mgr inż. Wioleta Januchta

HTML
DOWNLOAD

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "mgr inż. Wioleta Januchta"

Józef Kowalczyk
6 lat temu
Przeglądów:

1 mgr inż. Wioleta Januchta Temat rozprawy doktorskiej: Synteza i badania biologiczne nowych funkcjonalizowanych analogów batracyliny jako potencjalnych związków przeciwnowotworowych Batracylina jest heterocykliczną aminą wyselekcjonowaną w trakcie poszukiwań nowych leków przeciwnowotworowych przez Narodowy Instytut Rakowy w Bethesda, USA. Wykazała ona wysoką aktywność cytotoksyczną oraz przeciwnowotworową wobec kilku eksperymentalnych modeli komórek nowotworowych, w tym linii opornych na adriamycynę, cisplatynę oraz metotreksat. W 2007 roku batracylina weszła do I fazy badań klinicznych mających na celu określenie bezpieczeństwa jej stosowania u chorych na nowotwory. Ponieważ nie wykazano odpowiedniego wpływu BAT na zahamowanie rozwoju nowotworów, w 2011 roku badania zakończono. Niska rozpuszczalność BAT w wodzie, wysoka toksyczność oraz mała biodostępność i konieczność stosowania wysokich dawek leku stoją na przeszkodzie wykorzystania tego związku w praktyce klinicznej, co przyczyniło się do poszukiwania jej nowych analogów o lepszych właściwościach farmakologicznych. W ten nurt badań wpisuje się również temat mojej pracy doktorskiej. Uzyskałam dwa nowe typy analogów batracyliny zawierające w swej strukturze dodatkowe cząsteczki, pochodne tuftsyny/retro-tuftsyny oraz adenozynę. Tuftsyna, bioaktywny tetrapeptyd pochodzenia zwierzęcego, stymuluje rożne funkcje makrofagów, wykazuje aktywność bakteriobójczą, przeciwnowotworową oraz przyczynia się do wzrostu niespecyficznej odporności organizmu gospodarza przeciw licznym infekcjom. Natomiast adenozyna będąc endogennym nukleozydem purynowym, nie tylko stanowi prekursor nukleotydów adeninowych, ale jest również neuromodulatorem odgrywającym istotną rolę w funkcjonowaniu wielu komórek. Dzięki wiązaniu się z receptorami adenozyny (AR), stanowi czynnik ochronny w stanach niedokrwienia i niedotlenienia serca oraz innych tkanek, jak również, w zależności od pobudzonego AR, wpływa m.in. na pracę serca, agregację płytek, napięcie mięśni gładkich czy układ immunologiczny. Zakładałam, że wprowadzenie nowych cząsteczek do BAT może przyczynić się do zwiększenia jej specyficzności i aktywności przeciwnowotworowej w wyniku addytywnego/synergistycznego działania reszt adenozyny i tuftsyny ze względu na oddziaływania z receptorami adenozyny i stymulację układu immunologicznego przez tuftsynę.

2 Batracylinę otrzymałam opracowaną w naszym zespole zmodyfikowaną metodą Czerniaka-Einhorna. Jako substrat wykorzystałam p-fenylenodiaminę, którą przeprowadziłam w symetrycznie chronioną grupami acetylowymi pochodną, po czym poddałam ją reakcji Czerniaka-Einhorna i w wyniku hydrolizy grup ochronnych oraz cyklizacji uzyskałam BAT. Syntezę odpowiednio chronionej tuftsyny/retro-tuftsyny oraz ich pochodnych acylowanych na grupie ε-aminowej lizyny dodatkowym aminokwasem (Gly, Ala, Val, Leu, Ile) przeprowadziłam metodą klasyczną w roztworze z wykorzystaniem mieszanych bezwodników z chloromrówczanem izobutylu i NMM. Jest to synteza wieloetapowa, która wymaga wprowadzania i zdejmowania odpowiednich osłon grup funkcyjnych. Analogi BAT z oligopeptydami uzyskałam przy użyciu T3P jako odczynnika kondensującego, który dawał najczystsze produkty z najlepszą wydajnością. Natomiast analogi BAT zawierające adenozynę otrzymałam w reakcji podstawienia nukleofilowego rybozydu 6-chloropuryny aminokwasowymi pochodnymi BAT. Użycie linkera do połączenia dwóch cząsteczek jest powszechnie stosowaną metodą, a od jego długości i budowy bardzo często zależy aktywność biologiczna związku. Struktura otrzymanych nowych analogów została potwierdzona na podstawie analizy widm 1 H NMR, 13 C NMR i MS, a ich czystość za pomocą HPLC. W przeprowadzonych badaniach biologicznych określono żywotność komórek za pomocą testu MTT oraz wpływ badanych związków na aktywność katalityczną kompleksu rozszczepialnego topoizomeraza-dna, dystrybucję komórek w cyklu komórkowym i indukcję uszkodzeń DNA. Do badań wyselekcjonowano ludzkie linie komórkowe: niedrobnokomórkowego raka płuc A549 oraz białaczki promielocytarnej HL-60. Ewaluacja właściwości cytotoksycznych chlorowodorku batracyliny wykazała umiarkowane jego właściwości cytotoksyczne. Otrzymane chlorowodorki oligopeptydów tuftsyny/retro-tuftsyny nie wykazały aktywności cytotoksycznej. Znacznie lepszą aktywnością niż chlorowodorek batracyliny charakteryzowały się analogi batracyliny z pochodnymi retro-tuftsyny. Najbardziej aktywne okazały się jednak aminokwasowe pochodne batracyliny. Natomiast ich analogi z adenozyną nie wykazały aktywności w przeprowadzonych testach. Ponadto, zbadano wpływ oligopeptydowych analogów BAT na aktywność kompleksu rozszczepialnego topoizomeraza-dna. Wykazano, że nie hamują one w znacznym stopniu relaksacji DNA przez topoizomerazę typu I, natomiast dają dobre wyniki w przypadku inhibicji relaksacji DNA przez topoizomerazę typu IIα. W wyniku analizy cyklu komórkowego oraz morfologii jądra komórkowego, po traktowaniu komórek nowotworowych wybranymi oligopeptydowymi analogami BAT można stwierdzić,

3 że przyrost frakcji sub-g1 był znaczący w populacji komórek inkubowanych z tymi związkami.

4 mgr inż. Wioleta Januchta Temat rozprawy doktorskiej: Synthesis and biological evaluation of novel functionalized batracylin analogues as potential anticancer compounds. Batracylin (BAT) is a drug which showed high antitumor and cytotoxic activity toward several experimental tumor cell models. BAT had been tested in phase I clinical trial in patients with advanced solid tumors and lymphomas. This clinical investigation found that BAT was tolerated in most patients. However, due to absence of a stronger signal for antitumor activity, further development of BAT had been stopped. Tuftsin (TKPR) is a tetrapeptide that has been shown to possess immunologic, tumoricidal, and bactericidal activities. Adenosine (ADO) is an endogenous purine nucleoside and an antiarrhythmic drug with negative chronotropic and dromotropic action. The chemical part of the work involved synthesis of BAT via modified method based on the Czerniak-Einhorn reaction. I synthesized also the protected tuftsin/retro-tuftsin derivatives containing isopeptide bond between ε-amino group of lysine and carboxyl group of simple amino acids such as Gly, Ala, Val, Leu, Ile. Protected peptides were obtained using mixed anhydride method. New analogues of BAT with tuftsin/retro-tuftsin derivatives were synthesized using T3P as a coupling agent in solvent mixture. The amino acid-batracylin derivatives were synthesized using DCC and DMAP in anhydrous methyl chloride in good yelds 48-64%. Finally, the new analogues of adenosine with batracylin derivatives were synthesized using highly reactive DIEA in solvent mixture. The bond between 6-chloropurine riboside and an amine group of batracylin derivatives was achieved during reaction in anhydrous ethanol. Synthesized analogues were subjected to biological tests. The MTT viability test was used to estimate cytotoxicity of the compounds. Cytotoxic activity testing was performed using different human tumor cells: lung adenocarcinoma (A549) and human promyelocytic leukemia (HL-60). BAT showed moderate cytotoxic properties. Conjugation of BAT with tuftsin alone did not appreciably change the cytotoxicity of the analogues, compared to BAT. In contrast, retro-tuftsin-bat analogues were about 2-fold (for HL-60 cells) and about 5-fold (for A549 cells) more cytotoxic that BAT. This was particularly striking for retro-tuftsin analogues branched with leucine or isoleucine which showed about 10 times or more increased cytotoxicity against both tumor cells than the parent compound BAT and its

5 branched BAT-tuftsin analogues. Several of the aminoacid-bat precursors showed greatly increased cytotoxicity toward both tumor cell types compared to BAT. Sensitvity toward both A549 and HL-60 cells was higher from about 2- to more than 25-fold compared to the BAT. The majority of aminoacid-adenosine-bat analogues were completely biologically inactive toward both A549 as well as HL-60 cells. Only one was specifically cytotoxic toward A549 cells but showed comparable activity to BAT. Studied analogues did not appreciably inhibit DNA relaxation mediated by type I DNA topoisomerase. Effect of studied compounds on DNA relaxation mediated by topoisomerase IIα enzyme was much more pronounced and drug dose-dependent. Treatment of tumor cells with BAT and its analogues, at doses corresponding to their IC 90 concentrations, resulted in a rapid (within 3 h) phosphorylation of the H2AX histone which is a typical marker of double-stranded DNA breaks. Analysis of cell cycle progression and nuclear morphology after treatment of tumor cells with analogues revealed that biological action of BAT and its tuftsin/ retro-tuftsin analogs was cell-type specific. The BAT-tuftsin analogue increased debris fraction by about 3.5-fold, compared to BAT.

Podobne dokumenty

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu. Wydział Medycyny Weterynaryjnej. Katedra Biochemii, Farmakologii i Toksykologii.

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Biochemii, Farmakologii i Toksykologii Aleksandra Pawlak CHARAKTERYSTYKA FENOTYPOWA KOMÓREK CHŁONIAKÓW I BIAŁACZEK PSÓW ORAZ