pożywce IVM mają istotny wpływ na liczbę i jakość uzyskiwanych blastocyst. Zastosowany skład pożywki do dojrzewania oocytów wiązał się ze zróżnicowanym udziałem zarodków osiągających stadium blastocysty 8 dnia pi, a także ich jakością (indeks apoptotyczny, ekspresja genów) oraz z brakiem wpływu na jakość dojrzałych oocytów (kompetencja mejotyczna, występowanie apoptozy). Wyższa ekspresja mrna dla genów kodujących czynniki wzrostu i ich receptory (IGF1, IGF1R, IGF2, IGF2R) zanotowana w oocytach dojrzewających w obecności fafbsa oraz wywodzących się z nich blastocystach wskazała na pozytywny wpływ albuminy na jakość blastocyst. FafBSA stworzył zatem bardziej optymalne warunki do dojrzewania oocytów in vitro w porównaniu z FBS i PVP40, natomiast PVP40 wpływał na obniżenie jakości zarodków. (Warzych i wsp. 2007, Molecular Reproduction and Development; Warzych i wsp. 2007, Animal Reproduction Science). Niniejsze wyniki były efektem badań realizowanych w ramach mojej pracy doktorskiej. Po uzyskaniu stopnia naukowego doktora 5.4 Wpływ dojrzałości płciowej samic na jakość oocytów. Określenie wpływu dojrzałości płciowej samic na jakość oocytów bydła i świni stanowi jeden z wiodących nurtów badawczych zespołu, którego jestem członkiem. Jedne z pierwszych doświadczeń, w których brałam udział, pokazały, iż oocyty pozyskane od loszek dojrzałych i niedojrzałych płciowo wykazują porównywalny stopień zaburzeń euploidalnych (diploidie). Stwierdzono natomiast istotnie więcej zaburzeń aneuploidalnych w oocytach loszek niedojrzałych płciowo w porównaniu z samicami dojrzałymi (Lechniak i wsp. 2007, Theriogenology). Kolejne doświadczenia, w które zostałam zaangażowana (głównie na etapie pozyskiwania materiału do badań, a także przy analizie apoptozy), skupiły się na analizie wybranych elementów dojrzewania i jakości 13

14 oocytu (np. redystrybucja ziaren korowych, lokalizacja mitochondriów, ekspresja genów, apoptoza) oraz ilościowej analizie kwasów tłuszczowych w płynie pęcherzykowym. Wykazano istotne różnice w składzie płynu pęcherzykowego pomiędzy loszkami dojrzałymi i niedojrzałymi płciowo, co może znacząco wpływać na potencjał rozwojowy oocytów i zarodków (Pawlak i wsp. 2012, Theriogenology). Do tej pory nie wskazano jednoznacznej przyczyny obniżonego potencjału rozwojowego oocytów niedojrzałych płciowo loszek, stąd wynik ten był podstawą do kolejnych badań naszego zespołu. Dalsze prace wykazały istotne różnice w ekspresji mrna wybranych genów (BMP15, GDF9) oraz częstości występowania apoptozy w oocytach pochodzących od samic dojrzałych i niedojrzałych płciowo (Pawlak i wsp. 2015). W innym doświadczeniu przeprowadziłam analizę częstości występowania apoptozy w oocytach po zastosowaniu testu kompetencji BCB. Wykazałam, iż oocyty o wyższej kompetencji (BCB+) pochodzące od samic niedojrzałych płciowo charakteryzują się niższym poziomem apoptozy, w porównaniu z samicami dojrzałymi (Pawlak i wsp. 2011, Reproductive Biology). Wynik ten w pewnym zakresie kwestionuje zasadność stosowania testu BCB jako markera selekcji oocytów. W tych badaniach wiodącym autorem był dr Piotr Pawlak. 5.5 Apoptoza w komórkach pęcherzykowych jako marker jakości oocytów. Głównym przedmiotem moich zainteresowań naukowych jest poszukiwanie wiarygodnego markera jakości oocytu. Jako wiodący autor, w tych badaniach wykazałam, iż opisywana w literaturze apoptoza w obrębie komórek pęcherzykowych nie stanowi jednoznacznego źródła informacji o jakości oocytu. Stwierdziłam, iż 74,4% COC po dojrzewaniu in vitro posiadały komórki wykazujące zmiany apoptotyczne. Niemniej jednak indeks apoptotyczny określony dla każdego COC nie miał istotnego związku z klasą morfologiczną COC oraz z stadium podziału mejotycznego oocytu (Warzych i wsp. 2013, Reproductive Biology). Sugeruje się, iż wpływ na to mają interakcje pomiędzy komórkami pęcherzykowymi a oocytem w obrębie COC, gdyż częstość apoptozy maleje wraz ze wzrostem odległości komórki od oocytu. 5.6 Tworzenie embrionalnych linii komórkowych a jakość zarodków. W badaniach dedykowanych opisaniu czynników warunkujących pluripotencję oraz poznanie warunków niezbędnych do uzyskania stabilnych linii komórkowych (ESC) z zarodków bydlęcych, zaangażowana byłam w część embriologiczną (pozyskiwanie zarodków w stadiach od zygoty do blastocysty), a także w pewnym stopniu w analizę 14

15 ekspresji genów. Podczas przedimplantacyjnego rozwoju zarodkowego inicjowane są procesy różnicowania prowadzące do wytworzenia pierwszych linii komórkowych pluripotentnego węzła zarodkowego (ICM) oraz trofektodermy (TE). Doświadczenia przeprowadzone przez nasz zespól pokazały, iż proces tworzenia linii komórkowych w zarodkach bydła przypomina model mysi. Wraz z rozwojem zarodka oraz powstawaniem blastocysty obserwowana jest specyficzna alokacja markerów pluripotencji jak OCT4 i NANOG w ICM, oraz czynnika CDX2 istotnego dla powstania TE w komórkach tworzących zewnętrzną warstwę zarodka (Madeja i wsp. 2013, BMC Developmental Biology). W tych badaniach wiodącym autorem była dr Zofia Madeja. Klasyczny system hodowli ESC dla myszy lub człowieka opiera się na suplementacji pożywki czynnikami wzrostowymi (LIF, FGF). U szczura uzyskano ESC stosując specyficzne inhibitory ścieżek sygnalizacyjnych działających w obrębie istotnych dla pluripotencji ścieżek sygnalizacyjnych (WNT, MEK/ERK, JAK/STAT). Kwestia opracowania stabilnych warunków dla hodowli ESC od zwierząt gospodarskich nadal pozostaje przedmiotem badań. Projekt, który w ostatnim czasie realizowałam jako wiodący autor, miał na celu wykazanie, czy zarodki bydlęce uzyskane in vitro w obecności w/w inhibitorów wykazują zmiany jakościowe w stadium blastocysty, które jest kluczowe dla wyprowadzania ESC. Przedmiotem analiz była ekspresja genów markerowych, apoptoza, liczba blastomerów, które są istotnym elementem oceny jakości zarodka (a co za tym idzie jego potencjału rozwojowego). W rezultacie wykazałam istotny wpływ wyżej opisanych warunków hodowli na oceniane parametry (wzrost indeksu apoptotycznego, spadek liczby blastomerów) w zależności od stosowanych systemów inhibitorów. Praca opisująca powyższe wyniki jest w przygotowaniu. 5.7 Wpływ żywienia samic na oocyty i płyn pęcherzykowy u świń. Wykazaliśmy, iż dieta eksperymentalna bogatsza w kwasy n3 spowodowała wzrost zawartości kwasów nasyconych, a spadek zawartości kwasów nienasyconych w płynie pęcherzykowym. Istotne zmiany zaobserwowano też w oocytach w ekspresji genu EEF1A1 opisywanego w literaturze jako marker jakości (Warzych i wsp. 2011, Veterinarni Medicina). Zmiany te wskazują na znaczenie diety samic w determinowaniu jakości oocytów. Mój wiodący udział w powyższym doświadczeniu to zbieranie materiału 15

16