Ocena pracy doktorskiej mgr inż. Kingi Gazdy pt: Rola białka prekursorowego amyloidu w utrzymywaniu homeostazy wapnia w siateczce śródplazmatycznej

Transkrypt

1 PEŁNOMOCNIK REKTORA ds. specjalizacji dla diagnostów laboratoryjnych Adres do korespondencji: Katedra Biochemii Klinicznej, Zakład Medycyny Laboratoryjnej Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 7, Gdańsk tel /1771, strona Prof. dr hab. med. Andrzej Szutowicz Ocena pracy doktorskiej mgr inż. Kingi Gazdy pt: Rola białka prekursorowego amyloidu w utrzymywaniu homeostazy wapnia w siateczce śródplazmatycznej Ocenę przeprowadzono na podstawie decyzji Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk., pismo RN / SPD /2018 z dnia Rozprawa doktorska mgr Kingi Gazdy została wykonana w Pracowni Neurodegeneracji Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie pod kierunkiem dr Tomasza Węgierskiego i prof. dr Jacka Kuźnickiego. Zmiany wewnątrzkomórkowej kompartmentacji wapnia stanowią istotny czynnik utrzymania homeostazy strukturalnej i funkcjonalnej każdego rodzaju komórek. Szczególnie doniosłe znaczenie ma ona w komórkach nerwowych, w których Ca 2+ modyfikuje nie tylko ich metabolizm podstawowy, ale i pre i post synaptyczne zdarzenia związane z neuroprzekaźnictwem. Zaburzenie sygnału wapniowego w neuronach jest uznanym czynnikiem wpływającym na procesy neurodegeneracji. Pracownia, z której wychodzi recenzowana praca ma znaczące osiągnięcia w badaniach proteomicznych podstaw metabolizmu wapnia. W tym kontekście tematyka pracy doktorskiej Pani mgr Kingi Gazdy bardzo dobrze i celowo wpisuje się zarówno w profil badawczy Pracowni Neurodegeneracji jak i w ogólnoświatowe kierunki badań w tej dziedzinie. Doktorantka podjęła badania powiązane z wapniową hipotezą choroby Alzheimera, która w swej najwcześniejszej wersji zakłada, że oligomery Aβ1-42 tworzą w błonie plazmatycznej neuronów kanały o wysokiej niekontrolowanej przepuszczalności dla Ca 2+ /Na + wywołując hiper-stymulację szeregu procesów katabolicznych prowadzących do śmierci komórki. Zjawisko to jest zresztą opisane dla oligomerów wielu białek hydrofobowych o małej masie cząsteczkowej: takich jak kompleks ataku błon układu dopełniacza, amyloid-a, białko C-reaktywne czy, synukleina. Również regulacja transportu Ca poprzez przejściowy hetero tetramer 2 Orai 1-2 STIM tworzący SOCE między błoną plazmatyczną, a reticulum endoplazmatycznym, jest stosunkowo dobrze 1

2 poznana i opisana w kilku dobrych pracach przeglądowych. Jednakże problem modyfikacji mechanizmu SOCE, przez prawidłowe lub/i patologicznie zmienione białka APP i ich pochodne, nie został dogłębnie zbadany. Stąd temat pracy dotyczący oddziaływań różnych form APP lub PS1 z białkami kompleksu SOCE, należy uznać za interesujący i nowatorski. Tezę taką zdaje się potwierdzać fakt opublikowania głównych założeń i wyników rozprawy w dwóch pracach oryginalnych w czasopismach indeksowanych (JCR) i 1 poglądowej. Świadczy to o tym, że podstawowe części rozprawy przeszły już skrupulatną weryfikację merytoryczną. Przedstawiona praca stanowi próbę połączenia kilku modeli komórkowych, modyfikowanych genetycznie w zakresie genów białek metabolizmu Ca w celu wykrycia machanizmów zmian kompartmentacji tego kationu i ich związku z żywotnością komórek. Tworzą one dość logiczną, zwartą całość pozwalająca ocenić jak nadekspresja i/lub wybicie tych genów wpływa na homeostazę Ca 2+, stopień stresu oksydacyjnego, do których mogłoby dochodzić pod wpływem peptydów PS i APP-pochodnych. Autorka używając szeregu dobrze zdefiniowanych genotypów/fenotypów komórek T84 z wbitym lub/i wyciszonym genem APP, jak również przy użyciu specyficznych inhibitorów STIM/Orai 1 i transportu Ca wykazała, że: - białka APP nie tworzą kompleksów z białkami SOCE, wpływając jednak na homeostazę Ca -wybicie genu APP w komórkach T84 zmniejszało pasywny transport Ca z reticulum endoplazmatycznego do cytoplazmy. Wskutek tego zwiększał się poziom Ca w RE, a obniżał w cytoplazmie. -wynikało to z faktu, że brak APP hamował translokację STIM do Orai 1 i tym samym hamował powstanie kanału SOCE. -Poziom Ca w ER stanowi endogenny dwukierunkowy mechanizm regulujący szybkość fuzji obu białek. Ten wniosek potwierdza już istniejące obserwacje. Stanowi jednak podstawę niezbędną do interpretacji badań nad APP. - końcowa sugestia, że szybkość translokacji może służyć do oceny/oszacowania poziomu Ca w ER wydaje się być ryzykowna i pozbawiona aspektu ilościowego. Taka wtórna i mocno pośrednia metoda oceny Ca za pomocą ruchów endogennych białek, wydaje się a priori mało wiarygodna. Zastrzeżenie to potwierdzają załączone odpowiednie wykresy regresji (Ryc. 4.27). Niezależnie od ostatniego zastrzeżenia dysertacja dostarcza nowych danych dotyczących potencjalnej cytotoksyczności białek kręgu APP/PS wynikającej z ich pośredniej interakcji (mechanizm nieznany) z białkami kompleksu SOCE. Wartość tej obserwacji powiększa fakt niezwykle starannego opracowania modelu badawczego. 2

3 Uwagi szczegółowe (w kolejności chronologicznej) Praca zawiera dużą liczbę skrótów, których lista została podana na początku rozprawy. Niestety jest ona nie kompletna. Brakuje wyjaśnień znaczenia skrótów: APP< AICD, Aβ, Cav.1.2., C83, C99, GEM-CEPIA 1er, KPI, TH4, WB itp. Wstęp został podzielony na 8 podrozdziałów, które omawiają stan wiedzy dotyczący szczegółowych zagadnień związanych z tematyką pracy. Są to pojemnościowy napływ wapnia, APP, hipotezy choroby Alzheimera, czy też wpływ APP i presenilin na homeostazę wapnia. Dane te posłużyły autorce do zdefiniowania oryginalnego celu pracy, którego prezentacja jednak wzbudza pewne zastrzeżenia (patrz niżej). We wstępie można znaleźć niedokładne lub mylące informacje takie jak: Str 10. Stężenie Ca 2+ w PPK wynosi około 1 mm, a stężenie 2 mm odnosi się do wapnia całkowitego. Poziom 2 mm Ca 2+ w płynie pozakomórkowym jest niespotykany w klinice (Użycie nie-patofizjologicznie uzasadnionych stężeń Ca należy uzasadnić). Str. 11 niedomiar dodatniego ładunku?? Nie ma biernego usuwania jest to z definicji czynność aktywna. Bierny może być Wypływ - przepływ zgodnie z gradientem stężeń. Str. 12 cytozol powinno być cytosol Str. 13 STIM2 posiada nie niższe a wyższe powinowactwo do Ca 2+ niż STIM1 (Rosado i wsp. 2016) Str. 17.aktywacja pozasynaptyczna.. Receptor NMDA znajduje się w obrębie synapsy glutaminianergicznej, w jej części postsynaptycznej, a nie poza synapsą. Str 18 przydałoby się tłumaczenie słów : anterogradowy, retrogradowy, procesowanie. Nie.ilość.., a liczba połączeń; komórkowa lokalizacja raczej lokalizacja w komórce lub lokalizacja wewnątrzkomórkowa. Str.20. Tabela 1.3 zawierająca spis części mutacji APP związanych z FAD dostarcza informacji, które nie są użyteczne ani dla tego modelu doświadczalnego ani dla treści samej pracy. Str. 21 Wydaje się, że podrozdział dot. cholinergicznej hipotezy AD nie jest potrzebny. Zawiera on tylko jedną bardzo ogólną informację z błędem. Skrót acetylotransferazy cholinowej to CAT lub ChAT, a nie AChE = acetylocholinersteraza. Str Krótki podrozdział dotyczący Ca jest oddzielony od ściśle z nim związanego rozdziału 1.7., rozdziałem 1.6. Ten ostatni opisuje różne modele mysie genetycznej formy choroby Alzhiemera. Nie ma on bezpośredniego związku z prowadzonymi doświadczeniami i nie dostarcza użytecznych informacji. Zaburza natomiast omówienie hipotezy wapniowej i mechanizmów interakcji ER i PS1. 3

4 Str. 24.: Reakcje katalizowane, a nie..przeprowadzane.; może lepiej: hydroliza/proteoliza zamiast.rozszczepienie..; powinowactwo do różnorodnych białek (niska specyficzność substratowa).. zamiast.duża różnorodność substratowa Str. 25.mutanty.. odnosi się raczej do organizmów lub komórek a nie do PS1, które jest produktem zmutowanego genu..przeładowanie ER jonami wapnia. nie przyczynia się do patogenezy AD. nie ilość a liczba.. mutantów Str. 26. Czy pierwsze zdanie na tej stronie oznacza, że nieaktywny holoenzym PS1, reguluje poziom Ca w ER? Nie..ilości Ca 2+ a stężenia Ca 2+.; nie ilości a poziomu? podjednostki Na końcu paragrafu 2 brak jest odpowiedniego odnośnika literaturowego. Nie podano w jakim przedziale komórkowym jest regulowane steżenie Ca 2+? Str. 27. Jakie zmiany wywołują mutacje PS1 i PS2? Wzrost czy spadek Ca w ER? Stwierdzenie na końcu paragrafu opisujące odwrotne skutki genetycznej i chemicznej eliminacji PS1 na SOCE wymagają uzupełniającego komentarza. Jest on na pewno dostępny cytowanej publikacji. Końcowy opis publikacji dotyczących przypuszczalnych oddziaływań między zmutowanym APP i SOCE, dobrze uzasadnia podjęcie badań będących przedmiotem dysertacji. Są wątpliwości co do powinowactwa STIM 2 do Ca 2+ w cytowanych publikacjach: Rosado i wsp. (2017) vs Stathopulos i wsp. (2016). Należałoby enigmatyczną interpretację tych badań zastąpić dokładniejszym stwierdzeniem. Cele pracy. Cele pracy są dość precyzyjnie sformułowane w środkowej części tego rozdziału. Ani początkowy paragraf powtarzający stwierdzenia ze wstępu, ani końcowy opis narzędzi badawczych służących weryfikacji hipotezy, nie są tutaj potrzebne. Materiały i metody Zawierają dość przejrzyście przedstawione liczne modele doświadczalne i metody badawcze, którymi posługiwała się kandydatka przy realizacji tego projektu. Str należałoby podać źródła pochodzenia ludzkich linii komórkowych tak jak to zrobiono dla wektorów i plazmidów oraz przeciwciał pierwszo i drugorzędowych (Tab. 3.1 i 3.2.,.3., 3.4.). Bardzo liczne metody badawcze komórkowe, biochemiczne, genetyczne są opisane przejrzyście, stanowiąc cenną informację dla przyszłych badaczy. Str. 43 nie. na rotorze kołowym, a raczej na mieszadle kołowym Str. 43 Płyn Ringera stosowany w lecznictwie zawiera 2.2 mm CaCl 2. Jest on jednak podawany do krwi, gdzie po skompleksowaniu przez albuminę osocza stężenie jego kationu wynosi ok. 1.1 mm. 4

5 Stąd w doświadczeniu opisywanym w rozdziale stosowano środowisko hiperkacemiczne, przekraczające poza wartości krańcowo-ciężkich stanów hiperkalcemii.. Należałoby więc w dyskusji uzasadnienić użycie 1.8 i 10 mm Ca. Za wzorcowy należałoby uznać opis pomiarów jonów Ca z wykorzystaniem sondy GEM- CEPIA1er. Wobec małej liczby doświadczeń i prawdopodobnie nie-gaussowskim rozkładzie wyników, jak również większej niż 2 liczbie grup doświadczalnych w większości eksperymentów wskazane jest stosowanie testów nieparametrycznych dla mnogich porównań, a nie testu t Studenta. Wyniki Str. 49/50 Rodz. 4.1 opis doświadczeń dr Węgierskiego nadaje się raczej do wstępu lub/i do Metod jako informacja o użytym narzędziu badawczym Co wykazały wstępne wyniki dr Węgierskiego? Nie bardzo wiadomo, kto wykonywał te badania. Nie są potrzebne wyjaśnienia dotyczące technik transfekcji i wyciszania genów. Cały paragraf od początku do 12 linii str 50 powinien być, po odpowiednich modyfikacjach stylistycznych umieszczony w sekcji metodycznej. Str. 50 Czy Otrzymane linie komórkowe były wytworzone przez doktorantkę czy też wykorzystane w doświadczeniu? Obniżenie intensywności sygnałów luminescencji w liniach komórkowych z wyciszoną ekspresją APP nie świadczy o specyficzności przeciwciała, a jedynie o zmniejszeniu poziomu antygenu(ów) reagujących w przeciwciałem. Niezależnie od tego błędnego założenia, konkluzje dotyczące zmian poziomu białek APP i Orai 1 są jak najbardziej poprawne. Poziom białek trudno jest porównywać z ilością białka. Pierwszy termin odnosi się do jego zawartości w komórce (na mg białka lub na komórkę), a drugi określa nieilościowo ile jest samego białka. Wielokrotnie termin ilość jest używany nieadekwatnie do omawianego zagadnienia. Pewne zawiłości opisu wyników rekompensują w pełni czytelne ryciny Str. 54 i następne. Tytuły kolejnych rozdziałów zaczynające się od Próba stwarzają wrażenie, czegoś niedokończonego lub zakończonego negatywnym wynikiem. Zdaje się to potwierdzać szczegółowy opis trudności jakie doktorantka napotykała przy elucji białek Orai 1 i APP i ich wzajemnego oddziaływania. Mam wrażenie, że negatywne wyniki, związane z opracowaniem metody, nie powinny być opisywane, bo nie wnoszą nic do wyjaśnienia problemu. Zaskakująca jest wydajniejsza elucja białek za pomocą 0.1% niż 1% tritonu X-100. Może to być artefakt wynikający z interferencji Tritonu z reakcją antygen-przeciwciało. Str. 55. To złoże nie powodowało ko-immunoprecypitacji, a raczej ko-immunoabsorbcję. Co to jest współściąganie? Str. 56. Wielokrotnie użycie terminu:.ściąganie. Powinno być: absorbcja lub wiązanie 5

6 Podrozdział opisuje drogę prób i błędów prowadzącą do opracowania metody sieciowania przydatnej w wykrywaniu powstawania kompleksów Orai 1- APP oraz przy wykluczeniu ewentualnego kompleksowania APP. Odpowiednie ryciny dużo lepiej niż opisy obrazują ten problem Str. 58 rycina - Co znaczy brak lizatu? Str. 59 rozdz czy.oddziaływania. oznacza tworzenie kompleksu APP-Orai1? Rozdział ten zawiera wyniki pracy dr Węgierskiego. Powinien być umieszczony raczej w materiałach i metodach, a nie w wynikach, które w rozprawie doktorskiej powinny być wynikami własnymi. Co więcej po jego lekturze nadal nie wiadomo jaki był poziom białek APP w komórkach Jurkat. To, że był podobny do poziomu APP w HeLa i HEK 293T/17 też sprawy nie wyjaśnia, bo nie znamy poziomu APP w tych ostatnich (str 60). Str 60. Złoże z białkiem A i p-ciałem nie powoduje precypitacji białek Orai skompleksowanych czy też nie z dzikimi czy zmutowanymi APP, a ich immuno-absorbcję. Brak koelucji ze złoża APP i fragmentów C99 z Orai świadczyłby o nieobecności heterodimerów tych białek Termin.współściąganie należałoby zastąpić wyrażeniem lepiej obrazującym ten proces. Wartościową obserwacją jest tutaj wykazanie, że do kompleksowania nie dochodzi niezależnie od stopnia wypełnienia ER wapniem. Wykluczyło to tezę, że powstawanie kompleksów peptydów APP z białkami SOCE jest przyczyną zaburzeń wewnątrzkomórkowej kompartmentacji Ca. W ten sposób doktorantka przedstawiła fazę przygotowawczą do głównych doświadczeń dotyczących celu pracy. Wartość tych badań polegałaby na tym, że czytający uzyskuje przekonanie o solidnych podstawach modelu doświadczalnego opartego o 2 linie komórkowe Str 65 i następne. Funkcjonalne badania wpływu APP na stężenie Ca 2+ w ER przy użyciu specyficznej sondy białkowej są niewątpliwie najlepiej zaprezentowanym oryginalnym osiągnięciem mgr Kingi Gazdy. Jednakże wstęp w podrozdziale przedstawia w sposób niejasny przekaz o translokacji Orai do STIM. Nie wiadomo czy jest to state of art.(w takim przypadku brakuje odnośnika literaturowego), czy hipoteza autorki, czy też wynik Jej doświadczeń (w takim przypadku powinien być jako wniosek po omówieniu tych konkretnych badań). Dlaczego badania kinetyki przemieszczania nie zaprezentowano w tym miejscu, a w Metodach, gdzie powinien być opisany sposób wykonania? Specyficzności p-ciał nie potwierdza się wyciszaniem ekspresji genów. Ryc. 4,12 i 4.3. pokazują poziomy białek reagujących z p-ciałami (niezależnie od ich specyficzności) nie ekspresję-poziom mrna genów STIM1 i ORAI1. Wyniki na ryc wykazują, że oba p-ciała wykrywają spadek poziomu N i C końcowych epitopów białka STIM po aktywacji rozkładu mrna przez shrna co w uproszczeniu można nazwać wyciszeniem. 6

7 Str. 67 kinetyka podchodzenia i kinetyka odchodzenia to może przemieszczanie do i odłączanie od lub przyłączanie i odłączanie. Sugeruje to następnie zdanie, w którym jest mowa o reakcji wiązania. Więc może asocjacja i dysocjacja?..dynamiczne przemieszczanie Czy jest przemieszczanie nie-dynamiczne?.w sposób zależny od. Raczej w zależności od. Jakie dane literaturowe? Potrzebne cytowanie. Str Mimo powyższych zastrzeżeń, sama analiza obrazów immunocytochemicznych demonstrujących kinetykę dwukierunkowego przemieszczania STIM1 w stosunku do kanału Orai1, została zaprezentowana znakomicie. Następne podrozdziały Wyników wykazują, istnienie zmian interakcji białka STIM z SOCE w obecności licznych inhibitorów różnych dróg przemieszczania Ca w komórkach i translokacji STIM1, takich jak: ML-9 inhibitor translokacji STIM1, YM inhibitor kanałów SOCE; tapsygargina, CPA inhibitory Ca-ATP-azy SERCA itd.. Potwierdzają one tezę, że stopień wypełnienia magazynów Ca w RE jest czynnikiem autoregulacyjnym przepuszczalności kanałów SOCE zależnej od fuzji Orai1 i STIM1. Co ważniejsze mimo użycia dużej liczby czynników modyfikujących te wyniki nie wykazują sprzeczności i są wewnętrznie spójne. Doświadczenia te mają wszelkie cechy dobrej praktyki badań naukowych. Str.70. Czy transport Ca przez SOCE jest reakcją SOCE? Wykazanie odwrotnej zależności między poziomem Ca w ER i stopniem kolokalizacji Orai1 i STIM1 dało podstawy do dość trafnej tezy, że ta ostatnia może służyć do oceny szacunkowej poziomu Ca w ER. Na uwagę zasługuje użycie białkowej sondy GEM-Cepia do pomiaru stężenia Ca 2+ wewnątrzkomórkowego. Mimo pozytywnych wyników wykazanych na Ryc. 4.18, 4.19 osobiście nie zastosowałbym tej bardzo pośredniej, a przez to wrażliwej na interferencje metody, do oceny zasobów wapniowych w komórce. Są tańsze, prostsze i dużo dokładniejsze metody bezpośrednie. Niemniej sama obserwacja jest ciekawa i oryginalna. Str.73 legenda Ryc nie...błędy standardowe (SD), a średni błąd średniej (SEM) jak podano 4 linie wyżej. Str Opis metodyczny (7 linijek) konstruowania komórki z sondą GEM-Cepia powinien znajdować się w "Metodach". Tutaj jedynie "rozcieńcza" opis wyników doświadczenia powodując problemy z koordynacją opisów wyników z rycinami. Jest to usterka redakcyjna całego rozdziału. Obserwacje wykazujące, że stopień kolokalizacji Orai1 i STIM1, a więc wydajność SOCE nie zależy od poziomu APP w komórce, stanowią cenną informację dotyczącą Ca-zależnych mechanizmów neurodegeneracji Alzheimerowskiej. Wskazuje to, że APP moduluje wewnątrzkomórkowe [Ca 2+ ] poprzez inne mechanizmy. Znaczenie tego odkrycia zmniejsza nieco fakt, że zmiany ko-lokalizacji zależne od Ca-ER obserwowano w 25 o C, co wiąże sie ze wzrostem 7

8 stałej asocjacji. Wskazuje to, że być może w warunkach in vivo (37 o C) takie zjawisko może nie zachodzić. Problem ten został pominięty zarówno w tej sekcji jaki i w dyskusji. W Ryc Autorka nie porównywała statystycznie odpowiadających sobie komórek w różnych warunkach doświadczalnych mimo, że omawia je w tekście. Natomiast w każdych warunkach doświadczalnych dokonuje międzyliniowych porównań testem t. Przy małej liczbie doświadczeń nie wiadomo czy rozkład wyników jest normalny. Tak więc przy większej niż 2 liczbie grup doświadczalnych i nie-gaussowskim rozkładzie wyników odpowiednim testem statystycznym byłby test nieparametryczny dla mnogich porównań (np. Kruskal-Wallis z testem post hoc Dunn'a). Badania nad wpływem PSEN1 na stan funkcjonalny SOCE, chociaż negatywne, stanowią cenne uzupełnienie doświadczeń z APP. Wykazują one, że białka związane z mechanizmem amyloidogenezy nie interferują bezpośrednio z mechanizmami homeostazy Ca przez SOCE. Ostatnie sekcje wyników zawierają, jak się wydaje, najbardziej interesujące obserwacje dotyczące różnic w [ic.ca 2+ ] w komórkach z APP i z genetycznie obniżonym jego poziomem, w stanach ich normalnego, niskiego i wysokiego wypełnienia tym kationem, bardzo dobrze informuje o frakcyjnym udziale APP w utrzymaniu jego homeostazy. Obniżenie poziomu Ca 2+ w komórkach pozbawionych APP w stosunku to posiadających to białko wskazuje, że może być ono w około 30% odpowiedzialne za wypełnienie kompartmentów komórkowych tym kationem. Natomiast stwierdzenie na str. 80, że amplituda wypływu Ca z ER komórek z wyciszeniem APP była obniżona, lecz nieznamienna statystycznie przeczy (na razie) istotności tego zjawiska. W podrozdziale Kandydatka po raz n-ty opisuje sposób prowadzenia tego samego modelu. Poziom "spoczynkowy" - deplecja - powtórne wypełnianie. Tylko na str. 82 jest on powtórzony dwa razy. Należałoby to jasno opisać w części metodycznej, poprzez nieznaczną modyfikację opisów na str , a potem stosować odpowiedni krótki zwrot identyfikujący. Niemniej, ważnym wynikiem jest tutaj stwierdzenie podwyższenia poziomu Ca 2+ w ER spowodowanego opóźnionym jego wypływem z tego kationu Ca w komórkach z usuniętym APP, poprzez wyciszanie ekspresji genu APP przez shrna. (str. 82). Dyskusja Lektura tego rozdziału skłania do jednej ogólnej uwagi. Doktorantka powinna krytycznie ocenić i zinterpretować wyniki swoich badań i skonfrontować je z podobnymi lub uzupełniającymi danymi literaturowymi. Należy omówić i wyjaśnić ewentualne rozbieżności. Można oczekiwać, że przedstawione nowe dane będą lepsze i bardziej informatywne od tych już opublikowanych uprzednio przez innych badaczy. Tymczasem mgr Gazda najpierw dokonuje szerokiego opisu danych literaturowych (powtarzając w nieco zmienionej wersji wstęp), a dopiero potem dodaje w sposób mało wyraźny dane własne osiągnięcia pozostawiając je bez odpowiedniego komentarza. 8

9 Np. Niemal cała stron 86 to szczegółowy opis tego zrobili inni badacze, zamiast wyjaśnienia jak ich wyniki mają się do osiągnięć doktorantki. Uzasadnienie podjęcia badań przedstawione w czterech linijkach tekstu zostało już raz dokonane we wstępie i celu pracy. Dodatkowo lekturę dyskusji utrudnia fakt zbyt oszczędnego i niekompletnego odwoływania się do własnych rycin (brakuje 9 odnośników). Str Po bardzo szczegółowym omówieniu wyników badań poprzedników, do części brak jest cytowań. W końcu autorka przedstawia wyniki własne, sprzeczne z wynikami poprzedników. Jednakże zadowala się szczegółowym powtórzeniem już raz omówionych wyników, bez próby interpretacji. I tak po raz drugi uzasadniane jest użycie komórek Jurkat, zamiast interpretacji wyników. W końcu czytelnik pozostaje bez wyjaśnienia, kto tutaj miał rację? Być może wszyscy. Również 2-krotny opis udziału dr Węgierskiego nie jest tutaj potrzebny (zostało to już wyjaśnione w poprzednich rozdziałach). Str, 89. Nie ma potrzeby ciągłego uzasadniania wyboru przeciwciał bo to zostało już opisane wcześniej. Paradoksalnie najbardziej stylowi dyskusji odpowiada treść dolnej części tej strony, która dotyczy tylko części badań o charakterze potwierdzającym. Str. 90 Ta część dyskusji została napisana poprawnie, a wniosek dotyczący pośredniego, poprzez SERCA, wpływu APP na SOCE.-Orai1-STIM1 i transport wapnia, jest jak najbardziej uzasadniony. Niestety, ten fragment tekstu nie zawiera ani jednego odnośnika do konkretnej ryciny. Str Podrozdział 5.2. Zawiera względnie poprawną dyskusję wyjaśniającą istotę zależności [Ca 2+ i] od kolokalizacji Orai1-STIM1. Nie ma jednak jasnego wyjaśnienia różnic wiązania białek w 25 i 37 o C oraz samej kinetyki tego oddziaływania. Str. 93 Wytłumaczenie rozbieżności wyników uzyskiwanych w 25 i 37 o C jest niezadowalające. Autorka używa sformułowań zbyt ogólnych by cokolwiek wytłumaczyć. W jaki sposób aktywność pompy SERCA zależy od stężenia ATP. Czy jest ono różne w różnych temperaturach. Niska temperatura generalnie spowalnia aktywność wszystkich enzymów zarówno produkujących jak i zużywających ATP. Jednak Autorka danych dot. ATP nie przedstawia, ani nie odwołuje się do danych literaturowych. Jest to o tyle ważne, że ciepłostałe organizmy mają temp. ciała ok 37 o C. Skąd wiadomo, że przepływ przez SOCE zachowuje się przy spadku temperatury inaczej niż szybkość reakcji enzymatycznej? Poza stwierdzeniem faktu, że APP nie interferuje z SOCE, przyczyn różnic temperaturowych Autorka nie wytłumaczyła. Str. 94 co to jest.obniżenie kinetyki biernego napływu Ca.? Spadek V, wzrost [AC 0.5 ], a może coś innego?. Jednak podsumowujący wniosek dotyczący zwiększenia przez APP przepuszczalności pasywnych kanałów wapniowych w ER, należy uznać za odpowiedni do zaprezentowanych danych doświadczalnych. Brakuje tu jednak odnośników do rycin demonstrujących to zjawisko. 9

10 Początek drugiego segmentu zaczyna się od pustego zdania o rozszerzaniu wiedzy literaturowej o fizjologicznej roli APP, ponieważ następne fragmenty tekstu tego rozszerzenia nie opisują. Zajmują się natomiast omawianiem wyższości jednej metody pomiaru [Ca 2+ i] nad innymi. Zresztą w sposób budzący zainteresowanie. Str Ta część dyskusji zawiera szczegółową rzeczową ocenę wiarygodności i słabych stron dotychczasowych metod badawczych homeostazy Ca 2+. Końcowa bardzo trafna analiza własnych wyników, pozostawia jednak pewien niedosyt. Brak jest w niej nawiązania do poprzedzającej analizy wyników innych autorów. W drugim ustępie na str. 96, autorka w pierwszym zdaniu pisze o wykorzystaniu.podejścia utraty funkcji APP bez podania odnośnika do ryciny. Nie podano też jaki wynik uzyskano. Dlatego końcowe podsumowanie o wpływie (jakim?) APP na działanie tych kanałów należy uznać za wysoce spekulatywne. Str 97.Końcowy wniosek dyskusji, dotyczący hipotezy i istoty całego projektu, zobrazowanego na rycinie 4.28 został zbyty jednym zdaniem. Co więcej końcowa konkluzja Obserwacja może przyczynić się do poznania patogenezy AD jest, przy tym sposobie prowadzenia dyskusji, nie uzasadniona i na wyrost. Str Wnioski: Przydałby się dokładniejszy opis na czym miałaby polegać dysregulacja pasywnego uwalniania Ca 2+ z ER. Nie jest natomiast konieczne kolejne wspomnienie o pomiarach dr Węgierskiego, bez opisu czego dokładnie one dotyczyły i co wykazały. Poza tym wnioski 1, 2 i 3 są dobrze udokumentowane w przedstawianej pracy. Natomiast wniosek, aby używać szybkości przemieszczania STIM1 do Orai 1 do szacowania poziomu Ca w ER jest nieakceptowalny z technicznego i analitycznego punktu widzenia. Olbrzymie rozrzuty widoczne na rycinie 4.27 potwierdzają te wątpliwości. Prościej jest dokonać pomiaru bezpośredniego odpowiednią sondą wapniową. Str W podsumowaniu niepotrzebne są opisy planowanych dalszych badań, które zajmują ponad 60% strony. To ma być podsumowanie wyłącznie badań już wykonanych i przedstawionych w rozprawie. Nie ma również potrzeby umieszczania uzasadnienia wyboru metodyk badawczych. W sumie w takiej formie ten podrozdział nie jest potrzebny. Podsumowanie Mimo przedstawionych licznych uwag krytycznych uważam, że merytoryczna i techniczna strona rozprawy stoją na wysokim poziomie. Opisane w pracy i dyskutowane krytycznie w recenzji, dane są w pełni oryginalne i przedstawiają nowe fakty dotyczące regulacji poziomu Ca 2+ w reticulum endoplazmatycznym, poprzez aktywację/inhibicję szybkości ich wypływu przez zwiększenie/ zmniejszenie poziomu APP, bez bezpośredniej interakcji z SOCE. Co więcej przeszły one weryfikację na poziomie międzynarodowym udokumentowaną oryginalną publikacją w dobrym czasopiśmie o zasięgu międzynarodowym. 10

11 11