Obszary tematyczne OBSZAR TEMATYCZNY 1 GENETYKA I HODOWLA ZWIERZĄT GOSPODARSKICH

Transkrypt

1 Obszary tematyczne OBSZAR TEMATYCZNY 1 GENETYKA I HODOWLA ZWIERZĄT GOSPODARSKICH Zadanie Badanie efektywności polimorfozmu i ekspresji wybranyh genów warunkujacych długowieczność funkcjonalną bydła mlecznego na podstawie wyników produkcyjnych i behawioralnych Kierownik zadania: dr hab. Piotr Wójcik, prof. IZ PIB Badania prowadzono w latach w gospodarstwach: 1. Zakładzie Doświadczalnym IZ PIB Chorzelów sp. z o.o. na stadzie bydła utrzymywanego konwencjonalnie bydło rasy phf oraz w gospodarstwie ekologicznym w stadzie bydła phf oraz zb. 2. Kombinacie Rolnym Kietrz sp. z o.o. na fermie bydła mlecznego w Pilszczu. Ferma utrzymywała bydło rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej w czystości rasy w oborze kurtynowej z sektorami produkcyjnymi. 3. Zakładzie Doświadczalnym IZ PIB Kołbacz sp. z o.o. na dwóch grupach doświadczalnych bydła rasy phf. W ramach realizacji zadania, zgodnie z założeniami metodycznymi w wybranych gospodarstwach, utworzono grupy doświadczalne, do których wytypowano krowy o ukończonych laktacjach, co najmniej 305-dniowych, zgodnie z założeniami: Grupa I krowy o ukończonej laktacji I, II, III, IV Grupa II krowy o ukończonej laktacji V, VI, VII i więcej Grupa III krowy ubyłe Analizowano parametry produkcyjne krów w poszczególnych grupach badawczych oraz w gospodarstwach, uwzględniając czynniki warunkujące długowieczność produkcyjną krów oraz zachowania behawioralne w różnych warunkach środowiskowych i klimatycznych. Stwierdzono, że przy stałej średniej produkcji mleka i dość stabilnemu poziomowi tłuszczu i białka obserwujemy duże zróżnicowanie w poziomie komórek somatycznych. Zdecydowanie gorsze parametry mleka obserwujemy w miesiącach cieplejszych, począwszy od kwietnia do dnia ostatniego pomiaru w sierpniu (gospodarstwo ekologiczne). W gospodarstwach konwencjonalnych średni poziom komórek somatycznych począwszy od marca był znacznie podwyższony, natomiast w lipcu i sierpniu poziom LKS był najwyższy, co należy przypisać wysokiej temperaturze otoczenia. W ramach realizacji zadania analizowano dzienną produkcyjność krów także w obrębie poszczególnych sesji doju. Pod względem wydajności, jak również zawartości tłuszczu, białka i laktozy nie stwierdzono różnic pomiędzy poszczególnymi sesjami w obrębie laktacji. Wyraźne zmiany obserwujemy w obrębie wagi zwierząt. W sesji popołudniowej (2) krowy odznaczały się zdecydowanie wyższą wagą masy ciała. Analiza aktywności wykazała, że krowy o najniższej aktywności godzinowej w obu badanych sesjach były w III i IV laktacji, co bezpośrednio przełożyło się na najwyższą ich produkcję dzienną mleka. Tym samym krowy będące w szczycie produkcji życiowej zdecydowanie ograniczały aktywność na rzecz pobierania i trawienia paszy. 56

2 Analizowano także produkcyjność krów w poszczególnych fazach danej laktacji w rozbiciu na 100-dniowe cykle w grupie I, II oraz III (krowy wybrakowane). We wszystkich grupach laktacyjnych stwierdzono prawidłowy rozkład laktacji, gdzie szczyt produkcji obserwujemy w pierwszych 100 dniach laktacji, aby następnie malał w kolejnych cyklach. W grupie I i II stwierdzono zmiany wydajnościowe krów pomiędzy 100 a 305-dniowym okresem na poziomie od 796 kg do 829 kg. W grupie III różnica ta wynosiła już 1018 kg. Istotny jest fakt, że w grupie krów do IV laktacji różnice pomiędzy kolejnymi setnymi dniami laktacji średnio wynosiły od 396 kg do 436 kg, tym czasem w grupie II (krowy od V laktacji) różnice te były znacznie wyższe od 242 kg do 650 kg (w pierwszym okresie). W grupie krów wybrakowanych różnice te były wyższe od 460 kg do 558 kg. Tym samym, najmniejsze różne w produkcyjności biorąc pod uwagę krzywą laktacji stwierdzono w grupie krów I-IV laktacji. Przeanalizowano także w rozbiciu na 100-dniowe fazy laktacji produkcyjność, aktywność dobową oraz zmiany masy ciała uwzględniając trzy sesje doju. Zdecydowanie najwyższą aktywność przejawiały krowy w obu grupach doświadczalnych w drugiej sesji, czyli w okresie od 6.00 do 12.00, kiedy to odbywały się największe prace porządkowe w oborze oraz zasadniczy odpas zwierząt. Krowy z grupy I były jednak zdecydowanie aktywniejsze niż z grupy II. Analizując częstotliwość odpoczynku najwyższa występowała w okresie sesji pierwszej w obu grupach. Porównując dwie grupy wiekowe parametr ten był do siebie podobny. Zaobserwowano wyższy łączny czas spoczynku krów starszych z grupy II względem grupy I. Także w sesji pierwszej w obu grupach wskaźnik ten był najwyższy. Na łączny czas wpłynął wskaźnik długości pojedynczego spoczynku, który także w sesji pierwszej w obu grupach był najwyższy. Jak wykazały badania omawiane wskaźniki przełożyły się bezpośrednio na produkcję mleka, która także w sesji pierwszej była najwyższa. Sesja druga odznaczała się najniższą produkcją w obu grupach doświadczalnych. W ramach zadania analizowano także wskaźnik wytrwałości laktacji krów. Stwierdzono, że wzrost poziomu wskaźnika zależny jest od laktacji. Im krowy starsze, tym wartość jego wyższa. Jednocześnie wyższy wskaźnik charakteryzuje krowy o najwyższych wydajnościach dziennych mleka. Pozostałe parametry mleka jak tłuszcz, białko, laktoza czy sucha masa nie były zależne od wartości wskaźnika. Na uwagę zasługuje fakt, że krowy o niskiej wartości wskaźnika charakteryzowały się niskim poziomem komórek somatycznych w mleku (LKS). Wraz z kolejnymi laktacjami stwierdzono wydłużanie się laktacji od 90 dni w I laktacji do ponad 180 dni w grupie krów powyżej VI laktacji. Wiek krów (laktacja) nie miał statystycznie potwierdzonego wpływu na okres przedłużania laktacji. Wraz z kolejną laktacją zaobserwowano także spadek jednostkowy wydajności mleka w doju przedłużonym z poziomu 21 kg w laktacji I do 9,5 kg ml mleka powyżej VI. Różnice pomiędzy poszczególnymi grupami zostały potwierdzone statystycznie. Stwierdzono, że wraz z wydłużaniem się dni laktacji następuje wzrost długości okresu zasuszania z 56 dni w 300 dniu laktacji do przeszło 65 dni w laktacji trwającej 600 dni. Pomimo wzrostu wydajności ogólnej mlecznej, co jest konsekwencją wydłużonej laktacji odnotowano niepojący fakt wzrostu poziomu komórek somatycznych w mleku, przekraczający znacznie dopuszczalne normy dla mleka świeżego. Dłuższy czas laktacji niekorzystnie wpływa na wskaźniki inseminacji i liczbę zużytych porcji nasienia na jedno skuteczne pokrycie z 1,10 w 305-dniowej laktacji do ponad 6 porcji w 2 letniej II laktacji. Analizując dane płodnościowe w ujęciu wieku krów stwierdzono, że wraz z wiekiem wzrasta długość okresu międzyciążowego, a tym samym międzywycieleniowego. Nieznacznie wzrasta długość ciąży u krów starszych. Przy stałej masie rodzących się cieląt wzrasta z wiekiem problem z samoistnym porodem. W ramach prowadzonych badań krowy biorące udział w doświadczeniu zostały ocenione 57

3 pod względem budowy, ze szczególnym uwzględnieniem budowy wymion. Ocena wykonana była zgodnie z krajowym systemem w skali 1-9 pkt. Stwierdzono, że stada były bardzo wyrównane, a średnie ocen za poszczególne cechy wymienia bardzo zbliżone do siebie. Uwzględniając numer laktacji, w której daną grupę oceniano pod względem pokroju stwierdzono, że wraz z wiekiem zwierzęta uzyskiwały niższe oceny za kaliber, szerokość i głębokość klatki piersiowej. Wiek zwierząt nie wpływał na zmianę ustawienia zadu, jednak następowało stopniowe jego poszerzanie. Wraz z wiekiem obserwuje się pogorszenie postawy krów, czyli nogi z tendencją do tworzenia się postawy szablastej, przy spadającej wysokości piętki racicy. Także zawieszenie przednie wymienia ulega z wiekiem pogorszeniu, w konsekwencji następuje powolne obniżanie się położenia wymienia poniżej stawu skokowego. Przy nieznaczny skracaniu się strzyków odnotowano jednak pogarszanie się ustawienia strzyków tylnych na wymieniu. W drugim analizowanym gospodarstwie także zaobserwowano liczną grupę krów ubyłych będących powyżej IV laktacji, których poziom produkcji znacznie przekraczał 8 tys. kg mleka. W gospodarstwie tym brakowane krowy odznaczały się jednak bardzo wysokim poziomem komórek somatycznych w mleku, dochodzącym nawet do 1,5 mln. Dodatkowo w grupie krów ubyłych stwierdzono, że krowy o niskiej aktywności godzinowej charakteryzowały się wyższą wydajnością mleka niż sztuki aktywne. Jednocześnie łączny czas spoczynku, jak i długość pojedynczego spoczynku dla tych zwierząt nie była wysoka. Pomimo wysokiej laktacji (VII i VIII) krowy odznaczały się wysoką wydajnością dzienną mleka. Tym samym nie poziom wydajności decydował o brakowaniu zwierząt, ale inne decyzje hodowlane. Zgodnie z metodyką zadania po zamocowaniu na przednich nogach krów pedometrów, analizowano ich aktywność dobową w okresie szczytu sezonu pastwiskowego (gospodarstwo ekologiczne). W godzinach wieczornych stwierdzono zmniejszoną aktywność krów do poziomu kroków/godz. oraz zwiększoną częstotliwości odpoczynku (7-10 razy) przy dłuższym niż w ciągu dnia średnim czasem spoczynku (72-76 min). W godzinach wypasu bydła (eko) średnia aktywność wahała się od 128 do 235 kroków/godz., przy średnim czasie spoczynku od 36 do 49 minut. Krowy zdecydowanie mniej odpoczywały, były aktywniejsze, co bezpośrednio przełożyło się na łączny czas spoczynku ( min.) i wskaźnik niepokoju. Stwierdzono (ZD IZ PIB Kołbacz sp. z o.o. - gospodarstwo konwencjonalne), że krowy będące w II laktacji charakteryzowały się największą częstotliwością odpoczynków w ciągu doby, co przy najwyższym czasie pojedynczego spoczynku skutkowało najwyższym łącznym czasem spoczynku w pierwszej i drugiej sesji doju. Krowy pierwiastki charakteryzowały się najniższymi okresami spoczynku oraz najkrótszymi czasami, co spowodowało, że odznaczały się niskim łącznym czasem spoczynku. W konsekwencji, ich dzienna produkcja mleka była najniższa. W okresie wyższych temperatur (sierpień) krowy przejawiały wyższy wskaźnik niepokoju, który przekładał się na zwiększoną aktywność zarówno w dzień jak i w nocy oraz niższy łączny czas spoczynku. Wraz ze spadkiem temperatury rósł średni i łączny czas spoczynku (październik). Jak wykazały badania, wraz ze wzrostem siły wiatru w godzinach rannych i popołudniowych maleje aktywność godzinowa zwierząt. Wraz z rosnącą siłą wiatru maleje także średni czas spoczynku zwierząt, w konsekwencji czego następuje ograniczenie łącznego czasu spoczynku. Krowy obniżają czas przeznaczony na przeżuwanie, co prowadzi do spadku ich mleczności. Jak wykazały badania, parametry morfologiczne krwi różnią się u krów mlecznych w zależności od stanu fizjologicznego, jak również od wieku krowy. Tendencję do podwyższenia zawartości RBC, hemoglobiny i hematokrytu zaobserwowano u zwierząt w 200. dniu laktacji, natomiast u krów w okresie okołoporodowym występowało obniżenie wartości parametrów czerwonokrwinkowych i wzrost ilości białych ciałek krwi. Liczba neutrofili w krwi krów zmniejsza się wraz z wiekiem, jednakże w przypadku podwyższenia poziomu kortyzolu, co ma związek 58

4 ze stresem oraz poziomu adrenaliny po wysiłku, pobudzeniu lub strachu ulega podniesieniu np. w okresie okołoporodowym (poporodowa neutrofilia i limfopenia). Natomiast liczba limfocytów u krów zdrowych i w stanie homeostazy wraz z wiekiem wzrasta. Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) zmienia się wraz z wysiłkiem i wiekiem krowy osiągając wyższe wartości u krów starszych. W okresie trwania doświadczenia przez trzy kolejne lata pobierano każdorazowo próby tak, aby były reprezentatywne dla różnych grup wiekowych zwierząt przy założeniu, że są one powyżej IV laktacji dla grupy doświadczalnej w każdym gospodarstwie i do V laktacji dla grupy porównawczej. Badania obejmowały określenie wpływu polimorfizmu genów LEP/LEP, Gene ID: ) w BTA4: Y7F (Lagonigro et al., 2003), R25C i A80V (Konfortov et al., 1999) oraz transwersja C/T w pozycji 963 dojrzałego białka (Liefers et al. 2005) w odniesieniu do długowieczności badanych krów. Przeprowadzona analiza PCR-RFLP wykazała obecność mutacji Y7F w badanej populacji. Niemal wszystkie osobniki posiadały fenotyp dziki YY, o czym świadczy brak obecności dodatkowych prążków powstałych w wyniku cięcia restrykcyjnego. Tylko 0,04 posiadało fenotyp YF. Nie stwierdzono związku pomiędzy frekwencją badanych genotypów a długowiecznością produkcyjną krów. Krowy zarówno w pierwszej, jak i piątej laktacji odznaczały się dominującym genotypem YY a frekwencja allelu Y była dominująca. Tym samym gen leptyny Y7F nie warunkował długowieczność badanych krów. Analiza płodności krów w I laktacji z uwzględnieniem ilości zużytego nasienia na skuteczne pokrycie w odniesieniu do frekwencji genotypów genu leptyny Y7F stwierdzono, że wraz z rosnącą ilością porcji nasienia wydłuża się wiek I zacielenia i wycielenia bez wpływu na długość ciąży. Krowy o frekwencji genotypu YF potrzebowały dwie porcje nasienia na skuteczne pokrycie i odznaczały się najkrócej trwającą ciążą. W przypadku II laktacji obecność genotypu YF nie wpłynęła na ilość zużytego nasienia, gdyż wykorzystano zarówno jedną, jak i cztery porcje, co również nie miało to wpływu na długość ciąży u krów. Tym samym należy stwierdzić brak związku pomiędzy genem leptyny Y7F a cechami płodnościowymi krów. W dalszej części badań przeprowadzono identyfikację mutacji leptyny R25C i A80V dla 138 osobników. Analiza PCR-RFLP wykazała występowanie osobników o różnych genotypach. Odnotowano największy udział genotypu RC (0,50), natomiast najrzadziej występował genotyp RR (0,18). Analiza wykazała, że frekwencja dwóch alleli była bardzo zróżnicowana, najczęściej występował C (0,57), natomiast najrzadziej T (0,43). W obu badanych gospodarstwach stwierdzono podobną frekwencję genotypu CC leptyny R25C. Najwyzsze frekwencje stwierdzono dla genotypu RC w obu gospodsrtwach. Zdecydowanie najwyższa frekwencja w badanej populacji była dla allelu C, a najniższa dla R. Na podstawie wyników w gospodarstwie I stwierdzono, że przeżywalność krów do kolejnej laktacji związane jest ze spadkiem frekwencji genu CC przy stałym poziomie RR. Krowy o niskim udziale allelu C przeżywały do dalszych laktacji. W gospodarstwie II odnotowane powyżej zależności przeżywalności od frekwencji genotypu CC także zostały potwierdzone od III do V laktacji. Odnotowano znaczący udział w większości badanych grup wiekowych genotypu RC. Wraz z rosnącą ilością zużytego nasienia na skuteczne pokrycie rośnie wiek I zacielenia oraz wycielenia przy stałej długości ciąży. U krów o zwiększonej ilości zużytego nasienia stwierdzono w obu gospodarstwach wzrost frekwencji allelu R. Krowy o malejącym udziale allelu C wymagały większej ilości porcji nasienia (w I-III) na zacielenie. Ogólna analiza frekwencji genotypów i alleli genu LEPTYNA A80V we wszystkich liniach wykazała, że dominował w populacji genotyp AV (0,47), następnie AA (0,41) i najsłabiej genotyp VV (0,12). W układzie analizy frekwencji alleli najwyższy udział miał A (0,65). W obu gospodar- 59

5 stwach odnotowano najniższy udział był genotypu VV dla leptyny A80V. Zdecydowanie frekwencja allelu A była najwyższa. W gospodarstwie I wraz z rosnącym wiekiem produkcyjnym krów stwierdzono wzrost udziału frekwencji genotypu AA, podobną zależność, ale tylko do III laktacji odnotowano w gospodarstwie II. W obu gospodarstwach dominowała frekwencja allelu A, jednak udział jego był zmienny w poszczególnych grupach wiekowych i tylko w gospodarstwie I malał w poszczególnych grupach wiekowych krów. Wzrost ilości zużytego nasienia na skuteczne pokrycie związany był ze wzrostem udziały genotypu AA u bydła zarówno w gospodarstwie I (do 3 porcji), jak i II (do 4 porcji). W omawianych grupach stwierdzono spadek udziału genotypu VV wraz ze wzrostem zużytych porcji nasienia. Kolejna ogólna analiza frekwencji genotypów dla genu LEPTYNA C(-963)T wskazuje, że dominuje w badanych 19 liniach układ CT (0,54), a najsłabiej reprezentowany jest dla układu CC (0,11). Nie stwierdzono żadnych osobników o genotypie TC. Zdecydowanie najwyższy udział w badanych liniach miał allel T (0,63) względem C (0,37). Pomimo, że w gospodarstwie I stwierdzono większy udział genotypu CC u krów dłużej użytkowanych, tak w gospodarstwie II takie wnioski dotyczą tylko krów do III laktacji. W gospodarstwie I także wyższy udział genotypu CT charakteryzował krowy w II i III laktacji, natomiast w gospodarstwie II takich zależności nie stwierdzono. Udział genotypu TT malał wraz z badaną grupą wiekową w gospodarstwie I, a w gospodarstwie II pozostał na stałym poziomie. Przeciwstawne wyniki frekwencji alleli C i V nie wskazują na związek genu z długowiecznością. Badana frekwencja genotypów nie wykazuje związków ze wskaźnikami zużycia nasienia. Wyższa była frekwencja allelu C, którego nie można powiązać z efektywną inseminacją. Zadanie Zmiany struktury genetycznej małych populacji zwierząt gospodarskich Kierownik zadania: dr inż. Magdalena Szyndler-Nędza Celem zadania było określenie struktury genetycznej (polimorfizmu genów) wybranych ras świń, owiec i bydła w grupie zwierząt reprezentującej różny stopień zinbredowania. W przypadku świń badaniami objęto aktualnie utrzymywane populacje rasy puławskiej, złotnickiej białej i złotnickiej pstrej. W przypadku owiec materiał do badań stanowiły zwierzęta rasy Romanowskiej. Wśród populacji bydła mięsnego rasą o niewielkiej liczebności jest rasa Hereford. Zwierzęta utrzymywane były w warunkach fermowych, w miejscu ich przebywania. W każdym z gatunków kontrolowano zinbredowanie wybranych ras. Na podstawie wartości współczynnika inbredu F zwierzęta podzielono na grupy charakteryzujące się różną jego wartością. Z wyznaczonych grup wybrano reprezentatywną liczbę zwierząt od których zebrano wyniki użytkowości specyficzne dla każdego z gatunków oraz materiał biologiczny, na którego podstawie określono strukturę genetyczną (polimorfizmu wybranych genów) w każdej z populacji. Fot. 1. Rasa puławska Fot. 2. Rasa złotnicka biała Fot. 3. Rasa złotnicka pstra 60

6 Analizując wyniki dotyczące świń stwierdzono, że wyższa wartość współczynnika inbredu loch wpływała na pogorszenie wyników oceny przyżyciowej loszek rasy puławskiej (zmniejszenie wysokości oka polędwicy i zawartości mięsa w tuszy) i złotnickiej pstrej (zmniejszenie masy ciała i przyrostów dziennych). W przypadku wyników użytkowości rozpłodowej loch wyższa wartość współczynnika inbredu matek łączyła sie ze zmniejszeniem liczby prosiąt urodzonych w rasie złotnickiej pstrej oraz zwiększeniem strat prosiąt w rasie złotnickiej białej. Stwierdzony brak równowagi genetycznej w frekwencji niektórych polimorfizmów genów (FST i LIF3 - w rasie puławskiej, w FST, ESR, LIF, MC4R, HAFABP/Hpall, SKI - w rasie złotnickiej pstrej, OPN, LIF, LEP, HAFABP/HinfI, HAFABP/Hpall i COX2 - w rasie złotnickiej białej) może oznaczać, że na te populacje oddziaływały jakieś czynniki. Najprawdopodobniej mógł być to czynnik doświadczalny lub dobór do kojarzeń, a także selekcja. Na podstawie szczegółowej analizy zmian frekwencji genotypów genów związanych z rozrodem w poszczególnych grupach inbredu wykazano, że u każdej z analizowanych ras rodzimych występują istotne zależności pomiędzy wartością inbredu a pojedynczymi polimorfizmami. Przy czym u każdej z ras zależności te dotyczą innych genów. W rasie puławskiej wzrost inbredu związany był przede wszystkim ze zwiększeniem homozygotyczności w genie FST (w kierunku FST BB, r S = 0,199, P 0,05), w rasie złotnickiej białej w genie ESR (w kierunku ESR AA, r S = -0,212, P 0,05), w rasie złotnickiej pstrej w genie PRL (w kierunku PRL Del/Del, r S = 0,339, P 0,05). Ilustracja 1. Zmiany frekwencji genotypów w locus genów FST w rasie puławskiej, ESR w rasie złotnickiej białej i PRL w rasie złotnickiej pstrej W przypadku genów kodujących produkty uczestniczące w procesach wzrostu i rozwoju wskazano, że w każdej z analizowanych ras wzrastające zinbredowanie loch łączyło sie ze zmianą struktury genotypów w obrębie przede wszystkim genu MYF4. W rasie puławskiej wzrastała ilość osobników z allem MYF4 B (r S = 0,199, P 0,05), w rasie złotnickiej białej i pstrej zwiększała się frekwencja osobników obu form homozygotycznych AA i BB. Ponadto w rasie złotnickiej białej od wartości inbredu 6,25% stwierdzono zwiększenie ilości osobników posiadających allel G genu SCI (r S = 0,231, P 0,01), allel D genu HAFABP/Haell i allel h genu HAFABP/ HinfI, a w rasie złotnickiej pstrej przede wszystkim allel A genu MC4R. Analizując polimorfizm genów związanych ze zdrowotnością świń stwierdzono niewielki wpływ wartości inbredu osobniczego na zmiany struktury w ich polimorfizmie. Jedynie w rasie puławskiej wzrost wartości inbredu łączył sie ze statystycznie istotnym zmniejszeniem frekwencji osobników homozygotycznych COX2 22 (r S = -0,231, P 0,05) i CRP GG. Należy zazna- 61

7 czyć, że w przypadku niektórych polimorfizmów genów (w rasie puławskiej - MYF4, HFA- BP/Haell, HFABP/Hpall i SCI, w rasie złotnickiej białej - DGAT1, SCI, MC4R i HFABP/HinfI i w rasie zł pstrej - MC4R) wzrost wartości inbredu powyżej 6,25% (puławska, zł biała) i 9,8% (zł biała, zł pstra) łączył się (wbrew oczekiwaniom) ze zwiększeniem ilości osobników heterozygotycznych. W przypadku bydła mięsnego rasy Hereford wykazano, że wzrost wartości inbredu do wartości średnio 15,3% nie wpływał statystycznie istotnie na zmianę wartości analizowanych cech użytkowych za wyjątkiem masy ciała cieląt po urodzeniu. Dla tej cechy wykazano, że cielęta pochodzące od matek z grupy o wartości inbredu od 0 do 5,6% (grupa 1, 2, 3) cechują się statystycznie istotnie (P 0,05, P 0,01) wyższą Fot. 4. Rasa Hereford masą ciała w dniu urodzenia o średnio 1,1 kg w porównaniu do cieląt pochodzących od matek o wartości inbredu powyżej 6,25% (grupa 4, 5). Analizując frekwencję zidentyfikowanych polimorfizmów genów stwierdzono, że w tej populacji najwięcej krów posiada genotyp homozygotyczny w locus genów: osteopantyny SPP1 TT (52,21%), genu insulinopodobnego czynnika wzrostu IGF1 A2A2 (60,00%), genu µkalpainy CAPN1 GG (94,85%) oraz genotyp heterozygotyczny w przypadku genu transformującego czynnik wzrostu TGFß CG (46,32%). Na podstawie analizy frekwencji genotypów tych genów zgodnie z prawem Hardy ego-weinberga wykazano, że analizowana populacja krów rasy Hereford jest w równowadze genetycznej. Szczegółowa analiza wpływu wzrostu wartości współczynnika inbredu na zmianę frekwencji w analizowanych genach dała podstawę do stwierdzenia, że wzrost wartości inbredu związany był ze zwiększeniem występowania w analizowanej populacji zwierząt homozygotycznych o genotypie SPP1 CC (r S = -0,167, P 0,05), CAPN1 GG (r S = 0,192, P 0,05) oraz osobników heterozygotycznych w przypadku genu TGFß CG (osobniki o statystycznie istotnie (P 0,05) najwyższej wartości współczynnika inbredu). Ilustracja 2. Zmiany frekwencji genotypów w locus genów SPP1, CAPN1 i TGFβ w rasie Hereford 62

8 W przypadku owiec, uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, że w aktualnych warunkach hodowli rasy Romanowskiej 43,9% zwierząt ma zerowy współczynnik inbredu, a tylko 0,8% populacji znajduje się w grupie o współczynniku F>0,3372. Średni współczynnik zinbredowania w populacji wynosi F=0,0372 (3,7%), co wskazuje na prawidłowo prowadzoną pracę hodowlaną w tej rasie. Przeanalizowano wpływ wartości współczynnika inbredu na cechy użytkowe owiec. Stwierdzono istotny Fot. 5. Rasa Romanowska wpływ inbredu na liczbę urodzonych i odchowanych jagniąt oraz masę ciała w dniu licencji. W przypadku dwóch pierwszych cech wzrost wartości współczynnika inbredu matek wpływał na zmniejszenie ilości urodzonych i odchowanych przez nie jagniąt. W przypadku masy ciała osobników w dniu licencji stwierdzono odwrotną zależność. Wzrost wartości osobniczego współczynnika inbredu łączył się ze zwiększeniem masy ciała zwierząt. Na podstawie analizy frekwencji alleli w genach BMP15, BMPR1B, GDF9, CAST i DGAT1 dla badanej populacji owiec stwierdzono brak równowagi genetycznej jedynie w przypadku polimorfizmu w genach BMPR1B i CAST. Analizując zmiany struktury w polimorfizmie tych genów w zależności od wielkości inbredu osobniczego wykazano, że wraz ze wzrostem wartości współczynnika inbredu następuje zwiększenie ilości osobników homozygotycznych o genotypie BMPR1B CC (r S =-0,26), a w przypadku genu CAST ilości osobników posiadających w swoim genotypie allel N (r S =0,41). Stwierdzono również, że przekroczenie wartości inbredu F>0,3372 łączy się ze zmniejszeniem ilości osobników homozygotycznych o genotypie GDF9 GG na rzecz osobników także homozygotycznych o genotypie GDF9 AA. W przypadku genów BMP15 i DGAT1 nie zaobserwowano istotnego wpływu inbredu na zmiany struktury polimorfizmu tych genów w populacji. Uzyskane dla świń i owiec wyniki badań wskazują, że występujący w małych populacjach brak równowagi genetycznej w polimorfizmie niektórych genów, w tym genów związanych z rozrodem, może wynikać z oddziaływania na te populacje między innymi takich czynników, jak: selekcja, dobór do kojarzeń, dryf genetyczny lub czynnik doświadczalny. W związku z powyższym w populacjach tych należy monitorować zmienność szczególnie w obrębie genów związanych z rozrodem. W analizowanej populacji krów rasy Hereford, na podstawie analizy frekwencji genotypów i alleli genów SPP1, IGF1, CAPN1, TGFß stwierdzono, że jest w równowadze genetycznej. Ponadto wyniki badań wskazują, że w przypadku trzech ras świń rodzimych konieczne jest monitorowanie tych populacji pod kątem zmienności w genach związanych ze zdrowotnością. Obserwowana obecnie mała ilość osobników o genotypach COX2 11 i FUT1 AA świadczyć może o znikaniu tego genotypu z populacji. W związku z powyższym w praktyce hodowlanej rasy puławskiej należy zwrócić szczególną uwagę na zmiany w polimorfizmie genów, poszukując przede wszystkim osobników o genotypie LIF3 BB, ESR BB, COX2 11, a w rasach złotnickich osobników o genotypach LIF3 BB, ESR BB, COX2 11, FUT AA. Przeprowadzona analiza wpływu wartości inbredu na strukturę polimorfizmu genów wykazała, że w rasie puławskiej wzrost inbredu związany był przede wszystkim ze zwiększeniem homozygotyczności w genie FST (w kierunku FST BB ), w rasie złotnickiej białej w genie ESR (w kierunku ESR AA ), w rasie złotnickiej pstrej w genie PRL (w kierunku PRL Del/Del ). W przypadku bydła mięsnego rasy Hereford wzrost wartości inbredu związany był ze zwiększeniem występowania w analizowanej populacji zwierząt o genotypie homozygotycznym SPP1 CC, CAPN1 GG oraz osobników o genotypie heterozygotycznym w przypadku genu TGFß CG. W rasie owiec Romanowskich wraz z wzrostem wartości współ- 63

9 czynnika inbredu następowało zwiększenie ilości osobników homozygotycznych o genotypie BMPR1B CC, a w przypadku genu CAST ilości osobników posiadających w swoim genotypie allel N (r S =0,41). Stwierdzono również, że przekroczenie wartości inbredu F>0,3372 łączyło się ze zmniejszeniem ilości osobników homozygotycznych o genotypie GDF9 GG na rzecz osobników także homozygotycznych o genotypie GDF9 AA. Zadanie Wpływ polimorfizmu i ekspresji genów GHRL i GHSR na wyniki produkcyjne i jakość mięsa kurcząt Kierownik zadania: dr hab. Katarzyna Połtowicz Celem zadania było zbadanie zależności pomiędzy polimorfizmem w obrębie genów kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR) a wynikami produkcyjnymi, cechami jakości tuszki oraz fizykochemicznymi właściwościami mięsa kurcząt brojlerów. Zbadano również związek pomiędzy oznaczonym poziomem transkryptu dla genów GHRL i GHSR a umięśnieniem i otłuszczeniem ciała i jakością mięsa kurcząt w zależności od masy ciała i wieku uboju. W celu szczegółowym nr 1 zatytułowanym: Określenie wpływu polimorfizmu w genach kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR) na wyniki produkcyjne i jakość mięsa kurcząt materiał do badań stanowiły kurczęta Ross 308 (kogutki) odchowywane do 42. dnia życia. W 42. dniu doświadczenia wybrano do uboju łącznie 123 ptaki, w tym 61 szt. o średniej masie ciała oraz 62 szt. o masie ciała istotnie wyższej od średniej, w celu określenia wydajności poubojowej, jakości tuszki i fizykochemicznych właściwości mięśni piersiowych. Od wszystkich 123 ptaków poddanych ocenie jakości tuszki i mięsa pobrano krew w celu określenia polimorfizmów w genach kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR). W badaniach określono związek pomiędzy oznaczonym polimorfizmem genów kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR) a wynikami produkcyjnymi i cechami jakości mięsa ptaków. Różniące się masą ciała kurczęta różniły się także masą mięśni piersiowych i mięśni nóg oraz masą tłuszczu sadełkowego. Nie stwierdzono natomiast różnic w udziale procentowym poszczególnych elementów tuszki za wyjątkiem udziału kości nóg, który był istotnie wyższy u kurcząt lżejszych. Kurczęta o ponadprzeciętnym potencjale wzrostu charakteryzowały się większą siłą cięcia mięśni piersiowych i mniej korzystnymi parametrami tekstury w porównaniu z ptakami o średniej masie ciała. Pomimo braku istotnych różnic pomiędzy grupami ptaków, tuszki i mięso pochodzące od kurcząt z badanego stada wykazywało znaczne indywidualne zróżnicowanie zarówno pod względem jakości, jak i wydajności. Badania sekwencjonowania pozwoliły na zidentyfikowanie 5 mutacji typu SNP w regionie promotorowym genu GHRL oraz 10 mutacji w regionie promotorowym genu GHSR. Analiza wpływu polimorfizmów w badanych genach na cechy kurcząt brojlerów wykazała różnice w niektórych cechach tuszki i fizykochemicznych właściwościach mięśni piersiowych. W kilku przypadkach stwierdzono także wpływ genotypu na masę ciała i mięśni ptaków. Polimorfizm 12: T>G w regionie promotorowym genu GHRL istotnie wpłynął na masę ciała, masę mięśni piersiowych oraz na ich wodochłonność, dlatego może on mieć znaczenie praktyczne jako marker genetyczny. Mutacje rs c>t oraz rs a>g w regionie promotorowym genu GHSR istotnie wpływały na siłę cięcia. W związku z powyższym selekcja ukierunkowana na poprawę kruchości mięśni piersiowych kurcząt powinna preferować osobniki o genotypie odpowiednio TT oraz GG w tych loci. 64

10 W celu szczegółowym nr 2 pt. Określenie wpływu ekspresji genów kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR) na wyniki produkcyjne i jakość mięsa kurcząt przeprowadzono analizę związku poziomu transkryptu badanych genów w wybranych tkankach kurcząt z ich masą ciała, umięśnieniem, otłuszczeniem i jakością mięsa. Materiał do badań stanowiły kogutki komercyjnej linii Ross 308 odchowywane na ściółce do 42. dnia życia. Podczas odchowu, co tydzień kontrolowano indywidualną masę ciała ptaków. W 1., 21. i 42. dniu odchowu ze stada wybrano do uboju po 20 kurcząt, które przydzielono do dwóch grup w zależności od osiąganej przez nie masy ciała. Grupę I stanowiły kurczęta o średniej masie ciała, natomiast grupę II kurczęta reprezentujące ponadprzeciętny potencjał wzrostu czyli ptaki, które w tym samym czasie osiągnęły istotnie wyższą masę ciała. Ubój wybranych kurcząt (po 10 z każdej grupy) przeprowadzono w 1., 21. oraz 42. dniu życia. Natychmiast po uboju od ptaków tych pobrano narządy (przysadkę mózgową, podwzgórze, żołądek gruczołowy i wątrobę) w celu określenia w nich ekspresji genów GHRL oraz GHSR. Ponadto na zakończenie doświadczenia, przeprowadzono ocenę wydajności poubojowej oraz jakości tuszki i fizykochemicznych właściwości mięsa. W 15 min. i 24 godz. post mortem określono kwasowość początkową i końcową mięśni piersiowych. Schłodzone tuszki poddano uproszczonej analizie rzeźnej, a następnie wyliczono m.in. wydajność rzeźną kurcząt oraz procentowy udział mięśni, tłuszczu i podrobów w tuszce. Wypreparowane mięśnie poddano ocenie wybranych wskaźników jakości mięsa: barwy L*a*b*, wycieku swobodnego, wycieku po rozmrożeniu i strat termicznych. Gotowane mięśnie oceniono pod względem kruchości (siły cięcia W-B) i parametrów tekstury. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy pomocy programu Statistica 10 PL. W badaniach określono związek pomiędzy oznaczonym poziomem transkryptu dla genów kodujących grelinę (GHRL) i receptor greliny (GHSR) a wynikami produkcyjnymi i cechami jakości mięsa badanych ptaków. Niezależnie od wieku, różniące się masą ciała kurczęta różniły się istotnie także pod względem masy mięśni piersiowych, masy mięśni nóg oraz masy tłuszczu sadełkowego. Nie wykazano natomiast u nich różnic w procentowym udziale mięśni i tłuszczu w tuszce. Wyższa masa ubojowa kurcząt nie miała istotnego wpływu na większość ocenianych cech jakości mięsa za wyjątkiem zdolności do utrzymywania wody własnej, mniej korzystnej u kurcząt cięższych. Masa ciała kurcząt wpłynęła istotnie na poziom transkryptu genu GHSR w podwzgórzu. W przypadku pozostałych tkanek różnice w ekspresji badanego genu pomiędzy grupami okazały się nieistotne. Ekspresja genu receptora greliny (GHSR) w przysadce mózgowej, wątrobie i żołądku mięśniowym była zależna od wieku ptaków. Nie stwierdzono natomiast wpływu wieku kurcząt na poziom jego ekspresji w podwzgórzu. Badania nie wykazały istotnych różnic w poziomie ekspresji genu greliny (GHRL) w tkankach różniących się masą ciała kurcząt brojlerów. Nie stwierdzono również wpływu wieku ptaków na poziom transkryptu omawianego genu w podwzgórzu, przysadce mózgowej, wątrobie i żołądku mięśniowym. Poziom ekspresji genu GHSR w tkankach 42-dniowych kurcząt skorelowany był z niektórymi fizykochemicznymi cechami mięsa, takimi jak barwa, straty po rozmrożeniu czy parametry tekstury. Nie stwierdzono natomiast wpływu ekspresji genu GHRL na jakość mięsa brojlerów. Poziom ekspresji genu GHRL w większości badanych tkanek miał istotny dodatni wpływ na procentowy udział serca w ciele ptaków. Zaobserwowano również istotną dodatnią zależność pomiędzy poziomem transkryptu genu greliny w podwzgórzu, przysadce mózgowej i żołądku gruczołowym a masą ciała kurcząt grupy I. W grupie II korelacje te okazały się jednak nieistotne. 65

11 Zadanie Wykorzystanie parametrów z zakresu genetyki populacji oraz elementów genetyki molekularnej w doskonaleniu zwierząt gospodarskich Kierownik zadania: dr hab. Grzegorz Żak, prof. IZ PIB Celem zadania było doskonalenie metod hodowlanych, głównie z wykorzystaniem genetyki populacyjnej oraz elementów genetyki molekularnej dających możliwość poprawy produkcyjności i zdrowotności bydła i świń oraz jakości pozyskiwanych od nich produktów. Realizacji celu służyło wskazanie możliwości lepszego wykorzystywania w praktyce hodowlanej zarówno już istniejących, jak i nowo opracowanych metod. Materiał do badań stanowiły 2 gatunki zwierząt gospodarskich, tj. bydło i świnie. W zakresie badań prowadzonych na bydle materiałem były zbiory danych o krowach rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej, zawierające informacje o ich wydajnościach mlecznych, szybkości oddawania mleka i temperamencie, zgromadzone w systemie Symlek (tabela 2) oraz dane o buhajach rasy simentalskiej pochodzących po buhajach testowych poddawanych ocenie w Stacji Oceny Mięsnej Buhajów Simentalskich. Rezultatem przeprowadzonych badań dotyczących krów mlecznych było oszacowanie parametrów genetycznych, korelacji fenotypowych i genetycznych cech zdolności udojowej oraz ich (genomowej) wartości hodowlanej w populacji bydła rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej (tabela 1). Liczba krów w zbiorze wykorzystanym do analiz i obliczeń wynosiła szt. Tabela 1. Współczynniki odziedziczalności (h 2 ), korelacji genetycznej (r g ) i korelacji fenotypowej (r p ) cech zdolności udojowej Cecha Szybkość oddawania mleka h2 Szybkość oddawania mleka rg Temperament Szybkość oddawania mleka rp Temperament 0, Temperament 0,253 0,176-0,136 - Tabela 2. Charakterystyka wartości hodowlanej (WH) oraz dokładności jej oszacowania (ACC) dla buhajów pod względem cech zdolności udojowej Szybkość oddawania mleka Temperament WH ACC WH ACC N ,92 0,39 100,64 0,02 SD 18,83 0,11 21,78 0,01 CV(%) 18,66 27,03 21,65 46,91 MIN 36,17 0,07 41,09 0,01 MAX 152,44 0,55 181,95 0,04 ASYMPTOTA -0,20-1,25 0,33 0,51 KURTOZA 0,49 0,96 0,52-1,01 66

12 Efektem badań prowadzonych na bydle rasy simentalskiej było opracowanie metody polowej pozwalającej na przyżyciową ocenę wartości użytkowej i hodowlanej buhajów rasy simentalskiej w zakresie cech mięsnych na podstawie użytkowości własnej lub potomstwa. Materiałem doświadczalnym było 58 buhajów rasy simentalskiej opasanych w stacji testowej od 120. dnia życia do osiągnięcia masy ciała kg, poddawanych przyżyciowo kontroli zużycia paszy oraz pomiarom zoometrycznym, w tym z wykorzystaniem techniki USG. Po uboju określano masę tuszy, wydajność rzeźną, mięsność i otłuszczenie tuszy wg systemu EUROP. Po 24-godzinnym schłodzeniu przeprowadzono szczegółową dysekcję 5 podstawowych wyrębów tuszy na mięso, tłuszcz i kości. Na podstawie zebranego materiału obliczono współczynniki korelacji pomiędzy przyżyciowymi pomiarami grubości mięśnia wykonywanymi aparaturą USG, a wybranymi wskaźnikami użytkowości mięsnej. Posłużyły one do opracowania równania regresji dla określenia procentowego udziału mięsa w pięciu podstawowych wyrębach jako wskaźnika charakteryzującego mięsność zwierzęcia (Wskaźnik mięsności WM). Jako rozwiązanie polecane do szacowania Wskaźnika mięsności (WM) w praktyce wybrano wariant z dwoma zmiennymi niezależnymi USG i wydajnością rzeźną (WYDRZ). Wybrane równanie ma tę zaletę, że wszystkie dwie zmienne niezależne mają współczynniki regresji dodatnie, co przekłada się na preferowanie zwierząt o wyższych parametrach wybranych cech. Formuła równania ma postać: WM = x USG x WYDRZ W badaniach przeprowadzonych na świniach w obszarze genetyki populacyjnej określono stopień wykorzystania w stadach hodowlanych loszek oraz knurków ras wbp i pbz, charakteryzujących się wysoką zbiorczą wartością hodowlaną i możliwości doskonalenia jakości mięsa świń poprzez pracę hodowlaną oraz w obszarze genetyki molekularnej dokonano analizy asocjacji polimorfizmów sekwencji kodujących z cechami produkcyjnymi świń. Do analiz populacyjnych wykorzystano zbiory danych systemów SEPIT, Centralnej Bazy Internetowej Polskiego Związku Hodowców i Producentów Trzody Chlewnej POLSUS oraz wyniki oceny ze stacji kontroli świń. Zbadano, czy wyniki oceny knurów i loszek hodowlanych stanowią podstawę do przeprowadzenia selekcji w populacji aktywnej świń poprzez określenie stopnia wykorzystania w stadach hodowlanych loszek i knurów, charakteryzujących się wysoką zbiorczą wartością hodowlaną. Tabela 3. Różnica selekcyjna wartości hodowlanej w rasie świń pbz i wbp dla Zbiorczej Wartości Hodowlanej (ZWH) uzyskana i możliwa do uzyskania (przy wyborze 245 knurów pbz i 141 wbp z najwyższą wartością ZWH) Średnia wartość hodowlana w badanej populacji Średnia wartość hodowlana knurów wybranych na ojców Średnia wartość hodowlana możliwa do uzyskania Rasa pbz Zrealizowana różnica selekcyjna Możliwa do uzyskania różnica selekcyjna 10,19 10,54 11,83 0,35 1,64 Rasa wbp 10,25 10,64 12,07 0,39 1,82 67

13 Dokonano tego na podstawie obliczenia różnicy selekcyjnej jaka została zrealizowana z hipotetyczną różnicą, którą można by uzyskać pozostawiając na ojców następnego pokolenia zwierzęta najlepsze pod względem zbiorczej wartości hodowlanej (tabela 3). Analiza dokonana dla 4 cech użytkowych oraz wartości hodowlanych wykazała, że potencjalne możliwości genetyczne populacji aktywnej świń raz wbp i pbz są znacznie wyższe niż efekty jakie w rzeczywistości uzyskano w krajowej hodowli. Stwierdzono, że dla niektórych cech na podstawie wyników symulacji można uzyskać nawet 20-krotnie wyższe efekty doskonalenia genetycznego od uzyskanych. Analiza stopnia odziedziczalności cech jakości mięsa wykazała, że można je doskonalić poprzez prace hodowlane, gdyż współczynniki h 2 dla cech jakościowych mieściły się w przedziale od 0,19 do 0,57. W zakresie badań molekularnych wykorzystano wyniki z metody RNA-seq do poszukiwania genów kandydujących odpowiadających za profil histologiczny tkanki mięśniowej świń oraz procesy metaboliczne zachodzące w tkance mięśniowej, a co za tym idzie za jakość mięsa. Wykonano analizę sekwencjonowania RNA-seq transkrytpomu tkanki mięśniowej (m. longissimus lumborum) pochodzącej od 11 świń rasy wbp. Zwierzęta podzielono na dwie grupy charakteryzujące się skrajnymi wartościami procentowego udziału włókien typu IIB: I tkanka mięśniowa o zawartości włókien typu IIB do 70% (n=7) i II - grupa o wspomnianym odsetku włókien powyżej 70% (n=4). Ponadto, świnie należące do grupy I posiadały istotnie wyższą zawartość włókien typu I. Sekwencje uzyskane po sekwencjonowaniu RNA-seq zmapowano do genomu referencyjnego (Sscrofa ), a geny o różnicowej ekspresji zostały wytypowane przy użyciu pakietów: edger, bayseq oraz DESeq2. W kolejnym etapie wytypowana lokalizacja genów o istotnych różnicach w poziomie ekspresji DEGs (p<0,05; fold change FC <1,3) pomiędzy badanymi grupami świń została zestawiona z danymi z bazy pigqtl database przy użyciu dedykowanego oprogramowania w pakiecie R. Przy użyciu trzech pakietów (edger, bayseq, DESeq2) zidentyfikowano 355 genów o różnicowej ekspresji. Wytypowane geny, których poziom transkryptu był uzależniony od zawartości poszczególnych włókien mięśniowych zaangażowane były w procesy wzrostu i rozwoju komórek, w procesy metaboliczne oraz kodowały białka cytoszkieletowe. Analiza statystyczna GLM potwierdziła istotny związek trzech z czterech analizowanych genów (FOXO1, DESG1, TNNT2) z powierzchnią oka polędwicy i masą polędwicy (FOXO1), a także procentową zawartością mięsa w tuszu (FOXO1; TACC2). Ponadto, wykryto istotny (P <0,01) wpływ polimorfizmów w obrębie genów DESG1, TACC2 i TNNT2 na zawartość tłuszczu śródmięśniowego (tabela 4). Zastosowanie metody RNA-seq umożliwiło wytypowanie genów determinujących strukturę tkanki mięśniowej u świń - zawartość poszczególnych typów włókien oraz rozmiar komórek, które w dużym stopniu wpływają na zwartość tłuszczu śródmięśniowego oraz jakość uzyskiwanego mięsa. W wyniku realizacji zadania stwierdzono, że oszacowane współczynniki odziedziczalności cech zdolności udojowej (CZU) oraz korelacji genetycznej i fenotypowej między nimi wskazują na możliwość skutecznego doskonalenia populacji pod względem tej grupy parametrów. Otrzymane wyniki wskazują na występowanie w krajowej populacji bydła holsztyńsko- -fryzyjskiego pozytywnego trendu genetycznego, który polega na wzroście średniej wartości hodowlanej pod względem CZU w kolejnych latach urodzeń zwierząt. Wykazano możliwość rutynowego szacowania w krajowej populacji bydła holsztyńsko-fryzyjskiego (genomowej) wartości hodowlanej pod względem cech zdolności udojowej. Stwierdzono, że opracowany wskaźnik mięsności (WM) charakteryzujący wartość mięsną zwierzęcia może być wykorzystany w praktyce do oceny wartości użytkowej i hodowlanej buhajów simentalskich w zakresie cech mięsnych metodą polową. Wykazano, że istnieje możliwość uzyskania znacząco wyższej różnicy selekcyjnej w zakresie cech mierzonych przyżyciowo w stosunku do zrealizowanej różnicy 68

14 selekcyjnej w krajowej populacji aktywnej świń rasy pbz i wbp, a cechy jakości mięsa można doskonalić na drodze genetycznej. Badania molekularne pozwoliły na wytypowanie genów determinujących strukturę tkanki mięśniowej u świń i wytypowanie panelu genów kandydujących oraz mutacji w ich obrębie warunkujących cechy produkcyjne u świń, co może w praktyce być wykorzystywane przy tworzeniu panelu markerów SNP do przyspieszenia postępu hodowlanego i poprawy określonej grupy cech. Tabela 4. Asocjacja wykrytych polimorfizmów z cechami produkcyjnymi świń Waga polędwicy (kg) Powierzchnia oka polędwicy (cm) Zawartość mięsa w tuszy AA AG GG AA AG GG IMF AA AG GG L* AA AG GG a* AA AG GG b* AA AG GG FOXO1 DESG1 TACC2 TNNT2 LSM SE p ±0.03 ±0.04 ±0.10 ±0.26 ±0.54 ±0.12 ±0.14 ±0.23 ±0.04 ±0.02 ±0.03 ±0.11 ±0.12 ±0.21 ±0.45 ±0.08 ±0.14 ±0.38 ±0.10 ±0.18 ±.0.54 a a b b a ab b b a Genotyp AA AG GG Genotyp TT CT CC TT CT CC TT CT CC TT CT CC TT CT CC TT CT CC TT CT CC LSM SE p Genotyp 6.11 ±0.04 CC 6.03 ±0.03 CT 6.05 ±0.03 TT ±0.52 ±0.46 ±0.33 ±0.27 ±0.18 ±0.20 ±0.06 ±0.03 ±0.03 ±0.22 ±0.14 ±0.20 ±0.14 ±0.10 ±0.14 ±0.17 ±0.12 ±0.19 a a b B B A CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT LSM SE p Genotyp 6.06 ±0.08 TT 6.11 ±0.03 TC 6.02 ±0.03 CC ±0.84 ±0.42 ±0.32 ±0.38 ±0.19 ±0.17 ±0.09 ±0.03 ±0.03 ±0.51 ±0.16 ±0.13 ±0.06 ±0.12 ±0.09 ±0.40 ±0.14 ±0.12 b ab a A AB B a ab b TT TC CC TT TC CC TT TC CC TT TC CC TT TC CC TT TC CC LSM SE p ±0.02 ±0.07 ±0.27 ±0.25 ±0.87 ±3.10 ±0.13 ±0.35 ±0.78 ±0.02 ±0.08 ±0.31 ±0.11 ±0.30 ±0.96 ±0.08 ±0.20 ±0.73 ±0.10 ±0.19 ±1.37 ab a b C B A b b a IMF zawartość tłuszczu śródmięśniowego; barwa mięsa a*, b*, L*; p value a,b p<0.05; A,B,C p<0.01 Zadanie Poszukiwanie genetycznych mechanizmów zmienności u wysokoprodukcyjnych ras świń w zakresie cech użytkowych metodą RNA-SEQ Kierownik zadania: dr hab. Mirosław Tyra, prof. IZ PIB Celem badań jest poszukiwanie genetycznych mechanizmów warunkowania zmienności w zakresie cech użytkowych metodą RNA-seq u świń oraz ocena możliwości ich wykorzystania w praktyce hodowlanej. Zastosowanie nowej metody analitycznej (RNA-seq) umożliwi najbardziej obiektywne poznanie genetycznych podstaw warunkujących wybrane cechy użytkowe i może posłużyć do opracowania nowoczesnych metod hodowlanych. Wykorzystanie tego narzędzia w nowoczesnej hodowli to bardziej efektywny dobór osobników do kojarzeń oparty na markerach genetycznych znacznie przyspieszający postęp hodowlany w tym zakresie. To także nowoczesne narzędzie hodowlane w ręku POLSUS dające możliwości kreowania kierunków hodowlanych krajowej populacji zarodowej trzody chlewnej. 69

15 W okresie sprawozdawczym badania wykonano na materiale pochodzącym ze Stacji Kontroli Użytkowości Rzeźnej Trzody Chlewnej (SKURTCh). Materiał do badań stanowiły loszki ras wbp, pbz. Zwierzęta utrzymywane były w kojcach indywidualnych. Żywienie odbywało się w systemie ad libitum drobno granulowaną mieszanką o znanym i stałym składzie zadawaną z automatów. Ilość pobieranej paszy była ściśle kontrolowana. Pozostałe warunki utrzymania i postępowania ze zwierzętami były zgodne z dotychczasową metodyką oceny w stacjach kontroli. W okresie sprawozdawczym przekontrolowano 216 osobników wyżej wymienionych ras (60 szt. wbp i 156 szt. pbz). Łącznie dla tych dwu ras z dwu lat prowadzenia doświadczenia posiadamy w bazie 422 osobniki (126 szt. wbp i 296 szt. pbz). Dla całej grupy zwierząt skompletowano dane uzyskiwane w czasie tuczu kontrolnego i dysekcji (tab. 1-3). Tabela 1. DANE Z TUCZU: przyrost dzienny w teście (od 30 kg do 100 kg), zużycie paszy w czasie testu (kg), zużycie paszy na kilogram przyrostu (kg), dzienne pobranie paszy (kg), wiek w dniu uboju (dni), ilość dni tuczu kontrolnego od 30 do 100 kg (dni) Variable Mean Std Dev Std Err Var Minimum Maximum Przyrost Przyżyc. Pasz (kg) Pasz (dz) Wiek uboju Dni tuczu Pasz og Tabela 2. DANE Z DYSEKCJI (cechy umięśnienia): wydajność rzeźna (%), masa polędwicy (kg), masa szynki zadniej (kg), masa szynki właściwej (kg), grubość mięśnia najdłuższego grzbietu (cm), szerokość oka polędwicy (cm), wysokość oka polędwicy (cm), powierzchnia oka polędwicy po planimetrowaniu obrysu (cm2), procent mięsa w wyrębach podstawowych (%), procent mięsa w tuszy (%), masy mięsa wyrębów podstawowych (kg), średnia grubość słoniny z 5 pomiarów (cm) X1 X3 X9 X11 X18 X23 X27 X30 MWP Var Mean Std Dev Std Err Variation Minimum Maximum Tabela 3. DANE O JAKOŚCI MIĘSA (dotyczące pomiarów): odczynu ph najdłuższego grzbietu 45 min. po uboju, odczynu ph najdłuższego grzbietu 24 godz. po uboju, wodochłonność mięsa, barwy mięsa parametr L, a i b, zawartości tłuszczu śródmięśniowego w polędwicy IMF (%) 70 Var Mean Std Dev Std Err Var Minimum Maximum IMF WOD ML MA MB PHPOL45 PHPOL24 PHSZYN45 PHSZYN

16 Licznie zgromadzony materiał odnośnie rasy pbz pozwolił na wytypowania grup zwierząt zróżnicowanych pod względem następujących użytkowości: średniej grubości słoniny z 5 pomiarów, masy polędwicy bez słoniny i skóry oraz zużycia paszy na kilogram przyrostu. Cechy te powiązane były z gromadzonym materiałem biologicznym (odpowiednio tłuszczem podskórnym, próbkami mięśnia najdłuższego grzbietu, pod-wzgórze), który poddany został analizom genetycznym. W ramach tych analiz dokonano izolacji RNA i jego oceny ilościowej i jakościowej. Następnie przygotowano biblioteki cdna, które także zostały poddane ocenie ilościowej i jakościowej. Pobrany materiał biologiczny został poddany analizie metodą RNA- -SEQ. Zadanie Wpływ ekspresji genów FADS1, FADS2, ELOVL2 i ELOVL5 na jakość mięsa kurcząt brojlerów w zależności od sposobu żywienia i długości stosowania mieszanek paszowych wzbogaconych w wielonienasycone kwasy tłuszczowe Kierownik zadania: dr inż. Joanna Nowak Celem zadania było określenie związku między oznaczonym poziomem transkryptu dla genów kodujących wybrane elongazy (ELOVL2 i ELOVL5) i desaturazy (FADS1 i FADS2) kwasów tłuszczowych a profilem kwasów tłuszczowych oraz jakością mięsa kurcząt w zależności od sposobu żywienia i długości stosowania mieszanek paszowych wzbogaconych w wielonienasycone kwasy tłuszczowe. W ramach zadania oceniano jakość tuszki i mięsa kurcząt brojlerów w zależności od sposobu żywienia i długości podawania mieszanek paszowych wzbogaconych w wielonienasycone kwasy tłuszczowe. Materiał doświadczalny stanowiły kurczęta brojlery linii Ross308 (n=800). Pisklęta zostały wylężone w komercyjnym zakładzie wylęgu drobiu z jaj pozyskanych z wybranej fermy rodzicielskiej. Jednodniowe seksowane i oznaczonych indywidualnymi numerami pisklęta (kogutki) przydzielono losowo do czterech grup żywieniowych (n=200). Ptaki umieszczono w przedziałach na głębokiej ściółce i odchowano w optymalnych warunkach środowiskowych do 42. dnia życia. We wszystkich grupach kurczęta żywiono do woli pełnoporcjowymi mieszankami paszowymi starter, grower i finiszer o takiej samej recepturze, ale różniącymi się źródłem tłuszczu. W mieszankach dla kurcząt grupy I źródłem tłuszczu był wyłącznie łój wołowy, natomiast ptaki z grupy II, III i IV od 15. dnia życia żywiono mieszankami wzbogaconymi w wielonienasycone kwasy tłuszczowe z rodziny n-3 pochodzące z oleju lnianego (tab.1). Grupa II otrzymywała mieszanki z olejem lnianym przez 2 tygodnie, grupa III 71

17 przez 3 tygodnie, a grupa IV przez 4 tygodnie odchowu. Poza tym czasem kurczęta z grup 2-3 żywiono tak jak ptaki z grupy I. Uboje kurcząt przeprowadzono wg harmonogramu podanego w tabeli 1. Podczas ubojów zabezpieczono próbki krwi i tkanek do analiz, które zostaną wykonane w kolejnych etapach zadania. Tabela 1. Harmonogram żywienia kurcząt dni GRUPA I II III IV łój wołowy 10 ubój (szt.) łój wołowy olej lniany olej lniany olej lniany łój wołowy olej lniany olej lniany olej lniany łój wołowy łój wołowy olej lniany olej lniany łój wołowy łój wołowy łój wołowy olej lniany 10 (I) +10 (II+III+IV) 10 (I) +10 (II+III+IV) 10 (I) +10 (II) +10 (III+IV) 10 z każdej grupy Do oceny jakości tuszki i mięsa wybrano 35- i 42-dniowe kurczęta. W 15. minucie po uboju określono kwasowość mięśni piersiowych przy pomocy ph-metru CyberScan10 wyposażonego w szklaną elektrodę do badania ph mięsa. Pomiar kwasowości mięsa powtórzono po 24 godzinnym schłodzeniu tuszek w temperaturze +4 C. Przeprowadzono analizę rzeźną kurcząt. Wypreparowane mięśnie piersiowe oceniono pod względem: barwy (CIE, L*a*b*), wycieku swobodnego (24h i 48h), strat po rozmrożeniu i strat termicznych. Ponadto mięśnie piersiowe kurcząt poddano ocenie parametrów tekstury (TPA) i siły cięcia (Warner-Bratzler) przy pomocy aparatu Instron Uzyskane wyniki zweryfikowano statystycznie przy pomocy 1-czynnikowej analizy wariancji. W opracowaniu wyników uwzględniono średnie arytmetyczne, standardowy błąd pomiaru (SEM). Istotność różnic pomiędzy średnimi ustalono testem Duncana. Do obliczeń statystycznych wykorzystano program Statistica 13. Stwierdzono, że 35-dniowe kurczęta należące do grupy I i II różniły się istotnie końcową masą ciała, a korzystniejszy wynik uzyskały ptaki, które przez cały okres odchowu były żywione paszą z dodatkiem łoju wołowego (tab. 2). Ponadto ptaki te charakteryzowały się istotnie większą masą mięśni piersiowych (P 0,05) oraz wyższym udziałem tych mięśni w tuszce (P 0,01), w porównaniu do kurcząt z grupy III. Najniższe otłuszczenie tuszki stwierdzono w przypadku kurcząt otrzymujących paszę z dodatkiem tłuszczu zwierzęcego w zestawieniu z kurczętami, które żywione były również paszą z dodatkiem oleju lnianego (gr. II i III). Nie stwierdzono wpływu żywienia na wydajność rzeźną kurcząt oraz udział mięśni nóg i podrobów w tuszce. 72

18 Tabela 2. Masa ciała oraz wyniki analizy rzeźnej kurcząt brojlerów 35-dniowe Cecha Grupa I II III SEM Masa ciała (kg) 2,57 a 2,54 b 2,55 0,01 Straty masy tuszki (%) 1,42 1,39 1,48 0,04 Wydajność rzeźna z podrobami (%) 78,23 78,17 78,14 0,30 Wydajność rzeźna bez podrobów (%) 74,97 74,91 74,94 0,30 Mięśnie piersiowe (%) 31,35 a 30,31 29,83 b 0,25 Mięśnie piersiowe (g) 630,76 Aa 602,00 b 593,82 B 5,54 Mięśnie nóg (%) 19,99 19,54 19,50 0,21 Mięśnie nóg (g) 402,18 388,00 388,04 4,21 Podroby (%): 4,16 4,17 4,10 0,06 - wątroba (%) 2,50 2,52 2,50 0,04 - żołądek mięśniowy (%) 1,06 1,06 1,01 0,04 - serce (%) 0,60 0,59 0,59 0,01 Tłuszcz (%) 0,94 A 1,49 B 1,38 B 0,07 Tłuszcz (g) 18,85 A 29,77 B 27,60 B 1,50 Średnie w wierszach oznaczone różnymi literami a,b różnią się przy P 0,05; A,B przy P 0,01. Kurczęta ubite w 35. dniu życia różniły się pod względem niektórych fizykochemicznych cech mięsa (tab. 3). Mięśnie piersiowe brojlerów żywionych przez 3 tygodnie paszą z dodatkiem oleju lnianego (gr. III) charakteryzowały się mniejszymi stratami wody, potwierdzonymi statystycznie w przypadku wycieku mierzonego po 24 i 48 h, w porównaniu do mięśni kurcząt I i II grupy (P 0,05) oraz w przypadku strat na skutek mrożenia w zestawieniu z grupą I (P 0,05). Omawiane mięśnie różniły się także barwą, a zwłaszcza nasyceniem żółci. Niższą wartość wskaźnika b* stwierdzono w grupie III w porównaniu z grupą II (P 0,05). Również w grupie III odnotowano nieistotnie wyższą wartość a* (nasycenie czerwieni) oraz tendencję do nieznacznie niższej wartości wskaźnika L* (jasność). Dodatkowo mięśnie piersiowe kurcząt grupy III charakteryzowały się istotnie mniejszą sprężystością, w porównaniu z mięśniami kurcząt I grupy (P 0,05). Tabela 3. Jakość mięśni piersiowych kurcząt brojlerów 35-dniowe Cecha Grupa I II III SEM ph 15min 6,41 6,39 6,38 0,02 ph 24h 5,86 5,89 5,87 0,02 L* 56,62 56,02 55,79 0,28 a* 10,40 10,85 11,21 0,17 b* 9,60 10,13 a 9,32 b 0,17 Wyciek swobodny 24h (%) 1,07 a 1,08 a 0,76 b 0,06 Wyciek swobodny 48h (%) 1,92 a 1,82 a 1,35 b 0,09 Straty termiczne (%) 24,44 22,90 22,50 0,43 Straty po rozmrożeniu (%) 5,64 a 4,41 3,41 b 0,40 Siła cięcia (N) 16,69 17,78 16,52 0,72 Twardość (N) 24,75 26,94 26,96 0,74 Sprężystość (mm) 5,32 a 4,81 3,70 b 0,33 Gumowatość (N) 7,88 8,39 8,98 0,27 Żujność (mj) 41,49 40,62 33,87 2,89 Średnie w wierszach oznaczone różnymi literami a,b różnią się przy P 0,05. 73

19 Wyniki dotyczące 42-dniowych kurcząt wskazują, że im dłużej kurczęta były żywione mieszankami paszowymi z dodatkiem oleju lnianego, tym ich końcowa masa ciała była niższa (tab. 4). Najkorzystniejszy wynik uzyskały ptaki, które przez cały okres odchowu były żywione paszą z dodatkiem łoju wołowego (gr. I). Największą masą mięśni charakteryzowały się kurczęta z grupy I, a najniższą kurczęta z grupy IV w przypadku mięśni nóg (P 0,05) oraz z grupy III i IV ze względu na umięśnienie części piersiowej (P 0,01). Kurczęta, które najdłużej otrzymywały paszę z dodatkiem oleju lnianego (gr. IV) charakteryzowały się istotnie wyższym udziałem wątroby w tuszce, w porównaniu do pozostałych dwóch grup, otrzymujących również paszę z takim samym dodatkiem tłuszczu, tylko przez krótszy okres czasu (gr. II i III). Ponadto najwyższe otłuszczenie tuszki stwierdzono w przypadku kurcząt otrzymujących przez 2 tygodnie paszę z dodatkiem tłuszczu roślinnego (gr. II), w zestawieniu z kurczętami, które żywione były jedynie paszą z dodatkiem tłuszczu zwierzęcego (gr. I). Nie stwierdzono wpływu żywienia na wydajność rzeźną kurcząt oraz udział mięśni nóg, żołądka i serca w tuszce. Tabela 4. Masa ciała oraz wyniki analizy rzeźnej kurcząt brojlerów 42-dniowe Cecha Grupa I II III IV SEM Masa ciała (kg) 3,55 A 3,48 Ba 3,44 Bb 3,37 C 0,01 Straty masy tuszki (%) 1,50 1,47 1,48 1,57 0,05 Wydajność rzeźna z podrobami (%) 79,62 80,85 79,64 80,26 0,23 Wydajność rzeźna bez podrobów (%) 76,83 77,94 76,65 77,64 0,24 Mięśnie piersiowe (%) 32,25 a 31,39 30,39 b 31,00 0,28 Mięśnie piersiowe (g) 910,6 A 882,8 a 832,7 Bb 839,2 B 9,24 Mięśnie nóg (%) 20,94 20,15 20,99 20,21 0,24 Mięśnie nóg (g) 591,66 a 567,18 574,82 546,58 b 7,30 Podroby (%): 3,51 3,60 a 3,76 A 3,27 Bb 0,06 - wątroba (%) 2,19 2,22 a 2,36 A 1,95 Bb 0,05 - żołądek mięśniowy (%) 0,76 0,83 0,87 0,78 0,02 - serce (%) 0,56 0,55 0,53 0,55 0,01 Tłuszcz (%) 1,10 a 1,58 b 1,34 1,48 b 0,07 Tłuszcz (g) 31,14 A 44,40 B 36,73 39,98 1,88 Średnie w wierszach oznaczone różnymi literami a,b różnią się przy P 0,05; A,B przy P 0,01. Kurczęta ubite w 42. dniu życia różniły się pod względem niektórych fizykochemicznych cech mięsa (tab. 5). Mięśnie kurcząt żywionych 4 tygodnie paszą z olejem lnianym (gr. IV) charakteryzowały się istotnie wyższym ph początkowym niż mięśnie kurcząt grupy III oraz wyższym ph końcowym, w porównaniu do mięśni ptaków pozostałych grup (P 0,01). Równocześnie mięśnie piersiowe kurcząt grupy IV były bardziej kruche oraz charakteryzowały się mniejszym wyciekiem chłodniczym (24 i 48 h) w porównaniu do pozostałych kurcząt (P 0,01) oraz mniejszymi stratami: termicznymi i po mrożeniu w zestawieniu z mięśniami kurcząt grupy I (P 0,05). Stwierdzono także różnice w barwie mięsa badanych kurcząt. Mniejszym nasyceniem żółci (b*) oraz ciemniejszą barwą (L*) cechowały się mięśnie kurcząt grupy IV, w porównaniu odpowiednio z kurczętami grupy I i II (P 0,05). 74

20 Tabela 5. Jakość mięśni piersiowych kurcząt brojlerów 42-dniowe Cecha Grupa I II III IV ph 15min 6,29 6,32 6,22 A 6,39 B 0,02 ph 24h 5,82 A 5,83 A 5,81 A 5,95 B 0,02 L* 58,39 59,39 a 58,60 57,22 b 0,35 a* 11,25 a 10,35 10,81 10,07 b 0,20 b* 9,97 10,03 9,85 9,88 0,16 Wyciek swobodny 24h (%) 1,22 A 1,10 A 1,33 A 0,60 B 0,08 Wyciek swobodny 48h (%) 2,33 A 2,12 A 2,31 A 1,33 B 0,12 Straty termiczne (%) 26,15 a 23,93 25,69 21,94 b 0,72 Straty po rozmrożeniu (%) 3,77 a 2,74 2,91 2,46 b 0,21 Siła cięcia (N) 14,98 A 15,06 A 15,68 A 12,66 B 0,34 Twardość (N) 29,15 25,14 29,34 25,18 1,07 Sprężystość (mm) 6,65 6,63 6,67 6,56 0,03 Gumowatość (N) 9,38 7,88 9,57 7,82 0,39 Żujność (mj) 62,12 52,16 63,92 51,33 2,62 Średnie w wierszach oznaczone różnymi literami a,b różnią się przy P 0,05; A,B przy P 0,01. W dalszych etapach zostanie określony wpływ sposobu żywienia i długości stosowania mieszanki paszowej wzbogaconej w wielonienasycone kwasy tłuszczowe na wskaźniki lipidowe krwi oraz profil jedno i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w mięsie kurcząt. Ponadto zostanie określony poziom ekspresji genów kodujących delta-5 i delta-6 desaturazę kwasów tłuszczowych (FADS1 i FADS2) oraz elongazę 2 i 5 kwasów tłuszczowych (ELOVL2 i ELOVL5) w wątrobie i mięśniach piersiowych kurcząt. SEM Zadanie Poszukiwania markerów genetycznych i fenotypowych mających wpływ na poprawę wartości hodowlanej i użytkowej świń Kierownik zadania: dr inż. Magdalena Szyndler-Nędza Celem naukowym i praktycznym zadania jest określenie genetycznych, jak również fenotypowych markerów wczesnego szacowania potencjału rozrodczego i matczynego loch oraz określenie ich wpływu na cechy użytkowe świń. Cel ten realizowany jest w dwóch celach szczegółowych. W pierwszym celu, obejmującym poszukiwanie markerów genetycznych i fenotypowych wczesnego szacowania potencjału rozrodczego loch, analizowany jest wpływ wybranych polimorfizmów genów związanych z budową i funkcjonowaniem układu rozrodczego na parametry morfometryczne układu rozrodczego loszek i loch i na wyniki ich użytkowości rozpłodowej. Drugi cel obejmuje poszukiwanie polimorfizmów w genach związanych z syntezą mleka, a także mogących wpływać na poziom laktozy w siarze i mleku oraz określenie ich wpływu na cechy użytkowe tych loch. Badania prowadzone są dla loch ras matecznych i zachowawczych pochodzące z ferm zarodowych i produkcyjnych. 75

21 Dane do analiz statystycznych (w zależności od celu szczegółowego zadania) są zbierane na podstawie: - pomiarów długości pochwy przy inseminacji, - pomiarów morfometrycznych układu rozrodczego loch, - cech użytkowości rozpłodowej loch, - zidentyfikowanego polimorfizmu wybranych genów. Pobierany materiał biologiczny stanowić będzie: - krew lub cebulki włosa do analiz polimorfizmów badanych genów, - tkanki jajnika, jajowodu oraz rogu macicy. Analizy laboratoryjne: - identyfikacja nowych zmian polimorficznych obrębie genów HoxA z wykorzystaniem urządzenia Eco Real Time PCR System (Illumina) i sekwenatora Backema Coulter, - detekcja zmian polimorficznych w obrębie wybranych genów w reakcji PCR-RFLP, - oszacowanie poziomu ekspresji wybranych genów metodą Real-Time PCR. Analizę statystyczną uzyskanych wyników wykonano przy pomocy programów statystycznych SAS i Statistica. W ramach pierwszego celu szczegółowego w okresie sprawozdawczym pobrano materiał biologiczny (szczecina z mieszkami włosowymi) od 490 szt. loch raz pbz, wbp, F1, Danbred Landrace, Danbred Yorkshire, złotnicka biała, złotnicka pstra oraz rozpoczęto pomiary długości pochwy (VCL) u 210 loszek przy pierwszym kryciu. W wyniku przeprowadzonych badań zidentyfikowano 4 nowe zmiany polimorficzne w genie HOXA10: g c>a, g _ delinscc, g c>g oraz g g>a. Mutacja w obrębie genu HOXA11 została zidentyfikowana w wyniku wcześniej prowadzonych badań. W tabeli 2 przedstawiono wstępne analizy dotyczące frekwencji genotypów i alleli nowo zidentyfikowanych polimorfizmów genu HOXA10 oraz dla genu HOXA11 g.3786a>g. Dla jednej z badanych mutacji (g _ delinscc) stwierdzono występowanie tylko dwóch genotypów. Dla mutacji w locus g c>a, g g>a i g.3786a>g częstotliwość występowania genotypów odpowiednio AA i AC, AA i AG oraz GG i AG była zbliżona (odpowiednio: 0,41 i 0,48; 0,49 i 0,44 oraz 0,39 i 0,41). W przypadku g _ delinscc i g c>g najczęściej występowały homozygoty odpowiednio del/del (0,71) i GG (0,66). Tabela 1. Frekwencja genotypów i alleli genów HOXA10 i HOXA11 Locus Genotype Allele HOXA10 g c>a HOXA10 g _ delinscc HOXA10 g c>g HOXA10 g g>a HOXA11 g.3786a>g AA AC CC A C 0,41 0,48 0,11 0,65 0,35 del/del del/ins ins/ins del ins 0,71 0,29-0,85 0,15 GG GC CC G C 0,66 0,31 0,03 0,81 0,19 AA AG GG A G 0,49 0,44 0,07 0,71 0,29 GG AG AA G A 0,39 0,41 0,20 0,59 0,41 76

22 W ramach poszukiwań polimorfizmu w genach związanych z laktogenezą świń (cel drugi), na zgromadzonym materiale biologicznym (123 próbki krwi pozyskane od 58 loch rasy wbp i 65 loch rasy pbz) w toku wcześniejszych badań (temat statut ) oznaczano polimorfizm genu hormonu wzrostu GH ( polimorfizm G316A FokI ) zgodnie z metodyką da Faria (2006) i przeprowadzono poszukiwania polimorfizmów w genach: beta 1,4-galaktozylotransferaza-I (B4GALT1), który pełni funkcje w zapłodnienia, rozwoju i laktacji świń oraz genu receptora insuliny (INSR), którego ekspresja w gruczole mlekowym w czasie laktacji nie ulega zmianom. W efekcie prowadzonych prac w locus genu GH potwierdzono obecność badanej mutacji, tj. polimorfizm G>A identyfikowany enzymem FokI. Sekwencjonowanie genu B4GALT1 na chromosomie 10 pozwoliło na zidentyfikowanie enzymem BsmFI zmianę polimorficzną A>G zlokalizowaną w regionie 3 UTR wariant (rs ). W genie INSR zlokalizowanym na chromosomie 2 wykryto mutację C>T (rs ) w regionie 3 UTR, którą identyfikowano enzymem XmnI. Frekwencję genotypów i alleli oznaczonych polimorfizmów genów oraz P-value zgodnie z prawem Hardy ego-weinberga przedstawiono w tabeli 2. Tabela 2. Frekwencja genotypów i alleli genów GH, BGATL1, INSR u loch ras wbp i pbz WBP Liczba Liczba Frekwencja loch H-W Frekwencja loch p- Gen genotyp n genotypu alleli value n genotypu alleli PBZ H-W p- value GH FokI B4GATL1 INSR AA 3 5,26 A 25,44 6 9,23 A 33,85 ns AG 23 40,35 ns 32 49,23 GG 31 54,39 G 74, ,54 G 66,15 AA 17 29,31 A 54,31 ns 9 14,06 A 47,00 ns AG 29 50, ,31 GG 12 20,69 G 45, ,63 G 53,00 CC 3 5,17 C 45,69 0, ,31 C 74,62 ns CT 47 81, ,62 TT 8 13,79 T 54,31 2 3,08 T 25,38 Ponadto na podstawie posiadanych danych (masy ciała prosiąt w dniu urodzenia i w 21. dniu ich życia) oszacowano dodatkowy wskaźnik określający parametry reprodukcyjne loch, tj. wydajność mleczną. Wiadomym jest, że wydajność mleczna loch jest zależna przede wszystkim od ilości ssących lochę prosiąt. W związku z tym analizowane mioty loch podzielono na 4 grupy, w zależności od liczby prosiąt urodzonych (n) (gr 1 = 5 n 7; grupa 2 = 8 n 10, grupa 3 = 11 n 12, grupa 4=13 n 14). Przeprowadzono podstawową analizę statystyczną dla wydajności mlecznej loch. Przeanalizowano również wpływ rasy na wydajność loch stwierdzając, że lochy ras wbp i pbz cechują się podobną wydajnością mleczną (brak statystycznie istotnych różnic). Określono też zmienność wydajności mlecznej loch w zależności od kolejnej laktacji i liczby prosiąt urodzonych (wykres 1). 77

23 Wykres 1. Wydajność mleczna loch ras matecznych w kolejnych 3 laktacjach z uwzględnieniem liczby prosiąt urodzonych w miocie. Kolumny w obrębie liczby prosiąt oznaczone różnymi literami różnią sie statystycznie istotnie przy P 0,05) Analiza uzyskanych wyników dała podstawę do przygotowania bazy danych do dalszych analiz dotyczących wydajności mlecznej loch. Utworzona baza zawiera informacje o użytkowości 112 loch ras matecznych (55 loch wbp i 57 loch pbz) będących w drugiej laktacji, które urodziły 11 i więcej prosiąt w miocie. Zebrane dane poddano analizie statystycznej w celu określenia wpływu zidentyfikowanych polimorfizmów genów na wydajność mleczną loch (wyd. ml.). Przeprowadzono również wstępne analizy określające wpływ polimorfizmów genów na skład siary i mleka loch, a także wyniki odchowu prosiąt. Zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji, gdzie gen był efektem głównym, a rasa efektem losowym. W przypadku wydajności mlecznej stwierdzono, że osobniki o genotypie GH AG, B4GATL1 GG i INSR CC produkowały więcej mleka w czasie laktacji, jednak różnice pomiędzy genotypami nie zostały potwierdzone statystycznie. Polimorfizm w locus genu GH miał wpływ jedynie na zawartość tłuszczu i suchej masy w mleku w 7. dniu laktacji oraz w mleku z całej laktacji. Osobniki o genotypie GH GG, w porównaniu do osobników o genotypie AA, cechowały się istotnie większą zawartością tych składników. Nie znalazło to jednak bezpośredniego przełożenia na wyniki odchowu prosiąt. Polimorfizm w genie B4GATL1 miał istotny wpływ na zawartość laktozy i wyniki odchowu prosiąt w czasie 21-dniowej laktacji. Lochy o genotypie B4GATL1 GG, w porównaniu do loch o genotypie AA, produkowały w kolejnych dniach laktacji siarę i mleko istotnie uboższe w laktozę i odchowały prosięta o istotnie wyższej masie ciała w 21. dniu życia. Podobny efekt jak dla mutacji w genie B4GATL1, stwierdzono dla polimorfizmu w genie INSR. Lochy posiadające w swym genotypie allel C genu INSR (INSR CC i INSR CT ) w porównaniu do osobników o genotypie INSR TT produkowały w 7. i 14. dniu laktacji mleko o istotnie mniejszej zawartości laktozy i odchowały prosięta o istotnie większej masie ciała w 21. dniu życia. W roku 2017 w ramach zadania pobrano materiał biologiczny (szczecina z mieszkami włosowymi) od 490 szt. loch raz pbz, wbp, F1, Danbred Landrace, Danbred Yorkshire, złotnicka biała, złotnicka pstra oraz rozpoczęto pomiary długości pochwy (VCL) u 210 loszek przy pierwszym i kolejnym kryciu. Zebrany materiał biologiczny stanowił podstawę do sekwencjonowania w celu identyfikacji zmian polimorficznych. Zidentyfikowano 4 nowe zmiany polimorficzne w genie HOXA10: g c>a, g _ delinscc, g c>g 78

24 oraz g g>a. Przeprowadzono analizę frekwencji zidentyfikowanych polimorfizmów genów HOXA10, oraz polimorfizmu w genie HOXA11: g.3786a>g. W efekcie prowadzonych prac związanych z laktogenezą świń potwierdzono obecność badanej mutacji w locus genu GH tj polimorfizm G>A identyfikowany enzymem FokI. Zidentyfikowano enzymem BsmfI zmianę polimorficzną w genie B4GALT1 A>G zlokalizowaną w regionie 3 UTR wariant (rs ). W genie INSR zlokalizowanym na chromosomie 2, wykryto mutację C>T (rs ) w regionie 3 UTR, którą identyfikowano enzymem XmnI. Ponadto na podstawie posiadanych danych (masy ciała prosiąt w dniu urodzenia i w 21. dniu ich życia) oszacowano dodatkowy wskaźnik określający parametry reprodukcyjne loch, tj. wydajność mleczną. Zebrane dane poddano wstępnej analizie statystycznej w celu określenia wpływu zidentyfikowanych polimorfizmów genów na wydajność mleczną loch oraz na skład produkowanej przez nie siary i mleka, a także wyniki odchowu prosiąt. OBSZAR TEMATYCZNY 2 ROZWÓJ METOD BIOTECHNOLOGII ROZRODU SAMCÓW I SAMIC ZWIERZĄT GOSPODARSKICH Zadanie Klonowanie somatyczne kóz w układzie heterologicznym koza-bydło oraz koza-świnia Kierownik zadania: prof. dr hab. Maria Skrzyszowska Celem zadania było opracowanie metod międzygatunkowego klonowania somatycznego kóz w układzie międzyrodzajowym i wewnątrzrodzinowym: koza bydło (Cel szczegółowy I) oraz w układzie międzyrodzajowym i międzyrodzinowym: koza świnia (Cel szczegółowy II). Efektywność tych metod była oceniana w oparciu o potencjał rozwojowy in vitro, jakość oraz profil ekspresji wybranych genów totipotencji/pluripotencji hybrydowych (kozio bydlęcych lub kozio świńskich) zarodków klonalnych. Źródłem komórek-dawców jąder w procedurze międzyrodzajowego (wewnątrz- i międzyrodzinowego) klonowania somatycznego kóz były niemodulowane i modulowane epigenetycznie komórki fibroblasto-podobne wyizolowane z krwi obwodowej koźląt. Do klonowania wykorzystano komórki hodowane in vitro do stadium pełnej konfluencji (synchronizacja cyklu mitotycznego w fazach G1/G0 poprzez inhibicję kontaktową). Źródłem komórek-biorców dla jąder komórek fibroblastycznych kozy były oocyty bydlęce (Cel szczegółowy I klonowanie wewnątrzrodzinowe) lub oocyty świni (Cel szczegółowy II klonowanie międzyrodzinowe), które dojrzałość mejotyczną osiągnęły w warunkach pozaustrojowych. W grupie kontrolnej (klonowanie wewnątrzgatunkowe) źródłem komórek-biorców jąder były dojrzałe in vitro oocyty kozy (Cel szczegółowy I) lub oocyty świni (Cel szczegółowy II). W trzecim etapie realizacji Celu szczegółowego I do dojrzewania pozaustrojowego pozyskano 164 oocyty bydlęce, spośród których 87 (53,0%) osiągnęło stadium metafazy II podziału mejotycznego (MII). Do klonowania wyselekcjonowano 63/87 (72,4%) oocytów. 79

25 Po enukleacji i rekonstrukcji, do hodowli in vitro przeznaczono 58/63 (92,1%) zrekonstruowanych oocytów. Aktywność podziałowa hybrydowych zarodków klonalnych kształtowała się na poziomie 52/58 (89,6%). Do stadium moruli i blastocysty rozwinęło się odpowiednio: 34/58 (58,6%) i 7/58 (12,1%) zarodków uzyskanych techniką międzygatunkowego klonowania w układzie: koza bydło. Do dojrzewania ex vivo pozyskano także 91 oocytów kozy, spośród których 79 (86,8%) oocytów w stadium MII wyselekcjonowano do klonowania. Do hodowli in vitro przeznaczono 79/79 (100,0%) zrekonstruowanych oocytów. Aktywność mitotyczna zarodków klonalnych wyniosła 67/79 (84,8%), w tym do stadium moruli rozwinęło się 48/79 (60,7%) zarodków, a do stadium blastocysty 20/79 (25,3%) zarodków uzyskanych techniką wewnątrzgatunkowego klonowania w układzie: koza koza. Pulę 10 kozio bydlęcych i 10 kozich blastocyst klonalnych poddano analizie cytologicznej metodą TUNEL w celu określenia całkowitej liczby komórek w zarodkach oraz oszacowania liczby TUNEL-pozytywnych komórek (późnoapoptotycznych), co umożliwiło określenie indeksu apoptotycznego. W kozio bydlęcych blastocystach klonalnych, średnia liczba komórek wynosiła 38,4, a średnia liczba komórek poźnoapoptotycznych 6,2 (indeks apoptotyczny 16,15%). Z kolei w kozich blastocystach klonalnych, średnia liczba komórek wynosiła 56,6, a średnia liczba komórek poźnoapoptotycznych 3,1 (indeks apoptotyczny 5,48%). Ponadto, pozostałe kozio bydlęce i kozie blastocysty oraz morule z objawami kawitacji poddano analizie ilościowego profilu ekspresji genów warunkujących pluripotencję (Sox2, Oct4, Klf4, Nanog) przy wykorzystaniu metody real-time PCR (Ryciny 1A i 1B). Ocenę jakości molekularnej zarodków klonalnych przeprowadzono we współpracy z zespołem badawczym Zakładu Biologii Molekularnej Zwierząt IZ PIB. Rycina 1. Porównanie molekularnej jakości wewnątrzgatunkowych (kozich) i międzygatunkowych (kozio bydlęcych) zarodków klonalnych na podstawie oceny profilu ekspresji genów Sox2 i Oct4 (A) oraz Klf4 i Nanog (B) K: kozie zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów kozy i z jąder komórek fibroblastycznych kozy; KB: kozio bydlęce zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów bydła i z jąder komórek fibroblastycznych kozy. W trzecim etapie realizacji Celu szczegółowego II uzyskiwano kozio-świńskie zarodki klonalne w wyniku zastosowania techniki międzygatunkowego klonowania somatycznego w układzie międzyrodzajowym i międzyrodzinowym (koza świnia) z wykorzystaniem enukleowanych oocytów świni jako biorców jąder krwiopochodnych komórek fibroblastycznych kozy, poddanych skryptaido (SCPT) - zależnej modulacji epigenetycznej. Oceniano także molekularną jakość kozio świńskich zarodków klonalnych na podstawie ilościowej analizy stopnia ak- 80

26 tywności transkrypcyjnej genów determinujących totipotencję/pluripotencję (Sox2, Oct4, Klf4 i Nanog) przy wykorzystaniu metody real-time PCR. Ponadto, przedmiotem badań było porównanie potencjału rozwojowego in vitro (Tabela) oraz molekularnej jakości międzygatunkowych (kozio świńskich) zarodków klonalnych oraz wewnątrzgatunkowych (świńskich) zarodków klonalnych. Wyniki obejmujące analizę porównawczą molekularnej jakości kozio świńskich i świńskich zarodków klonalnych (Ryciny 2A i 2B) oraz analizę porównawczą molekularnej jakości kozio świńskich i kozio bydlęcych zarodków klonalnych (Ryciny 3A i 3B) zostały przedstawione w postaci diagramów słupkowych uwzględniających profile aktywności transkrypcyjnej genów Sox2, Oct4, Klf4 i Nanog. Tabela. 1 Porównanie potencjału rozwojowego in vitro międzygatunkowych (kozio świńskich) i wewnątrzgatunkowych (świńskich) zarodków klonalnych Rodzaj zarodków klonalnych Modulacja epigenetyczna komórekdawców jąder Liczba rekonstytuowanych oocytów świni Liczba hodowanych zarodków klonalnych (%) Liczba dzielących się zarodków (%) Liczba morul (%) Liczba blastocyst (%) Międzygatunkowe (kozio świńskie) Wewnątrzgatunkowe (świńskie) Wewnątrzgatunkowe (świńskie) Rodzaj zarodków klonalnych Międzygatunkowe (kozio świńskie) Wewnątrzgatunkowe (świńskie) Wewnątrzgatunkowe (świńskie) / /231 62/231 26/231 (91,3) a (74,5) Ab (26,8) A (11,3) A / / /148 52/148 (93,7) a (93,9) Bc (70,3) B (35,1) B _ / /134 69/134 32/134 (92,4) a (83,6) a (51,5) C (23,9) D Modulacja epigenetyczna komórekdawców jąder Liczba rekonstytuowanych oocytów świni Liczba hodowanych zarodków klonalnych (%) Liczba dzielących się zarodków (%) Liczba morul (%) Liczba blastocyst (%) / /231 62/231 26/231 (91,3) a (74,5) Ab (26,8) A (11,3) A / / /148 52/148 (93,7) a (93,9) Bc (70,3) B (35,1) B _ / /134 69/134 32/134 (92,4) a (83,6) a (51,5) C (23,9) D Legenda do Tabeli: a,b; a,c Niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P 0,05 (Test χ2). A,B; A,C; B,C Niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P 0,001 (Test χ2). A,D; B,D Niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P 0,01 (Test χ2). 81

27 Rycina 2. Porównanie molekularnej jakości międzygatunkowych (kozio świńskich) i wewnątrzgatunkowych (świńskich) zarodków klonalnych na podstawie oceny profilu ekspresji genów Sox2 i Oct4 (A) oraz genów Klf4 i Nanog (B) KS SCPT+: kozio świńskie zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów świni i z jąder komórek fibroblastycznych kozy, poddanych skryptaido (SCPT)-zależnej modulacji epigenetycznej; S SCPT : świńskie zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów świni i z jąder komórek fibroblastycznych świni, nie poddanych SCPT-zależnej modulacji epigenetycznej; S SCPT+: świńskie zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów świni i z jąder komórek fibroblastycznych świni, poddanych SCPT-zależnej modulacji epigenetycznej. Rycina 3. Porównanie molekularnej jakości kozio świńskich i kozio bydlęcych zarodków klonalnych na podstawie oceny profilu ekspresji genów Sox2 i Oct4 (A) oraz genów Klf4 i Nanog (B) KS SCPT+: kozio świńskie zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów świni i z jąder komórek fibroblastycznych kozy, poddanych SCPT-zależnej modulacji epigenetycznej; KB: kozio bydlęce zarodki klonalne, rozwijające się z zarodków zrekonstruowanych z ooplastów bydła i z jąder komórek fibroblastycznych kozy, nie poddanych SCPT-zależnej modulacji epigenetycznej. Oznaczenia w formie symbolu * wskazują na statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P 0,05 (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA oraz test wielokrotnych rozstępów/porównań Duncana typu post hoc). Strategia międzygatunkowego klonowania somatycznego z użyciem obcogatunkowej cytoplazmy oocytów bydlęcych skutkowała stosunkowo wysoką zdolnością jąder krwiopochodnych komórek fibroblasto-podobnych kozy do pokierowania rozwojem hybrydowych (kozio bydlęcych) zarodków klonalnych. Wykazano nieznacznie niższy potencjał rozwojowy zarodków uzyskanych w wyniku wewnątrzrodzinowego i międzyrodzajowego klonowania w układzie: koza bydło, w porównaniu do zarodków uzyskanych w wyniku klonowania wewnątrzgatunkowego w układzie: koza koza. Ponadto, odnotowano znacząco niższy poziom ekspresji genów pluripotencji (Sox2, Oct4, Klf4 i Nanog) w kozio bydlęcych zarodkach klonalnych w odniesieniu do kozich zarodków klonalnych. Niskie pokrewieństwo filogenetyczne 82

28 między osobnikami-dawcami komórek somatycznych a dawcami oocytówbiorców jąder komórek somatycznych w międzyrodzinowym i międzyrodzajowym modelu klonowania w układzie: koza świnia wydaje się być główną przyczyną bardzo ograniczonej przeprogramowalności jąder somatogenicznych w blastomerach międzygatunkowych (kozio świńskich) zarodków. Skrajnie obniżona zdolność jąder komórek somatycznych kozy do epigenetycznego przeprogramowania w hybrydowych zarodkach zrekonstruowanych z oocytów świni skutkowała drastycznie obniżoną aktywnością transkrypcyjną genów Sox2, Oct4, Klf4 i Nanog (kluczowych dla utrzymania pluripotencji w rozwijających się kozio świńskich morulach i blastocystach klonalnych) w porównaniu z zarodkami wewnątrzgatunkowymi, zrekonstruowanymi z jąder komórek somatycznych świni oraz z oocytów świni. Stopień pluripotencji międzyrodzinowych i międzyrodzajowych (kozio świńskich) zarodków klonalnych ulegał gwałtownemu spadkowi także w odniesieniu do wewnątrzrodzinowych i międzyrodzajowych (kozio bydlęcych) zarodków klonalnych, w przypadku których międzygatunkowy dystans filogenetyczny w układzie: Capra aegagrus hircus Bos primigenius taurus jest znacznie mniej odległy. Ponadto, w przeciwieństwie do wewnątrzgatunkowych (świńskich) zarodków klonalnych, w przypadku których modulacja epigenetyczna komórek-dawców jąder przy użyciu skryptaidu skutkowała zwiększeniem stopnia pluripotencji zarodków poprzez wzrost ekspresji genów Sox2, Oct4, Klf4 i Nanog, SCPT-zależna transformacja epigenomowa komórek somatycznych świni nie prowadziła do zwiększenia przeprogramowalności ich jąder w enukleowanych oocytach kozy, a następnie w rozwijających się zarodkach kozio świńskich. Według naszej wiedzy, badania z zakresu uzyskiwania międzygatunkowych zarodków klonalnych, zarówno w wyniku zastosowania wewnątrzrodzinowego klonowania międzyrodzajowego w układzie heterologicznym: koza bydło, jak i międzyrodzinowego klonowania międzyrodzajowego w układzie heterologicznym: koza świnia nie były dotąd prowadzone i stanowią zupełnie nowy kierunek badawczy w międzygatunkowej embriologii eksperymentalnej ssaków i w biotechnologii wspomaganego rozrodu międzygatunkowego zwierząt gospodarskich. Strategia międzygatunkowego klonowania kóz może być atrakcyjnym narzędziem w badaniach podstawowych, dotyczących przeprogramowania jądra komórki somatycznej w obcogatunkowym (ksenogenicznym) środowisku cytoplazmatycznym oocytu-biorcy, ale także może być wykorzystana w programach odtwarzania rezerw genetycznych oraz w programach ratowania i restytucji ginących gatunków ssaków bądź zagrożonych wyginięciem ras zwierząt gospodarskich. Zadanie Dynamika zmian wybranych parametrów nasienia u młodych buhajów Kierownik zadania: dr inż. Michał Bochenek Celem pracy było zbadanie dynamiki zmian jakości nasienia, począwszy od pierwszych pobieranych ejakulatów młodych buhajów, określenie stopnia korelacji pomiędzy badanymi cechami nasienia oraz wyznaczenie średniego wieku zwierząt, dla którego możliwe już jest uzyskanie pełnowartościowego nasienia dla celów mrożenia i inseminacji. Prace przeprowadzone zostały w 2 etapach: 1. Etap: badania wstępne na dobranych losowo 52 ejakulatach pochodzących od 9 buhajów; 83

29 2. Etap: badania na 224 ejakulatach od 66 buhajów będących w wieku od miesięcy. Nasienie pochodziło od buhajów będących własnością Małopolskiego Centrum Biotechniki w Krasnem (MCB Krasne) i tam też było ono pobierane i mrożone według standardowej metody. Przeprowadzono następujące rodzaje testów nasienia: Ocenę parametrów ruchu plemników za pomocą komputerowego systemu CASA; Ocenę mechanicznych uszkodzeń błon komórkowych plemników wykonywaną przy pomocy cytometrii przepływowej; Ocenę fragmentacji DNA oraz kondensacji chromatyny plemnikowej metodą SCSA; Ocenę zmian apoptotycznych plemników poprzez ocenę zaburzeń asymetryczności błony komórkowej; Ocenę aktywności wewnątrzkomórkowych wolnych rodników tlenowych (ROS), która stanowi odzwierciedlenie aktywności metabolicznej tych plemników. Test polegał na znakowaniu plemników związkiem CellROXgreen (ThermoFisher Scientific, USA). Zmodyfikowano go wzbogacając o dodatkowy marker uszkodzeń błon komórkowych PI (Sigma). Wnioski: 1. Stopień kondensacji chromatyny plemnikowej (HDS) zależy od wieku buhaja. Młode samce wykazują podwyższony odsetek plemników z niepełną kondensacją, co może skutkować ich obniżoną płodnością. Odsetek ten maleje z wiekiem i ulega stabilizacji w wieku ok. 18 miesięcy; 2. Standardowy test fluorescencyjny tzw. żywe/martwe za pomocą Live/Dead Sperm Viability Kit zastąpiony przez zestaw markerów CellROXgreen + PI (Thermo Fisher Scientific / Sigma). Nowe markery dają nie tylko pełną informację o integralności błon komórkowych, ale i o aktywności metabolicznej plemników; 3. Marker AnnexinV zastosowany dla mrożonego/rozmrożonego nasienia buhajów nie daje informacji o przebiegu procesów apoptotycznych plemników. Zadanie Rola analogu hormonu grasicy w dojrzewaniu oocytów, zapłodnieniu i rozwoju zarodków bydlęcych in vitro Kierownik zadania: dr hab. Jolanta Opiela Celem badań było określenie wpływu analogu hormonu grasicy o właściwościach tymozyny beta 4 (Tβ-4) w hodowli in vitro oocytów bydlęcych na ich dojrzewanie, zapłodnienie i zdolności rozwojowe uzyskanych zarodków. Do tej pory nie stosowano tymozyny β-4 lub jej analogu w pożywce do dojrzewania oocytów bydlęcych in vitro. Oocyty grupy doświadczalnej oraz grupy kontrolnej poddano ocenie dojrzałości mejotycznej i fragmentacji DNA przy użyciu analizy TUNEL. Z kolei, aby ocenić zdolności rozwojowe oocytów dojrzewających w zmodyfikowanej pożywce używano je do zapłodnienia pozaustrojowego, a uzyskane zarodki hodowano do stadium blastocysty. Oczekiwano, że badania te doprowadzą do poprawy jakości zarodków i zwiększenia efektywności metody pozaustrojowej produkcji zarodków bydlęcych. 84

30 Uzyskano następujące wyniki: Dojrzewanie oocytów in vitro w obecności tymozyny B4 w pożywce IVM oraz ocena dojrzałości mejotycznej i poziomu fragmentacji DNA metodą TUNEL Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w osiąganiu dojrzałości mejotycznej między analizowanymi grupami eksperymentalnymi. Co ciekawe, komórki jajowe bydlęce, które dojrzewały in vitro w pożywce bez tymozyny β4 osiągały wyższy odsetek oocytów w stadium MII niż oocyty inkubowane z Tβ4 o różnym stężeniu. Żaden z analizowanych oocytów nie wykazał pozytywnej fluorescencji wzbudzenia i emisji barwnika FITC czyli nie wykazano fragmentacji DNA oraz nie wykazano statystycznie istotnych różnic między oocytami z nieprawidłową strukturą chromatyny we wszystkich badanych grupach doświadczalnych. Fotografie 1 i 2 przedstawiają przykładowe wyniki analizy TUNEL na oocycie dojrzałych (Fot.1) i niedojrzałym (Fot.2). (a) (b) (c) Fot. 1. Dojrzały oocyt bydlęcy po analizie metodą TUNEL (a) chromatyna w stadium metafazy II i pierwsze ciałko kierunkowe (b) brak oznak fragmentacji DNA (c) zdjęcia (a) i (b) nałożone (fot. N. Zdebska) (a) (b) (c) Fot. 2. Niedojrzały oocyt bydlęcy - kontrola pozytywna indukcja apoptozy staurosporyną, a następnie analiza TUNEL (a) chromatyna w stadium metafazy I (b) zielona fluorescencja sfragmentowanego DNA chromatyny w stadium MI (c) zdjęcia (a) i (b) nałożone (fot. N. Zdebska) Testowanie zdolności zapładniającej plemników pozyskanych z najądrzy W pierwszych dwóch latach realizacji zadania nie uzyskano plemników o zadawalającej zdolności zapładniającej. Uzyskany odsetek podziału komórek jajowych po zapłodnieniu testowanymi plemnikami z najądrzy był niższy od wymaganego poziomu 70%. Uzysk blastocyst przy zastosowaniu testowanych porcji plemników mrożonych był zerowy. 85

31 Ocena wpływu analogu hormonu grasicy o właściwościach tymozyny β4 w hodowli in vitro oocytów bydlęcych na zdolności rozwojowe uzyskanych zarodków W sumie zapłodnieniu in vitro poddano 527 oocytów po dojrzewaniu in vitro, z czego dalszy rozwój zarodkowy podjęło 475 komórek, co stanowi 90% zapłodnionych komórek jajowych. Uzyskano prawie 20% blastocyst, które poddano ocenie jakościowej. W ostatnim roku realizacji zadania uzyskano porcje plemników z najądrzy o zadawalającej zdolności zapładniającej. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w liczbie podzielonych zarodków jak i w liczbie uzyskanych blastocyst między oocytami hodowanymi w obecności Tβ4 (oba testowane stężenia) a oocytami kontrolnymi. Wykazano natomiast statystycznie istotne różnice w liczbie podzielonych zarodków między oocytami hodowanymi w obecności Tβ4 50 ng a Tβ4 0,5 mg na korzyść niższej wartości stężenia. Co ciekawe tendencja ta uległa odwróceniu w liczbie uzyskanych blastocyst jednak nie wykazano statystycznej istotności. Dlatego zdecydowano o kontynuacji badań testując wyższe stężenie tymozyny β4 w pożywce IVM. Wykonano już 2 próby zapłodnienia oocytów hodowanych in vitro w obecności 1mg tymozyny β4. Badania są w toku. W tabeli nr 1 przedstawiamy zbiorcze wyniki prób zapłodnienia in vitro. Tabela 1. Kompetencje rozwojowe oocytów dojrzewających w obecności tymozyny β4 Grupa doświadczalna n oocytów IVM n zapładnianych oocytów (%) n podzielonych oocytów (%) (mean±s.d.) n uzyskanych blastocyst (%) (mean±s.d.) 27 (19%) 9±3 50 ng tymozyny β (94%) b 45±9 0.5mg tymozyny (85%) a 42±13 46 (22%) 12±7 β4 control (91%) 42,25±8 32 (18%) 8±2,2 Test χ 2 ; a:b, P<0,05, n- liczba (90%) 105 (19,9) Analiza TUNEL uzyskanych blastocyst Przeanalizowano 91 blastocyst pod kątem liczby komórek w blastocyście i liczby komórek apoptotycznych. Dane te pozwoliły na wyznaczenie indeksu apoptotycznego. Uzyskane wyniki nie wykazały statystycznie istotnych różnic w wyżej opisanych parametrach między analizowanymi grupami doświadczalnymi. Wyniki zebrano w tabeli 2. Tabela 2. Efekt różnych systemów hodowli na jakość blastocyst Grupa doświadczalna 50 ng Thymozyny 0.5 mg Thymozyny n blastocyst Śr liczba jąder na blastocyste± S.D. Śr liczba jąder apoptotycznych na blastocyste± S.D. Śr indeks DCI na blastocyste ± S.D ± ± ± ± ± ± 1.89 Controla ± ± ± Brak statystycznie istotnych różnic-tuckey test 86

32 Obecnie, przy użyciu metod in vitro możliwe jest uzyskanie u bydła około 90% oocytów osiągających dojrzałość jądra (stadium Metafazy II), z których ponad 80% ulega zapłodnieniu in vitro, a ponad 70% podejmuje podziały zarodkowe. Jednakże odsetek zapłodnionych oocytów, osiągających w kompleksowym systemie in vitro stadium blastocysty jest znacznie niższy i nawet w najbardziej optymalnych warunkach nie przekracza 40% wyjściowej liczby hodowanych zygot (Kątska-Książkiewicz, 2004). Zatem mamy tutaj do czynienia z nie w pełni wykorzystanym potencjałem metody. Nasza propozycja badawcza zmierzająca do opracowania warunków pozwalających na lepsze wykorzystanie potencjału ww. technologii przy zastosowania do tego celu tymozyny β-4 nie dała jednoznacznej odpowiedzi. Wiemy, że białko to nie szkodzi dojrzewaniu mejotycznemu oocytów, niemniej jednak nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w liczbie podzielonych zarodków jak i w liczbie uzyskanych blastocyst między oocytami hodowanymi w obecności Tβ4 (oba testowane stężenia) oocytami kontrolnymi. Ponieważ wyniki kompetencji rozwojowych oocytów hodowanych in vitro w obecności 0,5 mg tymozyny β4 świadczą o możliwym pozytywnym wpływie tego związku przy zastosowaniu jego wyższego stężenia w pożywce IVM dlatego wykonano już 2 próby zapłodnienia oocytów hodowanych in vitro w obecności 1 mg tymozyny β4. Zadanie Opracowanie laparoskopowej metody uzyskiwania oocytów u świń Kierownik zadania: dr n. wet. Jarosław Wieczorek Celem zadania było kompleksowe opracowanie laparoskopowej metody OPU u świń, pozwalającej na uzyskanie oocytów zdolnych do zapłodnienia in vitro. Było to pionierskie badanie z tego zakresu w Polsce. O podjęciu tej tematyki badawczej decydowały aspekty ekonomiczne, społeczne, naukowe i etyczne. W założeniu opracowanie i wdrożenie metody pozwala na jej wykorzystanie w różnych dziedzinach biotechnologii rozrodu zwierząt oraz na dostosowanie bazy naukowej do coraz bardziej rygorystycznych regulacji dotyczących prowadzenia badań z udziałem żywych zwierząt i zachowania ich dobrostanu. W projekcie uwzględniono nie tylko sposób pozyskiwania oocytów, ale także szereg czynników mających wpływ na skuteczność i powtarzalność metody, takich jak: dobór odpowiednich dawczyń oocytów, czas między kolejnymi pobraniami, sposób stabilizacji jajników i aspiracji pęcherzyków jajnikowych, grubość igły do punkcji i stosowanego podciśnienia do aspiracji oocytów oraz zdolność uzyskanych oocytów do zapłodnienia in vitro. Badanie wykonywano w 3 etapach. W każdym z nich badano inny aspekt metodyczny. W pierwszej kolejności dopracowano aspekty techniczne metody, do których należy: dobór odpowiedniego instrumentarium ze szczególnym uwzględnieniem grubości igły do aspiracji oocytów i podciśnienia. Uzyskane oocyty poddawano ocenie morfologicznej, wyselekcjo- nowane oocyty zapładniano in vitro. Ta część doświadczenia była realizowana bez udziału żywych zwierząt, a źródłem oocytów były jajniki pochodzące z ubojni. W dalszej kolejności opracowano manualną część metody, dopracowano techniki penetracji powłok brzusznych, stabilizacji jajników i aspiracji pęcherzyków jajnikowych na żywych zwierzętach. Podobnie jak w pierwszej części uzyskane oocyty poddano ocenie morfologicznej, a część z nich zapładniano in vitro. W następnej części określono dobór odpowiednich wiekowo dawczyń zarodków, w tym celu oocyty pozyskiwano od dawczyń w różnym wieku. Uwzględniono także możliwość wielokrotnego pozyskiwania oocytów od jednej dawczyni. Końcowym etapem było pozyskanie 87

33 blastocyst po zapłodnieniu in vitro i ich transplantacja. Uzyskane wyniki oceniano na podstawie ilości i jakości uzyskanych oocytów oraz ich zdolności do hodowli i zapłodnienia in vitro. Dodatkowo oceniano: wielkość, masę, wiek dawczyń, występowanie i nasilenie objawów rujowych u dawczyń oocytów, ilość i wielkość pęcherzyków jajnikowych na każdym jajniku, ilość aspirowanych pęcherzyków jajnikowych, sposób aspiracji, ilość uzyskanych zygot i blastocyst po zapłodnieniu in vitro, całkowita liczba komórek w blastocystach oraz stopień fragmentacji jądrowego DNA blastocyst (indeks apoptotyczny), przebieg znieczulenia, przebieg zabiegu, powikłania śródoperacyjne i obserwacja zwierząt po zabiegu. Zadanie Liofilizacja jako metoda długotrwałej konserwacji nasienia knura Kierownik zadania: prof. dr hab. Barbara Gajda Celem podjętych badań jest wykorzystanie liofilizacji do opracowania innowacyjnej metody konserwacji nasienia knura. W pierwszym etapie badano czynniki wpływające na efektywność procesu liofilizacji, takie jak: rodzaj medium do liofilizacji, czas trwania liofilizacji, temperaturę oraz czas przechowywania liofilizatu. Nasienie uzyskane od 5 wyselekcjonowanych knurów zamrażano w 5 różnych mediach: TI-Hepes-PVA, Modena, Laktozowo-żółtkowy, Glukozowo- -żółtkowy oraz Tris. Zamrożone próbki nasienia o objętości 0,2 ml poddawano liofilizacji w 2 ml probówkach Eppendorf, umieszczonych w termobloku, w laboratoryjnym liofilizatorze. Zamrożone próbki sublimacyjnie suszono w obniżonej temperaturze wynoszącej -20 o C i pod zmniejszonym ciśnieniem wynoszącym 0,037 mbara. Liofilizację prowadzono przez 6, 18 i 24 godziny. Uzyskane liofilizaty przechowywano w różnym czasie (14 i 30 dni oraz 3 i 6 miesięcy) oraz w różnej temperaturze (-80 o, -20 o, +4 o i +20 o C). Następnie część próbek liofilizowanego nasienia poddawano rehydratacji przy użyciu wody dejonizowanej w ilości odpowiadającej objętości próbki przed liofilizacją, rozcieńczono przy użyciu soli fizjologicznej i poddano ocenie ruchliwości pod mikroskopem. Przeprowadzono próby obniżenia zawartości glicerolu w medium do liofilizacji z 3 do 2%, biorąc pod uwagę jego szkodliwe oddziaływanie na nasienie w trakcie i po liofilizacji. Ponadto, przeprowadzono badania zastąpienia w medium do liofilizacji białka zwierzęcego pod postacią żółtka jaja białkiem roślinnym takim jak soja lub Porex. Ryc. 1. Etapy procesu liofilizacji nasienia Przygotowanie nasienia. Rozrzedzanie w medium liofilizacyjnym Liofilizacja - zamrażanie - 1 suszenie - 2 suszenie Przechowywanie próbek w temp. plusowych lub minusowych Rehydratacja nasienia Ocena ruchliwości nasienia. Ocena uszkodzeń DNA ICSI nasieniem liofilizowanym Fot. 1. Liofilizator laboratoryjny 88

34 Wyniki badań przedstawiono w tabelach 1-4. Tabela 1. Średnia ruchliwość nasienia (%) 5 knurów po ekwilibracji/rozmrożeniu w 5 różnych mediach przeznaczonych do liofilizacji Nasienie knura Tl-Hepes-PVA Modena Laktozowożółtkowy Glukozowożółtkowy TRIS mrożeniowy Maxter 33 65% / 15% 70% / 0% 85% / 25% - - Biały Pietrain 25 60% / 20% % / 40% 90% / 55% Maxter % / 15% 90% / 30% 90% / 40% Maxter % / 10% 85% / 15% 90% / 40% Maxter 31 60% / 0% 70% / 0% 85% / 20% 90% / 25% 85% / 35% Tabela 2. Średnia ruchliwość nasienia (%) 2 knurów po ekwilibracji/rozmrożeniu w mediach z dodatkiem różnych koncentracji glicerolu przeznaczonych do liofilizacji Nasienie knura Glicerol 1% Glicerol 2% Glicerol 3% Maxter 33 90% / 20% 90% / 30% 90% / 40% Maxter 31 85% / 50% 85% / 70% 85% / 60% Tabela 3. Średnia ruchliwość nasienia (%) 2 knurów po ekwilibracji/rozmrożeniu w mediach z dodatkiem żółtka lub soi przeznaczonych do liofilizacji Nasienie knura Żółtko 20 % Soja 2% Soja 4% Soja 6% Maxter 33 50% / 30% rp / rp rp / rp rp / rp Maxter 31 70% / 40% rp / rp rp / rp rp / rp rp ruch pojedynczy Tabela 4. Średnia ruchliwość nasienia 2 knurów po ekwilibracji/rozmrożeniu w mediach z dodatkiem żółtka lub Porexu przeznaczonych do liofilizacji Nasienie knura Żółtko 20 % Porex 2% Porex 4% Porex 6% Maxter 33 80% / 30% 10% / rp 20% / rp 20% / rp Maxter 31 80% / 40% 60% / rp 50% / rp rp / rp rp ruch pojedynczy 89

35 Dotychczas uzyskane wyniki wskazują, że z testowanych 5 mediów na obecnym etapie badań, najbardziej korzystnym do liofilizacji nasienia knura okazało się mediumtris. Nie obserwowano pozytywnego wpływu zastąpienia w medium do liofilizacji białka zwierzęcego białkiem roślinnym. Stwierdzono korzystny wpływ obniżenia zawartości glicerolu w medium do liofilizacji. Nie wykazano wpływu czasu oraz temperatury przechowywania na ruchliwość liofilizowanych plemników knura. Obserwowano negatywny wpływ dłuższego (6 miesięcy) czasu przechowywania liofilizatu w podwyższonej temperaturze (+20 o C) na podatność rehydratacji. Na obecnym etapie badań nie obserwowano ruchliwości liofilizowanych plemników knura. Badania są kontynuowane. Zadanie Zbadanie możliwości wykorzystania pierwotnych komórek płciowych kaczki do modyfikacji genomu kaczek z wykorzystaniem CRISPR/Cas9 Kierownik zadania: dr hab. Mirosław Lisowski Zadanie ma celu wykorzystanie CRISP/Cas9 do dezaktywacji (nokautu) genu miostatyny u kaczek. Ponieważ w przypadku drobiu nie zostały opublikowane sekwencje genów warunkujących choroby dziedziczne czy odporność, w realizowanym zadaniu CRISPR/Cas9 wykorzystane zostanie do dezaktywacji genu miostatyny kaczek, którego sekwencja jest znana. Dodatkowym celem zadania jest opracowanie metod izolacji pierwotnych komórek płciowych z będących we wczesnej fazie rozwoju zarodków kaczych. W SZGDW w Dworzyskach utrzymywana jest kolekcja 6 rodów zachowawczych kaczek. Opracowanie metod izolacji pierwotnych komórek płciowych kaczek umożliwi w przyszłości skuteczną kriokonserwcję nie tylko nasienia, ale także materiału genetycznego w postaci pierwotnych komórek płciowych pozyskanych od przedstawicieli poszczególnych stad zachowawczych. Wyizolowane pierwotne komórki płciowe pochodzące z zarodków kaczych wykorzystane zostaną również jako wektory do wprowadzania CRISP/Cas9. Celem badań w 2017 roku było opracowanie metody izolacji pierwotnych komórek płciowych z będących we wczesnej fazie rozwoju zarodków kaczych. Metody izolacji pierwotnych komórek płciowych kurzych zostały opisane. Natomiast w literaturze brak jest doniesień na temat pozyskania tych komórek z zarodków kaczych. Pierwotne komórki płciowe oglądane pod mikroskopem to duże, okrągłe, ziarniste komórki. Mogą one być identyfikowane na podstawie cech morfologicznych, takich jak: występowanie dużego jądra o średnicy ok. 8 μm, dobrze rozwiniętego aparatu Golgiego czy obecności licznych ziarnistości substancji zapasowych. W przypadku kur izolację PGCs wykonuje się z tarczek zarodkowych zniesionych jaj w 2,5 dobie inkubacji z krwi zarodka (np. aorty, serca) lub w 5,5 dobie inkubacji z grzebieni płciowych znajdujących się na brzegach śródnerczy. Najczęstszym sposobem pozyskiwania PGCs jest ich izolacja z gonad 5-7-dniowych zarodków kurzych. U kur długość okresu inkubacji wynosi 21 dni, natomiast u kaczek 28. Zarówno długość inkubacji, jak i inne czynniki (np. wielkość jaj, czy masa ciała) mają wpływ na terminy izolacji PGCs, które w przypadku kaczek są inne w porównaniu z tymi okresami u kur. W ramach zadania jaja kacze inkubowano przez ponad 8 dni w temperaturze 37,7 C i przy wilgotności 63-65%. PGCs izolowano ze śródnerczy 8. dniowych zarodków, oddzielono gonady i umieszczono je w probówce w 0,1 ml roztworu PBS (ang. Phosphate Buffered 90

36 Saline) pozbawionego jonów Ca2+ i Mg2+. Pierwotne komórki płciowe izolowano z gonad rozdrobnionych mechanicznie oraz gonad nierozdrobnionych. Umieszczano je 0,5 ml PBS[-] i inkubowano w temperaturze 37,7 C i 5% nasyceniu CO 2 przez 1 godzinę. W celu określenia przeżywalności pierwotnych komórek płciowych zastosowano metodę barwienia 0,4% błękitem trypanu. Zadanie Zastosowanie hydrofilowych i hydrofobowych przeciwutleniaczy w kriokonserwacji nasienia knura Kierownik zadania: dr Monika Trzcińska Celem badań jest określenie wpływu dodatku różnych stężeń hydrofilowych i hydrofobowych przeciwutleniaczy do rozcieńczalnika mrożeniowego na jakość nasienia knura. Zastosowanie markerów apoptotycznych i chemiluminescencyjnych do oceny nasienia pozwolą na określenie jego wartości biologicznej oraz wyznaczenie nowych kryteriów selekcji knurów do kriokonserwacji. W roku 2017 przeprowadzono wstępne badania mające na celu przygotowanie modyfikacji składu rozcieńczalnika mrożeniowego poprzez dodatek związków przeciwdziałających zmianom kriogenicznym w plemnikach. Badaniami objęto nasienie pochodzące od 3 knurów rasy Maxter H16 wolnych od genu stresu oraz 2 knurów mieszańców międzyrasowych (Duroc x Pietrain) standardowo wykorzystywanych do inseminacji w Stacji Eksploatacji Knurów w Kleczy Dolnej. Od każdego knura do badań przeznaczono od 4 do 5 ejakulatów. Nasienie po pobraniu (frakcja gęsta) transportowano do Zakładu Biotechnologii Rozrodu i Kriokonserwacji IZ PIB. Ocenę ruchliwości oraz koncentracji przeprowadzono przy zastosowaniu systemu CASA. Do dalszych analiz przeznaczano ejakulaty, w których wykazano ruch postępowy plemników powyżej 80%. Ogólnie, do kriokonserwacji zakwalifikowano 28 ejakulatów. Każdy z ejakulatów został zamrożony według metody własnej (patent nr P ) przy użyciu następujących rozcieńczalników: 1. żółtkowo-laktozowo-glicerolowy LEYG (rozcieńczalnik kontrolny) 2. LEYG z dodatkiem 2 mm butylowanego hydroksytoluenu (LEYG + 2BHT) 3. LEYG z dodatkiem 0,5 mm melatoniny (LEYG+0,5M) 4. LEYG z dodatkiem 1,0 mm melatoniny (LEYG+1M) 5. LEYG z dodatkiem 2,0 mm melatoniny (LEYG+2M) 6. LEYG z dodatkiem 0, 5 mm resweratrolu (LEYG+0,5R) 7. LEYG z dodatkiem 1,0 mm resweratrolu (LEYG+1R) 8. LEYG z dodatkiem 2,0 mm resweratrolu (LEYG+2R) 9. LEYG z dodatkiem 1,0 mm kurkumy (LEYG+1K) 10. LEYG z dodatkiem 2,0 mm kurkumy (LEYG+2K) 11. LEYG z dodatkiem 3,0 mm kurkumy (LEYG+3K) Rozcieńczone i schłodzone nasienie o koncentracji plemników 250x10 6 konfekcjonowano w słomkach IMV o objętości 0,5 ml, zamrażano w parach ciekłego azotu (temp. ok C), a następnie przenoszono do kontenera z ciekłym azotem (temp. ok C) i przechowywano przez minimum 2 tygodnie. Ogółem zamrożono 3080 słomek. Nasienie świeże i po procedurze kriokonserwacji oceniano na podstawie ruchliwości, markerów apoptotycznych analizowanych przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii 91

37 fluorescencyjnej oraz chemiluminescencyjnego pomiaru uszkodzeń oksydacyjnych plemników. Nasienie świeże oceniano po 2 godzinach od pobrania, po wcześniejszym rozrzedzeniu w stosunku 1:1 w rozcieńczalniku Biosolwens Plus. Ocenę jakości kriokonserwowanego nasienia przeprowadzono po rozmrożeniu słomek w łaźni wodnej w temp. 37 C i po minutowej inkubacji w rozcieńczalniku Biosolwens Plus. Zastosowane metody oceny pozwoliły na wybór odpowiedniej suplementacji rozcieńczalnika mrożeniowego, jak i stężenia przeciwutleniaczy pozwalającego na uzyskanie wysokiej jakości nasienia badanych knurów po procedurze kriokonserwacji. Zastosowano następujące metody oceny jakości nasienia knura: 1) Komputerowo wspomagana analiza nasienia z wykorzystaniem analizatora S.C.A V5.1; 2) Ocena zmian w przepuszczalności błony komórkowej plemników przy zastosowaniu fluorochromu YO-PRO-1; 3) Wykrywanie translokacji fosfatydyloseryny na powierzchni błony komórkowej plemników i aktywności kaspazy-3; 4) Ocena fragmentacji DNA plemników przy użyciu metody TUNEL; 5) Ocena mitochondrialnego potencjału transbłonowego przy zastosowaniu barwnika fluorescencyjnego JC-1; 6) Badanie uszkodzeń oksydacyjnych plemników metodą chemiluminescencyjną. Wstępne wyniki badań pozwoliły na wybór odpowiedniej suplementacji rozcieńczalnika mrożeniowego, jak i stężenia przeciwutleniaczy. Na podstawie uzyskanych wyników oceny nasienia kriokonserwowanego w rozcieńczalniku żółtkowo-laktozowo-glicerolowym z dodatkiem związków o działaniu przeciwutleniającym (butylowanego hydroksytoluenu, melatoniny, resweratrolu, kurkumy) o różnych stężeniach opracowano skład rozcieńczalników mrożeniowych zapewniających w zależności od rasy knura najwyższą wartość biologiczną plemników po rozmrożeniu. Kryterium wyboru stężenia i rodzaju przeciwutleniacza było uzyskanie po procedurze zamrażania-rozmrażania najwyższego odsetka plemników o ruchu postępowym, plemników żywych ocenianych za pomocą fluorochromu YO-PRO-1, plemników żywych nie wykazujących translokacji fosfatydyloseryny i aktywności kaspazy-3, plemników z wysokim mitochondrialnym potencjałem transbłonowym oraz najniższym odsetkiem plemników apoptotycznych ocenianych za pomocą fluorochromu YO-PRO-1 i najniższym poziomem peroksydacji lipidów błon komórkowych plemników. W tabeli nr 1 i tabeli nr 2 zamieszczono średnie wyniki dla badanych knurów po kriokonserwacji nasienia w zmodyfikowanych rozcieńczalnikach spełniających w/w kryteria. Dla mieszańców Duroc x Pietrain uzyskano wysoką jakość nasienia po procedurze zamrażania-rozmrażania, po zastosowaniu rozcieńczalnika żółtkowo-laktozowo-glicerolowego z dadatkiem 2 mm butylowanego hydroksytoluenu lub 2 mm melatoniny. Natomiast dla wszystkich przebadanych knurów rasy Maxter suplementacja rozcieńczalnika mrożeniowego resweratrolem o stężeniu 2 mm pozwoliła na zachowanie po rozmrożeniu wysokiego odsetka plemników o ruchu postępowym. Jednocześnie w przypadku knura nr III dodatek przeciwutleniczy takich jak: melatonina, resweratrol lub kurkuma o stężeniu 2 mm do rozcieńczalnika żółtkowo-laktozowo-glicerolowego umożliwia zachowanie wysokiego odsetka plemników żywych wynoszący odpowiednio: 55,0±2,2; 54,8±3,2; 59,4±4,6. Spośród knurów rasy Maxter nasienie samca nr V po procedurze zamrażania-rozmrażania w rozcieńczalniku z dodatkiem 2 mm resweratrolu charakteryzowało się najwyższym odsetkiem plemników o ruchu postępowym (77,6±7,0), plemników żywych ocenianych za pomocą fluorochromu YO- -PRO-1 (70,8±4,8), plemników żywych nie wykazujących translokacji fosfatydyloseryny i aktywności kaspazy-3 (70,7±7,5), plemników z wysokim mitochondrialnym potencjałem transbłono- 92

38 wym (71,5±4,6) oraz najniższym odsetkiem plemników apoptotycznych ocenianych za pomocą fluorochromu YO-PRO-1 (4,3±1,0). Suplementacja rozcieńczalnika mrożeniowego 2 mm BHT w znaczący sposób obniża peroksydacje lipidów błon komórkowych plemników. OBSZAR TEMATYCZNY 3 OCHRONA ZASOBÓW GENETYCZNYCH ZWIERZĄT GOSPODARSKICH METODAMI IN SITU I EX SITU Zadanie Analiza eksploratywna zmienności fenotypowej i genetycznej zwierząt gospodarskich objętych programami ochrony zasobów genetycznych Kierownik zadania: dr inż. Jacek Sikora Celem zadania było przeprowadzenie eksploratywnej analizy danych rodowodowych oraz danych dotyczących kształtowania się najważniejszych cech użytkowych wybranych populacji bydła, koni i owiec objętych programami ochrony zasobów genetycznych. W okresie sprawozdawczym realizowano badania zmierzające do określenia współczynnika spokrewnienia i stopnia inbredu oraz pozostałych parametrów zmienności genetycznej populacji objętych ochroną. Współczynniki spokrewnienia (R xy ) oraz inbredu (F x ), a także efektywna liczebność populacji (N e ) uznawane są za podstawowe parametry służące określeniu zmienności genetycznej populacji. Zastosowanie metod takich jak reprezentacyjny wybór osobników na rodziców następnego pokolenia, systemy kojarzeń w pewien sposób ograniczają możliwość wystąpienia znacznego wzrostu inbredu w populacjach chronionych. Dodatkowo w krótszych odstępach czasowych uwzględniających kilka pokoleń jako narzędzia do określenia zmian struktury genetycznej, mogą zostać wykorzystane efektywna liczba założycieli (f e ) i efektywna liczba przodków populacji (f a ). Niniejsze opracowanie dotyczy populacji wybranych ras z trzech podstawowych gatunków zwierząt gospodarskich bydła, owiec i koni i jest pilotażowym działaniem do wprowadzenia cyklicznych analiz zmienności genetycznej wszystkich populacji ras chronionych w Polsce. W przypadku rasy polskiej czerwonej, przy założeniu wykorzystania pełnej informacji, głębokość rodowodów sięga 19 pokoleń, natomiast kompletność rodowodów wzrasta od 11 pokolenia. Dla rasy polskiej czerwono-białej dane o przodkach sięgają 16. pokolenia, przy czym stopień wypełnienia rodowodów stopniowo wzrasta dopiero od 9. pokolenia. Średni współczynnik inbredu był wyższy w rasie polskiej czerwonej niż polskiej czerwono- -białej, na co wpływ miał prawdopodobnie stopień wypełnienia rodowodów. Dla wszystkich analizowanych zwierząt średni inbred w rasie polskiej czerwonej (7833 szt.) wynosił 0,78%, natomiast dla rasy polskiej czerwono-białej (12178 szt.) 0,11%. Średnie współczynniki inbredu na rok urodzenia przyjmowały wartości dla rasy RP maksymalnie w 2012 roku około 1,6%, natomiast dla rasy ZR maksymalnie poniżej 0,5%. W przypadku obu analizowanych ras, dla zwierząt urodzonych po wprowadzeniu programów ochrony odnotowywany jest wzrost liczby zwierząt zinbredowanych oraz wzrost średniego współczynnika inbredu spowodowany najprawdopodobniej wzrostem udziału zwierząt o znanym pochodzeniu. Efektywna liczba założycieli to liczba osobników będących przodkami bez udokumentowanego pochodzenia posiadających ten sam udział genów w badanej populacji. W przypadku populacji krów rasy ZR 93

39 ogólna liczba założycieli oraz efektywna liczba założycieli z uwagi na brak znanego pochodzenia większości krów były zdecydowanie wyższe niż w przypadku rasy polskiej czerwonej. Efektywna liczba założycieli dla rasy polskiej czerwonej wynosiła 23 sztuki. Materiałem doświadczalnym dotyczącym owiec były dane na temat ras wrzosówka i wielkopolska, objętych programem ochrony zasobów genetycznych. W poszczególnych analizach wykorzystano informacje zgromadzone w bazie Bioróżnorodność Instytutu Zootechniki PIB dotyczące wybranych ras. W wyniku przeprowadzonych analiz generalnie stwierdzono niskie wartości inbredu dla obu ras. Zarówno dla wrzosówki, jak i owcy wielkopolskiej w pokoleniu 2014 kształtował się on na poziomie 1,6%. Wyznaczona liczba założycieli jak również efektywna liczba założycieli dla obu ras jest wystarczająca i nie zagraża wzrostem wskaźników. Uzyskane wyniki świadczą o bardzo dobrej pracy hodowlanej związków hodowców owiec i kóz w terenie oraz o dużej świadomości i wiedzy hodowców owiec objętych programem ochrony zasobów genetycznych. Pomimo niskich wartości inbredu na pokolenie i na rok urodzenia owiec objętych badaniami trzeba w kolejnych latach monitorować wskaźniki, aby utrzymać ich niski poziom. Do badań dotyczących koni wybrano populacje dwóch ras: przedstawiciela rasy prymitywnej konika polskiego i reprezentanta rasy szlachetnej, powstałej z krzyżowania miejscowego materiału z rasami kulturalnymi konia śląskiego. Koniki polskie objęte są programem ochrony od 2000 r., a rasa śląska od 2005 r. Te dwie rasy są obecnie najliczniej reprezentowane w swoich kategoriach, koniki polskie w rasach prymitywnych (1518 szt.), a konie śląskie w rasach półkrwi (915 szt.). Do czwartego pokolenia wstecz kompletność rodowodów badanych koników polskich wynosi praktycznie 100%. Piąte pokolenie to 98,6% kompletności, a szóste 89,9%. Drastyczny spadek jest zauważalny dopiero od dziewiątego pokolenia wstecz. Wskaźnik efektywnej liczby założycieli, utrzymujący się na poziomie 16,76 potwierdza wysokie wartości zinbredowania populacji konika polskiego. Średni współczynnik inbredu przypadku koni śląskich jest niski, zwłaszcza w porównaniu z populacją konika polskiego. Praktycznie do piątego pokolenia wstecz ma wartość równą prawie 0%. Wzrost wskaźnika zaczyna się od szóstego pokolenia, ale najwyższą wartość jaką przyjmuje, to 2,25%. Jednak nie jest to do końca rzeczywisty obraz, gdyż należy pamiętać, że w programie ochrony uczestniczy około połowa całej hodowlanej populacji klaczy śląskich wpisanych do ksiąg, a nie tak jak w przypadku koników polskich, gdzie prawie cala hodowlana populacja jest w programie ochrony. Wskaźnik efektywnej liczby założycieli na poziomie 110,02 daje zabezpieczenie, że inne wskaźniki charakteryzujące populację pod względem pokrewieństwa utrzymują się na niskich bezpiecznych poziomach. W przypadku ras rodzimych bardzo ważnym zadaniem jest monitorowanie homozygotyczności zwierząt w poszczególnych populacjach hodowlanych objętych programami ochrony zasobów genetycznych. Możliwości takie daje szacowanie wartości spokrewnienia i inbredu, na podstawie których można określać i regulować czynniki mające wpływ na zmienność genetyczną poprzez stosowanie odpowiedniego doboru par do kojarzeń oraz ustalania planu kojarzeń. W ramach realizacji zadania przeprowadzono również badania, których celem było wyznaczenie trendów kształtowania się cech użytkowych wybranych zagrożonych ras w poszczególnych latach funkcjonowania programów ochrony. Analiza została przeprowadzona na 13 rasach owiec (cakiel podhalański, kamieniecka, corideil, merynos barwny, merynos polski w starym typie, olkuska, polska owca górska odmiany barwnej, pomorska, świniarka, uhruska, wielkopolska, wrzosówka, żelaźnieńska), 2 rasach bydła (polska czerwono-biała, polska czarno- -biała) oraz 2 rasach koni (konik polski i śląska). Wyznaczono trendy dla najważniejszych cech poszczególnych gatunków. Analizę wyników owiec przeprowadzono z uwzględnieniem cech związanych ze wskaźnikami rozrodu, tj. plenność, odchów jagniąt i użytkowość rozpłodowa, 94

40 a także cech związanych z odchowem potomstwa: masa ciała jagniąt w 65. dniu życia. Trendy dla ras bydła wyznaczono dla cech związanych z produkcyjnością: wydajność mleka, tłuszczu, białka, procentowa zawartość tłuszczu, białka, długość użytkowania i produkcyjność życiowa dla sztuk ubyłych oraz dla podstawowych wskaźników rozrodu: wiek pierwszego wycielenia, okres międzywycieleniowy oraz łatwość porodów. Wybrane rasy koni analizowane były pod kątem zmian na przestrzeni lat w odniesieniu do cech uwzględnionych w programach ochrony. Obejmowały one podstawowe pomiary biometryczne, szczegółową ocenę bonitacyjną i ocenę potomstwa. W rasach owiec na przestrzeni lat obserwowano spadek plenności w odniesieniu do większości ras, za wyjątkiem rasy merynos polski barwny (między 2014 a 2016 wzrost plenności o 11,4%). Największy spadek plenności obserwowano w stadach owcy wrzosówki (7,9%) i rasy olkuskiej (13%). Wskaźnik użytkowości rozpłodowej wahał się od 94,2% (owca uhruska w 2014 roku) do 154,4% (owca olkuska 2010 r.) i charakteryzował się największym zróżnicowaniem spośród wszystkich badanych cech. Niekorzystne tendencje w zakresie użytkowości rozpłodowej odnotowano dla ras: corideil, pomorska, kamieniecka, polska owca górska odmiany barwnej. Wskaźnik odchowu jagniąt u wszystkich ras utrzymywał się na dość stabilnym poziomie i nie wykazywał tendencji spadkowych. W trakcie realizacji programów ochrony dla ras bydła polskiej czerwono-białej i polskiej czarno-białej obserwowano trendy spadkowe w odniesieniu do cech, takich jak wydajność mleka, tłuszczu i białka. W latach większą zmienność odnotowano dla procentowej zawartości tłuszczu niż białka, szczególnie w odniesieniu do rasy polskiej czerwono-białej (wzrost z 4,05 do 4,15%). Tendencje wzrostowe odnotowano dla długości użytkowania krów oraz ich produkcyjności życiowej. Stwierdzono wydłużenie okresu pierwszego wycielenia oraz okresu międzywycieleniowego. W przypadku koni przeprowadzone badania miały służyć ocenie efektywności realizowania programów ochrony na przykładzie wybranych dwóch ras: konika polskiego i konia śląskiego. Wszystkie analizy oparte na średnich wartościach poszczególnych badanych cech oraz analiza kształtowania się trendów potwierdziła skuteczność działań prowadzonych w ramach programów ochrony. Zarówno w rasie konika polskiego jak i koni śląskich w długoterminowej 13-letniej ocenie nie stwierdzono istotnych odchyleń od przyjętego wzorca rasowego w żadnej z ocenianych cech. Na zachowanie utrzymania trendów badanych cech nie miała wpływu systematycznie wzrastająca liczebność populacji objętej programem ochrony w kolejnych latach. Bardzo dużym sukcesem jest wzrastający trend średniej liczby potomstwa przypadającego na klacz uczestniczącą w ochronie bioróżnorodności. Uzyskane wyniki stanowią cenny materiał do dalszych analiz oraz do rozszerzenia badań o pozostałe rasy objęte działaniem programów ochrony. Zadanie Wpływ genotypu na jakość mięsa kapłonów i pulard Kierownik zadania: prof. dr hab. Józefa Krawczyk Celem przeprowadzonych badań była ocena jakości mięsa i kości kapłonów i pulard pochodzących od mieszańców R-11 x Ż-33. Doświadczenie przeprowadzono w Zakładzie Doświadczalnym IZ PIB w Chorzelowie. W żywieniu ptaków zastosowano trzyfazowy program żywienia: mieszanka I, tj. od 1. dnia do 7 tygodnia (grupy I - IV), mieszanka sypka o zawartości: 204 g białka i 11,92 MJ; mieszanka II, tj. od 8 do 16 tygodnia życia (grupy I - IV), mieszanka sypka, o zawartości: 184 g białka i 12,05 MJ; 95

41 mieszanka III, tj. od tygodnia życia o zawartości: 165 g białka i 12,18 MJ w układzie: mieszanka zbożowo-sojowa (grupa I i III), granulat, mieszanka z 4 % dodatkiem mleka (grupa II i VI), granulat. Badania na kapłonach przeprowadzono w układzie zamieszczonym w tabeli 1. Tabela 1. Układ doświadczenia Grupa Ilość szt. System utrzymania Żywienie I - kontrola koguty bez kastracji 30 ściołowy mieszanka II - kontrola koguty bez kastracji 30 ściołowy mieszanka + mleko (ostatnie 4 tyg.) III - doświadcz. kapłony 30 ściołowy mieszanka IV - doświadcz. kapłony 30 ściołowy mieszanka + mleko (ostatnie 4 tyg.) Zabieg kastracji został przeprowadzony w znieczuleniu miejscowym przez lekarza weterynarii w 8. tygodniu życia ptaków, przy masie ciała ok. 620 g. Tucz kapłonów trwał do 20. tygodnia życia ptaków. Po zakończeniu tuczu z każdej grupy wybrano do uboju po 8 ptaków o masie ciała zbliżonej do średniej w grupie. Na fotografiach 1 i 2 przedstawiono różnice w wyglądzie kogutów i kapłonów. Wyniki uzyskane w trakcie realizacji badań zamieszczono na rycinach 1-4 oraz w tabelach 2-4. Fot. 1. Kogut R-11 x Ż-33 Fot. 2. Kapłon R-11 x Ż-33 96

42 A, B - wartości w wierszach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (P<0,01); a, b...- dla P<0,05 Oznaczenia jak wyżej Oznaczenia jak wyżej 97

43 Tabela 1. Barwa tuszki w skali: L*a*b* Wyszczególnienie Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 L* 69,86±1,41 Aa 70,34±1,66 a 72,04±1,04 Bb 72,28±0,65 Bb a* 5,85±1,04 Aa 5,80±0,90 a 4,65±1,14 Bb 4,70±0,39 b b* 12,05±1,87 a 12,27±1,53 a 14,44±2,03 b 14,71±0,83 b Oznaczenia jak wyżej Tabela 2. Kwasowość mięśni piersiowych i nóg Wyszczególnienie Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 ph 15 pierś 6,31±0,07 6,29±0,09 6,27±0,03 6,30±0,14 ph 24 pierś 5,75±0,11 5,89±0,24 5,71±0,19 5,76±0,13 istotność ** ** ** ** ph 24 noga 6,49±0,04 6,54±0,07 6,53±0,14 6,55±0,12 ph 24 noga 6,01±0,07 5,93±0,24 5,97±0,20 5,93±0,18 istotność ** ** ** ** A, B - wartości w wierszach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (P<0,01); a, b...- dla P<0,05 ** - wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (P<0,01); * - dla P<0,05 Podsumowując, zabieg kastracji mieszańców R-11 x Ż-33 wpłynął korzystnie na masę ciała i umięśnienie tuszki. Pomiędzy ocenianymi grupami ptaków odnotowano także zróżnicowanie w zakresie wybarwienia tuszek, które u kapłonowanych ptaków były jaśniejsze (L*) i bardziej żółte (b*), natomiast u kogutów bardziej czerwone (a*). Ponadto zarówno mięśnie piersiowe, jak i nóg kapłonów w stosunku do niekastrowanych ptaków wyróżniały się lepszą kruchością. Pod względem wszystkich ww. cech lepsze wyniki uzyskano u kapłonów żywionych paszą z 4% dodatkiem mleka. Aktualnie zebrane dane poddawane są analizie statystycznej. Z każdej tuszki pobrano próbki mięśni piersiowych i nóg, które przekazano do CL IZ PIB. W próbkach mięśni określony zostanie skład chemiczny mięsa. 98

44 W ramach realizacji zadania przeprowadzono kolejny eksperyment dotyczący badania umięśnienia i kości pulard ubijanych w różnym wieku. Odchów pulard trwał do 20. tygodnia. Wykonano dwa uboje doświadczalne w 16. i 20. tygodniu. Pobrano próbki mięsa i kości z nóg i przesłano w celu wykonania analiz chemicznych. Podczas ubojów pobrano także próbki krwi, aby określić poziom hormonów płciowych. W całym okresie odchowu, a szczególnie po zabiegu sterylizacji nie odnotowano żadnych padnięć. Masa ciała ptaków z grupy kontrolnej (kurki) była niższa niż pulard we wszystkich badanych okresach (Ryc. 5). Średni przyrost masy ciała zarówno dla kurek jak i pulard wynosił 97 g/tydzień. Jak wynika z ryc. 6 w czasie odchowu pulardy spożyły o 549 g więcej paszy niż kurki w przeliczeniu na 1 szt. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że pulardy uzyskały większą masę ciała w porównaniu z kurkami, ale równocześnie spożyły więcej mieszanki paszowej. Szczegółowe wyniki analiz chemicznych mięsa, kości i krwi będą omówione w 2018 roku realizacji, po przeprowadzeniu analiz chemicznych. 99

45 Zadanie Poprawa efektywności chowu zwierząt futerkowych Kierownik zadania: prof. dr hab. Paweł Bielański W bieżącym roku sprawozdawczym w ramach celu Zmiany aktywności trawiennej żołądka i jelit w okresie wzrostu młodych królików w zależności od systemu żywienia przeprowadzono badania mające na celu przetestowanie trzech mieszanek paszowych i ich wpływu na odchów młodych królików. Badania na zwierzętach przeprowadzono w sezonie wiosenno-letnim, w fermie królików należącej do Instytutu Zootechniki - Państwowego Instytutu Badawczego w Aleksandrowicach. Doświadczeniem objęto łącznie 120 sztuk królików, w tym 60 sztuk rasy nowozelandzkiej białej i 60 sztuk popielniańskich białych. Pełnodawkowa mieszanka standardowa, którą żywione były króliki z grupy I zawierała: susz z lucerny - 25%, otręby pszenne - 18,6%, śrutę jęczmienną - 26%, śrutę kukurydzianą - 14%, śrutę sojową poekstrakcyjną - 12%, preparat mlekozastępczy DOLMILK MD - 2%, fosforan wapnia - 1%, NaCl - 0,4% oraz dodatek mineralno-witaminowy. Premiks zawierał witaminy: A j.m./kg, D j.m./kg, E (Dl-Alpha Tokoferol) mg/kg, K 3-52 mg/kg, B 1-50 mg/kg, B mg/kg, B mg/kg, B mg/kg, B 6-50 mg/kg, B mcg/kg, biotyna mcg/kg, chlorek choliny mg/kg, kwas foliowy - 57 mg/kg, minerały: Fe mg/kg, Mn mg/kg, Cu mg/kg, Zn mg/kg, I mg/kg, Co mg/kg, Se - 20 mg/kg, Ca - 33,2 mg/kg. Do mieszanki dla grupy II wprowadzono 2% dodatek oleju lnianego, który zastąpił 1% śruty kukurydzianej i 1% suszu z lucerny. Grupa III żywiona była zielonką (400 g/dzień/szt.) i mieszanką granulowaną jak w grupie I. Najwyższą masę ciała w 90. dniu życia uzyskały króliki rasy NB (2529,3 g) w grupie II, gdzie mieszanka granulowana była natłuszczana olejem lnianym. Tabela 1. Masa ciała królików rasy PB i NB w 35., 70. i 90. dniu życia (g) Dane Rasa PB Rasa NB Grupa I Grupa II Grupa III Grupa I Grupa II Grupa III Masa ,2 664,1 652,3 728,0 733,7 718,4 Masa ,4a 2145,3a 1856,3b 2033,3a 2162,7a 1916,3b Masa ,2a 2480,1a 2259,1b 2433,0a 2529,3a 2348,3b Wartości oznaczone różnymi literami różnią się statystycznie p 0,05. Długość poszczególnych odcinków przewodu pokarmowego w 90. dniu życia królików różniła się pomiędzy rasami. Dłuższy przewód pokarmowy miały króliki rasy PB. Dla rasy NB stwierdzono statystycznie potwierdzone różnice (p 0,05) w długości jelita cienkiego i jelita czczego pomiędzy grupami I i II a III. W treści pokarmowej jelita ślepego u wszystkich sztuk badanych królików izolowano oocysty z rodzaju Eimeria. Najczęściej były to gatunki Eimeria. perforans, E. media i E. magna. U wszystkich sztuk padłych wyizolowano oprócz wyżej wymienionych gatunków Eimerii również Eimeria intestinalis, najbardziej chorobotwórczy gatunek dla tej grupy zwierząt, która nawet przy niewielkiej intensywności zarażenia, bo powyżej 1000 opg, może powodować skutek śmiertelny. W ramach celu Zmiany aktywności enzymów trawiennych w przewodzie pokarmowym norek w różnych okresach żywieniowych utworzono, na podstawie uzyskanych wyników 100

46 z pierwszych dwóch etapów, trzy grupy zwierząt żywionych dawką o zróżnicowanym poziomie białka i prebiotyku oddziaływującego na rozwój flory bakteryjnej: grupa I kontrolna, karma powszechnie stosowana na fermie, bez udziału dodatków, grupa II doświadczalna, karma z powszechnie stosowanym udziałem EM z białka i dodatkiem prebiotyku 0,2 g/szt./dziennie, grupa III doświadczalna, karma ze zwiększonym udziałem EM z białka i dodatkiem prebiotyku (0,2 g/szt./dziennie). W dawce udział poszczególnych pasz wynosił: pasze pochodzenia zwierzęcego 80% (w tym: 10% odpady rybne, 20% korpusy z indyka, 50% poubojowe odpady drobiowe), pasze pochodzenia roślinnego 10% (w tym: 2% oleju sojowego, 8% ekstrudera z pszenicy), dodatki witaminowe 1,5%, hemoglobina 1,5% i woda 7%. Co miesiąc, w okresie od odsadzenia aż do osiągnięcia dojrzałości zimowej okrywy włosowej, kontrolowano masę ciała młodych norek z poszczególnych grup. Masa ciała norek przy odsadzeniu była wyrównana w grupach dla samic i samców. Tendencja ta utrzymywała się w kolejnych miesiącach życia w przypadku samic, u których różnice średniej masy ciała były niewielkie i wynosiły od 0,01 do 0,11 g. U samców, w okresie odchowu od września do listopada, stwierdzone różnice masy ciała zostały potwierdzone statystyczne pomiędzy grupami: I a III i II a III (P 0,05) oraz II a III (P 0,01). W bieżącym roku część norek poddano ubojowi kontrolnemu w sierpniu i listopadzie. Pobrany materiał biologiczny (treść żołądka i jelit) przeznaczano do dalszych badań bakteriologicznych i oznaczenia enzymów trawiennych w treści pokarmowej. Wykonano pomiary poszczególnych organów i odcinków przewodu pokarmowego. Długość poszczególnych odcinków przewodu pokarmowego była na zbliżonym poziomie w przypadku przełyku, żołądka i jelita grubego. Większe różnice długości odnotowano dla jelita cienkiego i długości całkowitej przewodu. W listopadzie długość jelita cienkiego i całego przewodu była najdłuższa w grupie I, krótsza w grupie II odpowiednio o 15,9 i 13,5% i najkrótsza w grupie III o 17,3 i 14,5%. Zbadano także poziom ph żołądka i jelit, który u badanych norek kształtował się na poziomie 5,2-5,5 dla żołądka i 6,4-6,6 dla jelita grubego. W pobranej treści pokarmowej żołądka i jelit oznaczono: ogólną liczbę grzybów, liczebność bakterii tlenowych mezofilnych, E.coli, bakterii grupy Enterobacteriaceae, beztlenowców i salmonelli (tab. 6). Badania wykazały, że średnia koncentracja ogólnej liczby grzybów w treści żołądka była najwyższa w grupie III 9136 jtk/g i zdecydowanie niższa w grupie I i II odpowiednio o 2772 jtk/g oraz 2636 jtk/g. Prowadzono także na norkach badania nad poprawą wskaźników odchowu szczeniąt norek poprzez optymalizację środowiska. Materiał doświadczalny stanowiło 90 kotnych samic norek odmiany pastel, w pierwszym i drugim roku rozrodu. Utworzone zostały cztery grupy doświadczalne samic norek po 30 zwierząt w każdej, wyrównane pod względem wieku: - grupa I samice norek utrzymywane w klatkach z wykotnikiem z wkładem i lejkiem oraz ze słomą pszenną, - grupa II samice norek utrzymywane w klatkach z wykotnikiem z wkładem i lejkiem oraz ze słomą owsianą, - grupa III samice norek utrzymywane w klatkach wykotnikiem z wkładem oraz ze słomą pszenną, - grupa IV samice norek utrzymywane w klatkach z wykotnikiem z wkładem oraz ze słomą owsianą. W badanym roku odsetek samic rodzących kształtował się na poziomie 83-87% w grupach I i II oraz 77% w grupie III i IV. Liczba samic odchowujących norczęta była najwyższa w grupie II 80% i I 77%. Niższe wartości odnotowano w grupie III 63% i IV 60%. Liczba młodych urodzonych od jednej samicy była wyrównana i wahała się od 5,39 szt. w grupie III do 6,69 szt. w grupie II. Najmniej młodych martwo urodzonych w miocie było w grupie I i II odpowiednio 0,35 i 0,3 szt., 101

47 zaś najwięcej w grupie III i IV odpowiednio 0,5 i 0,6 szt. Największe upadki wśród młodych szczeniąt odnotowano w pierwszym tygodniu odchowu. Należy zaznaczyć, że najniższe upadki były w grupie I i II odpowiednio 11,68 i 14,19. W grupach III i IV odnotowano najwyższy procent upadków odpowiednio 22,58% i 23,26%. Fot. 1. Klatka z wykotnikiem systemu holenderskiego z wkładem i klatka z wykotnikiem z wkładem wraz z lejkiem Zadanie Badania jakości mięsa pochodzącego od przeżuwaczy ras objętych programem ochrony zasobów genetycznych z wykorzystaniem technik olfaktometrii Kierownik zadania: dr hab. Aldona Kawęcka Celem badań jest określenie cech jakościowych mięsa, pochodzącego od przeżuwaczy (owce, kozy, bydło) wybranych ras rodzimych, objętych programem ochrony zasobów genetycznych, ze szczególnym uwzględnieniem badania związków lotnych odpowiedzialnych za walory smakowo-zapachowe mięsa. W każdym celu szczegółowym uwzględniono następujące elementy metodyczne: ocena użytkowości mięsnej, właściwości fizykochemiczne mięsa, ocena sensoryczna po obróbce termicznej, badania związków lotnych mięsa. W okresie sprawozdawczym, w ramach badania jakości jagnięciny pozyskiwanej od owiec rodzimych ras z wykorzystaniem technik olfaktometrii, wyznaczono kluczowe, lotne związki organiczne (LZO) w próbkach pieczonego mięsa jagnięcego. Zastosowano analizę olfaktometryczną (GC-O), która łączy rozdział związków lotnych za pomocą chromatografii gazowej i detekcję ich za pomocą ludzkiego nosa. LZO rozdzielane na kolumnie chromatograficznej były jednocześnie wykrywane za pomocą detektora płomieniowo jonizującego (FID) i wąchane przez osobę analizującą aromat dzięki zastosowaniu podzielnika strumienia gazu nośnego opuszczającego kolumnę chromatograficzną. Wykonanie w takich samych warunkach analitycznych dodatkowej analizy z zastosowaniem jako detektora spektrometru masowego (GC-MS) pozwala na identyfikację LZO. Wartość wskaźnika FD (Factor Dilution) jest miarą natężenia zapachu danego związku lotnego. Im wyższa jest jego wartość, tym ma on większy udział w ogólnym aromacie wąchanej próbki. Wyznacza się go wykonując analizę zapachu kolejnych rozcieńczeń badanej próbki aż do momentu, w którym zapach przestanie być już wyczuwalny. W próbce pieczonego mięsa pochodzącego z udźca owcy wrzosówki operatorzy wyczuli ogółem 95 LZO. Natomiast po analizie AEDA stwierdzono obecność 3 LZO o faktorze rozcieńczenia 128, 5 LZO z FD=32, 19 LZO z FD=8 i 12 LZO z FD=2. Aktualnie trwają prace prowadzące do zidentyfikowania tych związków z nazwy. Wyniki analizy metodą AEDA (Aroma Extract Dilution Analysis) dla pieczonej jagnięciny w postaci chromatogramu (FID) oraz aromagramu (FD) przedstawiono na rys

48 Rys. 1. Chromatogram i aromagram dla próbki pieczonego mięsa W ramach kontynuacji badań obejmujących charakterystykę jakości mięsa kóz wybranych ras występujących w Polsce, w tym objętych Programem ochrony zasobów genetycznych z wykorzystaniem technik olfaktometrii wykonano ocenę jakości mięsa koziołków rasy karpackiej (ubój w wieku 10 i 12 m-cy życia). Nie stwierdzono różnic w zawartości poszczególnych składników w zależności od terminu uboju. W ocenie organoleptycznej stwierdzono różnice w odniesieniu do barwy pieczonego udźca, zapachu, soczystości i smaku. Oceniający wszystkie cechy mięsa ocenili wyżej dla grupy zwierząt starszych. Ich mięso było ciemniejsze, bardziej aromatyczne, bardziej kruche i soczyste (tab. 1). Tab. 1. Właściwości organoleptyczne mięsa koziego Wyszczególnienie barwa zapach soczystość kruchość smak Tab 2. Skład kwasów tłuszczowych mięsa koźlęcego (%) Koziołki Koziołki Wyszczególnienie 10 m-cy 12 m-cy 10 m-cy 12 m-cy 4,25A 4,23A 4,08A 4,17A 4,29A 4,48B 4,53B 4,42B 4,51B 4,56B SFA UFA MUFA PUFA PUFA-6 PUFA-3 36,073 63,926 40,706a 23,221A 19,878A 2,75 34,879 65,121 35,380b 29,740B 27,101B 2,406 Mięso koźląt młodszych zawierało więcej kwasów MUFA, natomiast starszych więcej wielonienasyconych (PUFA) 103

49 W obrębie badań dotyczących określenia zależności między związkami zapachowymi a ich percepcją w mięsie buhajów różnych ras żywionych dawką ze zwiększonym udziałem nienasyconych kwasów tłuszczowych zakończono tucz buhajków rasy polskiej czerwono-białej i rasy simentalskiej (18 m-cy). Poubojowo została określona wydajność rzeźna, masa produktów ubocznych, ubytek tuszy podczas schładzania, klasyfikacja tuszy według skali EUROP, masa wyrębów wartościowych, właściwości fizykochemiczne mięsa. Próbki mięsa mięśnia najdłuższego grzbietu przekazano do oceny chemicznej i rozpoczęto analizy związków zapachowych. Tab. 3. Wybrane wskaźniki wartości rzeźnej buhajków Rasa polska Rasa Wyszczególnienie czerwono simentalska -biała wiek w dniu uboju, d masa przed ubojem, kg masa zimna, kg wydajność rzeźna % masa prawej półtuszy, kg masa wyrębów wartościowych, kg udział wyrębów wartościowych, % ,5 343,5 55,0 170,3 108,05 63, , ,9 181,1 114,0 63,05 Buhajki rasy simentalskiej uzyskały wyższą końcową masę ciała i nieco wyższe dobowe przyrosty, miały również przewagę nad buhajkami rasy zachowawczej w zakresie wydajności rzeźnej, a także masie wyrębów wartościowych. Mimo to procentowy udział cenniejszych wyrębów był dla obu ras porównywalny (63%). Tab. 4. Wpływ rasy na wyniki analizy fizykochemicznej mięsa Rasa polska Rasa simentalska Wyszczególnienie czerwono -biała Ubytek termiczny, % ph, 48h Barwa L a* b* Siła cięcia, N 33,6 5,83 34,3 19,2 5,07 120,1 32,6 5,83 34,9 18,07 5,2 124,6 Zarówno rasa, jak i zastosowany rodzaj makuchu w dawce miał wpływ na wyniki oceny fzykochemicznej mięsa buhajków. Mięso pochodzące od buhajków zachowawczych uzyskało wyższe noty w ocenie sensorycznej, szczególnie w odniesieniu do natężenia smaku i zapachu. Ocena sensoryczna mięsa pochodzącego od buhajków żywionych makuchami lnianym i rzepakowym była dość wyrównana. Zadanie Wytworzenie polskiej rasy syntetycznej królików Kierownik zadania: prof. dr hab. Dorota Kowalska Celem badań jest wytworzenie polskich syntetycznych linii ojcowskich (Ch1) i matczynych (Ch2) królików w oparciu o dwie rasy: zachowawczą popielniańską białą i termondzką białą wraz z opracowaniem kryteriów selekcji tych linii w celu poprawy produkcyjności oraz ekonomiki ferm produkcyjnych. W bieżącym roku sprawozdawczym prowadzono badania jednocześnie na obu wymienionych wyżej rasach. Utworzono po 6 grup rodzinnych składających się z 1 samca i 5 samic. Samice były kryte trzykrotnie w ciągu roku, a ocenę stada podstawowego przeprowadzano na podstawie sztuk urodzonych we wszystkich miotach. Układ grup rodzinnych obejmował: grupa A - PB x TB, grupa B - TB x PB. W linii ojcowskiej (Ch1) selekcja opierała się na maksymalnej ilości sztuk urodzonych w miocie, maksymalnym tempie wzrostu całości potomstwa i osiągania najwyższej masy ciała w wieku 90 dni, czyli na zakończenie okresu tuczu. W linii matczynej (Ch2) selekcja opierała się na 104

50 mleczności, maksymalnej ilości sztuk odchowanych w miocie, maksymalnego tempa wzrostu całości potomstwa i osiągania najwyższej masy ciała w wieku 90 dni, czyli na zakończenie okresu tuczu. W każdej z grup doświadczalnych zbierano następujące dane: liczebność i masa ciała jednej sztuki w 24 godziny po urodzeniu, liczebność i masa ciała jednej sztuki w 21. dniu życia (celem określenia mleczności matek), liczebność i masa ciała królików w wieku 35 dni przy rozpoczęciu okresu tuczu, liczebność i masa ciała królików w wieku 70 i 90 dni, przyrosty dzienne masy ciała od urodzenia do 21. dnia życia, od 35. do 90. dnia życia i od urodzenia do 90. dnia życia oraz procent upadków za cały okres tuczu. W tabeli 1 przedstawiono średnią masę jednej sztuki, liczebność miotu i przyrosty dzienne w określonych dniach życia królicząt urodzonych po samcach rasy PB i samicach rasy TB, za trzy kolejne mioty samic w danej grupie rodzinnej. Statystycznie potwierdzone różnice (p 0,05) stwierdzono jedynie w masie ciała jednej sztuki w 70. dniu życia pomiędzy grupą rodzinną 1 a 4. Różnice te nie wystąpiły jednak na zakończenie tuczu, tj. w 90. dniu życia. Tabela 1. Średnia masa jednej sztuki, liczebność i przyrosty dzienne w poszczególnych dniach życia królicząt w grupach rodzinnych z kolejnych trzech miotów samic Samce PB x samice TB Grupa rodzinna Liczeb. miotu w dniu urodzenia (szt.) Masa 1 sztuki w dniu urodzenia (g) Liczeb. miotu w 21. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 21. dniu (g) Liczeb. miotu w 35. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 35. dniu (g) Liczeb. miotu w 70. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 70. dniu (g) Liczeb. miotu w 90. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 90. dniu (g) Przyrosty dzienne od dnia życia (g) 1 7,86 61,5 7,73 331,3 7,20 605,2 7, ,1a 6, ,8 34,8 2 7,86 60,1 7,66 327,8 7,40 582,9 7, ,5 7, ,6 34,5 3 8,00 61,7 8,00 333,1 7,46 607,7 7, ,0 7, ,4 34,1 4 8,40 59,5 7,86 333,3 7,60 596,8 7, ,7a 7, ,5 34,9 5 8,73 59,7 8,06 332,5 7,46 601,9 7, ,0 6, ,0 34,6 6 8,00 59,9 7,86 329,9 7,40 586,1 7, ,5 6, ,3 34,6 Wartości średnie ( x ) oznaczone tymi samymi literami w kolumnach różnią się statystycznie istotnie na poziomie: a, b p 0,05 Podobne zestawienie obejmuje tabela 2, dotyczy ono jednak samców rasy TB i samic rasy PB. Najwyższą liczebność miotu urodzonego i odchowanego stwierdzono w grupie rodzinnej 4. Statystycznie potwierdzone różnice (p 0,01) stwierdzono w 90. dniu życia królicząt pomiędzy grupą 4 a 1 i 3. Nie stwierdzono różnic pomiędzy grupami rodzinnymi w masie ciała jednej sztuki w poszczególnych dniach odchowu oraz w przyrostach dziennych. 105

51 Tabela 2. Średnia masa jednej sztuki, liczebność i przyrosty dzienne w poszczególnych dniach życia królicząt w grupach rodzinnych z kolejnych trzech miotów samic Grupa rodzinna Liczeb. miotu w dniu urodzenia (szt.) Masa 1 sztuki w dniu urodzenia (g) Liczeb. miotu w 21. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 21. dniu (g) Samce TB x samice PB Liczeb. miotu w 35. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 35. dniu (g) Liczeb. miotu w 70. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 70. dniu (g) Liczeb. miotu w 90. dniu (szt.) Masa 1 sztuki w 90. dniu (g) Przyrosty dzienne od dnia życia (g) 1 7,26Aa 62,2 7,06AB 347,3 6,86A 604,9 6,73a 2165,7 6,66A 2528,0 35,6 2 8,46a 61,4 8,26Aa 345,4 7,73 603,6 7, ,8 7, ,2 34,8 3 7,60 65,4 7,40a 347,5 7,00B 597,5 6,73b 2152,7 6,73B 2527,8 35,7 4 8,46A 61,1 8,26B 327,1 8,26AB 588,4 7,86ab 2022,0 7,66AB 2501,5 35,4 5 7,80 61,5 7,66 329,7 7,53 589,7 7, ,1 7, ,9 35,6 6 7,73 62,8 7,66 357,3 7,46 619,1 7, ,3 7, ,6 35,5 Wartości średnie ( x ) oznaczone tymi samymi literami w kolumnach różnią się statystycznie istotnie na poziomie: A, B p 0,01; a, b p 0,05 W tabelach 3 i 4 porównano grupy rodzinne A i B pod względem cech produkcyjnych. W grupie rodzinnej B uzyskano istotnie wyższą masę ciała królicząt (p 0,01) w dniu urodzenia, w 21. i 90. dniu życia. W 70. dniu życia królicząt masa ciała różniła się pomiędzy grupami rodzinnymi A i B istotnie na poziomie p 0,05. Statystycznie potwierdzone różnice na korzyść grupy rodzinnej B (p 0,05) dotyczyły również przyrostów dziennych od urodzenia do 21. dnia życia, między 35 a 90 dniem życia (p 0,01) oraz między 1 a 90 dniem życia (p 0,01). Nie stwierdzono statystycznie potwierdzonych różnic w liczbie urodzonych i odchowanych królicząt. Tabela 3. Porównanie grup rodzinnych A i B pod względem cech produkcyjnych do 21. dnia życia królicząt Grupa rodzinna Urodzone (szt.) Odchowane (szt.) % padnięć Przyrosty dzienne od urodzenia do 21. dnia życia (g) Przyrosty dzienne od 35. do 90. dnia życia (g) Przyrosty dzienne od urodzenia do 90. dnia życia (g) A( PB x TB) ,9 12,9a 34,6A 26,7A B( TB x PB) ,29 13,3a 35,5A 27,3A Wartości średnie ( x ) oznaczone tymi samymi literami w kolumnach różnią się statystycznie istotnie na poziomie: A, B p 0,01; a, b p 0,05 Grupa rodzinna Tabela 4. Porównanie grup rodzinnych A i B pod względem cech produkcyjnych od 35. do 90. dnia życia królicząt Średnia ilość młodych w 35. dniu (szt.) Średnia masa ciała 1 szt. w 35. dniu życia (g) Średnia ilość młodych w 70. dniu (szt.) Średnia masa ciała 1 szt. w 70. dniu życia (g) Średnia ilość młodych w 90. dniu (szt.) Średnia masa ciała 1 szt. w 90. dniu życia (g) Przyrosty dzienne od 35. do 90. dnia życia (g) A( PB x TB) 7,42 596,8 7, ,8a 7, ,3A 34,6A B( TB x PB) 7,47 600,6 7, ,9a 7, ,2A 35,5A Wartości średnie ( x ) oznaczone tymi samymi literami w kolumnach różnią się statystycznie istotnie na poziomie: A, B p 0,01; a, b p 0,05 106

52 Analizując dotychczas uzyskane wyniki należy stwierdzić, że o ile liczebność miotów obydwu ras jest zadawalająca, o tyle konieczne jest zwiększenie masy ciała w 70. dniu życia zwierząt. Zadanie Ocena właściwości fizycznych i chemicznych jaj wybranych populacji drobiu wodnego utrzymywanego w Polsce Kierownik zadania: dr inż. Lidia Lewko Celem przeprowadzonych badań była ocena bioróżnorodności drobiu wodnego na podstawie określenia fizykochemicznych cech jaj pochodzących ze stad hodowlanych, objętych programem ochrony zasobów genetycznych zwierząt oraz komercyjnych utrzymywanych w Polsce. Warunki technologiczne w trakcie odchowu ptaków były zgodne z ogólnymi założeniami dla tego typu produkcji. Ptaki żywione były do woli mieszankami paszowymi o jednakowej wartości pokarmowej, odpowiedniej dla danego okresu wzrostu. Zgodnie z założoną metodyką od kaczek i gęsi będących w końcowym okresie nieśności (18-22 tydz.) kolejnego sezonu użytkowania pobrano jaja do badań następujących parametrów: masa jaja i jego podstawowych frakcji, cechy jakości białka (wysokość, jednostki Haugha, wartość ph), żółtka (barwa, wartość ph) i skorupy (grubość, wytrzymałość, gęstość, barwa, porowatość, powierzchnia). Określono ponadto procentową zawartość wody w białku i żółtku jaj oraz przeprowadzono analizę czynnej substancji we frakcjach białka jaj, tj. lizozymu (aktywność hydrolityczna, procentowa zawartość). Z każdej grupy pobrano losowo po 30 sztuk jaj do badań. Badania cech fizycznych i chemicznych jaj przeprowadzono w pracowni Stacji Zasobów Genetycznych Drobiu Wodnego w Dworzyskach należącej do Instytutu Zootechniki PIB Zakładu Doświadczalnego Kołuda Wielka z wykorzystaniem aparatury odpowiedniej do tego typu pomiarów. Dokonano analizy parametrów wylęgowości w grupach ptaków objętych badaniami. Spośród analizowanych grup doświadczalnych kaczek, jaja ptaków P-8 objętych programem ochrony zasobów genetycznych zwierząt cechowały się największą masą (93,04 g), masą białka (49,79 g), a także najcięższymi skorupami (12,46 g) o największej ich powierzchni (97,14 cm 2 ). W grupie tej wykazano aż 15,58% zamarłych zarodków, co było istotne (p 0,05) wobec grup: KhO-1, P-9, P-33, LsA i D-11. Najbardziej kulisty kształt wyróżniał jaja pozyskane od kaczek pomniejszonych K-2 (74,67%), które odznaczały się najmniej korzystnymi parametrami skorupy, tj.: najmniejszą masą (9,77 g), grubością (345,1 µm) Fot. 1. Para kaczek typu pekin P-8 i wytrzymałością (32,41 N). Natomiast jaja kaczek komercyjnego stada Star 53 H.Y. cechowały się największym procentowym udziałem białka w jaju (54,53%), przy jednocześnie najmniej korzystnych jego cechach jakościowych najmniejszej wysokości (5,11 mm) i jednostkach Haugha (57,92). 107

53 Fot. 2. Zróżnicowanie jaj kaczek pochodzących ze stad objętych programem ochrony zasobów genetycznych zwierząt Fot. 3. Pomiar wysokości białka gęstego oraz wybarwienia żółtka jaja kaczego (P-8) W przypadku doświadczalnych stad gęsi, jajami o największej masie (171,7 g), masie żółtka (65,37 g) i skorupy (34,75 g) charakteryzowały się gęsi komercyjnego stada W-31. Ta grupa cechowała się także najkorzystniejszym wskaźnikiem wylęgowości z jaj zapłodnionych (85,98%), co było różnicą statystycznie istotną (p 0,05) wobec ptaków LsD-01, Ga, Pd, Ki i Lu. Z kolei najkorzystniejszymi cechami jakości białka, tj. największą wysokością (9,23 mm) i jednostkami Haugha (77,05) wyróżniały się jaja gęsi rypińskich (Ry). Natomiast ptaki pochodzące ze stada LsD-01 znosiły jaja o największym procentowym udziale wody w białku (89,80%) i żółtku (48,10%) i w grupie tej stwierdzono najniższe zapłodnienie (85,49%). Fot. 4. Para gęsi garbonosych (Ga) Fot. 5. Pomiar aktywności hydrolitycznej lizozymu we frakcjach białka jaja - spektrofotometr Metertech SP-830 plus 108

54 Zadanie Analiza rodzaju i częstotliwości występowania wad dyskwalifikujących z hodowli konie wybranych ras rodzimych Kierownik zadania: dr inż. Marta Pasternak Celem badań jest analiza rodzaju i częstotliwości występowania wad dyskwalifikujących konie wybranych ras rodzimych z hodowli. Dane zebrane w 1., 2. i 3. roku podczas przeglądów hodowlanych (informacje i materiał biologiczny gromadzone będą w Zakładach IZ PIB w Balicach oraz w bazie danych Bio_konie). Uzyskane wyniki zostaną przeanalizowane pod kątem: określenia rodzaju, częstości występowania oraz powtarzalności zaobserwowanych wad (budowy, pokroju, ruchu i in.), określenia wad charakterystycznych dla danej rasy/typu, stopnia przekazania wad potomstwu w przypadku oceny osobników pochodzących z jednej linii/posiadających wspólnych przodków, możliwych przyczyn występowania zaobserwowanych wad (czynniki genetyczne, wady wrodzone, rozwojowe, nabyte), eliminacji nieprawidłowości budowy poprzez odpowiednią selekcję i poprawę cech przy doborze par do rozpłodu, przygotowania koni do przeglądu i ich zachowania podczas oceny, określenia skali występowania odmian i ich charakterystyki, weryfikacji umaszczenia metodą PCR w przypadku braku możliwości odróżnienia minimalnego wzoru srokatości tobiano (krypto-tobiano) od odmian (konie rasy huculskiej). W bieżącym, pierwszym roku sprawozdawczym, badaniami objęto łącznie 133 konie. Dla 122 koni zimnokrwistych w typie sztumskim i sokólskim przeprowadzono ocenę występowania wad związanych z typem, budową i pokrojem. W przypadku koni huculskich skupiono się na występowaniu odmian jako cechy niepożądanej i eliminującej konie tej rasy z hodowli. Odmiany zidentyfikowano i opisano u 11 koni huculskich. 1. Wybrane konie zimnokrwiste w typie sztumskim i sokólskim zgłoszone na przeglądy hodowlane poddano ocenie typu i budowy mającej na celu zgromadzenie jak największej liczby informacji dotyczących wad budowy oraz cech niepożądanych i wymagających poprawy. Ze względu na ciągłą konsolidację typu koni sztumskich i sokólskich, pod szczególną uwagę brano wady, które były wyraźnie widoczne. a) Liczba osobników poddanych ocenie: 122, w tym: 2 ogiery i 53 klacze zimnokrwiste w typie sokólskim, łącznie: 55 sztuk 2 ogiery i 65 klaczy zimnokrwiste w typie sztumskim, łącznie: 67 sztuk Uzyskane dane zestawiono w tabelach, uwzględniając: rasę, płeć, wiek, wady wyszczególnione dla: typu, głowy i szyi, kłody, zadu, kończyn przednich, kończyn tylnych, kopyt, zgryzu i ruchu osobno uwzględniono konie, które nie uzyskały kwalifikacji do hodowli. 109

55 Tabela. 1. Przykładowe zestawienie ocenianych klaczy w typie sokólskim b) Liczba osobników posiadających wady oraz cechy niepożądane związane z typem, budową i ruchem: 39 koni zimnokrwistych w typie sokólskim spośród 55 sztuk, co daje 70,9% 41 koni zimnokrwistych w typie sztumskim spośród 67 sztuk, co daje 61,2% 110

56 c) Konie zimnokrwite w typie sokólskim niezakwalifikowane do hodowli: 1 ogier nie uzyskał licencji do krycia klaczy sokólskich ze względu na nieprawidłowy typ, 1 klacz zgłoszona jako sokólska nie uzyskała kwalifikacji ze względu na nieprawidłowy typ, 1 klacz sokólska nie uzyskała kwalifikacji ze względu na nieprawidłowy ruch. d) Konie zimnokrwiste w typie sztumskim niezakwalifikowane do hodowli: 1 klacz sztumska nie uzyskała kwalifikacji ze względu na szczupaczy zgryz, 1 klacz zgłoszona jako sztumska nie uzyskała kwalifikacji ze względu na nieprawidłowy typ, 1 klacz zgłoszona jako sztumska nie uzyskała kwalifikacji z powodu nieprawidłowego pochodzenia. e) Przykładowe wady zidentyfikowane u koni zimnokrwistych w typie sokólskim i sztumskim. Fot Od lewej: postawa francuska, postawa szpotawa, jelenia szyja i krótki, stromy staw pęcinowy (kozie kopyto), szczupaczy zgryz 2. Od 11 koni rasy huculskiej posiadających odmiany będące cechą przyczyniającą się do eliminacji z hodowli zgromadzono materiał biologiczny. Dodatkowo jedna z próbek pobrana została od młodej klaczy, której umaszczenie jest dyskusyjne ze względu na obecność białych plam na nogach. Klacz pochodzi od matki o umaszczeniu srokatym, posiadającej podobny wzór białych plam, stąd podejrzenie, że córka odziedziczyła po matce gen srokatości. Białe plamy na nogach mogą okazać się odmianami, przez które klacz może zostać wyeliminowana z hodowli. W tym przypadku konieczna jest weryfikacja umaszczenia metodami molekularnymi, czyli przebadanie pod kątem obecności inwersji w chromosomie 3, która wykaże czy klacz posiada gen warunkujący prawidłowe u koni huculskich srokate umaszczenie. Fot Klacz o umaszczeniu wymagającym weryfikacji (wzór srokatości krypto-tobiano lub odmiany) 111

57 Fot Przykładowe odmiany u koni rasy huculskiej, od których zgromadzono materiał biologiczny Podsumowując, w pierwszym roku sprawozdawczym, badaniami objęto łącznie 133 konie. Dla 122 koni zimnokrwistych w typie sztumskim i sokólskim przeprowadzono ocenę typu oraz identyfikację wad budowy i pokroju. Spośród badanych osobników wyodrębniono te, które z różnych powodów nie zostały zakwalifikowane do hodowli. W przypadku koni huculskich pobrano materiał biologiczny od 11 osobników z odmianami, które zostaną szczegółowo scharakteryzowane pod kątem posiadanej cechy, będącej częstą przyczyną eliminacji koni tej rasy z hodowli. Pobrano także materiał biologiczny od klaczy wymagającej weryfikacji umaszczenia metodami molekularnymi, która wykaże czy klacz ta posiada prawidłowe, srokate umaszczenia (krypto-tobiano) czy niepożądane odmiany. Zadanie Opracowanie metody oceny budowy i funkcjonalności aparatu ruchowego u koni Kierownik zadania: dr inż. Iwona Tomczyk-Wrona W pierwszym roku realizacji zadania doprecyzowano metodykę oraz sposób zbierania danych i przeprowadzenia doświadczenia. Dopracowano sposób wyznaczania i oznakowania fizjologicznych punktów pomiarowych na skórze konia, służących do wyznaczenia teoretycznych osi podparcia kończyn przednich i tylnych. Wykonano próbne zdjęcia z uwzględnieniem wyznaczonych punktów fizjologicznych. Obserwacjom poddano konie w różnym wieku, w tym: 35 koni w ZZD IZ Odrzechowa, 10 koni w SK Izby, 20 koni w SKH Gładyszów. Analiza dotychczas zgromadzonego materiału posłuży również do wybrania odpowiedniego oprogramowania do komputerowej analizy obrazu cech ocenianych według założeń metodyki. 112

58 OBSZAR TEMATYCZNY 4 GENOMIKA I BIOLOGIA MOLEKULARNA ZWIERZĄT Zadanie Opracowanie metody skanowania genomu zwierząt gospodarskich w oparciu o sekwencjonowanie następnej generacji Kierownik zadania: dr inż. Artur Gurgul Celem zadania było opracowanie metody genotypowania przez sekwencjonowanie dla wybranych gatunków zwierząt. W badaniach uwzględnione zostało bydło, jako gatunek dla którego konieczne jest wypracowanie alternatywnej dla mikromacierzy metody genotypowania, owce, konie oraz inne gatunki dla których brak jest dostępnych komercyjnie narzędzi genomicznych. Uzasadnieniem podjęcia badań jest dynamiczny rozwój metod molekularnych w genetyce, który wymusza ciągłe aktualizowanie warsztatu badawczego i podążenie za najnowszymi trendami światowymi. Selekcja genomowa bydła prowadzona w oparciu o markery molekularne jest obecnie rutynowo stosowana w niektórych państwach europejskich i stała się oficjalną metodą oceny zwierząt również w Polsce. Obecnie, skanowanie genomu bydła w ramach selekcji genomowej prowadzone jest z wykorzystaniem mikromacierzy genotypowych wysokiej gęstości, które według wiarygodnych przesłanek w najbliższych latach zostaną wyparte przez metodę wysokowydajnego sekwencjonowania. Szczególnie interesująca w tym zakresie wydaje się być metoda genotypowania przez sekwencjonowanie (GBS), która pozwala na analizę zbliżonej do mikromacierzy liczby polimorfizmów z porównywalną wiarygodnością, a dodatkowo pozwala na badanie genomów gatunków, dla których nie są dostępne komercyjnie mikromacierze genotypowe lub o nieustalonej dotychczas sekwencji genomów. W ramach realizacji badań przeprowadzono optymalizację warunków trawienia genomowego DNA z wykorzystaniem różnych często tnących enzymów restrykcyjnych (ApekII; MspI, PstI). W oparciu o obraz elektroforetyczny, do dalszych analiz wytypowano enzym PstI, jako endonukleazę trawiącą DNA ssaków w sposób najbardziej losowy, bez nadreprezentacji powtarzalnych regionów genomu. Z uwzględnieniem sekwencji miejsca cięcia tego enzymu, z wykorzystaniem optymalnego narzędzia internetowego - GBS Barcode Generator, zaprojektowano zestaw 48 indeksowanych adapterów, pozwalających na wysoki stopień multipleksowania badanych próbek. Testy wydajności ligacji adapterów do miejsc cięcia enzymu w genomowym DNA przeprowadzono w oparciu o dwa losowo wybrane adaptery. Po ligacji i amplifikacji otrzymanych fragmentów stwierdzono obecność prawidło wych bibliotek do sekwencjonowania następnej generacji. W ramach dalszych badań wytypowano zbiory zwierząt, przynależące do różnych ras i gatunków, zgodnie z założeniami doświadczenia. Analiza dostępnej literatury pozwoliła także na wytypowania oprogramowania TASSEL, jako optymalnego do dalszych analiz wyników sekwencjonowania. W ramach dalszych badań zgromadzono materiał biologiczny od 48 sztuk była, 48 sztuk koni oraz 48 owiec należących do pięciu różnych ras (w obrębie każdego gatunku). Dodatkowo, jako próby pochodzące od zwierząt nieposiadających referencyjnej sekwencji genomu, pozyskano materiał biologiczny od 22 dzięciołów (dwa podgatunki: Dendrocopos syriacus i Dendrocopos major) oraz 26 ślimaków (Caucasotachea vindobonensis, zebranych z rożnych lokalizacji geograficznych). Z pozyskanego materiału wyizolowano DNA 113

59 i przygotowano biblioteki do sekwencjonowania zgodnie z opracowanym we wcześniejszym etapie protokołem. Biblioteki pozyskane z wykorzystaniem enzymu PstI zawierały niewielką ilość sekwencji powtarzalnych w przypadku bydła i koni, pośrednią w przypadku owiec, natomiast najgorszą jakość bibliotek zaobserwowano u ślimaków z widocznymi prążkami sekwencji satelitarnych. Otrzymane biblioteki poddano sekwencjonowaniu na urządzeniu HiScanSQ, przy długości odczytu 50 pz. Prawdopodobnie ze względu na obecność licznych fragmentów DNA w badanych bibliotekach nieposiadających adapterów, otrzymano zróżnicowaną liczbę odczytów dla poszczególnych gatunków. Odczyty otrzymane dla bydła, koni i owiec poddano kontroli jakości i przenalizowano z wykorzystaniem oprogramowania TASSEL. Analiza obejmowała: identyfikację unikalnych odczytów i określenie ich liczby, mapowanie tagów sekwencyjnych do genomu referencyjnego, identyfikację polimorfizmów w obrębie tagów oraz filtrację otrzymanych genotypów. Rys. 1. Drzewo filogenetyczne poszczególnych ras bydła, koni i owiec wykreślone na podstawie danych genotypowych uzyskanych z wykorzystaniem genotypowania przez sekwencjonowanie Dla wspomnianych gatunków o znanej sekwencji referencyjnej wykryto od tys. SNP (w zależności od głębokości sekwencjonowania), a genotypy wykorzystano do analiz populacyjnych. Dla zwierząt nieposiadających sekwencji referencyjnej, z wykorzystaniem programowania GBS-SNP-CROP zidentyfikowano od 1100 do 2500 polimorfizmów. Wynik analiz populacyjnych wskazał, że za pomocą zidentyfikowanych SNP jest możliwe prawidłowe rozróżnienie struktury genetycznej badanych gatunków i przydzielenie odpowiednich zwierząt do poszczególnych ras (Rys 1.) czy miejsca pochodzenia w przypadku zwierząt wolnożyjących. SNP zidentyfikowane u bydła poddano dodatkowo walidacji z wykorzystaniem genotypów otrzymanych z wykorzystaniem mikromacierzy genotypowych. Dla 44 wspólnych SNP stwierdzono średnią zgodność genotypów dla poszczególnych zwierząt na poziomie 91.9% (±7.3), co wynika prawdopodobnie z małej głębokości sekwencjonowania uzyskanej dla tego gatunku. 114

60 Podsumowując, otrzymane w trakcie realizacji zadania wyniki pozwoliły na przetestowanie całego procesu analitycznego genotypowania przez sekwencjonowanie w praktyce oraz zidentyfikowanie wariantów polimorficznych genomu, przydatnych w analizach populacyjnych u różnych gatunków zwierząt gospodarskich. Pozwala to na stwierdzenie, że opracowana metoda może stanowić narzędzie do analiz genetycznych w skali genomu. Zadanie Ocena możliwości weryfikacji rasowej pierza gęsi w oparciu o markery molekularne Kierownik zadania: prof. dr hab. Monika Bugno-Poniewierska Gęś Biała Kołudzka jest obecnie najpowszechniej występującą w Polsce rasą gęsi, stanowiącą 90% pogłowia krajowego. Rasa ta została wyprowadzona w wyniku prac hodowlanych z gęsi białej włoskiej w Kołudzie Wielkiej i jest niewątpliwym sukcesem polskiej zootechniki. Gęś Biała Kołudzka stanowi słynny na całą Europę produkt eksportowy pod względem doskonałych właściwości mięsa jak również pierza, które jest wykorzystywane do produkcji wysokiej jakości poduszek, kołder oraz odzieży, docenianego nawet na rynku azjatyckim (Badowski, 2012). W związku z rosnącym zapotrzebowaniem konsumentów na wysokiej jakości produkty zwierzęce pozyskiwanie od specyficznych ras oraz możliwością zafałszowań finalnego produktu materiałem pozyskanym od innych ras oraz gatunków, celem zadania jest określenie możliwości identyfikacji przynależności rasowej wykorzystywanego do produkcji wysokiej jakości poduszek, kołder oraz odzieży, pierza gęsi hodowanych w Polsce. Badania ukierunkowane są na opracowanie narzędzia molekularnego, pozwalającego na weryfikację jakości i zgodności produktu z deklaracjami producenta. Projekt obejmuje opracowanie zagadnień wstępnych odnośnie możliwości uzyskiwania wysokiej jakości DNA z pierza gęsi oraz zastosowanie dostępnych dla drobiu narzędzi molekularnych dla planowanych celów. Badania stanowią wstęp do określenia możliwości opracowania testu diagnostycznego pozwalającego na jednoznaczne przypisanie produktu do rasy od jakiej został on pozyskany. Należy podkreślić, że brak wystarczającej ilości wytypowanych markerów molekularnych limituje poznanie pokrewieństwa i genetycznych zależności pomiędzy i w obrębie populacji wielu gatunków zwierząt. Zróżnicowanie genetyczne dużej liczby gatunków gęsi na całym świecie pozostaje słabo poznane na poziomie molekularnym. Głównym narzędziem pozwalającym na scharakteryzowanie zróżnicowania genetycznego zwierząt hodowlanych jest analiza polimorfizmów mikrosatelitarnego DNA, który jest słabo poznany u gęsi. Pokrewieństwo pomiędzy rasami oraz różnorodność genetyczna gęsi nie została dotychczas zbadana na poziomie molekularnym, a zalecany panel mikrosatelitów do badań identyfikacyjnych nie został jeszcze do końca dopracowany. Testy wykorzystujące polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych dają wysoką powtarzalność wyników, dlatego też z powodzeniem są wykorzystywane do identyfikacji osobniczej oraz kontroli pochodzenia (Charon i Świtoński, 2004). Niezwykle przydatnym narzędziem genetyki molekularnej jest również analiza genomu mitochondrialnego, charakteryzującego się szybkim tempem ewolucji przy jednoczesnym konserwatyzmie długości sekwencji, kodowanych genów i ich organizacji (Ramirez i wsp., 1993). Sekwencją nukleotydową wykazującą największą zmienność i częstość mutacji w genomie mitochondrialnym jest region kontrolny (D-loop), który może znaleźć zastosowanie jako marker, pozwalający na badanie struktury populacji oraz filogenezę blisko spokrewnionych gatunków (Ruokonen i wsp., 2002). Rozwój wysokoprzepustowych technik molekularnych, 115

61 a w tym genotypowania przez sekwencjonowanie (GBS), daje możliwość szerokiego zastosowania markerów genetycznych w badaniach populacyjnych oraz charakterystyce genomu. Genotypowanie przez sekwencjonowanie jest stosunkowo prostą, powtarzalną i multipleksową metodą opartą o platformy sekwencjonowania następnej generacji. Została opisana po raz pierwszy przez Elshire i wsp. w 2011 i w odróżnieniu od sekwencjonowania genomowego, pozwala na analizowanie jedynie pewnych frakcji genomu w poszukiwaniu polimorfizmów pojedynczych nukleotydów - SNP (De Donato i wsp., 2013). Markery otrzymane podczas GBS są równomiernie rozmieszczone w całym genomie badanego organizmu, co nadaje im charakter markerów genomowych. Metoda GBS okazuje się być niezwykle przydatna, gdyż umożliwia badania genomu zwierząt, dla których nie opracowano dotychczas pełnej sekwencji genomu oraz odpowiednich macierzy. Genotypowanie przez sekwencjonowanie dostarcza informacji o potencjalnych markerach oraz otaczających go sekwencjach bez poznania dokładanej lokalizacji genomowej i chromosomowej, co umożliwia prowadzenie badań populacyjnych, selekcji genomowej czy identyfikacji osobniczej (Sonah i wsp., 2013). Celem prowadzonych badań było poszukiwanie narzędzi genetyki molekularnej do kontroli zafałszowań pierza gęsiego innymi gatunkami oraz poszukiwanie unikatowych markerów molekularnych dla rasy gęś Biała Kołudzka, mogących służyć do opracowania testu diagnostycznego pozwalającego na jednoznaczne przypisanie produktu do rasy od jakiej został on pozyskany. Materiał do badań stanowiły próbki DNA wyizolowane z piór i krwi gęsi rasy Biała Kołudzka oraz 12 ras zachowawczych gęsi (Kielecka, Podkarpacka, Garbonosa, Pomorska, Rypińska, Landes, Lubelska, Suwalska, Kartuska, Romańska, Słowacka, Kubańska) w celu porównawczym. Do porównań międzygatunkowych wykorzystano DNA wyizolowane od kaczek. Zastosowano następujące metody: identyfikacji gatunkowej puchu kaczki i gęsi oparty na selektywnej amplifikacji PCR specyficznych gatunkowo fragmentów 12S rrna i D-loop mtdna, analiza polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych (analiza fragmentów DNA), analiza polimorfizmów pojedynczego nukleotydów (genotypowanie przez sekwencjonowanie) oraz mitochondrialnego DNA (analiza produktów sekwencjonowania DNA). Amplifikacja starterami gęsimi DNA wyizolowanego z piór i puchu umożliwiła otrzymanie produktu o długości 387 pz specyficznego dla DNA gęsiego jedynie dla próbek tego gatunku. Dla DNA pozostałych gatunków (kaczki, kury i indyka) nie otrzymano produktu reakcji. Analizy próbek DNA pozyskanego od kaczek pozwoliły na identyfikację fragmentu o długości 64 par zasad, charakterystycznego wyłącznie dla tego gatunku. W obu przypadkach dla kontroli pozytywnej (PTC) reakcji otrzymano produkt, natomiast kontrola negatywna (NTC) potwierdziła czystość reakcji. Reakcję pozytywną dla obu gatunków można uzyskać dla próbek puchu o zawartości między 0,09% do 100%, przy czym intensywność świecenia prążków jest uzależniona od ilości materiału wyjściowego. Czułość prezentowanych metod jest uzależniona od rodzaju materiału, z którego pozyskiwano DNA. Wyższa czułość zaobserwowano dla reakcji wykonywanej na DNA otrzymanego z dudki niż z puchu. Ponadto czułość metody identyfikacji puchu gęsi jest taka sama niezależnie od rasy osobnika, od którego pozyskano materiał, natomiast dla kaczki czułość jest zróżnicowana w zależności od gatunku. Dla kaczki Rouen jest niższa od wcześniej ustalonej czułości na poziomie 0,1%. 116

62 Fot. 1. Identyfikacja puchu gęsiego. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR w całym zakresie działania metody. W kolejnych studzienkach znajduje się produkt PCR dla DNA wyizolowanego z puchu gęsiego w ilości 100% (1-5), 10% (6-10), 1% (11-15), 0,09% (16-20), PTC, NTC, M marker wielkości 25 pz Fot. 2. Zależność czułości metody od miejsca pozyskiwania DNA i rasy. W kolejnych studzienkach znajduje się produkt PCR dla DNA wyizolowanego z piór kaczki Rouen (kr), kaczki Pekińskiej (kp), gęsi China Sage (gsg) i gęsi Białej (gb), (d) DNA pozyskane z dudków, (p) DNA pozyskane z puchu, M marker wielkości 25 pz Analiza regionu kontrolnego mitochondrialnego DNA oraz sekwencji mikrosatelitarnych została wykorzystana do poszukiwania unikalnych markerów dla rasy gęsi Białej Kołudzkiej. Amplifikacja wybranych fragmentów mikrosateliternych została przeprowadzona przy użyciu specyficznych starterów w reakcji PCR typu multipleks, polegającej na jednoczesnej amplifikacji 15 sekwencji mikrosatelitarnych (Bca µ1, TTUCG5, CKW21, Bca µ9, Bca µ8, Ans02, Ans18, Ans25, CAUD-G013, CAUD-G007, CKW47, Aal µ1, Afa35, CAUD-G012, Ans07). Sekwencje mikrosatelitarne zostały wybrane w oparciu o dane literaturowe w celu utworzenia jednolitego panelu markerów. Profil termiczny łańcuchowej reakcji polimerazy został zoptymalizowany zgodnie z wytycznymi producenta odczynników. Elektroforeza kapilarna produktów reakcji PCR, umożliwiła analizę długości otrzymanych fragmentów DNA wykorzystując sekwenator kapilarny. Analiza wyników rozdziału elektroforetycznego odbyła się przy pomocy programu komputerowego GeneMapper 4.0, w którym w oparciu o wielkość fragmentów standardu DNA automatycznie określano wielkość alleli w parach zasad. Amplifikacja regionu hiperzmiennego pętli D odbyła się przy użyciu par starterów zaprojektowanych dla regionu kontrolnego mitochondrialnego DNA gęsi gęgawej (Anser anser) (region pętli D mitochondrialnego DNA) (nr ref. w bazie NCBI - NC_ ). Zaprojektowano startery przyłączające się do domeny centralnej regionu kontrolnego mitochondrialnego DNA (starter forward: CTCCTCACGTGAAATCAGCA; starter reverse: GATTGGGCGATGAAGGTTTA), umożliwiające otrzymanie fragmentu mtdna. W wyniku analizy bioinformatycznej otrzymane sekwencje okazały się monomorficzne, w związku z tym zaprojektowano kolejne dwie pary starterów do innego regionu pętli D, (starter forward (1): ACCAAACCAACAACCCCATA; starter reverse (1): TGCTGATTTCACGTGAGGAG; starter forward (2): CTCCACTCAAGCGCATAACA; starter reverse (2): GGGGGTGTGGTTAGCTGATA) przyłączające się do dwóch domen peryferyjnych (I i II). Profil termiczny reakcji PCR został zoptymalizowany. Ocena produktu reakcji PCR została 117

63 przeprowadzona metodą elektroforezy agarozowej. Przygotowanie produktów amplifikacji do sekwencjonowania przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnego zestawu, pozwalającego na enzymatyczne strawienie niezwiązanych starterów i nukleotydów. Reakcja sekwencjonowania sangerowskiego została przeprowadzona według standardowego protokołu. Po zakończeniu reakcji, produkty zostały oczyszczone i poddane odczytowi w sekwenatorze kapilarnym. Analiza sekwencji regionu kontrolnego mtdna badanych osobników odbyła się przy pomocy programu BioEdit oraz w wybranych programach do analizy i porównywana do sekwencji referencyjnej dostępnych na stronach GenBank. W zakresie analizy genotypowania przez sekwencjonowanie (GBS) wybrano często tnący enzym restrykcyjny PstI, będący endonukeazą trawiącą DNA, charakteryzującą się losowym sposobem trawienia, bez nadreprezentacji powtarzalnych fragmentów genomu. Zaprojektowano 48 indeksowanych adapterów, umożliwiających uzyskanie wysokiego stopnia multipleksowania badanych próbek w oparciu o narzędzie internetowe, GBS Barcode Generator. Następnie przeprowadzono testy wydajności ligacji adapterów do miejsc trawienia enzymu w genomowym DNA, otrzymując prawidłowe biblioteki do sekwencjonowania następnej generacji. Zgromadzono materiał biologiczny od 397 gęsi (próbki pierza i krwi obwodowej), w tym od gęsi Białej Kołudzkiej oraz 12 ras zachowawczych utrzymywanych w Polsce, a następnie utworzono grupy badawcze uwzględniając przynależność rasową. Z wyizolowanego wcześniej DNA przygotowano biblioteki do sekwencjonowania, które poddano sekwencjonowaniu na urządzeniu HiScanSQ, przy długości odczytu 50 pz. Na podstawie dostępnej literatury wytypowano program TASSEL, jako optymalny do analizy wyników sekwencjonowania. Przeprowadzone procedury pozwoliły na uzyskanie DNA o odpowiedniej ilości i jakości do badań molekularnych. Opracowano specyficzną gatunkowo metodę, pozwalającą na otrzymanie wyniku powtarzalnego w całym jej zakresie działania. Zakres działania metody jest bardzo szeroki: od 0,1% zafałszowania puchu do 100%. Jest ona na tyle czuła, że umożliwia detekcję z 15 µg puchu. Na uwagę zasługuje fakt zróżnicowanej czułości w zależności od fragmentu pióra poddanego analizie, większą czułość uzyskano dla dutki niż dla puchu. Ponadto czułość metody identyfikacji puchu gęsi była taka sama niezależnie od rasy osobnika, od którego pozyskano materiał, natomiast dla kaczki czułość była zróżnicowana w zależności od gatunku. Opracowane metody stanowią skuteczne narzędzie do oceny wiarygodności producentów puchu i pierza. Sekwencjami mikrosatelitarnymi wykazującymi największą zmienność były TTUCG5, CKW21 and Aal µ1. Łącznie w 15 analizowanych loci zidentyfikowano średnio 171,8 alleli, których liczba w zależności od locus wynosiła od 3 (CAUD-G013, CAUD-G007, CKW47) do 13 (TTUCG5, CKW21). W większości przypadków allele zidentyfikowane w poszczególnych loci występowały ze zróżnicowaną częstością. Profile STR uzyskano dla 173 osobników gęsi rasy kołudzka biała oraz 12 ras zachowawczych, badane allele wykazały polimorficzność, a średnia liczba zidentyfikowanych alleli wyniosła 6,8 ± 0,835, co wskazuje na przydatność zaproponowanego zestawu STR do identyfikacji osobniczej testowanych ras gęsi. Analiza regionu pętli D mitochondrialnego DNA, po przeprowadzeniu analiz w wyselekcjonowanych rejonach mitogenomu wykazała, że w każdym z wybranych fragmentów sekwencje są zgodne z sekwencją referencyjną mtdna i nie wykazują zmienności niezależnie od rasy gęsi. W zakresie analiz genotypowania przez sekwencjonowanie z powodu uzyskania niskiej gęstości klastrów nie uzyskano wystarczającej liczby odczytów do przeprowadzenia pełnej analizy danych, w związku z tym analiza obecnie jest przeprowadzana ponownie. 118

64 Wykaz publikacji oraz doniesienia na konferencje wynikających z realizacji zadania: Natonek-Wiśniewska M., Krzyścin P., Bugno-Poniewierska M. (2016). Wykorzystanie polimorfizmu mtdna do rozróżniania puchu kaczek i gęsi. Roczniki Naukowe Zootechniki. T. 43, z. 1: Warzecha J., Fornal A., Oczkowicz M., Bugno-Poniewierska M. (2017). A molecular characteristic of the Anatidae mitochondrial control region a review. Annals of Animal Science. DOI: Warzecha J., Fornal A., Bugno-Poniewierska M. (2016). Analysis of mitochondrial DNA hypervariable D-loop region of Biala Koludzka goose. VIIth International Scientific Symposium for Young Scientists PhD Students and Students of Agriculture Colleges Innovative researches for the future of ariculture and rural areas development. Bydgoszcz, September 15-17, Warzecha J., Fornal A., Rubiś D., Oczkowicz M., Bugno-Poniewierska M. Genetic diversity among different geese breeds based on molecular markers. 6th Central European Congress of Life Sciences EUROBIOTECH Kraków, September Literatura: 1. Badowski J. (2012). 50 lat hodowli gęsi Białej Kołudzkiej [w:] Polskie Drobiarstwo, nr 11/ 2012 r., s Charon K. M., Świtoński M. (2004). Genetyka zwierząt (II unowocz.): Warszawa: PWN. 3. De Donato M., Peters S. O., Mitchell S. E., Hussain T., Imumorin I. G. (2013). Genotyping- -by-sequencing (GBS): a novel, efficient and cost-effective genotyping method for cattle using next-generation sequencing. PLoS One 8:e Ramirez V., Savoie P., Morais R. (1993). Molecular characterization and evolution of a duck mitochondrial genome. Journal of molecular evolution. 37(3), Ruokonen M., Kvist L. (2002). Structure and evolution of the avian mitochondrial control region. Molecular Phylogenetics and Evolution, 23(3), Sonah H., Bastien M., Iquira E., Tardivel A., Légaré G., Boyle B., Normandeau É., Laroche J., Larose S., Jean M., Belzile F. (2013). An improved genotyping by sequencing (GBS) approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping. PLoS One 8:e Zadanie Opracowanie i walidacja nowych metod identyfikacji zwierząt na podstawie markerów DNA Kierownik zadania: dr hab. Anna Radko Celem zadania jest opracowanie testu DNA w oparciu o polimorfizm w obrębie genu MC1R u gatunku dzika i świni domowej umożliwiającego identyfikację oraz różnicowanie osobników należących do rodziny świniowatych a także doskonalenie metod badań rodowodowych koni i świń. Zadanie obejmuje opracowanie uzupełniającego zestawu markerów STR rekomendowanego przez ISAG do kontroli pochodzenia koni oraz opracowanie i zastosowanie metody analizy markerów mikrosatelitarnych DNA zalecanych przez ISAG do rutynowych badań rodowodowych świń. Dla rozróżnienia świni domowej od dzika wykorzystano materiał genetyczny w postaci DNA wyizolowanego z tkanki ucha od 50 dzików z województw: opolskiego i śląskiego oraz z krwi 250 świń 6 ras: polska biała zwisłoucha, wielka biała zwisłoucha, złotnicka biała, pietrain, puławska i duroc. Reakcję PCR fragmentu genu MC1R o wielkości 795 pz przeprowadzono 119

65 z zastosowaniem specyficznych starterów flankujących dwa miejsca polimorficzne (tabela 1). Te same sekwencje starterowe wykorzystano do przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania uzyskanych produktów PCR. Tabela 1. Startery użyte do reakcji PCR dla genu MC1R Nazwa Sekwencja [5`-3`] Wielkość produktu Literatura MC1R-F MC1R-R 5 -AGTGCCTGGAGGTGTCCATTCAC-3 5 -CGTAGATGAGGGGGTCCAGGATAGA-3 795pz Fajardo i in., 2008 Produkt PCR poddano reakcji cięcia dwoma enzymami restrykcyjnymi BstHI w 37 o C (przez całą noc) oraz BstUI w 60 o C (przez 60 min.). W obydwu przypadkach mieszanina reakcyjna złożona była z 10 μl produktu PCR 1 μl enzymu i 2 μl buforu dedykowanego do przeprowadzenia reakcji enzymatycznej. Produkt reakcji został rozdzielony w 3% żelu agarozowym z dodatkiem barwnika interkalującego MidoriGreen. Uzyskano następujące wyniki trawienia enzymatycznego: 1. BSPHI: fragmenty o długości 256 i 172 pz dla prób pochodzących od świni domowej brak cięcia dla większości prób pochodzących od dzika 2. BSTUI: fragmenty o długości 345, 399 pz dla prób pochodzących od świni domowej fragmenty o długości 345, 345, 222 pz dla prób pochodzących od dzika W zakresie identyfikacji koni podjęto próbę multipleksowania początkowo w czterech reakcjach, a następnie w jednej. Z uwagi na niejednoznaczne wyniki elektroforezy w niektórych przypadkach podjęto próbę optymalizacji reakcji PCR, dostosowywano stężenia poszczególnych starterów w reakcji. Produkty reakcji PCR poddano elektroforezeie kapilarnej w sekwenatorach kapilarnych (Genetic Analyzer 3130xl oraz 3500xl) Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. Uzyskane wyniki analizowano za pomocą programu GeneMapper 4.0. Po powtórnym przeanalizowaniu zasobów National Center for Biotechnology Information Search database oraz ponownej analizie bioinformatycznej i weryfikacji literatury, zmodyfikowano cztery pary sekwencji starterowych. W ramach identyfikacji świń przeprowadzono pierwsze analizy DNA w oparciu o opracowany zestaw markerów mikrosatelitarnych. Materiał badań stanowił genomowy DNA wyizolowany z krwi obwodowej świń różnych ras. Panel zawierający 14 z pośród 22 loci mikrosatelitarnych rekomendowanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki Zwierząt (ISAG) obejmował następujące sekwencje: SW240, SW911, S0101, S0090, SW72, SW857, S0226, S0228, SW936, SW632, S0227, SW24, S0155, S0355 amplifikowane w jednej reakcji PCR. Reakcję PCR multiplex przeprowadzono z użyciem Type-it Microsatellite PCR Kit (Qiagen) oraz fluorescencyjnie znakowanych sekwencji mikrosatelitarnych (barwniki: FAM, VIC, NED, PET). Otrzymane produkty PCR poddano elektroforezie, w denaturującym żelu poliakryloamidowym w obecności standardu długości 500 LIZ, w sekwenatorze Applied Biosystems 3100xl Genetic Analyzer. Wynik rozdziału elektroforetycznego, fragmenty DNA o różnej długości odczytano w programie GeneMapper Software 4.0. Analiza wykazała, że w obrębie 14 sekwencji mikrosatelitarnych najwięcej alleli zidentyfikowano w loci: SW632 (5 alleli) oraz SW240, S0101, S0090, SW857, SW24 (po 4 allele). 120

66 Najmniejszy polimorfizm zaobserwowano w locus S0227, w obrębie którego zidentyfikowano tylko jeden allel. Badania nad polimorfizmem wybranych sekwencji mikrosatelitarnych zostały przeprowadzone na niewielkiej grupie zwierząt i wymagają weryfikacji na większej liczbie zwierząt. Ostatnie wyniki z międzynarodowego testu porównawczego organizowanego przez ISAG w bieżącym roku potwierdziły poprawność prowadzonych badań w LGM IZ PIB. Zadanie Charakterystyka metylomów tkanek i linii komórkowych gatunku Equus caballus Kierownik zadania: dr hab. Tomasz Ząbek, prof. IZ PIB Celem badań jest próba ustalenia związków między metylacją DNA i ekspresją genów, które podlegają tkankowo-specyficznej ekspresji w genomie konia. Metylacja DNA jest chemiczną modyfikacją nukleotydów, która odpowiada za blokowanie ekspresji genów. Opracowanie katalogu miejsc genomu, których zmiany metylacji mają znaczenie dla aktywności genów stanowi podstawę dla identyfikacji epigenetycznego podłoża fenotypu badanych gatunków zwierząt hodowlanych. Wykonano sekwencjonowanie DNA poddanego konwersji bisulfitowej w skali genomu. Materiałem wyjściowym było DNA z wycinków tkanki serca, wątroby i płuc pobranych poubojowo od czterech koni rasy Polski Koń Zimnokrwisty. Analiza metylomu obejmowała frakcję genomu bogatą w sekwencje typu CpG. Przygotowane biblioteki typu RRBS poddano sekwencjonowaniu metodą NGS w skali genomu (aparat Illumina). Celem analizy była identyfikacja miejsc CpG o różnicowej metylacji pomiędzy badanymi rodzajami tkanek (miejsca tdms), ze szczególnym uwzględnieniem miejsc tdms zlokalizowanych w loci sekwencji kodujących (genów). Sekwencjonowanie metylomu trzech tkanek pozwoliło zidentyfikować 2619 unikalnych miejsc wykazujących różnice w profilu metylacji (miejsca typu tdms) pomiędzy badanymi tkankami. Obecność tych miejsc jest podstawą różnic metylacyjnych w skali genomu pomiędzy badanymi typami tkanek, co obrazuje przykład na rysunku 1. Rys. 1. Wynik sekwencjonowania metylomu techniką NGS - przykład różnic metylacyjnych w skali genomu pomiędzy tkanką serca i płuca konia 121

67 Większość miejsc typu tdms była zlokalizowana w regionach pomiędzy genami oraz w dalszej kolejności w sekwencjach wewnątrz genów (rys. 2). Pewna ilość tdms charakteryzowała regiony końców 5 oraz 3 genów (rys. 2). Rys. 2. Liczba zidentyfikowanych miejsc tdms w zależności od ich lokalizacji względem genów (wyniki dopasowania uzyskanych danych do sekwencji genomu konia domowego) Zidentyfikowano 1669 miejsc CpG zlokalizowanych w loci genów, o różnicowym profilu metylacji (tdms) pomiędzy jedną lub dwiema parami tkanek. Najwięcej miejsc tdms zidentyfikowano dla pary tkanek: wątroba - serce (W/S). 6 miejsc tdms było wspólnych dla trzech typów tkanek (rys. 3). Rys. 3. Diagram przedstawiający liczbę miejsc typu tdms, różnicujących poszczególne tkanki względem siebie (S serce, P płuco, W wątroba) 894 unikalne miejsca tdms (428 podlegających spadkowi metylacji oraz 529 wykazujących wzrost metylacji w porównywanych parach tkanek) były zlokalizowane w regionach występowania 169 sekwencji kodujących. Zidentyfikowane grupy genów powiązanych z występowaniem miejsc typu tdms poddano analizie ich znaczenia w zdefiniowanych procesach biologicznych na podstawie informacji z ogólnodostępnych baz danych. Porównawcza analiza 122

68 zdefiniowanych procesów biologicznych z udziałem genów, w loci których zlokalizowano miejsca o różnicowej metylacji między tkankami, pozwoliła wytypować grupy genów zaangażowanych w embriologię, fizjologię i procesy chorobowe charakterystyczne w przypadku każdej z badanych tkanek (przykład w tab. 1). Tabela 1. Lista genów zaangażowanych w procesy biologiczne związane z funkcjonowaniem i patologią serca oraz wątroby (wynik analizy bioinformatycznej z udziałem zestawu genów, w loci których zidentyfikwano miejsca o różnicowej metylacji) P-value tissue hypomethylated genes cardiovascular system development 0, heart NKX2-6/ COL4A2/ NEK8/ HIF3A/ PRKCA/ ANGPT4/ NTRK2/ SOX11/ TBX5/ BMP2/ WNT4/ cardiac ventricle formation 0, heart TBX5/ SOX11/ cardiac chamber formation 0, heart TBX5/ SOX11/ negative regulation of cardiac muscle tissue development 0, heart TBX5/ BMP2/ Cardiovascular diseases 0, heart NKX2-6/ F2/ FGG/ LBR/ FGA/ cardiac muscle cell differentiation 0, heart NKX2-6/ TBX5/ BMP2/ regulation of cardiocyte differentiation 0, heart TBX5/ BMP2/ regulation of heart morphogenesis 0, heart TBX5/ BMP2/ heart valve morphogenesis 0, heart TBX5/ BMP2/ endocardial cushion development 0, heart TBX5/ BMP2/ cardiocyte differentiation 0, heart NKX2-6/ TBX5/ BMP2/ heart valve development 0, heart TBX5/ BMP2/ regulation of cardiac muscle tissue development 0, heart TBX5/ BMP2/ cardiac septum morphogenesis 0, heart TBX5/ SOX11/ Różnice metylomów analizowanych tkanek są zgodne z ich odmiennym pochodzeniem embrionalnym, co podkreśla rolę metylacji DNA w mechanizmach związanych z utrzymaniem integralności tkanek i narządów. Zidentyfikowane różnice w metylacji DNA dotyczą genów zaangażowanych w szlaki molekularne charakterystyczne dla procesów biologicznych, powiązanych między innymi z rozwojem embrionalnym oraz specyfiką tkankową. Dalsze etapy badań będą obejmować analizę ekspresji wybranych genów i ustalenie relacji między ich aktywnością, a stanem metylacji związanych z nimi miejsc tdms. Zadanie Zastosowanie metod sekwencjonowania następnej generacji (NGS) do identyfikacji genetycznego podłoża cech produkcyjnych świń Kierownik zadania: dr inż. Katarzyna Ropka-Molik Celem zadania jest poszukiwanie genetycznego podłoża cech produkcyjnych świń poprzez analizę ekspresji genów oraz mechanizmów ich regulacji. Planowane badania prowadzone są na materiale biologicznym pochodzącym od loch ras Pietrain, Hampshire i Wielkiej Białej Polskiej (wbp), pozyskanym i zgromadzonym w Dziale Genetyki i Hodowli Zwierząt IZ PIB. Dla każdego zwierzęcia poddanego ocenie na Stacji Kontroli Użytkowości Trzody Chlewnej (SKRUTCH) zebrano szereg cech rzeźnych i tucznych oraz cech jakości mięsa. Planowane cele szczegółowe obejmują kompleksową analizę transkryptomu, mirna oraz degradomu w tkance mięśniowej oraz tłuszczowej pobranej od wszystkich analizowanych świń. Badania przeprowadzone są z wykorzystaniem techniki sekwencjonowania następnej generacji (NGS) na platformie HiScanSQ (Illumina). Uzyskane wyniki przeanalizowane zostaną pod kątem analizy ekspresji genów oraz mirna, wariantów splicingowych, mutacji punktowych w regionach kodujących (csnp) oraz identyfikacji potencjalnych genów docelowych dla mirna. 123

69 W ramach pierwszego celu szczegółowego, obejmującego kompleksową analizę transkryptomu tkanki mięśniowej oraz tłuszczowej świń różnych ras, zastosowanie metody RNA-seq pozwoliło na identyfikację 627 (dla rasy Pietrain) i 416 (dla rasy Hampshire) genów o różnicowej ekspresji (DEGs) między grupami świń o różnym poziomie mięsności (p <0,05). Porównanie panelu genów zidentyfikowanych w obu rasach wykazało obecność 43 genów wspólnych, których poziom ekspresji prawdopodobnie związany był ze wzrostem i rozwojem tkanki mięśniowej (Ryc. 1). Analiza szlaków metabolicznych (oprogramowanie Panther oraz David) potwierdziła, że wykryte geny uczestniczyły w regulacji procesów metabolicznych (18 genów) oraz wzrostu i rozwoju tkanki mięśniowej (PCOLCE, BBS2, TBX2, RBBP6; ATAF5). U obu ras świń w grupach o wyższej masie mięśniowej najwyższą ekspresją charakteryzował się gen UCP3 kodujący mitochondrialne białko 3 występujące głównie w mięśniach szkieletowych i regulujące procesy metaboliczne (zmiana ekspresji FC fold change - na poziomie 2,73 oraz 1,68 razy odpowiednio dla rasy Hampshire i Pietrain pomiędzy grupami o różnym umięśnieniu). Geny wykazujące istotnie największy spadek poziomu ekspresji u świń o wyższej masie mięśniowej w porównaniu do zwierząt o niższej masie mięśniowej to geny MED13 (FC = -2,40 i -1,39 dla ras Hampshire i Pietrain) i CYP51 (kodujący podjednostkę A cytochromu P450 51, FC = -2,26 i -1,41 dla świń rasy H i P). Na podstawie wyników uzyskanych metodą RNA-seq do dalszych badań wytypowano 6 genów mogących mieć największy wpływ na wzrost tkanki mięśniowej u świń (Tabela 1). Uzyskane wyniki pozwoliły na identyfikację genów, które mogą być związane ze wzrostem i rozwojem mięśni świni. Taka analiza może być podstawą przyszłych badań w zakresie identyfikacji potencjalnych genów związanych z ważnymi cechami produkcyjnymi u świń. Ryc. 1. Ilości genów o różnicowej ekspresji wytypowanych w obu rasach pomiędzy zwierzętami o zróżnicowanej mięsności oraz 43 geny wytypowane w obu rasach (oprogramowanie Venny 2.1.0) 124

70 Tabela 1. Geny wybrane do dalszych analiz na podstawie wyników z sekwencjonowania transkryptomu Gen Nazwa genu Numer akcesyjny MGP Matrix Gla Protein; Cell Growth-Inhibiting Gene 36 Protein ENSSSCG BBS2 Biedl-Bardet- Syndrome 2 ENSSSCG PCOLCE Procollagen C-Endopeptidase Enhancer ENSSSCG COL6A1 Collagen Type VI Alpha 1 Chain ENSSSCG TBX2 T-Box 2 ENSSSCG XPO1 Exportin 1 ENSSSCG W ramach drugiego celu szczegółowego analizowano profil cząsteczek mirna tkanki mięśniowej oraz tłuszczowej świń różnych ras. W wyniku przeprowadzonego sekwencjonowania następnej generacji mirnaomu, zidentyfikowano od do surowych sekwencji w poszczególnych próbkach, co w sumie daje surowych odczytów. Dalsza analiza z wykorzystaniem specjalistycznych programów bioinformatycznych pozwoliła na zidentyfikowanie zarówno znanych jak i nowych cząsteczek mikrorna ulegających ekspresji w badanych tkankach. Liczba tych cząstek wahała się od 180 do 280 i zostały one zmapowane do wszystkich chromosomów. Najwięcej cząsteczek mikrorna miało długość 22pz, co pozostaje w zgodzie z innymi badaniami i danymi literaturowymi (Ryc. 2). Dodatkowa analiza wykazała również obecność wariantów długości i sekwencji, czyli tzw. izomirów. Ich liczba dla pojedynczych mikrorna wahała się od 1 do 14, co jest zjawiskiem powszechnie identyfikowanym, również w dotychczasowych badaniach własnych. W dalszym badań etapie zostanie przeprowadzona różnicowa analiza ich ekspresji oraz analiza szlaków biologicznych, w których biorą udział wraz z określeniem ich funkcji. Ryc. 2. Histogram długości zsekwencjonowanych cząsteczek mikrorna W ramach trzeciego celu szczegółowego, obejmującego charakterystykę stopnia degradacji mrna przy zastosowaniu metody NGS przygotowano biblioteki degradomu dla próbek tkanek (mięśnia i tłuszczu) pobranych od świń rasy wbp, Pietrain i Hampshire. Ich stężenie oraz 125

71 jakość oceniono na aparacie TapeStation Tak przygotowane próbki w kolejnym etapie zostaną zsekwencjonowane metodą sekwencjonowania następnej generacji (NGS; degradom). Uzyskane profile ekspresji genów w skali całego transkrytptomu tkanki mięśniowej świń zostały zgłoszone do międzynarodowej bazy danych GEO Gene Expression Omnibus NCBI i uzyskały numer akcesyjny (GSE107207). OBSZAR TEMATYCZNY 5 ŻYWIENIE ZWIERZĄT I PASZOZNAWSTWO Zadanie Wpływ czynników aktywnych metabolicznie na retencję PUFA i CLnA w tkankach i produktach zwierząt oraz określenie wpływu pasz rzepakowych jako substytutu pasz GMO na efektywność wykorzystania składników w dawkach pokarmowych dla kurcząt rzeźnych Kierownik zadania: prof. dr hab. Franciszek Brzóska Planowane wydanie nowych Zaleceń Żywienia Drobiu i Tabel Wartości Pokarmowej Pasz oparte będzie na zawartości aminokwasów strawnych w jelicie cienkim. Celowym jest zatem poszerzanie doświadczeń wzrostowych na kurczętach brojlerach o wykonywanie oceny strawności jelitowej aminokwasów. Strawność jelitowa aminokwasów u kurcząt brojlerów zależy od wielu czynników. Kim i Corzo (2012) wykazali, że rzeczywista strawność jelitowa aminokwasów u brojlerów zależy od linii, wieku i płci kurcząt. Jamroz i in. (2001) wskazała na różnice gatunkowe drobiu, w tym brojlerów, gęsi i kaczek w strawności składników diet pokarmowych. Huang i in. (2005) wykazali, że strawność aminokwasów 8 materiałów paszowych zwiększała się wraz z wiekiem kurcząt brojlerów, co mogło wynikać z rozwoju powierzchni chłonnej jelita cienkiego u rosnących kurcząt. Wykazano również, że na strawność aminokwasów w przewodzie pokarmowym wpływa tempo pasażu treści pokarmowej i długość przewodu pokarmowego (Jamroz i in., 2002). Ptaki starsze posiadają wolniejsze tempo pasażu treści i dłuższy przewód pokarmowy, co zwiększa ekspozycję treści pokarmowej na hydrolityczne działanie enzymów trawiennych, a większa powierzchnia chłonna zwiększa strawność jelitową aminokwasów, co wykazano na paszach pochodzenia zwierzęcego (Shires i in., 1987). Przyjęto, że strawność aminokwasów u drobiu limitowana jest przez substancje antyodżywcze zawarte w diecie jak włókno pokarmowe i taniny (Fan i Sauer, 1999). W dostępnym piśmiennictwie nie stwierdzono bezpośrednich zależności pomiędzy poziomem glukozynolanów w dietach a strawnością pozorną lub rzeczywistą aminokwasów w jelicie cienkim. Wykazano natomiast, że pozorna strawność jelitowa aminokwasów dla pasz przetwarzanych termicznie, poddanych procesom technologicznym jak toastowanie czy suszenie, jest niższa jak strawność aminokwasów ziarna zbóż (Szczurek, 2008). Wykonane badania dotyczyły określenia strawności białka ogólnego i aminokwasów mieszanek paszowych, w których śrutę sojową GM zastąpiono zwiększającymi się ilościami poekstrakcyjnej śruty rzepakowej (doświadczenie 1) i makuchu rzepakowego (doświadczenie 2). Dwa doświadczenia strawnościowe wykonano łącznie na 640 kogutkach Ross 308, w wieku 126

72 od 2 do 4 tygodni. Użyto trójtlenku chromu jako wskaźnika strawności. Układ badań w doświadczeniu 1: mieszanka kukurydziano-sojowa (grupa kontrolna), 4, 7 i 11% mieszanka Starter, 12,6; 16,2 i 20,7% mieszanka Grower (grupy doświadczalne). Układ badań w doświadczeniu 2: mieszanka kukurydziano-sojowa (grupa kontrolna), 4, 7 i 11% mieszanka Starter, 8, 12 i 16% mieszanka Grower (grupy doświadczalne). Wyniki dla białka ogólnego i aminokwasów egzogennych podano w tabelach 1 i 2. Tabela 1. Współczynniki pozornej strawności jelitowej białka ogólnego i aminokwasów mieszanek paszowych zawierających rosnące poziomy śruty rzepakowej (dośw. 1) Wyszczególnienie Kontrola Poziom śruty rzepakowej* 4/12,6 7/16,2 11/20,7 SEM Wartość P Białko ogólne Aminokwasy egzogenne Arginina Fenyloalanina Histydyna Izoleucyna Leucyna Lizyna Metionina Treonina Walina 85 a 89 a 88 a 86 a 87 a 88 a 88 a 94 a 86 a 85 a 77 b 83 b 82 b 75 b 78 b 82 b 82 b 87 c 70 b 76 b 77 b 80 b 81 b 76 b 77 b 81 b 80 b 90 b 70 b 76 b 76 a 86 b 81 b 75 b 77 b 81 b 79 b 88 b 69 bc 76 b 0,46 0,64 0,42 0,53 0,50 0,44 0,63 0,58 0,57 0,49 0,707 0,162 0,619 0,837 0,919 0, ,018 0,742 0,939 Mieszanki paszowe Starter/Grower; a, b, c P 0,05 Strawność białka ogólnego i aminokwasów mieszanek paszowych malała w miarę zwiększania się poziomu śruty rzepakowej. Ogrzewanie wyekstrahowanej z tłuszczu śruty rzepakowej w procesie toastowania może prowadzić do reakcji Mailarda i ograniczenia strawności. Toastowanie śruty poekstrakcyjnej dla usunięcia resztek rozpuszczalnika tłuszczowego (heksanu) prowadzone jest w temperaturze o C pod ciśnieniem 3 atmosfer w czasie minut. Poekstrakcyjna śruta w tym czasie zmienia barwę z jasnej na ciemną. Być może nie są to warunki dla uzyskania pełnej reakcji Mailarda, ale zachodzą wstępne jej fazy. Przyjmuje się, że poziom glukozynolanów w nasionach rzepaku nie wpływa na strawność białka i aminokwasów, natomiast wpływa poziom polisacharydów nieskrobiowych. Wg kanadyjskich badań pasze rzepakowe zawierają do 13-14% NSP, posiadających nieprzyswajalne przez zwierzęta monogastryczne wiązania β-1,3- i β-1,4-glikozydowe, powiązane z frakcją celulozowo- -ligninową. Frakcja rozpuszczalna NSP w wodzie zwiększa lepkość treści pokarmowej, co obniża hydrolizę i wchłanianie składników pokarmowych w jelitach. 127

73 Tabela 2. Współczynniki pozornej strawności jelitowej białka ogólnego i aminokwasów mieszanek paszowych zawierających rosnące poziomy makuchu rzepakowego (dośw. 2) Wyszczególnienie Poziom makuchu rzepakowego Kontrola 4/8 7/12 11/16 SEM Wartość P Białko ogólne Aminokwasy egzogenne Arginina Fenyloalanina Histydyna Izoleucyna Leucyna Lizyna Metionina Treonina Walina 85 a 90 a a 87 a a 94 a a 85 a 88 a a 87 a a 94 a a 82 b 85 b a 85 ab b 93 a b 82 b 84 b b 82 c b 90 b b 0,56 0,71 0,33 0,54 0,53 0,39 0,61 0,55 0,81 0,58 0,012 0,022 0,543 0,019 0,041 0,229 0,041 0,001 0,016 0,009 Mieszanki paszowe Starter/Grower; a, b, c P 0,05 Stwierdzono, że mieszanki typu grower dla kurcząt brojlerów zawierające różne poziomy makuchu rzepakowego charakteryzowały się niższą od 1 do 4 jednostki procentowe pozorną strawnością jelitową białka i aminokwasów jak mieszanki zawierające śrutę sojową. Makuch użyty w badaniach pochodził z nasion nawilżanych i ogrzewanych przed tłoczeniem oleju (kondycjonowanych), natomiast w przeciwieństwie do śruty rzepakowej nie był ekstrahowany i poddany wysokiemu ciśnieniu oraz temperaturze w procesie toastowania. Wyniki badań uzyskane w niniejszej pracy potwierdzają rezultaty Woyengo i in. (2010), którzy w doświadczeniach na broilerach wykazali wyższą strawność aminokwasów i energii makuchu rzepakowego, aniżeli poekstrakcyjnej śruty rzepakowej, mimo wyższej zawartości glukozynolanów w makuchu (Glencross i in., 2004). Stwierdzili istotnie wyższą strawność jelitową leucyny, treoniny, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny i seryny. Współczynniki strawności jelitowej aminokwasów mieszanek paszowych makuchu rzepakowego w tej pracy nieznacznie odbiegają od rzeczywistej strawności jelitowej aminokwasów komercyjnej śruty poekstrakcyjnej i makuchu rzepakowego uzyskane w badaniach Szczurka (2010). Niższą strawność makuchu rzepakowego w porównaniu z poekstrakcyjną śrutą sojową tłumaczono na kilka sposobów. W badaniach Björek i in. (1984) wykazano, że wysoka temperatura modyfikuje matrycę ścian komórkowych, a w efekcie niszczy mostki pomiędzy łańcuchami polisacharydów. W konsekwencji rozkłada związki pomiędzy nimi i depolimeryzuje cząstki włókna, prowadząc do tworzenia fragmentów rozpuszczalnych w wodzie. W wyniku modyfikacji matrycy włókna, zwiększa się rozpuszczalność włókna pokarmowego, prowadząc do wzrostu lepkości i obniżenia strawności składników pokarmowych (Mateos i in., 2002; Garcia i in., 2008). Wobec obecności białek i aminokwasów oraz wolnych grup karboksylowych następuje reakcja, w której cukry redukujące i fragmenty włókna, zawierającego celulozę, hemicelulozę i pektyny koniugują z aminokwasami, prowadząc do reakcji Maillarda, tworzenia się zabarwionych na brązowo, nierozpuszczalnych w wodzie i niestrawnych produktów. Jako wskaźnik uszkodzenia białka pasz przetwarzanych termicznie przyjęto rozpuszczalność w roztworze wodnym wodorotlenku potasowego (KOH) (Parsons i in., 1991; Dudley-Cash, 1999), a także ilość N związanego z frakcją ścian komórkowych (Molero-Vichez i Wedzicha, 1997). Wzrost zawartości nierozpuszczalnego 128

74 N w neutralnym detergencie w śrucie rzepakowej poddanej odparowaniu rozpuszczalnika i toastowania stwierdzono w badaniach Classen i in. (2004) i Woyengo i in. (2010). Przedstawiono opinię, że wyższej strawności pozornej i rzeczywistej makuchu rzepakowego niż śruty rzepakowej, sprzyja wyższa zawartość tłuszczu surowego w makuchu. Stwierdzono bowiem, że olej sojowy i rzepakowy dodane do diet zwiększały strawność aminokwasów w dietach dla kurcząt broilerów (Li i Sauer, 1994; Cervantes-Pahm i Stein, 2008), jakkolwiek mechanizm tego zjawiska nie został wyjaśniony. Reasumując należy stwierdzić, że strawność jelitowa mieszanek paszowych zawierających makuch rzepakowy jest wyższa od mieszanek zawierających poekstrakcyjną śrutę rzepakową, wobec odmiennych technologii wytwarzania obu pasz rzepakowych. Wszystkie poziomy poekstrakcyjnej śruty rzepakowej w mieszankach paszowych obniżają jelitową strawność białka i aminokwasów egzogennych. Zwiększenie poziomu śruty i makuchu rzepakowego do 7/12% i powyżej w mieszankach Starter/Grower, obniża istotnie jelitową strawność, co skutkuje wolniejszym tempem wzrostu oraz niższą masą części kulinarnych tuszek brojlerów. Zadanie Wpływ żywienia i stosowania dodatków paszowych na parametry fizjologiczne warunkujące wzrost i produkcyjność zwierząt Kierownik zadania: prof. dr hab. Mariusz Pietras Celem zadania było ustalenie wpływu stosowania w żywieniu zwierząt różnych pasz i dodatków paszowych na przemiany metaboliczne i aktywność wydzielniczą gruczołów wewnętrznego wydzielania, wpływających na przebieg procesów wzrostu oraz kształtowanie parametrów produkcyjnych. Efekty działania oleju z pestek granatów badano na kurczętach brojlerach i kurach nioskach. W doświadczeniach użyto 150 kurcząt brojlerów Ross-308 i 48 kur Hy-Line. Kurczęta do wieku trzech tygodni odchowywano w ogrzewanych klatkach ze stałym dostępem do wody i żywiono do woli mieszanką paszową typu starter. W wieku 21 dni ptaki przydzielono losowo do 3 grup żywieniowych po 50 sztuk. Każda grupa składała się z 5 powtórzeń po 10 sztuk. Kurczęta grupy kontrolnej (I) żywiono standardowymi mieszankami typu grower z 5% udziałem oleju rzepakowego. Grupy doświadczalne II i III otrzymywały w mieszance odpowiednio 4,5% oleju rzepakowego i 0,5% oleju z pestek granatów oraz 3,5% oleju rzepakowego i 1,5% oleju z pestek granatów. W osoczu krwi oznaczono zawartość glukozy, trójglicerydów, poziom cholesterolu całkowitego oraz jego frakcji LDL i HDL metodą enzymatyczno-kolorymetryczną, wykorzystując zestawy firmy Cormay. Zawartość hormonów tarczycy oznaczano metodami radioimmunologicznymi przy użyciu komercyjnych zestawów RIA T3 i RIA T4. Kury nioski Hy-Line w wieku 24 tygodni przydzielono do 4 grup żywieniowych po 12 sztuk w każdej. Ptaki żywiono ad libitum mieszankami paszowymi o różnym udziale olejów roślinnych przy stałym dostępie do wody. Grupa kontrolna (I) otrzymywała w mieszance 4% oleju rzepakowego. Grupy doświadczalne II-IV otrzymywały odpowiednio 0,5, 1,0 i 1,5 % oleju z pestek granatów. W 34. tygodniu życia kury zważono, a następnie poddano ubojowi. W osoczu krwi oznaczono zawartość trójglicerydów, cholesterolu całkowitego i jego frakcji HDL oraz poziomu hormonów tarczycy T3 i T4. W kości udowej i piszczelowej oznaczono zawartość popiołu surowego oraz wytrzymałość mechaniczną przy użyciu aparatu Instron Określono wpływ poziomu i formy witaminy D3 ma wybrane wskaź- 129

75 niki lipidowe oraz zwartość hormonów tarczycy we krwi tuczników. Doświadczenie przeprowadzono na 64 tucznikach (32 loszki i 32 wieprzki), które podzielono na 4 grupy, żywione izobiałkowymi i izoenergetycznymi mieszankami paszowymi, różniącymi się poziomem i formą witaminy D (cholekalcyferol vs. 25-hydroksycholekalcyferol). Koncentracja pozostałych składników mineralnych i witaminowych w premiksach była dostosowana do potrzeb danej grupy technologicznej zwierząt, a w jej obrębie była identyczna dla każdej z 4 grup objętych badaniami. Zwierzęta utrzymywano indywidualnie i żywiono dawkowanymi ilościami paszy, w zależności od masy ciała, którą kontrolowano co dwa tygodnie. Tucz doświadczalny prowadzono od około 30 do 110 kg masy ciała. Określano wpływ żyta i ksylanazy w mieszankach paszowych dla kur niosek na wyniki produkcyjne i parametry histologiczne jelita czczego. Badania przeprowadzono na 96 kurach nioskach ISA Brown. W 26. tygodniu ptaki przydzielono losowo do 4 grup. Kury żywiono doświadczalnymi mieszankami paszowymi z 25% udziałem żyta hybrydowego Brasetto, nie uzupełnionego lub uzupełnionego ksylanazą (200 mg/kg paszy, Ronozyme WX, (CT) przy minimalnej aktywności ksylanazy 1000 FXU/g; DSM Nutritional Products sp. z oo. Mszczonów, Polska). W trakcie doświadczenia kontrolowano spożycie paszy, nieśność kur i masę jaj. W 50 tygodniu ubito po 8 szt. z każdej grupy, wypreparowano przewód pokarmowy i pobrano fragmenty jelita czczego do badań histologicznych. Ocena morfometryczna jelit obejmowała wysokość i szerokość kosmków jelitowych oraz głębokość krypt jelitowych. W badaniach na gęsiach określano wpływ wybranych odmian owsa (Rys. 1.) na wskaźniki lipidowe i hormonalne krwi oraz użytkowości rzeźnej gęsi owsianych. 130 Rys. 1. Skład chemiczny wybranych odmian owsa (g/kg s.m.) Przeprowadzono trzy doświadczenia żywieniowe na gęsiach Białych Kołudzkich wykorzystując łącznie 700 ptaków obu płci. W doświadczeniu pierwszym określano wpływ odmian owsa Furman i Breton różniących się zawartością włókna i skrobi, przy zbliżonych wartościach białka ogólnego i tłuszczu surowego. Celem drugiego doświadczenia było określenie wpływu odmian owsa Furman i Rajtar różniących się zawartością tłuszczu surowego, przy zbliżonych wartościach białka ogólnego i włókna, natomiast w doświadczeniu trzecim określano wpływu odmian owsa oplewionego Furman i nagoziarnistego Nagus na użytkowość rzeźną i wskaźniki krwi gęsi owsianych. We wszystkich doświadczeniach, od wyklucia do końca 12. tygodnia gęsi żywione były jednolicie roślinną mieszanką treściwą właściwą dla danego okresu. Dieta ptaków uzupełniona była o zielonkę z przewagą traw, którą otrzymywały ciętą bezpośrednio do koryt, a także podczas wypasu na łąkach i pastwiskach. W 13-tym tygodniu życia ptaków rozpoczęto tucz, w którym zastosowano całe ziarno owsa. Po ukończeniu tuczu (15 tydzień) z każdej grupy wybrano po 16 ptaków

76 (8 +8 ) o masie ciała zbliżonej do średniej i poddano ubojowi. W trakcie uboju pobrano krew do dalszych analiz. Tuszki poddano analizie rzeźnej. Analizę wyższych kwasów tłuszczowych w próbkach mięsa piersi wykonano metodą chromatografii gazowej na długiej kolumnie (105 m). Zawartość cholesterolu w mięsie oznaczono metodą GC. Oznaczenia cholesterolu całkowitego, HDL, ALT, AST, ALP w plazmie krwi wykonano metodą kolorymetryczną za pomocą zestawów diagnostycznych firmy POINTE. Zawartość hormonów tarczycy w plazmie krwi oznaczano metodą radioimmunologiczną przy użyciu zestawów RIA T3 i RIA T4. Stwierdzono, że olej z pestek granatów o wysokiej zawartości CLnA jako komponent mieszanki paszowej dla kurcząt, wywiera istotny wpływ na funkcjonowanie tarczycy, przejawiający się obniżeniem T3 i T4 w plazmie kurcząt brojlerów. Wraz ze wzrostem udziału oleju z granatów następuje znaczące obniżenie koncentracji T3 i T4 oraz istotny wzrost poziomu cholesterolu i trójglicerydów. Zastosowanie oleju z granatów jako źródła CLnA w diecie kur niosek nie wpłynęło istotnie na masę ciała oraz na poziom T3 i T4. Stwierdzono, że najniższy 0,5% udział oleju z granatów w mieszance paszowej dla kur niosek wpłynął znacząco na zwiększenie masy wątroby. Masa i długość kości piszczelowej oraz udowej zależała istotnie od udziału oleju z nasion granatów. Wprowadzenie do mieszanki paszowej 1% udziału oleju z nasion granatów wpłynęło korzystnie na parametry jakości kości piszczelowej i udowej kur niosek, wyrażone ich masą i długością. Podniesienie udziału w mieszance dla kur tego oleju, zwiększyło podatność kości piszczelowej i udowej na złamania oraz obniżyło masę kości udowej. Zawartość popiołu surowego w kościach kur niosek była zbliżona i nie zależała od ilości oleju w diecie ptaków. Dodatek 5-hydroksywitaminy D3 w diecie dla tuczników, w odpowiedzi na niedobór jej aktywnej formy, zwiększa aktywność wydzielniczą tarczycy oraz obniża zawartość cholesterolu i glukozy w plazmie krwi. Zastosowanie 25% udziału żyta hybrydowego Brasetto w mieszance paszowej spowodowało statystycznie istotne obniżenie nieśności kur bez istotnego wpływu na masę jaja i wykorzystanie paszy w przeliczeniu na jajo. Stwierdzono również statystycznie istotne zmniejszenie długości i szerokości kosmków jelitowych, głębokości krypt bez wpływu na grubość ściany jelita w grupie kur doświadczalnych. Wprowadzenie do mieszanek z 200 mg/kg ksylanazy odwracało efekt działania żyta (Fot. 1). A B C Fot. 1. Budowa histologiczna jelita czczego kur żywionych mieszanką standardową (A) z udziałem żyta (B) oraz udziałem żyta i ksylanazy (C) Różna zawartość podstawowych składników pokarmowych ziarna owsa, odmian zastosowanych w żywieniu gęsi wpłynęła na wyniki tuczu. Żywienie gęsi owsem o niższej o 19 g/kg suchej masy, zawartości włókna surowego przy zbliżonej zawartości białka ogólnego i tłuszczu surowego (Breton) nie wywarło istotnego wpływu na parametry tuczne i rzeźne, profil kwasów tłuszczowych i zawartość cholesterolu w mięsie piersi oraz wskaźni- 131

77 ki funkcji wątroby i tarczycy. Najlepsze wyniki uzyskano przy tuczu gęsi ziarnem owsa oplewionego odmiany Rajtar, zawierającego w kilogramie suchej masy więcej białka ogólnego, tłuszczu surowego, popiołu i mniej skrobi w porównaniu do ziarna owsa odmiany Furman przy zbliżonej zawartości włókna. Gęsi osiągały istotnie wyższe przyrosty i końcową masę ciała przy niższej zawartości cholesterolu w mięsie. Najgorsze efekty produkcyjne uzyskano przy tuczu gęsi owsem nagoziarnistym, Nagus. Gęsi tuczone ziarnem tej odmiany cechowały się statystycznie istotnie niższą, końcową masą ciała i przyrostami przy niższym wykorzystaniu owsa na przyrost 1 kg masy ciała. Stwierdzono również niższą masę tuszki po schodzeniu i wydajność rzeźną. Obserwowano również tendencje do wzrostu poziom cholesterolu całkowitego i HDL oraz wzrostu wartości parametrów określających funkcję wątroby, tj. aminotransferazy alaninowej (ALT) i fosfatazy alkalicznej (ALP) przy wysoko istotnym zwiększeniu się zawartości aminotransferazy asparaginowej (AST). Wyniki przeprowadzonych doświadczeń wskazują, że ziarno owsa nieoplewionego nie powinno być wykorzystywane do tuczu gęsi owsianych. Zadanie Wpływ dodatków fizjologicznie aktywnych na rozwój przewodu pokarmowego, status zdrowotny oraz wskaźniki produkcyjne prosiąt i tuczników Kierownik zadania: prof. dr hab. Ewa Hanczakowska Celem realizowanego zadania jest opracowanie nowej strategii żywienia ciężarnych loch w celu zminimalizowania efektu IUGR wywołanego niedożywieniem płodów, poprzez zastosowanie enzymów trzustkowych oraz poprawa wskaźników produkcyjnych prosiąt poprzez dodatek koncentratów włókna lub kwasów walerianowego i enantowgo. Cel obejmuje poznanie wpływu kwasu walerianowego (C5) i enantowego (C7) na strukturę nabłonka jelitowego i florę mikrobiologiczną przewodu pokarmowego prosiąt, a co za tym idzie na ich zdrowotność i wskaźniki odchowu. Krótkołańcuchowe (do 4 atomów węgla w łańcuchu) i średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe (od 5 do 12 atomów węgla) mogą być stosowane jako substancje zastępujące w żywieniu prosiąt wycofane z użycia rozporządzeniem Unii Europejskiej antybiotykowe stymulatory wzrostu. Oprócz naturalnych kwasów o parzystej ilości atomów węgla występują kwasy o nietypowej, nieparzystej ilości atomów węgla: kwas walerianowy (C5) i enantowy (C7), których działanie nie jest znane. Doświadczenie przeprowadzone zostało w Zakładzie Doświadczalnym Instytutu Zootechniki PIB w Grodźcu Śląskim sp. z o.o. Do doświadczenia przeznaczono 12 miotów (około 120 prosiąt). Wszystkie prosięta karmiono ad libitum taką samą standardową mieszanką paszową, która została uzupełniona odpowiednimi kwasami wg schematu przedstawionego w tabeli 1. Rodzaj dodatku Tabela 1. Układ doświadczenia Grupa I Grupa II Grupa III Grupa IV Grupa V Grupa VI Bez Kwas Kwas Kwas Kwas Kwas dodatku masłowy walerianowy kapronowy enantowy kaprylowy C4 C5 C6 C7 C8 Liczba prosiąt

78 Doświadczenie prowadzone było od dnia urodzenia do 84. dnia życia prosiąt. Prosięta odsadzano od loch w 28. dniu życia. Dokarmianie mieszanką paszową rozpoczęto w 7 dniu życia. W 28. oraz 56. dniu doświadczenia zostało ubite po 6 prosiąt z każdej grupy i pobrano próbki treści jelitowej oraz fragmenty jelita czczego do dalszych badań. Pozostałe prosięta odchowywano do 84. dnia życia. Dotychczasowe wyniki wskazują, że najskuteczniejszym dodatkiem do paszy okazał się maślan sodu (tab. 2). Prosięta tej grupy w całym okresie odchowu rosły szybciej o 14,3% od kontrolnych. Dodatek kwasu kaprylowego również zwiększył przyrosty prosiąt w porównaniu do kontrolnych o 3,8%, natomiast dodatek do paszy kwasu kapronowego pogorszył przyrosty prosiąt. Były one niższe o 11,4% w porównaniu do kontrolnych. Wyszczególnienie Kontrola Tabela 2. Wstępne wyniki odchowu prosiąt Maślan sodu Kwas walerianowy Kwas kapronowy Kwas enantowy Kwas kaprylowy Przyrost W 28. i 56. dniu życia ubito po 6 prosiąt z każdej grupy wykonano pomiary ph treści pokarmowej. W 28. dniu życia stwierdzono istotne zmiany w ph treści dwunastnicy i jelita grubego. W dwunastnicy najniższe ph stwierdzono u prosiąt otrzymujących kwas walerianowy a najwyższe u prosiąt kontrolnych i otrzymujących kwas enantowy (p<0,05). W 56. dniu życia zmiany w ph treści były większe. W żołądku najniższe ph stwierdzono u prosiąt otrzymujących kwas kapronowy (P<0,05), a w dwunastnicy u otrzymujących kwas walerianowy (P<0,01). W jelicie ślepym najniższe ph treści stwierdzono u prosiąt grupy kontrolnej i otrzymującej maślan sodu (P<0,01). Po uboju dokonano pomiarów poszczególnych części przewodu pokarmowego. W 28. dniu życia istotne różnice stwierdzono w masie jelita czczego. Najlżejsze okazało się jelito u prosiąt grupy otrzymującej kwas enantowy, a najcięższe u otrzymujących kwas walerianowy. Przewód pokarmowy prosiąt otrzymujących kwas walerianowy charakteryzował się również najcięższym jelitem grubym (P<0,01), co przełożyło się na najwyższą masę całego przewodu pokarmowego. Nie stwierdzono różnic w długościach poszczególnych elementów przewodu pokarmowego w przeliczeniu na masę ciała przy uboju. Nie stwierdzono również wpływu dodatku różnych kwasów na masę śledziony, wątroby oraz nerki. W 56. dniu życia prosiąt ich masa ciała była zróżnicowana, a najniższą masą oraz masą ubojową charakteryzowały się prosięta otrzymujące kwas kapronowy. Większe też było zróżnicowanie masy przewodu pokarmowego w przeliczeniu na masę ciała prosiąt. Prosięta otrzymujące kwas kapronowy, które rosły wolniej charakteryzowały się największą masą przewodu pokarmowego w przeliczeniu na masę ciała, co było rezultatem cięższego jelita czczego, ślepego i grubego. Nie stwierdzono różnic w długościach poszczególnych elementów przewodu pokarmowego w przeliczeniu na masę ciała przy uboju. Nie stwierdzono również wpływu dodatku różnych kwasów na masę śledziony, wątroby oraz nerki. Pozostałe pobrane próbki treści pokarmowej zostały zamrożone, a preparaty z dwunastnicy i jelita czczego umieszczono w roztworze formaliny do przeprowadzenia dalszych badań. 133

79 Kolejnym celem badań było określenie wpływu podawania enzymów pochodzenia mikrobiologicznego o profilu trzustkowym dodanych do paszy ciężarnych loch na wielkość płodów dla zminimalizowania IUGR wywołanego niedożywieniem płodów. Do doświadczenia przeznaczono 24 lochy pierwiastki rasy pbz w wieku 7 miesięcy i masie ok. 110 kg. Po miesięcznym okresie kwarantanny i aklimatyzacji w celu synchronizacji rui zastosowano program indukcji owulacji z wykorzystaniem progestagenów i prostaglandyn. Do indukcji rui zastosowano iniekcję 500 j.m. PMSG oraz 250 j.m. hcg. Sztuczne unasienianie przeprowadzono między godz. po iniekcji hcg, ponawiając unasienianie po 10 do 18 godz. Lochy przydzielono losowo do czterech grup po 6 zwierząt. Utworzono dwie grupy kontrolne każda po 6 sztuk, które są karmione standardowo paszą dla loch prośnych bez dodatków enzymów. Przy czym prosięta z jednej z tych grup (kontrola pozytywna) otrzymywać będą w okresie pomiędzy 14 a 21 dniem życia dodatek mieszaniny enzymów trzustkowych (PLEM). Utworzono także dwie grupy doświadczalne, każda po 6 loch. Pierwsza z grup doświadczalnych (D1) otrzymuje przez całą ciążę mieszankę paszową dla loch prośnych z dodatkiem enzymów trzustkowych pochodzenia mikrobiologicznego, natomiast druga grupa doświadczalna (D2) będzie otrzymywała dodatek enzymów tylko w ostatnich trzech tygodniach ciąży w ilości podanej w tabeli 3. Tabela 3. Dawki enzymów podawane lochom w trakcie doświadczenia Wyszczególnienie Kontrolna negatywna K1 Kontrolna pozytywna * K2 Grupa żywieniowa Doświadczalna 1 D1 Doświadczalna 2 D2 Okres podawania, dni Dawka, IU/kg m.c. Lipaza Proteaza Amylaza * podawanie prosiętom w mieszance super prestarter w okresie dnia życia enzymów mikrobiologicznych o profilu trzustkowym (lipaza IU/kg m.c.; proteaza IU/kg m.c.; amylaza IU/kg m.c.) Doświadczenie jest w trakcie realizacji. Lochy żywione są systemem dawkowanym w ilości 3 kg do 90. dnia ciąży paszą dla loch niskoprośnych, która zawiera: 12,5 MJ EM i 125 g/g s.m. białka ogólnego. Od 90. dnia lochy otrzymują mieszankę pełnoporcjową dla loch wysokoprośnych i karmiących o zawartości energii metabolicznej 13,0 MJ, białka ogólnego 161 g. Mieszanki paszowe zawierają w swym składzie śruty zbożowe: jęczmienną, pszenną, pszenno- -żytnią, kukurydzianą i poekstrakcyjną śrutę sojową, ponadto olej rzepakowy i syntetyczne aminokwasy: lizynę, metioninę, treoninę i tryptofan, mrówczan wapnia, fosforan jednowapniowy, NaCl i premiks witaminowo-mineralny. Maciory utrzymywane są w standardowych warunkach z kontrolowaną długością dnia świetlnego (7:00-19:00) oraz temperaturą (22 ± 2 stopnie). Masa ciała loch poddanych inseminacji wynosiła odpowiednio w grupach: K1-128,0 kg ± 3,0; K2-127,2 kg ± 2,6; D1-129,1 kg ± 3,1; D2-128,5 ± 2,9 kg. Średni wiek inseminowanych loch wynosił 260 ± 6 dni. W trakcie trwania doświadczenia kontrolowana jest masa ciała wszystkich loch, rozpoczynając ważenie w dniu ich pokrycia, a następnie w 30., 60., 90. i 110. Po 30 dniach od pokrycia średnia masa loch była wyrównana we wszystkich grupach i wynosiła odpowiednio, w grupie K1-140,5 ± 2,8; K2-139,6 ± 2,5; D1-141,2 ± 2,7; D2-140,0 ± 3,0. 134

80 W ramach zadania realizowane są również badania dotyczące oceny przydatności rozdrobnionego włókna pochodzącego z krajowych roślin włóknistych w żywieniu prosiąt i określenie wpływu na rozwój przewodu pokarmowego oraz status zdrowotny tych zwierząt w okresie około odsadzeniowym. Na potrzeby badań wybrano i zakupiono włókno słańcowe z lnu odmiany Modran (typ - krótkie) i włókno z konopi (typ - jasne), które zostało rozdrobnione w Instytucie Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich na odcinki do 1 mm długości. Realizację badań rozpoczęto wykonaniem szczegółowych analiz włókien przeznaczonych do doświadczeń na prosiętach. W Centralnym Laboratorium IZ PIB przeprowadzono analizę podstawową oraz frakcji włókna, w IWNiRZ przeprowadzono analizę składu procentowego włókien łykowych. Wyniki tych analiz chemicznych zamieszczono w tabeli 4. Oceniona została zawartość mikotoksyn. Tabela 4. Analizy chemiczne włókien stosowanych jako dodatki do paszy dla prosiąt Analiza podstawowa (%) Sucha masa Tłuszcz surowy Białko ogólne Włókno surowe Popiół surowy Bez azotowe wyciągowe Frakcje włókna (%) NDF ADF ADL Włókno lniane 91,10 0,80 3,30 68,44 1,85 16,71 81,05 75,80 3,49 Analiz chemicznych składu procentowego włókien łykowych (%) Włókno konopne 90,21 0,24 2,08 68,86 1,64 17,39 84,59 78,08 2,88 Włókno kontrolne z drzew iglastych 92,35 0,26 0,10 75,17 0,23 16,59 92,28 86,45 0,37 Zawartość celulozy (%) 69,18 66,71 73,06 Zawartość hemiceluloz (%) 19,85 20,02 19,72 Zawartość lignin (%) 8,40 4,92 0,00 Zawartość pektyn (%) 2,45 1,98 0,00 Zawartość wosków i tłuszczy (%) 0,94 0,29 0,09 Zgodnie z metodyką badań w okresie sprawozdawczym rozpoczęto doświadczenie wzrostowe na prosiętach w ZD IZ PIB Grodziec Śląski sp. z o.o. Opracowano receptury mieszanek paszowych (K, D), które zostały wykonane w mieszalni pasz w Grodźcu. Do grudnia 2017 r. badaniami objęto 9 miotów, w których średnia liczba prosiąt wynosiła 11 sztuk. Układ doświadczenia przedstawiono w tabeli 5. Kontrolna (K) Tabela 5. Układ doświadczenia dodatek włókna z lnu (DL) dodatek włókna z konopi (DK) Vitacel R 200 Ilość dodatku, % bez dodatku 1,5% 2 % 1,5% 2% 2% włókna Ilość prosiąt, szt

81 Prosięta żywione są do woli od 7. dnia życia, przy stałym dostępie do wody. 14 miotów prosiąt zostanie przydzielonych do 7 grup, po 2 mioty w każdej. Indywidualne ważenia prosiąt odbywają się w 1., 28., 56., 70. i 84. dniu życia. W celu pobrania próbek tkanek i treści pokarmowej jelit, w każdej grupie zostanie uśmierconych 12 prosiąt (po 3 sztuki z miotu), w tym 6 sztuk w 28. dniu życia oraz 6 sztuk w 56. dniu życia. Wszystkie zwierzęta żywione są izobiałkowymi i izoenergetycznymi mieszankami paszowymi, różniącymi się jedynie rodzajem i/lub ilością dodanego preparatu z włókna. Dotychczas ubojowi poddano 27 prosiąt w wieku 28 dni oraz 12 prosiąt w wieku 56 dni życia. Podczas uboju pobierano próbki krwi, w których przeprowadzono analizy hematologiczne, a po odwirowaniu surowicę zamrożono do czasu wykonania analiz biochemicznych. Pobrano także wycinki wybranych odcinków jelit w celu wykonania preparatów mikroskopowych i przeprowadzenia oceny histometrycznej struktur nabłonka ściany jelit. W treści pokarmowej kolejnych odcinków przewodu pokarmowego wykonano pomiar ph, a próbki treści z jelita cienkiego i ślepego zamrożono z przeznaczeniem do analizy mikrobiomu ilości lotnych kwasów tłuszczowych. Próbki treści pokarmowej poszczególnych odcinków jelita grubego przekazano do IFiŻZ PAN, gdzie badany będzie status metaboliczny jelita grubego na podstawie oceny aktywności flory bakteryjnej i analiz zawartości w treści pokarmowej amin biogennych, koncentracji lotnych kwasów tłuszczowych. Otrzymane wyniki zostaną opracowane statystycznie i opisane w kolejnym roku realizacji zadania. Zadanie Czynniki żywieniowe warunkujące wydajność i zdrowotność zwierząt przeżuwających Kierownik zadania: prof. dr hab. Barbara Niwińska Cel badań stanowi analiza możliwości wykorzystania czynników żywieniowych w poprawie wydajności produkcyjnej bydła i owiec. W ramach realizacji zadania poddano analizie możliwość modulacji rozwoju gruczołu mlekowego poprzez dobór optymalnego poziomu żywienia w okresie wczesnego wychowu cieliczek. Zaplanowano także porównanie efektów zastosowania różnych soli kwasu masłowego na przyspieszenie rozwoju funkcjonalnego przewodu pokarmowego młodych przeżuwaczy. W badaniach nad modulacją rozwoju gruczołu mlekowego materiał badawczy stanowią cieliczki rasy polskiej holsztyno-fryzyjskiej w okresie wychowu od 5. do 60. dnia życia. Cieliczki (prawidłowo karmione siarą i mlekiem matki w pierwszych dniach życia) w 5-tym dniu przydzielano do grup doświadczalnych w układzie statystycznym 2-czynnikowym niepełnym, w którym jako czynniki przyjęto: poziom żywienia (restrykcyjny vs. do woli) i wiek (14. d.ż. vs. 60. d.ż.). Badania przeprowadzane są w oborze doświadczalnej w Aleksandrowicach wg poniżej przedstawionego schematu. 136

82 Schemat realizowanych badań na cieliczkach CZYNNIKI Wyszczególnienie GRUPY 1-okres wychowu (od do; dzień życia) poziom żywienia KONTROLNY RESTRYKCYJNY AD LIBITUM OCENIANE WSKAŹNIKI PRZYŻYCIOWE Pomiary - przyrosty masy ciała pobranie i zużycie pasz POUBOJOWE pomiary anatomiczne pobranie prób tkanek analizy biochemiczne W okresie sprawozdawczym pobrano próby materiału biologicznego i zabezpieczono je w temperaturze -70 C do czasu wykonania analiz. Uzyskane dotychczas przyżyciowe informacje nie stanowią podstawy do wnioskowania. Analizę efektów zastosowania różnych soli kwasu masłowego na rozwój funkcjonalny przewodu pokarmowego przeżuwaczy rozpoczęto od określenia zmian fermentacji w żwaczu dorosłych przeżuwaczy pod wpływem wprowadzonego do paszy dodatku maślanu sodu lub tri-maślanu glicerolu. Badania realizowane są na przetokowanych krowach w 2-powtórzeniach (kwadrat 1, kwadrat 2) w układzie statystycznym kwadratu łacińskiego 3 3 (3 grupy: 1-kontrolna, 2-dodatkiem maślan sodu, 3-dodatkiem tri-maślanu glicerolu), 3 okresy (I, II i III). Badania są realizowane wg poniżej przedstawionego schematu. Schemat badań nad fermentacją w żwaczu krów przetokowanych KWADRAT Wyszczególnienie I II 1 2 III OKRES Krowa 1. KONTROLA Trimaślan gricerolu MAŚLAN SODU Krowa 2. MAŚLAN SODU KONTROLA Trimaślan gricerolu Krowa 3. Trimaślan gricerolu MAŚLAN SODU KONTROLA Krowa 1. MAŚLAN SODU KONTROLA Trimaślan gricerolu Krowa 2. KONTROLA Trimaślan gricerolu MAŚLAN SODU Krowa 3. Trimaślan gricerolu MAŚLAN SODU KONTROLA Przez cały okres realizacji badań przetokowane krowy były karmione jeden raz dziennie. Dawka pokarmowa (dzienna) dla każdej krowy składała się z siana łąkowego i paszy treściwej (w proporcji 3:1, a pobranie SM stanowiło 1,5% MC). Zwierzęta przebywały na indywidualnych stanowiskach ścielonych trocinami. W każdym cyklu i powtórzeniu badań w kolejności przedstawionej na schemacie, po 15 minutach od zadania paszy przez przetokę do żwacza wprowadzano wodny roztwór odpowiedniej soli maślanowej, a krowie z grupy kontrolnej wprowadzano taką samą ilość wody. Każdy cykl badań (kwadrat x okres) obejmował 14-dniowy okres adaptacyjny, 9-tego dnia podawano krowom marker w postaci 137

83 trójtlenku chromu, w 15. dniu przed karmieniem oraz 2, 4 i 8 h po pobraniu pokarmu przez krowę kolekcjonowano próbki treści żwacza. W dniach wykonywano kolekcję kału a w dniach wykonywana oznaczenie strawności siana metodą woreczków poliestrowych zawieszanych w żwaczu. W okresie sprawozdawczym wykonano badania w obrębie 1 kwadratu w 3 okresach, a uzyskane materiały biologiczne przeznaczone do analiz są przechowywane w temperaturze -20 C. Wyniki przeprowadzonych obserwacji nie stanowią podstawy wnioskowania. Zadanie Czynniki żywieniowe wpływające na wykorzystanie składników pokarmowych oraz metaboliczny i zdrowotny status intensywnie użytkowanego drobiu Kierownik zadania: prof. dr hab. Sylwester Świątkiewicz Zadanie dotyczy istotnych zagadnień nowoczesnej produkcji drobiarskiej - jakości skorup jaj i kośćca u wysokoprodukcyjnych kur nieśnych oraz strawności jelitowej aminokwasów nasion grochu siewnego u kurcząt. Tak więc, w ramach zadania realizowane są dwa cele badawcze: 1. Ocena wpływu profilu kwasów tłuszczowych lipidów mieszanki paszowej na jakość kośćca i skorup jaj u wysokoprodukcyjnych kur nieśnych. 2. Standaryzowana strawność jelitowa aminokwasów nasion grochu siewnego u kurcząt brojlerów wpływ wieku i dodatku paszowej proteazy. Cel szczegółowy 1. W okresie sprawozdawczym wykonywano doświadczenie 1, na intensywnie użytkowanych kurach nieśnych. Nioski żywiono doświadczalnymi mieszankami paszowymi zawierającymi różne źródła kwasów tłuszczowych (olej sojowy, olej kokosowy, olej rzepakowy, olej lniany, olej z lnianki siewnej, olej rybny, olej z alg). Analizowane są rezultaty produkcyjne (nieśność, pobranie i wykorzystanie paszy), jakość treści i skorupy jaj, parametry wytrzymałościowe kości długich oraz profil kwasów tłuszczowych lipidów żółtek jaj. Doświadczenie 1 wykonywane jest w układzie 1-czynnikowym. Utworzonych zostało 7 grup eksperymentalnych. W skład każdej grupy wchodzi po 12 powtórzeń, po 2 kury utrzymywane we wspólnej klatce. Schemat doświadczenia został przedstawiony w tabeli 1. Wstępna analiza wyników produkcyjnych wskazuje, że w początkowych tygodniach badań kury ze wszystkich doświadczalnych charakteryzują się bardzo dobrą wydajnością nieśną (97-98%), a stosowany czynnik eksperymentalny nie wpływa na otrzymywane rezultaty. Fot. 1. Nioski Lohman Brown w trakcie doświadczenia (kurnik doświadczalny ZFŻ IZ PIB) 138

84 Cel szczegółowy 2. W okresie sprawozdawczym przeprowadzono doświadczenie nad oceną wpływu wieku kurcząt (14 lub 28 dni) oraz dodatku mikrobiologicznej proteazy serynowej wytwarzanej przez Bacillus licheniformis na strawność aminokwasów nasion grochu z grupy biało kwitnących odmian krajowych. Do badań wybrano groch odmiany Tarchalska współczesna odmiana przydatna na cele spożywcze i paszowe. Analizy wykazały następujący podstawowy skład chemiczny nasion tej odmiany grochu (g/kg SM): białko ogólne 223,0, tłuszcz 14,9, włókno 58,2. Profil aminokwasowy białka zilustrowano na Rys. 1. Rys. 1. Profil aminokwasowy białka nasion grochu odmiany Tarchalska (wyniki analiz własnych, 2017) Zgodnie z przyjętymi założeniami eksperyment wykonano techniką bezpośrednią, stosując krótkookresowe żywienie ptaków dietą testową, w której nasiona grochu stanowiły jedyne źródło białka, a substancją wskaźnikową był trójtlenek chromu. Dietę podawano w dwóch wersjach: bez dodatku lub z dodatkiem preparatu proteazy. Treść jelitową po uboju kurcząt w kolejnych okresach pobrań (14 i 28 dzień życia) wypłukiwano z dolnego fragmentu jelita biodrowego tworząc po 6 prób zbiorczych materiału pobranego w obrębie każdej grupy doświadczalnej (wersji diety testowej). Komplet danych analitycznych (zawartość aminokwasów, suchej masy oraz chromu dodanego) tego materiału będzie podstawą do kalkulacji współczynników strawności jelitowej poszczególnych aminokwasów nasion grochu. Fot. 2. Kurczęta Ross 308 podczas wstępnego odchowu w klatkach grupowych przed pobraniem treści jelitowej do oznaczeń strawności aminokwasów nasion grochu w 14. dniu życia (brojlernia doświadczalna ZFŻ IZ PIB) 139

85 Zadanie Walidacja i doskonalenie metody GC-MS oznaczania związków lotnych jako istotnych substancji wpływających na jakość mięsa i tłuszczu gęsiego Kierownik zadania: dr hab. Robert Gąsior W ramach realizowanego zadania przeprowadzono doświadczenie na 100 ptakach (fot. 1). Do ukończenia 13. tygodnia życia gęsi były odchowywane i żywione jednakowo, zgodnie z systemem technologii tuczu IZ PIB ZD Kołuda Wielka. W okresie od 14. do 16. tygodnia życia ptaki żywione były do woli wyłącznie ziarnem owsa i pszenicy. Do uboju wybrano 48 gęsi. Fot. 1. Gęś Biała Kołudzka (fot. Krzysztof Wojtycza) Podczas walidacji opracowano techniki przygotowywania próbek tak, by uniknąć wielokrotnego ich rozmrażania i zamrażania. Próbki mięsa tworzono po pokrojeniu w kostki ok. 2 cm. Próbki zostały zamknięte próżniowo w woreczkach PA/PE (folia barierowa poliamid/polietylen) i przetransportowane do laboratorium w temperaturze około -78 C w suchym lodzie (CO 2 ). Próbkę w laboratorium domrożono w ciekłym azocie (N 2 ), a następnie ujednorodniono mieląc w blenderze, przeniesiono do fiolek (20 ml) i zamknięto (kapsel+septa) z septą PTFE/Silikon. Obróbka termiczna mięsa/tłuszczu polegała na ogrzewaniu uprzednio rozmrożonej (1,5 h w temperaturze pokojowej) i zamkniętej we fiolce (headspace) próbki w piecu w temperaturze 170 C przez 35 min. Następnie fiolkę z próbką niezwłocznie ostudzono w zimnej wodzie w celu ograniczenia dalszych reakcji chemicznych. Analiza chromatograficzna była prowadzona bezpośrednio po przygotowaniu próbek. Analizy lotnych związków wykonano w próbkach mięsa mięśni nóg oraz w tłuszczu sadełkowym (rys. 1) techniką ekstrakcji z fazy nadpowierzchniowej do fazy stacjonarnej HS-SPME i chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrem mas (HS-SPME-GC/MS, rys. 2). Zastosowano włókno typu DVB/CAR/PDMS, 50/30 mm) i kolumn ZB-5MSi (Phenomenex, 30 m 0,25 mm I.D. 0,25 mm film). Analizy wykonano po obróbce termicznej (170 C, 35 min.), przy parametrach: termostatowanie próbki -50 C, 30 min., czas ekspozycji włókna - 15 min. Próbkę podawano za pomocą autosamplera COMBI PAL System (AOC-5000). Rozdział chromatograficzny prowadzono na chromatografie gazowym Shimadzu GCMS-QP2010 Plus, wyposażonym w kwadrupolowy detektor MS (EI, 70 ev, 250 C) skanujący w trybie TIC w zakresie m/z, w następujących warunkach: gaz nośny: hel (He), 1 ml/min., program temperaturowy pieca: izoterma 37 C przez 10 min., następnie wzrost temperatury do 132 C (4 C/min.) ponowny jej wzrost do 240 C (8 C/min.), a następnie utrzymanie jej do końcowego czasu analizy (60 min.). W celu zapewnienia większej dokładności analizy zapewniono chłodzenie (około +1 do +3 C) stojaka automatycznego podajnika próbek, a w celu wyeliminowania niepożądanej zmienności na skutek zużywających się wraz z upływem czasu elementów 140

86 układu chromatograficznego, zapewniono takie ustawienie ich kolejności na stojaku podajnika, by wszystkie grupy żywieniowe i podgrupy były analizowane naprzemiennie (x10,000,000) Rys. 1. Chromatogramy analizy lotnych związków metodą SPME-GC-MS w próbce mięsa (górny chromato gram) i tłuszczu sadełkowego (dolny chromatogram), po obróbce termicznej (170 C, 35 min.) Pierwsze obserwacje wskazują na większą obfitość i różnorodność związków lotnych w mięsie gęsim, w porównaniu z tłuszczem sadełkowym. Jest to prawdopodobnie spowodowane obecnością w próbkach mięsa większej ilości różnych prekursorów związków lotnych. W tkance sadełka tymi prekursorami są prawie wyłącznie tłuszcz i kwasy tłuszczowe, natomiast w mięśniach nóg obecne są, dodatkowo, zarówno węglowodany, jak i białka i peptydy. Obecność tych substancji daje możliwość tworzenia w wyniku reakcji Maillarda licznych związków lotnych. Rys. 2. Wyposażenie podstawowe wraz z chromatografem HS-SPME-GC/MS do analiz związków lotnych (fot. Krzysztof Wojtycza) 141

87 Zadanie Wykorzystanie spektrometrii odbiciowej w bliskiej podczerwieni NIRS do badania zawartości fosforu w materiałach paszowych Kierownik zadania: dr inż. Sławomir Walczyński Celem badań w ramach zadania było opracowanie, a następnie doskonalenie kalibracji na spektrofotometr InfraXact TM 7500 (FOSS) pracujący w bliskiej podczerwieni umożliwiającej badanie (przewidywanie) zawartości fosforu całkowitego w roślinnych materiałach paszowych. Badania przeprowadzono w dwóch etapach na typowych roślinnych materiałach paszowych, stosowanych do produkcji mieszanek paszowych. W przeprowadzonych wstępnych testach kalibracji (pierwszy etap) z wykorzystaniem różnych sposobów statystycznej obróbki danych do krzywej kalibracji wykorzystano 162 próbki materiałów paszowych takich jak: pszenica, pszenżyto, jęczmień, owies, żyto, produkt uboczny z przemysłu paszowego (pszenmix), otręby pszenne, rzepak (nasiona), kukurydza, DDGS, makuch sojowy, śruta sojowa poekstrakcyjna, śruta słonecznikowa poekstrakcyjna, śruta rzepakowa poekstrakcyjna, wysłodki buraczane. Każdą próbkę skanowano w aparacie InfraXact TM 7500 w dużej kuwecie w dwóch powtórzeniach. Aparat ten pracuje w zakresie widmowym od 570 nm do 1848 nm. Jednocześnie wykonano badania zawartości fosforu metodą akredytowaną według Rozporządzenia Komisji (WE) nr 152/2009 z dnia 27 stycznia 2009 r., które posłużyły do ustalenia korelacji z widmami NIRS. Wykonano ocenę statystyczną wyników i stworzono odpowiednią kalibrację zgodnie z normą PN-EN ISO za pomocą programu WinISI firmy FOSS. Program ten wykorzystuje technikę kalibracyjną PCA, czyli metodę głównych składowych. W drugim etapie włączono do istniejącej już kalibracji kolejny zbiór kalibracyjny składający się z 141 próbek materiałów paszowych, takich jak: pszenica, kukurydza, owies, otręby pszenne, otręby kukurydziane, produkt uboczny przerobu kukurydzy (cornmix), śruta sojowa poekstrakcyjna, śruta pełnotłusta, śruta pełnotłusta ekstrudowana, mączka sojowa, śruta rzepakowa, śruta słonecznikowa, drożdże paszowe, DDGS, makuch sojowy, łuska sojowa, wysłodki buraczane, susz z cykorii, łubin ekstrudowany. Powiększanie zbiorów kalibracyjnych sprzyja zwiększaniu jej odporności. Podobnie jak w badaniach wstępnych określono zawartość fosforu metodą oficjalną i dodatkowo wykonano analizę wilgotności metodą wagosuszarkową. Ocena statystyczna wszystkich, ponad 300, wyników została przeprowadzona za pomocą programu WinISI. W obu przypadkach, po przeprowadzeniu wstępnych analiz statystycznych i odrzuceniu próbek odstających próbki rozdzielano na zbiór kalibracyjny i walidacyjny. Następnie przeprowadzano obróbkę statystyczną za pomocą modułu kalibracyjnego WinISI (FOSS). Po uzyskaniu końcowej krzywej kalibracyjnej przeprowadzono dodatkowe jej sprawdzenie za pomocą niezależnego zbioru walidacyjnego składającego się łącznie z 44 próbek pszenicy, pszenżyta, żyta, owsa, jęczmienia, śruty rzepakowej poekstrakcyjnej, drożdży paszowych, peletów z traw, makuchu słonecznikowego. Czynności te wykonano za pomocą programu WinISI zgodnie z normą EN ISO 12099:2010 Animal feeding stuffs, cereals and milled cereal products Guidelines for application of near infrared spectrometry. Obliczono parametry walidacyjne, takie jak: standardowy błąd kalibracji SEC, standardowy błąd przewidywania skorygowany na obciążenie SEPc, standardowy błąd walidacji krzyżowej SECV, współczynnik determinacji R 2, zakres oznaczania przewidywania (MIN, MAX). Przeprowadzono wstępne testy sporządzania kalibracji z wykorzystaniem różnych sposobów statystycznej obróbki danych do krzywej kalibracji. Przeskanowano w dwóch powtórze- 142

88 niach na dużej kuwecie aparatem InfraXact TM próbki materiałów paszowych. Wyniki oznaczeń fosforu całkowitego metodą referencyjną zawierały się w przedziale od 0,71 g/kg do 15,0 g/kg. Za pomocą programu WinISI przeprowadzono kalibrację, dopasowując przebiegi widmowe skanowanych próbek do przypisanych im wartości fosforu całkowitego. Po dodaniu kolejnych 141 próbek materiałów paszowych, których obraz widmowy przedstawiono na rys. 1 przeprowadzono drugą kalibrację (rys. 2, tab. 1). Zbiór liczył łącznie 303 próbki. W procesie selekcji przed tworzeniem kalibracji odrzucono 15 próbek, takich jak: wysłodki buraczane, łuska sojowa, makuch sojowy, lucerna, makuch rzepakowy, DDGS kukurydziany, śruta słonecznikowa. Próbki te znacznie odbiegały spektralnie od zbioru kalibracyjnego i ich włączenie było niemożliwe. Rys. 1. Wykres widmowy 141 próbek poszerzających zbiór kalibracyjny (linia żółta średnia wartość widm) Rys. 2. Wykres kalibracji po 2 etapach 303 próbki 143

89 Tabela 1. Parametry statystyczne opisujące jakość przeprowadzonej kalibracji w drugim etapie Składnik Min Max Średnia SEC RSQ SECV BIAS 1-VR Fosfor 1,58 15,0 6,409 0,599 0,967 0,746 0,161 0,949 Min minimalna zawartość fosforu w zbiorze kalibracyjnym, g/kg Max maksymalna zawartość fosforu w zbiorze kalibracyjnym, g/kg Średnia średnia zawartość fosforu w zbiorze kalibracyjnym, g/kg SEC standardowy błąd kalibracji, g/kg RSQ kwadrat współczynnika korelacji wielokrotnej wartości przewidywanych i odniesienia (R 2 ) SECV standardowy błąd kalibracji krzyżowej, g/kg BIAS obciążenie (błąd systematyczny), g/kg 1 VR korelacje pomiędzy grupami w walidacji krzyżowej Włączenie następnych próbek do zbioru kalibracyjnego rozszerzyło stosowanie kalibracji w dolnym zakresie do 1,58 g/kg oraz zmniejszyło standardowy błąd kalibracji do wartości 0,599 g/kg. Inne parametry uległy nieznacznemu pogorszeniu, np. R 2 z 97,1% do 96,7%, czy BIAS z 0,078 g/kg do 0,161 g/kg. Powiększanie zbioru kalibracyjnego czasami powoduje obniżenie parametrów jakościowych. Jednak równocześnie następuje wzrost odporności kalibracji. Kolejny etap to walidacja kalibracji przeprowadzona na zbiorze 72 próbek (tabela 2). Tabela 2. Parametry statystyczne opisujące walidację kalibracji w drugim etapie Składnik Średnia SEP SEP(C) Nachylenie RSQ Śr. GH Śr. LH Fosfor 6,496 0,740 0,727 1,026 0,956 0,837 0,006 Niektóre parametry jakościowe walidacji kalibracji drugiego etapu uległy nieznacznemu obniżeniu, jak np. standardowy błąd kalibracji krzyżowej z 0,617 na 0,727, R 2 z 0,972 na 0,956. Średnia wartość globalnego h (Śr. GH) zmniejszyła się do 0,837, średnia wartość lokalnego h (Śr. LH) osiągnęła poziom 0, Rezultatem przeprowadzonych prac jest opracowana kalibracja NIR na zawartość fosforu całkowitego o wysokim współczynniku determinacji R 2, który w II etapie kalibracji na 303 próbkach wyniósł 0, Zakres stosowania kalibracji zawiera się w granicach 1,58 g/kg do 15,0 g/kg, przy obciążeniu BIAS = 0,161 g/kg i SEC = 0,599 g/kg. 3. Należy prowadzić sprawdzania poprawności działania kalibracji na niezależnych zbiorach próbek testowych, które następnie mogą być włączane do podstawowego zbioru kalibracyjnego. 4. Badania powinny być kontynuowane w celu poszerzania zbioru kalibracyjnego zarówno przez istniejące już w zbiorze rodzaje próbek, jak również poprzez ocenę możliwości włączania do bazy danych próbek niespecyficznych, które obecnie obiegają widmowo od reszty zbioru. 144

90 OBSZAR TEMATYCZNY 6 TECHNOLOGIA, EKOLOGIA I EKONOMIKA PRODUKCJI ZWIERZĘCEJ Zadanie Wpływ ekologicznych metod chowu na wybrane parametry rozrodu zwierząt gospodarskich Kierownik zadania: dr inż. Ewa Sosnówka-Czajka Celem zakończonych badań przeprowadzonych w ramach zadania dotyczącego wpływu ekologicznych metod chowu na wybrane parametry rozrodu zwierząt gospodarskich było porównanie wybranych wskaźników rozrodu zwierząt gospodarskich utrzymywanych w systemie konwencjonalnym i ekologicznym, a także ocena różnych metod produkcji ekologicznej w aspekcie pozyskania zwierząt certyfikowanych przeznaczonych do dalszego chowu zgodnie z założeniami rolnictwa ekologicznego. Realizowane zadanie składało się z dwóch celów szczegółowych, a tematyka badawcza dotyczyła drobiu i owiec. W 2017 roku zakończono badania, których celem było porównanie wskaźników wylęgowości oraz jakości piskląt pochodzących od kur ras rodzimych utrzymywanych w systemie konwencjonalnym i ekologicznym. Ponadto oceniony został wpływ mieszanki ziół i dodatków witaminowych na parametry lęgu oraz jakość materiału biologicznego w warunkach chowu ekologicznego. Na powyższy cel główny składały się cele doświadczalne obejmujące: porównanie wylęgowości kur ras rodzimych w zależności od systemu odchowu, optymalizację parametrów lęgu i jakości biologicznej piskląt rasy Zielononóżka kuropatwiana oraz opracowanie metod poprawy wylęgowości oraz jakości biologicznej piskląt rasy Rhode Island Red. Materiał doświadczalny stanowiły kury rasy Zielononóżka kuropatwiana oraz Rhode Island Red. W doświadczeniu pierwszym kury obu ras były utrzymywane konwencjonalnie w systemie ściołowym bez wybiegowym oraz zgodnie z założeniami rolnictwa ekologicznego. W drugim doświadczeniu kury rasy Zielononóżka kuropatwiana utrzymywano w chowie ekologicznym. Grupa pierwsza była grupą kontrolną, w drugiej zastosowano jako dodatek do paszy mieszankę ziół, w kolejnej dodatek tokoferoli i kwasu foliowego. W kolejnym, trzecim doświadczeniu przebadano wpływ takich samych czynników jak w doświadczeniu 2, jednak badania prowadzone były na innej rasie kur, tj. Rhode Island Red. W trakcie realizacji badań kontrolowano wyniki produkcyjne kur, przeprowadzono ocenę wartości biologicznej jaj (porowatość skorupy i liczba brodawek w skorupie, jakość jaj, profil kwasów tłuszczowych, zawartość wit. A i E, skład chemiczny), a także ocenę lęgów (ocena ubytków w masie jaj podczas inkubacji, % zapłodnienia, % wylęgu z jaj nałożonych, % wylęgu z jaj zapłodnionych, zarodki zamarłe (%), badanie jaj zapłodnionych niewylężonych: niezresorbowany woreczek żółtkowy, wady budowy anatomicznej płodu, itp.). Określona została także wartość biologiczna piskląt (masa ciała jednodniowych piskląt, przeżywalność do 7 dnia życia, masa oraz skład woreczka żółtkowego, poziom glukozy oraz kompleksu immunoglobulinowego w pierwszym dniu życia piskląt, liczba piskląt słabych i kalekich). Wykonano również oznaczenie hormonów płciowych w surowicy krwi kur. Stwierdzono wpływ systemu utrzymania na wyniki produkcyjne, jakość jaj oraz wylęgowość kur nieśnych rasy Z11 i R11. Utrzymanie kur nieśnych zgodnie z założeniami rolnictwa ekologicznego wpłynęło na wzrost nieśności i poprawę wykorzystania paszy, a także zwiększyło przeżywalność piskląt w pierwszym okresie odchowu, natomiast obniżyło masę jaja oraz wy- 145

91 lęgowość i zwiększyło upadki kur w porównaniu do utrzymania w systemie konwencjonalnym. Jaja pochodzące od kur utrzymywanych w systemie ekologicznym cechowały się lepszym profilem kwasów tłuszczowych w żółtku jaja, jednak równocześnie stwierdzono mniejszą masę żółtka w jaju. Nie wykazano wpływu systemu utrzymania na kształtowanie się poziomu hormonów w surowicy krwi oraz na skład chemiczny jaja, a także na poziom witaminy A i E w jaju. Rasa kur nieśnych miała wpływ na wyniki produkcyjne, wylęgowość oraz jakość jaj. Kury rasy Rhode Island Red charakteryzowały się wyższą nieśnością i lepszym wykorzystaniem paszy w porównaniu do kur rasy Zielononóżka kuropatwiana. Jaja kur R11 miały wyższą masę i wysokość białka, ciemniejszą barwę skorupy oraz mniej wydłużony kształt jaja. Kury nieśne rasy Rhode Island Red cechowały się gorszą wylęgowością oraz większą częstotliwością występowania zaburzeń embriogenezy. Pisklęta pochodzące od kur Rhode Island Red charakteryzowały się wyższą masą ciała oraz mniejszym udziałem piskląt padłych w pierwszym okresie odchowu, jednak równocześnie wykazano mniejszy udział woreczka żółtkowego oraz wolniejsze tempo jego resorpcji u tych piskląt w porównaniu do piskląt rasy Zielononóżka kuropatwiana. Nie wykazano wpływu rasy kur na poziom hormonów płciowych w surowicy krwi. Kury żywione paszą wzbogaconą w witaminę E i kwas foliowy cechowały się lepszą zdrowotnością, o czym świadczą mniejsze upadki w okresie nieśności w porównaniu do grupy kontrolnej kur żywionych standardową ekologiczną mieszanką paszową utrzymywanych na certyfikowanej fermie drobiu. Dodatek do paszy witaminy E i kwasu foliowego wpłynął pozytywnie również na wylęgowość piskląt pochodzących od kur utrzymywanych w systemie ekologicznym poprzez zmniejszenie częstotliwości występowania zaburzeń embriogenezy, stwierdzono także wyższą masę ciała (pisklęta Z11) i wyższy udział woreczków żółtkowych u jednodniowych piskląt oraz szybsze tempo resorpcji woreczków żółtkowych, jednak równocześnie obserwowano wzrost śmiertelności tych piskląt w porównaniu do grupy kontrolnej. Zastosowane dodatki witamin zarówno dla kur Z11 jak i R11 wpłynęły na wzrost poziomu witaminy E oraz poprawę profilu kwasów tłuszczowych w żółtku jaja. Nie stwierdzono jednoznacznego wpływu mieszanki ziół podanej z paszą dla kur rasy Z11 i R11 utrzymywanych w warunkach rolnictwa ekologicznego na badane parametry produkcyjności. Wykazano jednak pozytywny wpływ mieszanki ziołowej na zdrowotność ptaków, co potwierdziły niższe upadki kur zarówno rasy Z11 i R11, lepszą wylęgowość oraz mniejszą częstotliwość występowania zaburzeń embriogenezy, a także wyższy udział woreczka żółtkowego i szybsze tempo resorpcji. Równocześnie obserwowano pogorszenie się profilu kwasów tłuszczowych w żółtku jaja kur rasy R11. Kolejnym celem szczegółowym zakończonym w roku 2017 było określenie porównania parametrów rozrodu owiec w chowie konwencjonalnym i ekologicznym z uwzględnieniem wczesnego okresu odchowu jagniąt oraz ocena skuteczności zastosowania dodatków ziołowych i mieszanki mineralno-witaminowej oraz ich wpływu na rozród owiec w produkcji ekologicznej. Badania realizowane były na maciorkach rasy suffolk (S) i owca pomorska (P). W pierwszym etapie doświadczenia przeprowadzono porównanie wyników rozrodu owiec w chowie ekologicznym (E) i konwencjonalnym (K). Etap II objął optymalizację parametrów rozrodu owiec w chowie ekologicznym. Zwierzęta zostały podzielone tu na cztery grupy doświadczalne: kontrolną (0) oraz otrzymujące: fermentowany ekstrakt ziołowy (Z), uzupełniającą mieszankę witaminowo-mineralną Blattin ADE (M) oraz zarówno ekstrakt ziołowy, jak i mieszankę witaminowo-mineralną (MZ). Przeprowadzono oznaczenia podstawowych wskaźników rozrodu owiec, ocenę kondycji matek przed stanówką (Body Condition Scoring, ocena 5-punktowa), monitorowano też przebieg porodów. Określono stężenie hormonów płciowych (estrogeny i progesteron) podczas trwania ciąży, immunoglobulin IgG w siarze oraz wchłoniętych po spożyciu siary w surowicy krwi jagniąt. Przeprowadzono obserwacje rozwoju jagniąt w okresie postnatalnym do 56. dnia życia. Stwierdzono korzystną kondycję matek w okresie poprzedzającym stanówkę [2,5 (ZP i MZP) - 3,6 pkt. (KS)], właściwy, typowy dla gatunku poziom hormonów płciowych w okre- 146

92 sie ciąży [progesteron: ok. 2,5-3,5 ng/ml przez większą część ciąży, ze wzrostem do ok. 10 ng/ml około 130. dnia; estrogeny - ok. 6 pg/ml przez większą część ciąży, z łagodną tendencją wzrostową w ostatnim trymestrze (ok. 8 pg/ml)] oraz wysoką zawartość przeciwciał u wszystkich objętych doświadczeniem zwierząt (stężenie IgG w siarze matek powyżej 100 g/l; transfer odporności biernej jagniąt - zawartość IgG we krwi powyżej 15 g/l). Wszystkie parametry rozrodu owiec utrzymywanych w systemie ekologicznym były korzystniejsze od określających zwierzęta utrzymywane konwencjonalnie, z równoczesnym wskazaniem na suplementację preparatem ziołowym, mającym wpływ na istotną ich poprawę. Tabela 1. Podstawowe wskaźniki rozrodu owiec I etap Grupa Cecha (%) Płodność Plenność Odchów jagniąt Użytkowość rozpłodowa E suffolk 95 b 125 Bb 96 Bb 120 Bb E pomorska 95 b 125 Bb 96 Bb 120 Bb K suffolk 90 a 115 Aa 91 Aa 100 Aa K pomorska 90 a 115 Aa 91 Aa 100 Aa E grupa ekologiczna, K grupa konwencjonalna a, b, c różnice istotne przy poziomie a = 0,05. A, B, C różnice istotne przy poziomie a = 0,01. Tabela 2. Podstawowe wskaźniki rozrodu owiec II etap Grupa Cecha (%) Płodność Plenność Odchów jagniąt Użytkowość rozpłodowa 0 suffolk 95 Ab 125 ABb 96 ABb 120 Bc 0 pomorska 95 Ab 125 ABb 96 ABb 120 Bc M suffolk 90 Aa 125 ABb 92 Aa 115 ABb M pomorska 95 Ab 120 Aa 92 Aa 110 Aa Z suffolk 100 Bc 135 Cd 100 Cc 135 Ce Z pomorska 100 Bc 135 Cd 100 Cc 135 Ce MZ suffolk 95 Ab 135 Cd 100 Cc 130 Cd MZ pomorska 100 Bc 130 BCc 100 Cc 130 Cd 0 grupa kontrolna, M, Z, MZ suplementacja, odpowiednio: witaminy-minerały, zioła i witaminy-minerały + zioła a, b, c różnice istotne przy poziomie a = 0,05. A, B, C różnice istotne przy poziomie a = 0,01. Równocześnie nie stwierdzono wyraźnie zaznaczonego trendu wpływu rasy na wartość tych wskaźników (tab. 1-2). Wyniki odchowu potwierdzają szybkie tempo wzrostu jagniąt obydwu ras, ze wskazaniem na tryczki rasy suffolk. Nie stwierdzono wpływu systemu utrzymania konwencjonalnego, ekologicznego i z suplementacją komponentem mineralno-witaminowym na dynamikę wzrostu badanych jagniąt, co zapewne wynikało z właściwie zbilansowanej dawki pokarmowej we wszystkich tych grupach. 147

93 Tabela 3. Masa ciała jagniąt (tryczków) doświadczalnych wraz z przyrostami do 56. dnia życia I etap Grupa Masa ciała (kg) 2 dzień 21 dzień 38 dzień 56 dzień Przyrosty masy ciała dnia (kg) E suffolk 4,8 b 11,9 b 17,5 b 22,8 b 0,33 b E pomorska 4,5 a 11,3 a 15,8 a 20,3 a 0,29 a K suffolk 4,7 b 11,8 b 17,3 b 22,5 b 0,32 b K pomorska 4,5 Aa 11,2 a 15,6 a 20,6 a 0,29 a E grupa ekologiczna, K grupa konwencjonalna a, b, c różnice istotne przy poziomie a = 0,05. Tabela 4. Masa ciała jagniąt (tryczków) doświadczalnych wraz z przyrostami do 56. dnia życia II etap Grupa Masa ciała (kg) 2 dzień 21 dzień 38 dzień 56 dzień Przyrosty masy ciała dnia (kg) 0 suffolk 4,8 c 11,9 ABc 17,5 Bc 22,9 BCc 0,33 Bb 0 pomorska 4,4 a 11,2 Aa 15,8 Aa 20,2 Aa 0,29 Aa M suffolk 4,8 c 11,8 ABc 17,7 Bc 23,1 Cd 0,33 Bb M pomorska 4,5 a 11,1 Aa 15,9 Aa 20,5Aa 0,29 Aa Z suffolk 4,8 c 12,6 Cd 19,4 Cd 25,1 De 0,37 Cc Z pomorska 4,6 ab 11,6 Ab 16,5 ABb 22,3 Bb 0,32 Bb MZ suffolk 4,7 bc 12,8 Cd 19,6 Cd 25,2 De 0,37 Cc MZ pomorska 4,5 a 11,6 Ab 16,4 ABb 22,5 Bb 0,33 Bb 0 grupa kontrolna, M, Z, MZ suplementacja, odpowiednio: witaminy-minerały, zioła i witaminy-minerały + zioła a, b, c różnice istotne przy poziomie a = 0,05. A, B, C różnice istotne przy poziomie a = 0,01. Tendencja taka wystąpiła u jagniąt otrzymujących ekstrakt ziołowy, które były zarówno najcięższe po urodzeniu, jak i we wszystkich pozostałych terminach pomiarów, osiągając w konsekwencji najwyższe średnie dobowe przyrosty masy ciała (tab. 3-4). Chów owiec ras wysokoprodukcyjnych w systemie ekologicznym prowadzi do poprawy wskaźników określających ich rozród w porównaniu z klasycznym systemem utrzymania. Wprowadzenie ekstraktu ziołowego ma korzystny wpływ zarówno na znaczną poprawę wszystkich wskaźników rozrodu matek, zwiększenie przeżywalności jagniąt, jak również i na poprawę dynamiki ich tuczu. Zadanie Optymalizacja zużycia energii w produkcji zwierzęcej Kierownik zadania: dr Wojciech Krawczyk Celem głównym zadania było określenie wielkości nakładów energii w chowie zwierząt gospodarskich, a także możliwość jej substytucji źródłami odnawialnymi z wykorzystaniem rozwiązań energooszczędnych oraz surowców rolniczych dla potrzeb kogeneracji. 148

94 Cel szczegółowy 1: Określenie wielkości nakładów energetycznych w podstawowych działach produkcji zwierzęcej. Cel szczegółowy 2: Walidacja alternatywnych rozwiązań energetycznych w produkcji zwierzęcej. Cel szczegółowy 3: Optymalizacja procesów hydrolizy dla stabilizacji fermentacji metanowej w produkcji biogazu rolniczego w małych i średnich instalacjach. Cel szczegółowy 1 i 2: Określenie zużycia energii konwencjonalnej wykorzystywanej do ogrzewania, oświetlenia i wentylacji pomieszczeń i urządzeń stosowanych w utrzymaniu brojlerów i niosek (tab. 1 i 2). Określenie możliwości zastosowania fotoogniw w celu wspomagania centralnej instalacji wody użytkowej oraz centralnego ogrzewania (promienniki), wentylacji oraz oświetlenia wykorzystywanych w pomieszczeniach, w których utrzymywany jest drób (brojlery i nioski). Wykonano pomiary ilości energii konwencjonalnej i pochodzącej ze źródeł alternatywnych, wykorzystywanej do zasilania ww. instalacji i rozwiązań technologicznych wykorzystywanych w utrzymaniu drobiu. Pomiarom poddano ilości wytwarzanej energii oraz pobór energii przez stosowane urządzenia. Do każdego OZE podłączono poprzez licznik energii, identyczne wentylatory zamocowane w wentylacyjnych kanałach wywiewnych i sterowane przez centralny sterownik. Pomiarom poddano ilości pobranej energii i efektywność zasilanych urządzeń. Ponadto, do każdego OZE podłączono także poprzez licznik energii, odpowiednie sektory utrzymania drobiu wyposażone w oświetlenie o określonej mocy w postaci lamp świetlówek zamocowanych identycznie pod sufitem i lamp halogenowych zewnętrznych. Pomiarom poddano ilości pobranej energii i efektywność zasilanych odbiorników. Tabela 1. Rozdysponowanie zużycia energii w fermowym chowie brojlerów Wyszczególnienie Ogrzewanie i oświetlenie 24 h/szt. Wiosna (kw) Jesień (kw) Zima (kw) Okres odchowu/szt. 24 h/szt. Okres odchowu/szt. 24 h/szt. Okres odchowu/szt. 0,119 4,19 0,06 2,24 0,09 3,11 Wentylacja 0,0001 0,005 0,0001 0,004 0, ,002 Pozostałe 0,005 0,195 0,003 0,117 0,0005 0,016 Razem 0,125 4,39 0,067 2,36 0,089 3,13 Tabela 2. Rozdysponowanie zużycia energii w fermowym chowie niosek Wyszczególnienie Ogrzewanie i oświetlenie 24 h/szt. Wiosna (kw) Jesień (kw) Zima (kw) Okres odchowu/szt. 24 h/szt. Okres odchowu/szt. 24 h/szt. Okres odchowu/szt. 0,119 4,19 0,06 2,24 0,09 3,11 Wentylacja 0,0001 0,005 0,0001 0,004 0, ,002 Pozostałe 0,005 0,195 0,003 0,117 0,0005 0,016 Razem 0,125 4,39 0,067 2,36 0,089 3,13 149

95 Cel szczegółowy 3: W toku dotychczasowych badań stwierdzono największy stopień hydrolizy w przypadku zastosowania ph 10, jednak z powodu konieczności uzyskania optymalnego ph w procesie metanogenezy, rzędu 5-6 ph, taki odczyn substratu po hydrolizie, wymaga intensywnego zakwaszania, co zwiększa koszty i wydłuża czas jego przygotowania Optymalnym ph dla potrzeb hydrolizy okazało się stężenie jonów wodorowych na poziomie 8. Stopień hydrolizy w tym samym czasie reakcji był tu mniejszy niż dla zastosowanego ph 10, jednak wydłużenie hydrolizy do 35 dni pozwalało na uzyskanie identycznych właściwości substratu. Dla potrzeb zachowania długości całości cyklu fermentacji wynoszącego w instalacjach przemysłowych 60 dni, powstała konieczność wykorzystania dodatkowego czynnika, skracającego czas niezbędnej hydrolizy alkalicznej substratu. Wobec różnych metod fizykochemicznych pomocnych w osiągnięciu tego celu, najtańszą wydaje się być podwyższenie temperatury procesu hydrolizy do 70 o C. Uzyskanie takiej temperatury możliwe jest bezkosztowo poprzez wykorzystanie ciepła odpadowego biogazowni, pozyskiwanego z kogeneracji energii. Ponadto, zakup nowej aparatury badawczej, dokonany w mijającym roku (2 mikrofermenter), pozwoli na zwielokrotnienie i poszerzenie prac w tym zakresie. Tym samym, z uwagi na wymienione powyżej zależności na podstawie aneksu nr 1 zaproponowano realizację czwartego powtórzenia doświadczenia właściwego, polegającego na hydrolizie 3 dotychczasowych rodzajów substratów przy warunkach ph 8 i temperaturze 70 o C, wobec dotychczasowych 37 o C. Uzyskane wyniki obejmujące cele 1 i 2 dotyczące rozdysponowania i wielkości zużycia energii elektrycznej w chowie drobiu (brojlerów i niosek), wskazują, że w intensywnym chowie tych zwierząt wskazane jest obniżanie kosztów zakupu energii oraz zastosowanie OZE. Największe zużycie energii zmierzono dla oświetlenia i ogrzewania pomieszczeń dla drobiu. Duże zapotrzebowanie energii na oświetlenie pomieszczeń potwierdza zasadność wykorzystania fotoogniw jak źródeł energii alternatywnych lub wspomagających i z nimi też należy wiązać największe nadzieje w przyszłości. Już na obecnym etapie mogą one wspomagać konwencjonalne źródła energii nawet w zakresie kilkudziesięciu procent zapotrzebowania mocy czynnej urządzeń. Uzyskane wyniki celu 3 wskazują na największy stopień hydrolizy w przypadku zastosowania ph 10. Jednak z powodu konieczności uzyskania optymalnego ph w procesie metanogenezy, rzędu 5-6 ph, taki odczyn substratu po hydrolizie wymaga intensywnego zakwaszania, co zwiększa koszty i wydłuża czas przygotowania substratu. Optymalnym ph dla potrzeb hydrolizy okazało się stężenie jonów wodorowych na poziomie 8. Stopień hydrolizy w tym samym czasie reakcji, jest tu mniejszy niż dla zastosowanego ph 10, jednak wydłużenie hydrolizy do 35 dni pozwala na uzyskanie identycznych właściwości substratu. Fot. 1. Bioreaktor-fermenter 150

96 Zadanie Optymalizacja warunków mikroklimatycznych w pomieszczeniach dla bydła Kierownik zadania: dr inż. Andrzej Kaczor Celem badań zadania była poprawa warunków utrzymania cieląt i krów a także poprawa warunków pracy obsługi poprzez zastosowanie urządzeń polepszających mikroklimat pomieszczeń. Cielęta. W pomieszczeniach dla cieląt trudno jest stworzyć mikroklimat odpowiadający ich wymaganiom. Podstawowym problemem systemu wentylacyjnego w cielętnikach, szczególnie w tych tradycyjnych, jest wymagana normatywnie duża wymiana powietrza w przeliczeniu na masę ciała cieląt, ale pod warunkiem niskiej jego prędkości. Z tego powodu nad strefą legowiskową cieląt została zainstalowana wzdłużnie tuba wentylacyjna (rękaw wentylacyjny) ze szczelinami, służąca do wtłaczania świeżego powietrza o niskiej prędkości z zewnątrz (fot. 1). Fot. 1. Rękaw wentylacyjny w cielętniku Grupę doświadczalną stanowił sektor cielętnika ze zwierzętami wyposażony w rękaw wentylacyjny a grupę kontrolną sektor bez rękawa. W okresie sprawozdawczym przeprowadzono badania przewidziane w metodyce, tj. badania mikroklimatyczne, badania etologiczne oraz przyrostów masy ciała cieląt. W ramach badań mikroklimatycznych wykonano ciągłe pomiary temperatury i wilgotności względnej w sektorze doświadczalnym i w kontrolnym oraz na zewnątrz. Wykonano także momentalne pomiary prędkości ruchu powietrza, temperatury i wilgotności względnej oraz szkodliwych domieszek gazowych (CO 2 i NH 3 ). W ramach badań etologicznych, w okresie letnim wykonano 24-godzinne obserwacje etologiczne na 44 cielętach po odsadzeniu (cielęta 4-miesięczne) utrzymywanych w sektorze doświadczalnym i 50 cielętach w sektorze kontrolnym. Przyrosty dobowe masy ciała cieląt biorących udział w obserwacjach etologicznych zostały obliczone na podstawie masy ciała przy urodzeniu i przy opuszczaniu cielętnika około 120. dnia życia. Wyniki pomiarów mikroklimatycznych wskazują na prawidłowe funkcjonowanie rękawa wentylacyjnego (nawiewnego) w dostarczaniu świeżego powietrza dla około 50 cieląt o masie ciała kg. Przy stosowaniu rękawa wentylacyjnego dało się zauważyć niewielki spadek zarówno temperatury jak i wilgotności powietrza wewnątrz cielętnika z powodu napływu chłodniejszego i o mniejszej wilgotności powietrza z zewnątrz. Zastosowanie rękawa wentylacyjnego nie wpłynęło istotnie na zwiększenie prędkości ruchu powietrza, która w otoczeniu zwierząt kształtowała się na poziomie 0,12 m/s i nie przekraczała zalecanych wartości dla tej kategorii zwierząt. Natomiast wpływ stosowania rękawa wentylacyjnego był istotny 151

97 przy redukcji koncentracji CO 2 i NH 3 w powietrzu cielętnika nawet do 50% w okresie letnim. W okresie zimowym podczas występowania niskich temperatur na zewnątrz, rękaw wentylacyjny był wyłączony ze względu na znaczne obniżenie temperatury w cielętniku. W pozostałych porach roku, w zależności od temperatury zewnętrznej, wystarczającą wymianę powietrza można było uzyskać przy obrotach wynoszących od 20 do 60% maksymalnych obrotów wentylatora. Zużycie energii elektrycznej było uzależnione od obrotów wentylatora nawiewowego w rękawie i wynosiło od 17,0 do 71,2 KWh w ciągu doby/sektor. Rękaw wentylacyjny nie wpłynął istotnie na zachowanie się cieląt różnice w czasie trwania poszczególnych czynności były niewielkie. Przyrosty dobowe masy ciała cieląt do 120. dnia życia utrzymywanych w sektorze doświadczalnym (830 g) były lepsze niż utrzymywanych w sektorze kontrolnym (790 g). Krowy. Problem niekorzystnych warunków mikroklimatycznych w odniesieniu nie tylko do krów, ale również do obsługi w sektorze doju, tj. w hali udojowej oraz w poczekalni jest powszechnie znany. Zarówno powierzchnia jak i kubatura przypadająca na krowę jest w tych pomieszczeniach 5-krotnie mniejsza niż w oborze. W okresie letnim przy niewielkiej kubaturze przypadającej na zwierzę często mamy do czynienia ze stresem cieplnym u krów, który powoduje m.in. spadek produkcji mleka. W celu ograniczenia skutków stresu cieplnego w hali udojowej zainstalowano wysokowydajny wentylator sufitowy (fot. 2), a w poczekalni oprócz wentylatora sufitowego, także urządzenie do rozpylania wody zamgławiania powietrza (fot. 3). Grupę doświadczalną stanowiły pomieszczenia hali udojowej i poczekalni wraz ze zwierzętami podczas stosowania wentylatora i zamgławiania powietrza, a grupę kontrolną te same pomieszczenia z wyłączonymi urządzeniami. Według założeń metodycznych w pomieszczeniach hali udojowej i poczekalni przeprowadzono badania mikroklimatyczne oraz pomiary szybkości oddawania mleka przez krowy, a także badania nad sterowaniem pracy wentylatorów. W ramach badań mikroklimatycznych wykonano ciągłe pomiary temperatury i wilgotności względnej powietrza w hali udojowej i poczekalni oraz na zewnątrz, natomiast metody pomiarów momentalnych były identyczne jak przeprowadzone w cielętniku. Fot. 2. Wentylator sufitowy w hali udojowej Fot. 3. Wentylator sufitowy i urządzenie do rozpylania wody w poczekalni Wyniki pomiarów mikroklimatycznych wskazują na wpływ wentylatora sufitowego na prędkość ruchu powietrza w hali udojowej. Po włączeniu wentylatora sufitowego w hali udojowej nastąpiło istotne zwiększenie prędkości ruchu powietrza z 0,08 m/s do 0,43 m/s. Można przypuszczać, że znaczne zwiększenie prędkości ruchu powietrza obniżyło temperaturę odczuwalną u krów, a tym samym wpłynęło na ograniczenie powstawania stresu cieplnego. Wpływ wentylatora sufitowego na temperaturę i wilgotność względną powietrza a także stężenie CO 2 był niewielki, natomiast koncentracja amoniaku zmniejszyła się z 8 do 4 ppm. Rzeczywisty czas doju (dój maszynowy) u krów podczas stosowania wentylatora sufitowego w hali udojowej (5,5 min.) był mniejszy niż podczas doju przy wyłączonym wentylatorze (5,9 min.). Wyniki pomiarów mikroklimatycznych w poczekalni wskazują na wpływ wentylatora sufitowego na pręd- 152

98 kość ruchu powietrza a urządzenia do rozpylania wody na temperaturę i wilgotność powietrza. Podobnie jak w hali udojowej, po włączeniu wentylatora sufitowego w poczekalni nastąpiło istotne zwiększenie prędkości ruchu powietrza z 0,15 m/s do 0,60 m/s, natomiast temperatura powietrza nie uległa zmianie. Zastosowanie dodatkowo urządzenia do rozpylania wody wpłynęło istotnie na obniżenie temperatury, ale przyczyniło się równocześnie do zwiększenia wilgotności powietrza w tym pomieszczeniu. Temperatura powietrza podczas pracy urządzenia do rozpylania wody zmniejszyła się z 31,2 do 27,7 C a wilgotność względna wzrosła z 76,2 do 82,3%. Można przypuszczać, że zastosowanie urządzenia do rozpylania wody w poczekalni wpłynęło dodatkowo oprócz wentylatora sufitowego na ograniczenie skutków stresu termicznego u krów. Wpływ stosowania urządzenia do zamgławiania powietrza na koncentrację szkodliwych domieszek powietrza (CO 2 i NH 3 ) był niewielki. Zadanie Wpływ dodatku betainy do mieszanek paszowych dla ślimaka Helix aspersa na strawność i produkcyjność Kierownik zadania: dr hab. Maciej Ligaszewski, prof. IZ PIB W warunkach laboratoryjnych przeprowadzono doświadczenie kuwetowe mające na celu zbadanie wpływu na cechy produkcyjne ślimaków dodatku do paszy hydro-chlorku betainy (C5H11NO2.HCl). Ze względów technicznych nie było tym razem możliwości przeprowadzenia badań w warunkach ziemnych zagród szklarniowych, a do badań użyto ponownie wylęgu ślimaka małego szarego (Cornu aspersum aspersum synonym Helix aspersa aspersa). Zdecydowano się ponownie na ten wybór ze względu na niedostateczną ilość posiadanych w roku sprawozdawczym ślimaków doświadczalnych z podgatunku Cornu aspersum maxima (synonym Helix aspersa maxima). W trzech kuwetach hodowlanych umieszczono po 50 sztuk 10-dniowego wylęgu ślimaków, w następującym układzie doświadczalnym: 1. Kuweta kontrolna: podawanie paszy bez dodatku betainy. 2. Kuweta doświadczalna: podawanie paszy z dodatkiem 1,5 g betainy w 1 kg paszy. 3. Kuweta doświadczalna: podawanie paszy z dodatkiem 3,0 g betainy w 1 kg paszy. Podstawę pasz doświadczalnych stanowiła standardowa, sucha, roślinna mieszanka dla ślimaków. Dodatkowo, w ramach prób opracowania techniki badania strawności paszy przez ślimaki, w każdym wariancie doświadczenia na 1 kg paszy dodano 3 g wskaźnika w postaci tlenku chromu (Cr 2 O 3 ). Ślimaki utrzymywano w kuwetach doświadczalnych do czasu uzyskania przez nie dojrzałości somatycznej, rozrodczej i handlowej. Przez cały okres chowu doświadczalnego z każdego wariantu doświadczenia pobierano próbki kałomoczu, w celu utworzenia prób zbiorczych. Doświadczenie trwało 8 tygodni, do czasu uzyskania przez ślimaki dojrzałości somatycznej, handlowej i rozrodczej. Próbki zbiorcze kału oraz mięsa ślimaków i worków trzewiowych przeznaczono do analiz na zawartość białka, tłuszczu surowego, s.m., profilu WKT, aminokwasów, wapnia i fosforu. Próbki te znajdują się na początkowym etapie analiz laboratoryjnych. Wyniki doświadczenia w zakresie parametrów morfometrycznych i wydajności mięsnej dla ślimaków dojrzałych z drugiego roku badań przedstawiono w tabeli 1. Stwierdzono, że: ślimaki żywione paszą z zawartością 3 g betainy kg miały masę ciała w sposób statystycznie wysoko istotny (p< 0,01) większą, niż w wariancie kontrolnym, w którym żywiono je paszą bez dodatku betainy, 153

99 różnice dotyczące średnicy i masy muszli ślimaków z obu wariantów doświadczalnych i wariantu kontrolnego były statystycznie nieistotne, masa tuszy ślimaków żywionych paszą z dodatkiem 3 g betainy kg była statystycznie wyższa (p<0,05), niż ślimaków z wariantu kontrolnego, współczynnik kondycji ciała ślimaków żywione paszami doświadczalnymi (3,0 g i 1,5 g betainy kg paszy) był w sposób statystycznie wysoko-istotny (p< 0,01) wyższy, niż ślimaków z grupy kontrolnej, stosunek masy tuszy do masy ciała był statystycznie nieistotny dla wszystkich wariantów doświadczenia, stosunek masy nogi (stopy) ślimaków do masy ciała oraz do masy tuszy był w sposób statystycznie wysoko istotny (p<0,01) wyższy u ślimaków z obu wariantów paszy doświadczalnej w porównaniu z wariantem kontrolnym. Zawartość białka i poszczególnych aminokwasów oraz tłuszczu surowego z doświadczenia prowadzonego w pierwszym roku badań. Zagrody szklarniowe Stwierdzono w tuszach ślimaków żywionych paszą doświadczalną zawierającą dodatek betainy (5,0 g kg i 2,5 g kg) większą zawartość białka, niż w dwóch powtórzeniach paszy kontrolnej ( odpowiednio 125 g kg i 124 g kg w porównaniu do 2 x 123 g kg). Wraz ze zwiększaniem dodatku betainy do paszy rosła zawartość w tuszy podstawowego aminokwasu jakim jest glicyna, w stosunku do obu wariantów kontrolnych. W jeszcze większym stopniu rósł wyliczony udział tego aminokwasu w profilu aminokwasów, a także jego udział w stosunku do zawartości białka w tuszy. Ponieważ betaina (N,N,N-trimetyloglicyna) jest pochodną glicyny, więc taka zależność może mieć bezpośredni związek z wielkością tego dodatku w paszy. W tuszach ślimaków żywionych paszą zawierającą dwa zróżnicowane dodatki betainy (5,0 g kg i 2,5 g kg) stwierdzono mniejszą zawartość tłuszczu surowego, niż u ślimaków z dwóch wariantów kontrolnych doświadczenia (odpowiednio 1,5 1,6 g kg wobec 1,7 g i 2,0 g kg). Podsumowanie: W warunkach doświadczenia laboratoryjnego (2017), prowadzonego z wykorzystaniem specjalnych kuwet hodowlanych u ślimaków żywionych paszą z dodatkiem 3,0 g betainy kg stwierdzono w sposób statystycznie istotny (p<0,05) wyższą masę ciała i tuszy, niż u ślimaków z wariantu kontrolnego. U ślimaków z obu wariantów doświadczalnych (3,0 g kg i 1,5 g betainy kg -1 paszy) stwierdzono w sposób statystycznie wysoko istotny lepszą kondycję ciała, niż u ślimaków z wariantu doświadczalnego. U ślimaków z obu wariantów doświadczalnych stwierdzono w sposób statystycznie wysoko istotny (p<0,01) wyższą wydajność mięsną, niż w wariancie kontrolnym. W próbach zbiorczych tusz ślimaków z dwóch wariantów doświadczalnych z doświadczenia prowadzonego w pierwszym roku badań (2016) stwierdzono wyższą zawartość białka i niższą zawartość tłuszczu surowego, niż w dwóch wariantach kontrolnych, w których ślimaki żywiono paszami bez dodatku betainy. 154

100 W odniesieniu do prób zbiorczych tusz ślimaków z dwóch wariantów doświadczalnych (2016) stwierdzono wyższy udział glicyny w profilu aminokwasów i w tuszy ślimaków, niż w dwóch wariantach kontrolnych. Tabela 1. Parametry ciała ślimaków i wydajność mięsna w doświadczeniu kuwetowym (2017) Badane parametry Zawartość betainy w paszy (g kg) 3,0 1,5 Kontrola Parametry ciała masa ciała (g) 10,66 a 10,40 9,98 b średnica muszli (mm) 26,0 25,9 25,9 masa muszli (g) 1,39 1,40 1,35 masa tuszy (g) 9,27 a 9,00 8,63 b Współczynnik kondycji (g cm -3 ) (masa ciała średnica muszli -3 ) Parametry wydajności mięsnej 0,61 A 0,60 A 0,57 B Stosunek masy tuszy do masy ciała ślimaków dojrzałych (%) Stosunek masy nogi do masy ciała ślimaków dojrzałych (%) Stosunek masy nogi do masy tuszy ślimaków dojrzałych 86,9 86,6 86,4 37,2 A 37,2 A 34,3 B 43,1 A 43,0 A 40,2 B a, b, c różnice statystycznie istotne (P<0,05) pomiędzy wariantami doświadczenia A, B, C różnice statystycznie wysoko istotne (P<0,01) Fot. 1. Hodowla ślimaków 155

101 Zadanie Waloryzacja metod ograniczenia rozpraszania związków azotu z produkcji zwierzęcej Kierownik zadania: dr hab. Jacek Walczak Głównym celem zadania jest podjęcie działań zmierzających do ograniczenia niekorzystnych oddziaływań produkcji zwierzęcej staje się niezbędne wobec standardów określonych przez Unię Europejską, mających na celu podniesienie poziomu świadomości ekologicznej społeczeństwa. Wymaga to rozpoznania skali i zakresu zjawiska oraz opracowania na tej podstawie tanich i skutecznych metod przeciwdziałania. Stąd celem zadania jest opracowanie oraz weryfikacja metod ograniczenia emisji lotnych związków gazowych, a także koncentracji związków biogennych z utrzymania zwierząt gospodarskich, przechowywania nawozów naturalnych i nawożenia wraz z ich krajowym monitoringiem. Realizacja zadania obejmuje 4 cele szczegółowe: Cel szczegółowy 1 - Określenie efektywności metod redukcji rozpraszania azotu z systemów utrzymania bydła, świń i drobiu. Cel szczegółowy 2 - Wpływ rodzaju stosowanych dodatków paszowych oraz liczby faz żywienia na poziom ograniczenia wydalania azotu. Cel szczegółowy 3 - Określenie możliwości redukcji rozpraszania na drodze modyfikacji warunków przechowywania nawozów naturalnych. Cel szczegółowy 4 - Wpływ sposobu aplikacji nawozów naturalnych w trakcie nawożenia na wielkość rozpraszania azotu. W omawianym okresie sprawozdawczym zrealizowano etap dotyczący określenia potencjału redukcji rozpraszania azotu w utrzymaniu bydła, świń i drobiu. Badaniami objęto świnie, bydło i drób czystych ras jak i krzyżówek towarowych, utrzymywane w systemach ściołowych i bezściołowych. Prace dotyczyły zarówno zwierząt jak i systemów ich utrzymania, miejsc składowania odchodów (obornik, gnojowica) oraz sposobów nawożenia. W zakresie trzody chlewnej materiał stanowiły lochy z prosiętami, lochy prośne, warchlaki i tuczniki, ogółem w liczbie 800 sztuk. Zwierzęta z poszczególnych grup technologicznych utrzymywano przez okres odpowiadający standardowemu sposobowi postępowania z daną grupą. W obrębie bydła uwzględniono krowy mleczne i krowy zasuszone rasy czarno-białej (ok. 70% udziału krwi hf) oraz bydło opasowe. Ogółem badaniom poddano 72 krowy w trakcie laktacji i 72 krowy zasuszone oraz 144 sztuk bydła opasowego. W przypadku drobiu prace etapu obejmowały 400 kurek i kur rasy ISA Brown oraz 800 kurcząt brojlerów Cobb, utrzymywanych w trzech systemach utrzymania: na ściółce słomiastej, na ściółce trocinowej (z drzew iglastych), klatkowo w bateriach. Zwierzęta żywiono i utrzymywane zgodnie z obowiązującymi normami zawartymi w rozporządzeniach o minimalnych warunkach utrzymania w obiektach hodowlanych i w 6 komorach klimatycznych, z których każda wyposażona była w inny system utrzymania. Badania przeprowadzono również na 160 t odchodów (po 5 t w każdej z grup) pozyskanych od wymienionych grup technologicznych zwierząt. Uzyskane w trakcie badań wyniki ilustrują tabele 1-5. Zamieszczono w nich nie tylko koncentrację związków biogennych w odchodach zwierząt po 6-miesięcznym okresie przechowywania, ale również wielkość emisji podstawowych gazów, tak z budynków inwentarskich, jak i miejsc przechowywania nawozów. Wyniki uzyskane w zakresie emisji z utrzymania drobiu pozostają jeszcze na etapie przetwarzania danych statystycznych. 156

102 Tabela 1. Wielkość produkcji oraz koncentracja związków azotu w nawozach naturalnych od badanych grup technologicznych zwierząt gospodarskich Gatunek/grupa technologiczna zwierząt System utrzymania Głęboka ściółka Płytka ściółka Bezściołowo Obornik Obornik Gnojówka Gnojowica/pomiot/ odchody* ) Produkcja (t/rok) Produkcja (t/rok) Produkcja (m 3 /rok) Zawartość (kg N/m 3 ) Zawar- -tość (kg N/t) Zawar- -tość (kg N/t) Produkcja (m 3 lub t/ rok) Zawartość (kg N/t lub m 3 ) Buhaje 19,0 3,1 10,5 3,3 5,8 3,4 22,0 3,5 Krowy mleczne 1 a) 18,8 2,6 10,0 2,8 6,2 2,7 17,6 3,4 Krowy mleczne 2 b) 23,8 3,1 14,8 3,3 7,6 3,2 23,0 4,0 Krowy mleczne 3 c) 26,0 3,7 16,2 4,0 8,4 3,8 25,4 4,5 Jałówki cielne 18,4 3,0 8,5 3,2 5,4 3,1 16,4 3,4 Jałówki powyżej 1 roku życia Jałówki od ½ do 1 roku życia Cielęta do ½ roku życia Bydło opasowe od ½ do 1 roku Bydło opasowe powyżej 1 roku 12,4 2,8 6,0 2,8 5,8 2,7 11,6 2,9 7,8 3,4 3,6 3,5 2,4 3,7 6,8 4,7 2,4 3,8 1,6 2,8 1,4 3,2 2,6 3,2 12,0 2,6 5,0 3,1 3,8 3,4 10,0 4,5 15,0 3,0 7,0 2,7 6,9 2,9 14,2 3,2 Knury 5,5 3,1 3,2 3,1 1,9 3,3 4,6 3,6 Lochy 5,0 3,9 3,7 4,0 1,8 4,2 4,6 4,3 Warchlaki od 2 do 4 miesięcy życia Prosięta do 2 miesięcy życia 1,5 2,9 1,0 1,5 0,5 0,8 1,4 3,0 0,5 1,8 0,3 0,9 0,2 0,4 0,7 2,0 Tuczniki 2,0 4,2 1,5 4,4 1,0 4,6 1,9 4,6 Kury 0,046 8,5 0,04 12,1 *) Kury pomiot podsuszony - - 0,03 10,5 Pisklęta 0,03 6,3 - - Brojlery kurze 0,05 12,7 0,03 17,0 Kaczki 0,064 6,1 0,06 8,5 Gęsi 0,036 14,5 0,04 17,0 Indyki 0,067 15,4 0,06 19,0 157

103 Tabela 2. Wielkość podstawowych emisji gazowych z badanych systemów utrzymania i grup technologicznych świń (kg/rok/szt.) System utrzymania Grupa technologiczna Ściołowy Samospławialny Głęboka ściółka Rusztowy Częścioworusztowy SEM Lochy karmiące para wodna 6132,94a X X 6571,59b 6324,21c 39,19 dwutlenek węgla 4550,70a X X 5130,64b 4651,47c 50,63 amoniak 5,92aA X X 9,43Bb 5,41Ac 0,50 siarkowodór 0,202A X X 0,530B 0,247C 0,03 metan 4,92Aa X X 6,21bB 3,93Ac 0,19 tlenki azotu 0,214a X X 0,230b 0,198c 0,01 Warchlaki para wodna 583,32a 578,28b 648,59c 656,07d 620,73b 7,02 dwutlenek węgla 344,10a 328,17a b 364,32a 332,03a 5,57 amoniak 1,20Aa 0,62Bb 1,67Ac 2,03Cd 0,91Bd 0,11 siarkowodór 0,042Aa 0,037Aa 0,047Aa 0,142Bb 0,077Ac 0,007 metan 0,61aA 0,42aA 1,53bB 0,97cD 0,54Aa 0,08 tlenki azotu 0,032 0,020 0,038 0,029 0,024 0,002 Tuczniki para wodna 728,45Aa 799,64b 1068cB 803,47b 783,04a 20,01 dwutlenek węgla 773,89a 728,91b 818,34c 797,89ac 748,60ab 7,47 amoniak 2,93a 2,31b 3,67c 5,24d 2,89a 0,29 siarkowodór 0,091A 0,084A 0,108B 0,322D 0,129AB 0,02 metan 1,91a 1,64a 2,5b 2,25b 1,83a 0,07 tlenki azotu 0,054a 0,043a 0,071b 0,048a 0,039a 0,003 Lochy prośne para wodna 1035,70a 1023,64a 1228,51b 1163,70b 1074,41a 14,69 dwutlenek węgla 1243,73a 1051,30b 1387,36c 1310,08c 1132,06b 25,04 amoniak 3,73aA 3,42bA 5,01B 7,45C 3,89aA 0,24 siarkowodór 0,169A 0,145A 0,234B 0,728C 0,259B 0,04 metan 3,42A 2,88A 4,60B 4,15C 3,26A 0,12 tlenki azotu 0,128aA 0,097bA 0,163cB 0,116aA 0,084bA 0,02 158

104 Tabela 3. Emisje gazowe z przechowywania stałych nawozów naturalnych różnych grup technologicznych świń (kg/t) Wyszczególnienie Tuczniki obornik Tuczniki głęboka ściółka Stałe nawozy naturalne Warchlaki obornik Lochy prośne obornik Lochy prośne głęboka ściółka Lochy karmiące obornik SEM NH 3 1,73aA 4,39bB 1,44cA 1,76aA 3,47dAB 2,76eAB 0,14 NO x 0,19aA 0,49bB 0,15cA 0,19aA 0,36dC 0,30dC 0,02 CH 4 6,93aA 10,92bB 9,59cB 8,73dAB 15,64eC 9,35cB 1,35 H 2 S 0,89aA 2,11bB 0,97cA 0.82aA 2,21bB 1,25dA 0,28 Tabela 4. Emisje gazowe z przechowywania płynnych nawozów naturalnych różnych grup technologicznych świń (kg/t) Wyszczególnienie Ciekłe nawozy naturalne Tuczniki gnojowica Tuczniki gnojówka Warchlaki gnojowica SEM Warchlaki gnojówka Lochy prośne gnojowica Lochy prośne gnojówka Lochy karmiące gnojowica Lochy karmiące gnojówka NH 3 4,91fB 5,17gB 2,53eAB 2,93hAB 3,04hAB 3,30dAB 3,87iAB 3,40dAB 0,14 NO x 0,69eD 0,82fE 0,42bB 0,53gB 0,38dC 0,62eD 0,59gB 0,40bB 0,02 CH 4 18,18fD 25,06gE 32,03hF 39,42iG 29,97jH 37,45kGI 25,73lE 35,38mI 1,35 H 2 S 7,25eC 6,97eC 6,43fC 5,95gC 4,83hC 4,31iCD 5,43jC 5,04kC 0,28 159

105 Tabela 5. Wielkość emisji gazowych z podstawowych systemów utrzymania różnych grup technologicznych bydła (kg/rok/szt.) System utrzymania Grupa technologiczna Ściołowy Głeboka ściółka Bezściołowy Częścioworusztowy Krowy mleczne - amoniak 7,92ABC X 16,43ADe 5,41cDF - siarkowodór 0,402ABC X 0,813AdE 0,647CEF - metan 74,92abC X 85,20bdE 73,93aEF - tlenki azotu 0,414abcd X 0,506bg 0,398defg Krowy zasuszone - amoniak 8,20AbCDe 8,67GFLmn 8,24CGLO 7,91einOP - siarkowodór 0,342ABc 0,472GHi 0,515ADGjk 0,377cfikl - metan 80,61AB 84,53ACfG 83,35BDhI 78,54fGIj - tlenki azotu 0,532 0,538 0,527 0,524 Jałówki - amoniaku 7,2ab 7,67bcfgh 8,85adf 7,09h - siarkowodór 0,31abCDe 0,358GfIJK 0,42cGICM 0,31ekMN - metan 51,91ab 62,5acf 60,40bdg 44,83fgh - tlenki azotu 0,54aB 0,71abcde 0,42c 0,39e Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono, że chów zwierząt, zwłaszcza przy dużej skali i koncentracji produkcji prowadzi do istotnych oddziaływań na środowisko powietrzne. Stąd konieczne jest wypracowanie skutecznych i możliwych do powszechnego użycia metod redukcyjnych. Pod względem koncentracji azotu w nawozach naturalnych stwierdzono brak zagrożeń dla środowiska glebowego i wodnego nawet przy intensywnej produkcji, jednak tylko w przypadku kiedy dawka nawozu nie przekracza 170 kg N/ha. Zadanie Technopatie i stereotypie w aspekcie dobrostanu zwierząt gospodarskich Kierownik zadania: prof. dr hab. Eugeniusz Herbut Celem głównym zadania jest określenie wpływu warunków chowu na występowanie technopatii w aspekcie dobrostanu, parametrów fizjologicznych i produkcyjnych zwierząt gospodarskich. Cel szczegółowy 1 - Wpływ zabiegów technologicznych i systemów utrzymania na kształtowanie się zdrowotnych i produkcyjnych wskaźników dobrostanu kur nieśnych W 2017 roku przeprowadzono odchów 360 kurek Hy-Line od 1. dnia życia do 16. tygodni odchowu, które przydzielono do 2 grup: z przyciętym dziobem i bez przycięcia utrzymywane w systemie ściołowym bezwybiegowym. Żywione były do woli standardowymi mieszankami paszowymi sporządzonymi na bazie koncentratów. Przez cały okres odchowu ptaki miały stały 160

106 dostęp do wody. W czasie odchowu kontrolowano masę ciała ptaków w 1. dniu i 16. tygodniu życia i co tydzień zużycie paszy oraz padnięcia. W 6., 12. i 16. tygodniu oceniono stan kończyn oraz stan upierzenia, a także przeprowadzono obserwacje behawioralne. Obejmowały one: liczbę ptaków agresywnych, skubiących i wzajemnie wyrywających sobie pióra oraz apatycznych. Dodatkowo w 1., 6., 12. i 16. tygodniu wykonano pomiar czasu trwania tonicznego bezruchu. Stwierdzono, że w 16. tygodniu odchowu kurki bez przyciętego dzioba charakteryzowały się większa masą ciała w porównaniu z kurkami z przyciętym dziobem. Nie zauważono różnic w dziennym spożyciu paszy między badanymi kurkami. Nie odnotowano także różnic pomiędzy grupami w długości trwania znieruchomienia tonicznego oraz rozmazie białokrwin- kowym kurek Hy-Line. Cel szczegółowy 2 - Wpływ pochodzenia wielkości stadka na kształtowanie się wskaźników zdrowotnych i produkcyjnych kur różnych ras W pierwszym roku doświadczenia przeprowadzono odchów kurek ras rodzimych od 1. dnia do 16. tygodnia życia niezbędnych do dalszych etapów badań. Kurki rasy Leghorn, Sussex i Rhode Island Red w liczbie 300 sztuk utrzymywano w systemie ściołowym bezwybiegowym na fermie drobiu w Aleksandrowicach. Żywiono je do woli standardowymi mieszankami paszowymi sporządzonymi na bazie koncentratów. Przez cały okres odchowu ptaki miały swobodny dostęp do wody. Podczas odchowu kontrolowano masę ciała w 1. dniu i w 16. tygodniu życia, zużycie paszy oraz padnięcia. W 6., 12. i 16. tygodniu życia oceniono stan kończyn oraz upierzenie ptaków, a także wykonano pomiar czasu trwania tonicznego bezruchu. Przeprowadzono również obserwacje behawioralne, które obejmowały: liczbę ptaków agresywnych, skubiących i wzajemnie wyrywających sobie pióra oraz apatycznych. W 1. tygodniu pobrano krew od piskląt do oznaczeń fizjologicznych. Jako jednodniowe pisklęta najlżejsze były rasy Sussex a najcięższe Leghorn. W 16. tygodniu odchowu kurki rasy Leghorn charakteryzowały się najniższą masą ciała, najwyższą zaś kurki rasy RIR. W ostatnich dniach odchowu kurki rasy Leghorn odznaczały się statystycznie istotnie niższym dziennym spożyciem paszy w porównaniu z kurkami rasy rasy RIR. W 6. tygodniu odchowu stwierdzono różnicę w czasie trwania tonicznego bezruchu pomiędzy kurkami rasy Leghorn a Sussex. Pisklęta RIR charakteryzowały się niższym poziomem limfocytów i równocześnie szerszym stosunkiem H:L we krwi w porównaniu z ptakami rasy Leghorn. Cel szczegółowy 3 - Ocena wpływu zagęszczenia obsady i materiałów absorbujących uwagę na występowanie technopatii i stereotypii u prosiąt odsadzonych w 28. dniu życia Doświadczenie obejmowało obserwacje reakcji behawioralnych u odsadzonych prosiąt, ocenę masy ciała oraz monitoring mikroklimatu. Prosięta w liczbie 20 sztuk były odsadzane w 28. dniu życia. Młode były przenoszone do kojców wyścielonych słomą. Na każde zwierzę przypadało co najmniej 0,2 m 2 powierzchni kojca. Prosięta ważono w dniu odsadzenia, następnie po 3 tygodniach (7 tydzień życia) oraz w 10. tygodniu życia. Oceny behawioru tuczników dokonano na podstawie 24 godzinnego monitoringu za pomocą kamer Sony Handycom umieszczonych nad kojcami dla zwierząt. Biorąc pod uwagę przedział czasowy od 9.00 do stwierdzono, że czas spędzony aktywnie stanowił ok. 39%, natomiast pozostałe 61% czasu prosięta spędzały leżąc. Wśród zachowań aktywnych rycie w słomie stanowiło 39%, około 15% czasu zwierzęta przeznaczyły na pobieranie paszy, około 4% na picie wody. Interakcja z innymi prosiętami wynosiła około 16% aktywnie spędzonego czasu. W niewielkim stopniu zwierzęta wykazywały zachowania agresywne, w tym najczęściej obserwowano obgryzanie w okolicy uszu, szyi i karku u innych. Podbijanie brzucha stanowiło około 1,1% aktywnie spędzonego czasu. 161

107 Fot. 1. Kadr z zapisu kamery monitorującej behawior prosiąt utrzymywanych na słomie (fot. D. Godyń) Cel szczegółowy 4 - Wpływ warunków chowu na występowanie technopatii i stereotypii u cieląt i krów mlecznych rasy simental Obserwacje objęły 120 cieląt, które były podzielone na 2 grupy wiekowe: do 2 miesięcy i powyżej 2. miesiąca życia. Cielęta po odsadzeniu do 10. dnia życia karmione były mlekiem, a od 10. do 60. dnia preparatem mlekozastępczym. Zwierzęta powyżej 2 miesiąca utrzymywane w kojcach zbiorowych otrzymywały kiszonkę z kukurydzy, sianokiszonkę, paszę treściwą oraz siano. Powierzchnia przypadająca na 1 cielę w zależności od masy ciała wynosiła od 1,5-1,8 m 2. Przeprowadzone obserwacje behawioralne wykazały, iż stereotypie w grupie cieląt poniżej 2 miesiąca w zależności od systemu utrzymania występują: w kojcach indywidualnych u 35% cieląt, w budkach u 40%, a w kojcach grupowych aż u 70% cieląt. W grupie powyżej 2 miesięcy dotyczą one około 23% cieląt. Stwierdzono, że rodzaj stereotypii jest związany z systemem utrzymania. W kojcach indywidualnych oraz budkach obserwowano ssanie i lizanie prętów, natomiast w kojcach grupowych ponad 80% stereotypii to wzajemne obsysanie. W grupie cieląt powyżej 2 miesięcy w okresie karmienia ponad 90% stanowią stereotypie oralne: rolowanie języka oraz układanie języka do nosa. Podsumowując wykazano, iż stereotypie w pierwszym okresie odchowu występują u 35% do 70% cieląt rasy simental, natomiast w późniejszym okresie występują u około 23%. Fot. 2. Wzajemne obsysanie się cieląt po karmieniu 162

108 Fot. 3. Rolowanie i zabawa językiem (Rolling, Tongue playing) (fot. I. Radkowska) 163