Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Michała Rażewa pt. Badania strukturalne kompleksu drożdżowego degradosomu mitochondrialnego RNA (mtexo)

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Artur Krężel Zakład Chemii Biologicznej Wydział Biotechnologii Uniwersytet Wrocławski Joliot-Curie 14a Wrocław Wrocław, Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Michała Rażewa pt. Badania strukturalne kompleksu drożdżowego degradosomu mitochondrialnego RNA (mtexo) Praca doktorska Pana mgr inż. Michała Rażewa została wykonana pod kierunkiem dr hab. Marcina Nowotnego z Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej. Tematem pracy są badania strukturalne kompleksu drożdżowego degradosomu mitochondrialnego RNA, co stanowi kontynuację wieloletnich badań doktora Nowotnego w tym temacie. Szlaki degradacji pełnią kluczową rolę w metabolizmie RNA począwszy od regulacji ekspresji genów po usuwanie wadliwych cząsteczek RNA. Zatem poznanie struktury oraz mechanizmu działania degradosomów jest istotne i atrakcyjne czyniąc recenzowaną pracę wartościową. Przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska liczy 158 stron i została przygotowana w klasycznym układzie pracy eksperymentalnej zawierającej wstęp, cel pracy, materiały i metody, wyniki, dyskusję oraz podsumowanie uzyskanych rezultatów. Do pracy dołączone jest streszczenie w języku polskim oraz angielskim. Rozprawa zawiera również wykaz używanych skrótów. Spis literaturowy obejmuje 126 pozycji opublikowanych głównie w ostatnim dwudziestoleciu. Wstęp pracy liczący 27 stron został napisany zwięźle i posiada najważniejsze informacje poświęcone procesom degradacji RNA, w szczególności strukturze i mechanizmom działania egzekutorów degradacji RNA oraz helikaz zaangażowanych w ten proces. Doktorant szczególną uwagę poświęcił egzorybonukleazom RNB, do których należy egzorobynukleaza Dss1 będące celem badań. Wstęp zakończony jest opisem roli helikazy Suv3 w degradacji mitochondrialnego RNA co jest swoistym wprowadzeniem do zdefiniowania celu pracy gdyż helikaza ta wraz z rybonuklezą Dss1, jest odpowiedziana za utworzenie drożdżowego degradosomu mitochondrialnego mtexo, którego strukturalnej charakterystyce Doktorant poświęcił ostatnie kilka lat swojej pracy. Cały wstęp napisany jest przejrzyście, zawiera starannie

2 przygotowane i niezbędne w śledzeniu treści ilustracje. Rzetelne przygotowanie tego rozdziału rozprawy świadczy o dużej wiedzy Doktoranta oraz o umiejętności analizy danych literaturowych. Część metodyczna pracy napisana jest poprawnie a powtórzenie opisanych badań nie powinno przysparzać większych trudności. Podczas realizacji opisywanych badań, Doktorant opanował podejścia doświadczalne, które są bardzo cennym połączeniem metod biologii molekularnej, produkcji i oczyszczania białek, charakterystyki enzymatycznej, a przede wszystkim metod poświęconych charakterystyce strukturalnej makromolekuł. Pewien niedosyt w tej części pracy budzi opis odczynników i materiałów stosowanych w badaniach. Nie ma tu informacji o czystości czy stężeniach zakupionych reagentów. Wbrew pozorom jest to bardzo ważna informacja, która może prowadzić do pewnych problemów w powtórnej realizacji badań. Opis składu stosowanych buforów jak i reagentów zaprezentowany jest dość rozrzutnie co niepotrzebnie zwiększa rozmiar rozprawy. Opisując nadprodukcję, oczyszczanie czy krystalizację białek Doktorant stosuje skróty konstruktów, które na tym etapie pracy nie są w pełni poznane a ponadto nie znajdują się w spisie skrótów. Chodzi tu głównie o skrócone białka. Wystarczyło wspomnieć o optymalizacji, która wyczerpująco opisana jest w części wynikowej lub jak wyżej wspomniano, umieścić je w spisie stosowanych skrótów. Rozdział Wyniki, tak jak przystało na pracę eksperymentalną to najobszerniejszy z rozdziałów rozprawy. Opis rezultatów przedstawiony jest bardzo rzetelnie i szczegółowo co wraz z częścią metodologiczną tworzy całość procedur związanych z nadprodukcją heterologiczną i oczyszczaniem białek tworzących kompleks mtexo. Doktorant opisuje tu logiczny tok postępowania oraz optymalizację sekwencji białek Dss1 i Suv3 pod względem tendencji do krystalizacji co przejrzyście ukazuje Rycina 4.5. Bardzo słusznie Doktorant postąpił sprawdzając aktywność enzymatyczną skróconych wariantów białkowych wchodzących w skład kompleksu mtexo. Należy tu mówić o dużym szczęściu, gdyż składniki kompleksu badane oddzielnie wskazują znacznie słabszą aktywność w porównaniu do zrekonstytuowanego kompleksu, którego aktywność nie odbiega od pełnej wersji mtexo. Patrząc na testy aktywności egzorybonukleolitycznej nie jest dla mnie jasne jak często były zbierane dane głównie przy reakcji zachodzącej z t1/2 równym 0,13 min. Biorąc pod uwagę sposób stopowania reakcji oraz analizę dnaych nasuwa się pytanie na ile metoda ta jest ilościowa? Myślę, że precyzyjniejszych danych zwłaszcza w 2

3 przypadku szybkich reakcji mogłaby dostarczyć metody fluorescencyjne i detekcja w czasie rzeczywistym a nie na żelu mocznikowym. Kolejna część pracy to opis krystalizacji zarówno pojedynczych jednostek jak i całego kompleksu w różnych wariantach sekwencyjnych oraz wyznakowanych selenometioniną. Na uznanie zasługuje tu przejrzysty i wyczerpujący opis stosowanych procedur jasny nawet dla niespecjalisty. Uważam jednak, że część zwartych informacji mogłaby znaleźć się w części metodycznej lub być pominięta jak na przykład opis podstawienia izomorficznego, który nie był stosowany w pracy. Ta część wyników zwieńczona jest opisem udokładniania struktur oraz ich szczegółową analizą, w której bardzo przydatne są starannie wykonane ilustracje oraz tabele. Mam tutaj pytania dotyczące obecności cząsteczki RNA w domenie katalitycznej RNB białka Cg-Dss D477N. Domyślam się, że uzyskanie białka bez zasocjowanego RNA nie jest łatwe. W pracy nie znalazłem jednak informacji o podjętych próbach uzyskania takiej formy białka. Tu prosiłbym Doktoranta o krótką dyskusję. Wreszcie, na jakiej podstawie przyjęto założenie, że cząsteczka RNA pochodzenia bakteryjnego posiada sekwencję 5 -CACUGA-3 lub 5 -AGAUAC-3 a nie inną? Kolejna część badań dotyczyła wglądu w mechanizm działa kompleksu mtexo co jest niezwykle wartościowym wzbogaceniem charakterystyki strukturalnej. Aby spojrzeć mechanistycznie na proces degradacji Doktorant podjął się próby określenia długości kanału wiążącego RNA w kompleksie. W tym celu przeprowadzono analizę aktywności egzorybonukleolitycznej z użyciem substratu znakowanego fluoresceiną na końcu 5 w obecności przeciwciała anty-fluoresceina. W wyniku połącznia przeciwciała z fluoresceiną powstała swoista blokada przestrzenna hamująca translokację RNA w kompleksie co zaskutkowało pojawieniem się pośredniego produktu degradacji substratu. Ostatnia część rozprawy to próba określenia znaczenia domeny HTH w formowaniu się kompleksu mtexo i jego aktywności. Doktorant stosując mutanty Ser386 i Arg390, znajdujące się w kluczowej dla interakcji helisie, przeprowadził badania aktywności egzorybonukleolitycznej wskazujące na to, że reszty te są kluczowe dla interakcji, potwierdzając tym samym znaczenie domeny HTH w tworzeniu się kompleksu mtexo. Zastosowana metodologia bazująca na aktywności enzymatycznej jest metodą pośrednią w badaniu oddziaływania pomiędzy białkami. Znacznie trafniejsze i komplementarne byłoby określenie stałej oddziaływania metodą bezpośrednią, choćby z wykorzystaniem kalorymetrii ITC. Obniżone powinowactwo mierzone czy to wartością Kd czy Kb dałoby jednoznaczny dowód na to, że kompleks nadal powstaje, a wprowadzenie mutacji skutkuje znaczącą zmianą 3

4 w entalpii swobodnej tworzenia się kompleksu. Dlaczego doktorant zdecydował się na substytucję Ser386 i Arg390 resztą tryptofanu a nie np. alaniny? Objętość reszty tryptofanowej z założenia zaburza oddziaływanie i nie wyjaśnia jednoznacznie jaka jest rola mutowanych reszt. Dyskusja uzyskanych wyników została przeprowadzona przez Doktoranta w sposób bardzo dojrzały i wyczerpujący. W rozdziale liczącym aż 41 stron Autor podejmuje się próby porównania struktury białka Cg- Dss1 ze strukturami innych przedstawicieli egzorybonukleaz RNB wskazując zarówno na podobieństwa jak i różnice strukturalne. Następnie szczegółowo zagłębia się on w wiązanie RNA przez kompleks degradosomu mtexo oraz mechanizm rozwijania dupleksów nukleinowych oraz translokacji cząsteczki RNA. Najbardziej zaskakujący rozdział dyskusji dotyczy weryfikacji modelu Cg-mtEXO. W rozdziale tym Autor przedstawia wyniki uzyskane z użyciem niskokątowego rozpraszania promieniowania Roentgena (SAXS) oraz badania funkcjonalne i biochemiczne zrealizowane w licznych współpracach naukowych. Rozdział ten jak i przedstawione w nim badania jest bardzo wartościowy i wpasowuje się jak najbardziej w dyskusję, nie mniej jednak, zawiera on opis rezultatów typowy dla części wynikowej. Uważam, że z powodzeniem Doktorant mógł je opisać wcześniej mimo, że zostały przeprowadzone ze współpracownikami. Najcenniejszy pod względem doskonałości naukowej jest ostatni podrozdział dotyczący kooperacji aktywności helikazowej i nukleazowej. Doktorant krok po kroku opisuje przykłady kooperatywności enzymatycznej różnych kompleksów białkowych ukazując niezwykłą rolę egzorybonukleazy Dss1 i helikazy Suv3 w degradacji RNA. Rozprawę wieńczy krótkie podsumowanie, w którym Autor syntetycznie przedstawia własne osiągnięcia i wyniki. Nie mam zasadniczych zastrzeżeń do recenzowanej rozprawy. Pracę czyta się z wielką przyjemnością mimo, że opisuje ona niełatwe w realizacji i prezentacji badania strukturalne oraz biochemiczne. Praca mogłaby być nieco krótsza gdyż miejscami Autor z wielką skrupulatnością opisuje wyniki jak i podstawy teoretyczne. Z drugiej strony, dzięki tym informacjom, praca zyskuje i staje się jaśniejsza dla szerszego grona czytelników. Z lektury rozprawy widać, że Doktorant poświęcił ogrom pracy w realizacji założonego celu wykorzystując szereg metod strukturalnych i biochemicznych. Cała rozprawa napisana jest bardzo poprawnym językiem. Znalazłem w niej nieliczne błędy interpunkcyjne czy językowe. Zaprezentowane ryciny i tabele wykonane są z wielką starannością i mogą być wzorem dla wielu innych rozpraw. Z obowiązku recenzenta chciałbym aby Doktorant ustosunkował się do następujących zagadnień: 4

5 1) Rekonstytucja kompleksu mtexo następowała w wyniku łączenia lizatów bakteryjnych zawierających nadprodukowane białko Dss1 i osobno Suv3. W jakich proporcjach łączono oba lizaty? Czy sprawdzano zawartość poszczególnych białek? Dlaczego Doktorant nie dokonywał rekonstytucji z użyciem oczyszczonych substratów białkowych? Prosiłbym również o dyskusję tego jak wybór rekonstytucji wpływał na czystość i homogenność preparatu na poszczególnych etapach oczyszczania. 2) Czy można uzyskać nieaktywne białko Dss1 poprzez zastosowanie chelatora wiążącego jony magnezu zamiast mutacji D477N? 3) Czy z pespektywy czasu i na podstawie uzyskanych wyników Doktorant nadal twierdzi, że N- końcowy fragment białka Dss1 wycięty w celach krystalizacyjnych jest w pełni nieustrukturyzowany? 4) Prosiłbym o dyskusję mechanizmu działania degradosomu mtexo w ujęciu termodynamicznym/energetycznym. Podsumowując stwierdzam, że przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska Pana mgr. inż. Michała Rażewa spełnia wymogi ustawy o stopniach i tytule naukowym, stanowi oryginalne rozwiązanie naukowe, wykazuje wiedzę teoretyczną Autora jak i umiejętności samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. W związku z powyższym wnoszę do Rady Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o dopuszczenie Pana mgr inż. Michała Rażewa do dalszych etapów postępowania doktorskiego. Biorąc pod uwagę fakt, że praca Doktoranta stanowi ważny wkład w zrozumienie mechanizmów działania degradosomów oraz roli jaką pełnią one w procesowaniu i degradacji RNA oraz to, że większość wyników zawartych w pracy doktorskiej została opublikowana w prestiżowym czasopiśmie Nature Communications, a Doktorant jest pierwszym autorem artykułu, wnoszę do Rady Instytutu o wyróżnienie rozprawy doktorskiej pana mgr inż. Michała Rażewa. Z wyrazami szacunku Artur Krężel 5