WYKORZYSTANIE POŻYTECZNYCH MIKROORGANIZMÓW W ROLNICTWIE EKOLOGICZNYM

Transkrypt

1 WYKORZYSTANIE POŻYTECZNYCH MIKROORGANIZMÓW W ROLNICTWIE EKOLOGICZNYM Lidia Sas Paszt, Paweł Trzciński, Anna Lisek, Beata Sumorok, Edyta Derkowska, Sławomir Głuszek, Eligio Malusá, Michał Przybył, Mateusz Frąc, Krzysztof Weszczak INSTYTUT OGRODNICTWA, SKIERNIEWICE Nauka dla praktyki innowacyjne rozwiązania w ekologicznej produkcji rolnej Międzynarodowe Targi Łódzkie Łódź

2 Pracownia Rizosfery prowadzi badania nad rolą korzeni i rizosfery we wzroście i plonowaniu roślin sadowniczych. Badania obejmują rozwój zrównoważonych metod uprawy i nawożenia roślin sadowniczych dla produkcji wysokiej jakości owoców, zwiększenia naturalnej żyzności gleby z wykorzystaniem bakterii pożytecznych, grzybów mikoryzowych i innych komponentów biosfery gleby.

3

4 EKOTECHPRODUKT dr hab. Lidia Sas Paszt, dr hab. Eligio Malusa, prof. dr hab. Zygmunt S.Grzyb, dr Elżbieta Rozpara, dr Paweł Wawrzyńczak, dr Krzysztof Rutkowski, prof. dr hab. Dariusz Nowak, dr Krzysztof Zmarlicki, dr Barbara Michalczuk Źródło finansowania projektu: Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego, Program Operacyjny Innowacyjna Gospodarka Poddziałanie osi priorytetowej 1.

5 CELE PROJEKTU: Stworzenie warunków dla poprawy konkurencyjności polskich przedsiębiorców z sektora rolnictwa ekologicznego m.in. poprzez: Opracowanie i wprowadzenie do praktyki innowacyjnych rozwiązań dla ekologicznej uprawy roślin sadowniczych. Zwiększenie ekologicznej produkcji owoców i materiału szkółkarskiego w Polsce oraz poprawa jej opłacalności. Określenie wpływu owoców ekologicznych na zdrowie człowieka.

6 Opracowanie innowacyjnych biopreparatów Opracowanie maszyn i urządzeń technicznych do aplikacji biopreparatów Utworzenie SYMBIO BANK-u Ekonomiczne analizy produkcji ekologicznej Ulepszenie ekologicznych metod produkcji owoców i materiału szkółkarskiego Ocena jakości właściwości prozdrowotnych owoców Upowszechnianie wiedzy i opracowanych technologii Rolnicy (producenci owoców) Wytwórcy biopreparatów i urządzeń aplikacyjnych Ośrodki Doradztwa Rolniczego Poradnictwo naukowe i technologiczne

7 CELE SYMBIO BANK-u INSTYTUTU OGRODNICTWA Izolacja i charakterystyka symbiotycznych mikroorganizmów glebowych naturalnie zasiedlających korzenie roślin sadowniczych lub glebę dla praktyki ogrodniczej Identyfikacja pożytecznych gatunków i szczepów grzybów mikoryzowych oraz bakterii rizosferowych z wykorzystaniem technik klasycznych, biochemicznych i molekularnych Określenie efektywności działania - analizy in vivo w celu wyselekcjonowania najbardziej pożytecznych gatunków/szczepów mikroorganizmów dla praktyki ogrodniczej Przygotowanie rodzimych inokulów mikoryzowych i bakteryjnych

8 ZASOBY SYMBIO BANK-u Spory arbuskularnych grzybów mikoryzowych (AMF) (spory z rizosfery w sztukach) truskawka 18 tys. jabłoń 10,5 tys. wiśnia 1,5 tys. grusza 14 tys. poziomka 9,0 tys. RAZEM 53 tys. Izolaty bakterii (szt.) Pseudomonas fluorescens 300 produkujące siderofory 500 rozpuszczające zw. fosforu 200 rozkładające celulozę 40 wytwarzające formy przetrwalnikowe 125 wiążące azot atmosferyczny 100 promieniowce 100 RAZEM

9 IDENTYFIKACJA POŻYTECZNYCH BAKTERII I GRZYBÓW METODAMI MIKROSKOPOWYMI

10 IDENTYFIKACJA POŻYTECZNYCH BAKTERII I GRZYBÓW METODAMI BIOCHEMICZNYMI Płytka do systemu identyfikacji BIOLOG Pożyteczne mikroorganizmy na podłożach selektywnych

11 IDENTYFIKACJA MOLEKULARNA I OCENA ZRÓŻNICOWANIA GENETYCZNEGO IZOLATÓW POŻYTECZNYCH BAKTERII Testowano izolaty bakterii glebowych Pseudomonas z rizosfery wiśni, kultywowane na pożywce selektywnej S1. Techniki RFLP (HaeIII, TaqI, RsaI) Gen 16S rrna Operon 16S-ITS-23S rrna rep-pcr Analiza sekwencji genu 16S rrna Lisek A., Sas Paszt L., Trzciński P Identification and assessment of genetic similarity of soil bacerial isolates of Pseudomonas spp. using molecular techniques. Pol. J. Microbiol. 63:

12 PROFILE DNA WYBRANYCH POŻYTECZNYCH SZCZEPÓW BAKTERII K50WA AF65AL X29L Pi22B Ps49A Ps1/2 Pi3A X31E Sp27D

13 IDENTYFIKACJA ARBUSKULARNYCH GRZYBÓW MIKORYZOWYCH METODAMI MOLEKULARNYMI Ekstrakcja DNA z korzeni roślin lub ze spor grzybów Zagnieżdżony PCR Analiza sekwencji RFLP Gen rdna i startery umożliwiające amplifikację jego regionów

14 BADANIE PRZEŻYWALNOŚCI BAKTERII POŻYTECZNYCH APLIKOWANYCH W FORMIE KAPSUŁKACH NA BAZIE BIODEGRADOWALNEGO POLIMERU + 20% zeolitu 3% alginianu Ca + 20% skrobi Populacja bakterii zamknięta w kapsułkach z alginianu-ca zwiększa się podczas przechowywania (4 0 C, w okresie 6 tygodni). Dodatek skrobi do kapsułek z żywymi komórkami bakterii Pseudomonas zwiększa wytrzymałość kapsułek.

15 PRZECHOWYWANIE SPOR GRZYBÓW MIKORYZOWYCH W TEMP. -80 O C Przechowywanie spor w roztworach krioprotektantów (sacharoza, glicerol, mannitol, trehaloza, glukoza) Przechowywanie spor w otoczkach z alginianu wapnia + krioprotektanty Ocena kondycji i kiełkowania spor po mrożeniu Spory Mrożenie spor Ocena kiełkowania Kiełkująca spora Spory przechowywane w temp. -80 o C w roztworach krioprotektantów przeżyły mrożenie w lepszej kondycji i zachowały większą zdolność do kiełkowania niż spory przechowywane w otoczkach z alginianu wapnia + krioprotektanty.

16 WYSELEKCJONOWANE SZCZEPY BAKTERII I GRZYBÓW KOMPONENTY KONSORCJÓW BAKTERYJNO - MIKORYZOWYCH Bakterie PGPR: Grzyby mikoryzowe: Pi22B Ps49A Ps1/2 Pi3A x31e x31n Sp27D Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Rahnella aquatilis Rahnella aquatilis Rahnella aquatilis Bacillus subtilis Gigaspora margarita Glomus aggregatum G. caledonium G. claroideum G. constrictum G. drummondii G. fasciculatum G. macrocarpum G. microaggregatum G. mosseae G. pallidum G. rubiforme Scutellospora dipurpurescens

17 GALERIA POŻYTECZNYCH BAKTERII POMO PGPR IMAGE GALLERY (Bacillus subtilis Sp27D) Wzrost Bacillus subtilis Sp27D na podłożu Nutrient agar Właściwości biochemiczne Bacillus subtilis Sp27D (badanie systemem BIOLOG) Wzrost Bacillus subtilis Sp27D na podłożu TSA Barwienie metodą Grama

18 ZNACZENIE MIKROORGANIZMÓW W PRZYRODZIE 1. Udział w obiegu pierwiastków (rozkład biologiczny): mineralizacja martwych organizmów i resztek organicznych, asymilacja wolnego azotu z powietrza (bakterie brodawkowe, promieniowce, sinice), 2. Działanie glebotwórcze, 3. Tworzenie symbioz z wieloma organizmami, 4. Kontrola rozwoju innych organizmów (np. mikroorganizmy pożyteczne i chorobotwórcze) 5. Unieszkodliwianie toksycznych związków chemicznych i jonów metali Spory arbuskularnych grzybów mikoryzowych (Glomus claroideum)

19 WYSTĘPOWANIE MIKROORGANIZMÓW W GLEBIE Najwięcej mikroorganizmów znajduje się: na korzeniach roślin ze względu na wydzieliny korzeniowe w warstwie próchnicznej gleby ze względu na jej zasobność w składniki pokarmowe W głębszych warstwach gleby liczebność mikroorganizmów jest mniejsza Saprobionty

20 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW W GOSPODARCE Ahmad et al. 2011

21 PGPR są powszechnie stosowane w produkcji rolniczej, w ochronie roślin, poprawie jakości gleb, w produkcji kompostów, bionawozów i ulepszaczy glebowych bakterie kolonizujące powierzchnię korzeni i rizosferę - bakterie fluoryzujące Pseudomonas, bakterie Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Burkholderia, Achromobacter, Arthobacter, Azocarus, Clostridium, Enterobacter, Flavobacterium, Frankia, Hydrogenophaga, Kluyvera, Microcoleous, Phyllobacterium, Serratia, Streptomyces, Vibrio. Bakterie rizosferowe i/rhizo2/ Bakterie rizosferowe na powierzchni korzenia Pseudomonas fluorescens Evgeniy_A/ evgeniy.htm Bashan i de-bashan 2005; Ahmad et al. 2008; Husen 2013; Bashan et al. 2014

22 del Carmen Montero-Calasanz et al. 2013; Kasim et al. 2013; Egamberdieva i Lugtenberg 2014 Mia et al POŻYTECZNE MIKROORGANIZMY W UPRAWIE ROŚLIN Poprawa kiełkowania nasion Stymulacja rozwoju systemu korzeniowego, Poprawa wzrostu wegetatywnego i plonowania - wiązanie azotu atmosferycznego, Udostępnianie składników pokarmowych Zwiększenie odporności roślin na patogeny i szkodniki oraz stres abiotyczny kontrola korzenie traktowane mikroorganizmami

23 Sobiczewski P. 2002; Ghyselinck et al. 2013; Smirnova et al. 2013; Papageni et al MIKROORGANIZMY STYMULUJĄ WZROST I PLONOWANIE RÓŻNYCH GATUNKÓW ROŚLIN UPRAWNYCH Ziemniaka - Pseudomonas sp. (wzrost plonu o 5-33%) Marchwi i owsa - Bacillus subtilis (wzrost plonu o 48,33%) Buraków cukrowych - Pseudomonas sp. (wzrost plonu o 4-8 t/ha) Pszenicy - szczep 2-79 Pseudomonas fluorescens (wzrost plonu o 17%) Jabłoni - szczepy EBW-4 i BACT-1 Bacillus subtilis (wzrost PPPP o %)

24 KORZYSTNY WPŁYW BAKTERII RAHNELLA AQUATILIS NA WZROST ROŚLIN TRUSKAWKI (ELSANTA) W WARUNKACH SZKLARNIOWYCH A B Truskawki inokulowane szczepami bakterii Rahnella aquatilis A - Rahnella aquatilis B - Kontrola A B Trzciński et al Pracownia Rizosfery IO

25 BIOPRODUKTY STYMULUJĄ WZROST PODKŁADEK I DRZEWEK WIŚNI I JABŁONI W SZKÓŁCE Kontrola BF Quality Vinassa Florovit Eco

26 BIOPRODUKTY STYMULUJĄ OWOCOWANIE DRZEW JABŁONI Topaz Skutki żerowania mszyc Ariwa

27 POŻYTECZNE BAKTERIE I DROŻDŻE: Bakterie zwiększają plonowanie sałaty i marchwi inokulowanych bakteriami Rhizobium leguminosarum (z brodawek korzeniowych fasoli, Flores-Félix i in. 2013) Bakterie zwiększają stan odżywienia roślin uprawnych w składniki mineralne (Das i in. 2014; Khajuria i in. 2014) Drożdże zwiększają wzrost i przyswajanie azotu i fosforu w tkankach pomidora i trzciny cukrowej (Lonhienne i in. 2014)

28 Aktywność chitynolityczna bakterii Rozpuszczanie związków fosforu przez bakterie (bezbarwne halo wokół kolonii) Zdolność izolatów bakterii do produkcji chitynazy (podłoże z chityną koloidalną) Trzciński i in. 2012, dane niepubl.

29 PRODUKCJA SIDEROFORÓW PRZEZ POŻYTECZNE BAKTERIE HAMUJĄCE WZROST I ROZWÓJ MIKROORGANIZMÓW PATOGENICZNYCH A B C A. i B. Podłoże CAS agar - pomarańczowe halo wokół bakterii wskazuje na produkcję sideroforów. C. Bakterie Pseudomonas fluorescens na podłożu S1 widziane w świetle UV. Żółto-zielony barwnik produkowany przez te bakterie jest sideroforem. Pseudomonas spp. są zaliczane do jednych z największych producentów tych związków w glebie. Wytwarzają m.in. pseudobaktynę, pyocheinę, piowerdynę, chinolobaktynę i kwas salicylowy. Trzciński i in. 2011, dane niepubl.

30 POŻYTECZNE BAKTERIE HAMUJĄ WZROST GRZYBÓW PATOGENICZNYCH Botrytis cinerea Fusarium oxysporum Verticillum dahliae powodujących straty w uprawach rolniczych i ogrodniczych Pracownia Rizosfery IO

31 POŻYTECZNE SZCZEPY BAKTERII I ICH PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE: Bakteriocydy Pseudomonas fluorescens A506 Agrobacterium radiobacter K84 Agrobacterium radiobacter K1026 Bacillus subtilis Bacillus circulans Bacillus amyloliquefaciens Fungicydy Streptomyces lydicus WYEC 108 Pseudomonas syringae ESC-10 Pseudomonas chlororaphis Pożyteczne działanie Przeciwdziałanie zarazie ogniowej Bakteria rizosferowa, przeciwdziałanie guzowatości korzeni Bakteria rizosferowa, konkurencja międzygatunkowa Bakteria rizosferowa, konkurencja międzygatunkowa Bakteria rizosferowa, konkurencja międzygatunkowa Bakteria rizosferowa, konkurencja międzygatunkowa Bakteria glebowa stosowana do zwalczania grzybów patogenicznych np. Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Phytomatotricum, Aphanomyces Zwalczanie szarej pleśni na owocach Bakteria rizosferowa, konkurencja międzygatunkowa

32 MIKORYZA POWODUJE Lepsze pobieranie substancji odżywczych i wody Produkcję regulatorów wzrostu i innych substancji stymulujących rozwój roślin Ochronę systemu korzeniowego przed chorobami odglebowymi Poprawę wzrostu i plonowania roślin uprawnych Poprawę żyzności i struktury gleby - stopień agregacji i mechaniczną oporność gleby Siddiky et al. 2012; Leung et al. 2013; Yang et al. 2014; Leifheit et al. 2015; Meier et al. 2015

33 POŻYTECZNE DZIAŁANIE GRZYBÓW WOLNO ŻYJĄCYCH PLANT GROWTH-PROMOTING FUNGI Stymulują wzrost i plonowanie roślin uprawnych Rozpuszczają związki fosforu - gatunki z rodzajów Aspergillus i Penicillium Ograniczają rozwój grzybów patogenicznych, zajmują nisze ekologiczne, konkurują o pokarm Ograniczają wzrost strzępek grzybów patogenicznych - Rhizoctonia, Botrytis, Colleotrichum Antagonizm grzybów z rodzaju Trichoderma w stosunku do Botrytis cinerea po 6 dniach inkubacji w 26ºC na podłożu PDA. A - grzyb z rodzaju Trichoderma; B - Botrytis cinerea (szara pleśń) enlarge Hermosa et al. 2013; Khan i Lee 2013; Zhang et al. 2013; Gong et al. 2014; Martínez-Medina et al. 2014

34 EFEKTYWNA OCHRONA JABŁEK PRZED SZARĄ PLEŚNIĄ (BOTRYTIS CINEREA) I MOKRĄ ZGNILIZNĄ (PENICILLIUM EXPANSUM) PRZEZ BAKTERIE PANTOEA AGGLOMERANS Fot. H. Bryk i D. Rasz-Zając; Sobiczewski et al. 2007; Poppe et al. 2003

35 BACILLUS SUBTILIS W OCHRONIE BRZOSKWINI PRZED BRUNATNĄ ZGNILIZNĄ Pusey 1989; Arrebola et al. 2010; Yánez-Mendizábal et al. 2013

36 Bionawozów POŻYTECZNE MIKROORGANIZMY KOMPONENTAMI BIOPRODUKTÓW: Stymulatorów wzrostu i plonowania roślin Stymulatorów odporności roślin Biopestycydów Preparatów mikrobiologicznych do przechowywania owoców i warzyw Inokulów mikrobiologicznych do poprawy jakości gleb

37 BIONAWOZY to produkty pochodzenia organicznego zawierające żywe mikroorganizmy, makro- i mikroelementy, aminokwasy, oligopepetydy, cukry, witaminy, hormony roślinne i inne substancje biologicznie czynne Bionawozy zaaplikowane na nasiona, powierzchnię roślin lub glebę, kolonizują rizosferę i korzenie, zwiększając pobieranie składników odżywczych. Do mikroorganizmów o działaniu bionawozowym można zaliczyć np.: bakterie asymilujące azot, symbiotyczne (Rhizobia u Fabaceae, Frankia u Alnus) i wolno żyjące (np.: Azospirillum, Acetobacter diazotrophicus) bakterie i grzyby rozpuszczające niedostępne dla roślin formy fosforu Rizobia na korzeniach roślin bobowatych Azospirillum brasilense ATCC O221_1999/A_brasilense.html Lim et al. 2012; Qiu et al. 2012; Mehnaz 2015

38 BIOPESTYCYDY MIKROBIOLOGICZNE Biopestycydy mikrobiologiczne zawierają żywe mikroorganizmy, głównie bakterie lub grzyby, które są ich składnikami aktywnymi. Stosowane są jako: fungicydy, bakteriocydy, herbicydy, nematocydy, insektycydy itp. Preparaty te mają różne mechanizmy działania: nadpasożytnictwo, konkurencja o niszę ekologiczną i zasoby, wydzielanie do środowiska substancji biobójczych. Beauveria bassiana grzyb pasożytujący na owadach, wykorzystywany jako bioinsektycyd a.aspx?are=0&pfl=2&jer=42 wse/detail.cfm?imgnum= /thrips.htm Fang et al. 2012; Harper 2013; Lamareddine et al. 2013; Wang i Leger 2014

39 BIOPESTYCYDY MIKROBIOLOGICZNE Mykopasożyt Trichoderma atakujący strzępki Rhizoctonia preparaty zawierające grzyby Trichoderma Mykopasożyt Trichoderma atakujący strzępki Pythium Drapieżny grzyb Arthrobotrys wyspecjalizowany w łowieniu nicieni nterna.aspx?are=0&pfl=2&jer=42 Ji et al. 2014; Woo et al. 2014; XueHui et al. 2014; Soytong 2015

40 BIOPESTYCYDY MIKROBIOLOGICZNE Pestycydy biochemiczne zawierające aktywne metabolity pochodzenia mikrobiologicznego (np. preparaty zawierające toksynę bakterii Bacillus thuringensis) Preparat zawierający bakterie Bacillus thuringensis Komórki Bacillus thuringensis

41 FORMY UŻYTKOWE PREPARATÓW MIKROBIOLOGICZNYCH Proszki, granulaty, pelety Produkty płynne (zawiesiny wodne, olejowe, koloidy i in.) Kapsułki (alginianowe, żelatynowe Nasiona otoczkowane Substraty organiczne ze sporami grzybów AMF i PGPR Mohammadi i Sohrabi 2014; Wang et al. 2015

42 PROBLEMY W PRZYGOTOWYWANIU I PRAKTYCZNYM ZASTOSOWANIU INOKULÓW MIKROBIOLOGICZNYCH Formulacja produktów Czy mikroorganizmy przeznaczone do zastosowania w praktyce będą efektywne? Trwałość produktu Metody aplikacji Mikroorganizmy hodowane na sztucznych podłożach, w kulturach in vitro mogą zatracić swoje efektywne działanie na rośliny po wielu pasażach Udowodnienie pozytywnego działania na rośliny Sethi et al. 2014, Owamach et al. 2014

43 Sprzedaż w milionach dolarów amerykańskich DYNAMICZNY WZROST PRODUKCJI INOKULÓW MIKROBIOLOGICZNYCH I BIOPESTYCYDÓW NA ŚWIECIE Trendy na światowym rynku mikroorganizmów i produktów mikrobiologicznych w latach (w milionach dolarów USA) MALEJE SPRZEDAŻ BIOPESTYCYDÓW I PESTYCYDÓW SYNTETYCZNYCH Biopestycydy Pestycydy syntetyczne Matthias Döring, 2012 za BBC Research

44 Udział procentowy zysków ze sprzedaży produktów mikrobiologicznych dla rolnictwa Rynek preparatów mikrobiologicznych dla rolnictwa na świecie 2011 r. Źródło: Markets & Markets Analysis biofertilizers-market.html

45 KONSORCJUM PRZECIWKO PATOGENOM GLEBOWYM Opis i skład konsorcjum przeciwko Verticillium dahlie, Fusarium oxysporum i Botrytis cinerea: Serratia plymuthica, szczep x61af, x61ab, Pseudomonas sp, szczep K50WA, Lysobacter sp, szczep 60.3AA, bakterie wytwarzające metabolity toksyczne dla grzybów i enzymy chitynolityczne, promieniowce N45PO, N45BD, AF45DO, Bacillus i inne gram+ pałeczki Sp27d, AF74AA, Paenibacillus sp, szczep AF74AA, szczep Sp17DA, AFG1AA, gęstość min jtk/ml oraz szczepy grzybów Trichoderma WT11AC, Tr43, Tr52 o wielkości populacji ok jtk/ml. Sposób działania: Bakterie wytwarzają toksyczne metabolity dla grzybów z rodzaju Verticillium i Fusarium ograniczające ich wzrost. Grzyby Trichoderma pasożytują m.in. na B. cinerea ograniczając ich występowanie. Sposób stosowania w uprawach roślin: Konsorcja pożytecznych mikroorganizmów stosuje się doglebowo (przeciwko Fusarium i Verticillium) lub dolistnie (przeciwko Botrytis cinerea), w formie 2%-10% wodnego roztworu, w dawce od 200 do 1000 litrów na hektar, 2 3 krotnie w ciągu sezonu wegetacyjnego, w odstępach 2 3 tygodniowych,, najlepiej w połączeniu z nawożeniem organicznym. Korzyści stosowania: ograniczenie występowania patogenów glebowych i stymulację rozwoju pożytecznych mikroorganizmów. Zwiększenie odporności na stresy abiotyczne, w szczególności na suszę, poprawia plonowanie w uprawie roślin bez nawadniania. Hamowanie wzrostu Verticillium dahliae przez antagonistyczny szczep bakterii. Hamowanie wzrostu B. cinerea przez grzyby antagonistyczne.

46 KONSORCJA BAKTERYJNO - MIKORYZOWE Bakterie PGPR: Grzyby mikoryzowe: Pi22B Ps49A Ps1/2 Pi3A x31e x31n Sp27D Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Rahnella aquatilis Rahnella aquatilis Rahnella aquatilis Bacillus subtilis Gigaspora margarita Glomus aggregatum G. caledonium G. claroideum G. constrictum G. drummondii G. fasciculatum G. macrocarpum G. microaggregatum G. mosseae G. pallidum G. rubiforme Scutellospora dipurpurescens

47 KONSORCJUM BAKTERYJNO-MIKORYZOWE stymulujące wzrost korzeni i procesy zachodzące w rizosferze Opis i skład produktu: gatunki grzybów mikoryzowych - Claroideoglomus claroideum, Gigaspora margarita, Septoglomus constrictum, Funneliformis mosseae, Scutellospora dipurpurescens, Glomus macrocarpum, Funneliformis caledonius, Rhizophagus fasciculatus oraz szczepy bakterii rizosferowych i grzybów syntetyzujące auksyny i inne hormony: gram- pałeczki: Rahnella aquatilis Pi3A, x31e, x31n, Pantoea sp./erwinia sp. Pi21B, Pseudomonas sp. Ps54GF, grzyby strzępkowe Trichoderma sp. Tr43, Tr52. Sposób stosowania konsorcjum: doglebowo lub dolistnie, 2%-10% wodny roztwór, (200 do 1000 litrów/ha), 2 3 krotnie w ciągu sezonu wegetacyjnego, w odstępach 2 3 tygodniowych, najlepiej w połączeniu z nawożeniem organicznym. Korzyści ze stosowania: Zwiększenie odporności roślin na stres wodny, poprawa ukorzeniania, zwiększenie powierzchni chłonnej korzeni i dostępności makro- i mikroelementów dla roślin, stymulacja wzrostu roślin i odporności na patogeny. Kwitnące drzewa wiśni Sabina - Humus Active + Aktywit PM. System korzeniowy jabłoni Topaz traktowanej Humus UP. System korzeniowy jabłoni Ariwa traktowanej Humus Active + Aktywit PM.

48 KONSORCJUM STYMULACJĄCE WZROST I PLONOWANIE ROŚLIN Paecilomyces lilacinus ograniczanie populacji nicieni. Trichoderma sp. ograniczanie populacji grzybów patogennych. Funneliformis mosseae Pseudomonas fluorescens stymulacja wzrostu roślin (barwienie metodą grama). Rahnella aquatillis stymulacja wzrostu roślin (barwienie oranżem akrydyny).

49 KONSORCJUM PGPR DO ZWIĘKSZENIA DOSTĘPNOŚCI JONÓW SKŁADNIKÓW MINERALNYCH Opis i skład produktu: bakterie rizosferowe i grzyby mikoryzowe: Bakterie Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens i Streptomyces spp. (10 6 komórek x g -1 ), mikroorganizmy produkujące enzymy degradujące celulozę i inne związki: promieniowce 7G2, TACT11, TACT10, TACT8A, TACT7A, grzyby Trichoderma WT8, gram- pałeczki 60.3AA Lysobacter sp. Zarodniki i strzępki 5 gatunków grzybów AGM z rodzaju Glomus i fragmenty skolonizowanych przez nie korzeni. Sposób stosowania: w postaci zwilżalnego proszku. Dodatek 25% roztworu melasy lub Vinassy lub 1% sproszkowanego mleka do zawiesiny wodnej na kilka godzin przed traktowaniem nasion zwiększa efektywność inokulacji. Substrat bakteryjnomikoryzowy można stosować łącznie z nawożeniem organicznym, 2-3 krotnie podczas sezonu, w odstępach 2-tygodniowych, w dawce od 50 do 100 kg/ha, stosowany także do zaprawiania nasion. Korzyści ze stosowania PGPR: synergizm oddziaływania z grzybami mikoryzowymi, stymulacja pobierania składników mineralnych przez rośliny, zwiększenie rozwoju i zasięgu oddziaływania korzeni, korzystny efekt, szczególnie w przypadku nienawadnianych upraw. Glomus macrocarpum Szczep Rhodotorulla sp (podłoże PDA). Pseudomonas fluorescens Światło UV Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens rozpuszczanie związków P.

50 KONSORCJUM MOBILIZUJĄCE ZWIĄZKI FOSFORU W GLEBIE Penicillium sp. Rozpuszczanie związków P Pantoea sp. - Rozpuszczanie związków P (barwienie DAPI). Claroideoglomus claroideum Pseudomonas fluorescens Rozpuszczanie związków P (barwienie oranżem akrydyny). Rahnella aquatillis Rozpuszczanie związków fosforu (Barwienie oranżem akrydyny).

51 WNIOSKI Pożyteczne mikroorganizmy z SYMBIO BANK-u stymulują wzrost wegetatywny i plonowanie roślin truskawki, jabłoni, wiśni, ogórka i pomidora i innych gatunków roślin ogrodniczych. Szczepy bakterii działają ochronnie przeciwko Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum i Verticillum dahliae. Najefektywniejsze szczepy i gatunki mikroorganizmów są składnikami nowo opracowanych biostymulatorów, kompostów i inokulów bakteryjno-mikoryzowych. Stwierdzono negatywny wpływ syntetycznych nawozów NPK na bioróżnorodność i aktywność pożytecznych mikroorganizmów glebowych.

52 WNIOSKI Konsorcja pożytecznych mikroorganizmów, bionawozy i komposty wzbogacone mikrobiologicznie są skuteczną i ekonomicznie opłacalną alternatywą w stosunku do standardowego nawożenia NPK. Nowatorskie bioprodukty wzbogacone mikrobiologicznie są wdrażane do praktyki rolniczej dla poprawy wzrostu i plonowania roślin oraz żyzności gleby.

53 Opracowanie modelu ograniczenia strat żywności produkowanej metodami naturalnymi Akronin ŻYW NATUR ( ) Cele projektu Poprawa jakości warzyw dzięki opracowaniu metod upraw naturalnych z zastosowaniem pożytecznych mikroorganizmów, pozwalających uzyskać warzywa o wysokiej zawartości witamin, karotenów, flawonoidów oraz skrobi, o wyższych parametrach przechowalniczych niż z produkcji integrowanej. Opracowanie naturalnych metod produkcji warzyw zawierających kompleksowe nawożenie i ochronę roślin przed chorobami i szkodnikami bez użycia chemicznych środków produkcji. Uruchomienie portalu internetowego umożliwiającego uzyskanie instrukcji stosowania naturalnych technologii uprawy warzyw przez rolników na podstawie charakterystyki uprawy.

54 Materiał i metody Zastosowane mikroorganizmy: - Pożyteczne szczepy bakterii Pseudomonas sp., Pantoea sp., Klebsiella oxytoca (Instytut Ogrodnictwa) Mikroorganizmy Skierniewickie - Preparaty komercyjne firmy ProBiotics Polska (Mikroorganizmy Probiotyczne). Aplikacja mikroorganizmów na rośliny rosnące w warunkach polowych w postaci pięciu oprysków, w okresie od kwietnia do sierpnia Ocena wpływu mikroorganizmów na wzrost wegetatywny oraz wielkość i jakość plonowania roślin marchwi, pietruszki, cebuli i ziemniaka. Pseudomonas fluorescens szczep bakterii stymulujący wzrost wegetatywny roślin (barwienie metodą Grama) Pantoea sp. szczep bakterii rozpuszczający związki fosforu (barwienie DAPI)

55 Wyniki Wpływ pożytecznych mikroorganizmów na wzrost części nadziemnej oraz korzeni roślin marchwi (Gospodarstwo Rolno-Ogrodnicze Piotr Krajewski, lipiec 2015). Traktowanie Świeża masa części nadziemnej roślin [g] Sucha masa części nadziemnej roślin [g] Świeża masa korzeni [g] Sucha masa korzeni [g] Kontrola 12,00 a 2,15 ab 89,13 a 11,25 ab Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie 17,28 ab 2,66 ab 152,85 b 14,20 ab 14,21 a 2,51 ab 106,05 ab 12,55 ab 25,28 b 3,61 b 154,08 b 15,33 b Baza 7,68 a 1,30 a 56,11 a 7,10 a

56 Wpływ pożytecznych mikroorganizmów na wzrost części nadziemnej oraz korzeni roślin pietruszki (Gospodarstwo Rolno-Ogrodnicze Piotr Krajewski, lipiec 2015). Traktowanie Świeża masa części nadziemnej roślin [g] Sucha masa części nadziemnej roślin [g] Świeża masa korzeni [g] Sucha masa korzeni [g] Kontrola 37,41 a 5,85a 49,85 a 10,96 a Mikroorganizmy 80,25 b 12,10 b 103,65 b 19,01 a Probiotyczne Mikroorganizmy 78,15 b 11,03 ab 84,80 a 15,90 a Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy 65,80 ab 10,05 ab 90,30 a 15,68 a Skierniewickie Baza 42,23 ab 6,70 ab 84,43 a 16,31 a

57 Wpływ mikroorganizmów na cechy wzrostu części nadziemnej oraz bulw roślin cebuli w porównaniu do kontroli (Gospodarstwo Rolno- Ogrodnicze Piotr Krajewski, lipiec 2015). Traktowanie Świeża masa części nadziemnej roślin [g] Sucha masa części nadziemnej roślin [g] Świeża masa bulw [g] Sucha masa bulw [g] Kontrola 42,15 a 3,40 a 102,00 a 88,38 a Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie 27,53 a 2,06 a 96,81 a 84,75 a 35,08 a 2,88 a 76,63 a 63,70 a 24,36 a 2,11 a 93,20 a 81,36 a Baza 38,56 a 3,23 a 99,75 a 84,75 a

58 Wpływ mikroorganizmów na cechy wzrostu roślin ziemniaka w porównaniu do kontroli (Gospodarstwo Rolno-Ogrodnicze Piotr Krajewski, lipiec 2015). Traktowanie Świeża masa korzeni +pędów [g] Sucha masa korzeni+pędów [g] Kontrola 35,91 ab 5,16 ab Mikroorganizmy 28,46 ab 4,51 ab Probiotyczne Mikroorganizmy 36,73 ab 4,96 ab Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy 40,88 b 6,76 b Skierniewickie Baza 24,92 a 3,23 a

59 Wpływ mikroorganizmów na cechy wzrostu części nadziemnej oraz korzeni roślin marchwi, w porównaniu do kontroli (Gospodarstwo Rolno-Ogrodnicze Piotr Krajewski, wrzesień 2015). Traktowanie Świeża masa części nadziemnej roślin [g] Sucha masa części nadziemnej roślin [g] Świeża masa korzeni [g] Sucha masa korzeni [g] Kontrola 6,50 a 3,16 a 55,31 a 7,23 a Mikroorganiz 29,50 b 4,05 a 174,68 b 19,50 b my Skierniewickie (MS) Baza 14,00 a 2,20 a 107,68 a 14,51 ab

60 Wpływ mikroorganizmów na cechy wzrostu części nadziemnej oraz korzeni roślin pietruszki w porównaniu do kontroli (Gospodarstwo Rolno-Ogrodnicze Piotr Krajewski, wrzesień 2015). Traktowanie Świeża masa części nadziemnej roślin [g] Sucha masa części nadziemnej roślin [g] Świeża masa korzeni [g] Sucha masa korzeni [g] Kontrola 29,45 a 4,98 a 129,21 a 28,46 a Mikroorganizmy 68,01 b 11,90 b 184,20 a 41,01 a Probiotyczne Mikroorganizmy 37,48 ab 6,4 ab 124,33 a 27,23 a Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Baza 51,36 ab 12,45 b 165,86 a 32,15 a

61 MARCHEW Charakterystyka roślin marchwi na podstawie dostarczonych prób. Traktowanie Kontrola Mikroorganizm y Probiotyczne Liczba roślin w próbie [szt.] 24 b (1 rozgałęziony) 23 b (0 rozgałęzionych) Świeża masa roślin z nacią [g/roślinę] Świeża masa naci [g/roślinę] Świeża masa korzeni [g/roślinę] Liczba liści [szt.] Średnica korzeni [cm/roślinę] Średnica walca osiowego [cm/roślinę] 79,7 a 9,2 ab 70,5 a 11,4 a 2,2 a 1,0 a 100,4 c 10,8 b 89,7 b 10,8 a 2,7 a 1,3 b Mikroorganizm y Skierniewickie Mikroorganizm y Skierniewickie + Mikroorganizm y Probiotyczne Baza 17 a (1 rozgałęziony) 23 b (0 rozgałęzionych) 18 a (1 rozgałęziony) 162,7 d 18,1 d 144,6 c 11,9 a 2,5 bc 1,1 ab 98,6 bc 8,2 a 90,4 b 10,9 a 2,3 ab 0,9 a 97,3 b 13,5 c 83,8 b 11,3 a 2,2 ab 0,9 a Przekroje poprzeczne korzeni marchwi na wysokości 2 cm poniżej górnej części (głowy korzenia)

62 Obrazy przekrojów poprzecznych korzeni marchwi analizowane przy użyciu mikroskopu stereoskopowego OLYMPUS SZX16 z przykładowymi pomiarami wykonywanymi przy pomocy programu Cell^B oraz diagram prezentujący wartości liczbowe wynikające ze stosunku promienia walca osiowego do promienia przekroju korzenia Kontrola Baza Mikroorganizmy Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie Aplikacja Mikroorganizmów Probiotycznych wpłynęła na lepszy rozwój kory pierwotnej zawierającej komórki miękiszowe z karotenami oraz zmniejszenie średnicy walca osiowego korzeni marchwi (ksylem + zlignifikowane twarde ściany komórkowe).

63 PIETRUSZKA Charakterystyka roślin pietruszki na podstawie dostarczonych prób. Traktowanie Kontrola Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie Liczba roślin w próbie [szt.] 26 bc (1 rozgałęziony) 14 a (7 rozgałęzionych) 24 bc (3 rozgałęzione) Świeża masa roślin z nacią [g/roślinę] Świeża masa naci [g/roślinę] Świeża masa korzeni [g/roślinę] Liczba liści [szt./roślinę ] Średnica korzeni [cm/roślinę] Średnica walca osiowego [cm/roślinę] 60,6 a 17,1a 43,5 a 12 a 2,7 a 1,8 a 166,1 d 58,3 d 107,9 e 20 b 3,5 b 2,5 b 94,5 b 28,6 b 65,9 c 14,5 a 3,2 ab 2,1 ab Mikroorganizmy Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Baza 20 ab (3 rozgałęzione) 30 c (1 rozgałęziony) 128 c 35,0 c 92,9 d 15 a 3,7 b 2,6 b 66 a 18,4 a 47,6 b 12 a 2,6 a 2,2 ab Przekroje poprzeczne korzeni pietruszki na wysokości 2 cm poniżej górnej części (głowy korzenia)

64 Obrazy przekrojów poprzecznych korzeni pietruszki analizowane przy użyciu mikroskopu stereoskopowego OLYMPUS SZX16 z przykładowymi pomiarami wykonywanymi przy pomocy programu Cell^B oraz diagram prezentujący wartości liczbowe wynikające ze stosunku promienia walca osiowego do promienia przekroju korzenia Kontrola Baza Mikroorganizmy Skierniewickie + Mikroorganizmy Probiotyczne Stosunek promienia walca osiowego do promienia korzenia 0,76 0,74 0,72 0,70 Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 KONTROLA BAZA MS+Probiotyki Probiotyki MS Aplikacja Bazy i Mikroorganizmów Skierniewickich wpłynęła na lepszy rozwój kory pierwotnej zawierającej komórki miękiszowe i zmniejszenie średnicy walca osiowego korzeni pietruszki (ksylem + zlignifikowane twarde ściany komórkowe).

65 MIKROBIOLOGIA Analizy mikrobiologiczne obejmowały: Ogólną liczbę bakterii Ogólną liczbę grzybów strzępkowych Ogólną liczbę promieniowców Ogólną liczbę bakterii wytwarzających formy przetrwalnikowe Ogólną liczbę bakterii z rodzaju diazotrofów Ogólną liczbę bakterii należących do grupy Pseudomonas fluorescens

66 Liczebność wybranych grup mikroorganizmów w glebie w zależności od rośliny. Próbka Ogólne populacja bakterii x 10^5 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja bakterii wytwarzających formy przetrwalnikowe x 10^4 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja fluorescencyjnych bakterii z rodzaju Pseudomonas x 10^3 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja diazotrofów x 10^5 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja promieniowców x 10^4 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja grzybów mikroskopowych x 10^3 w 1 g s.m.p. Marchew 136,01 ab 225,54 b 1,81 a 4,57 a 78,91 c 74,69 b Ziemniak 281,48 c 169,92 a 29,52 b 3,4 a 57,9 b 85,81 b Cebula 106,26 a 130,09 a 4,14 a 2,83 a 17,2 a 47,22 a Pietruszka 194,63 bc 176,52 ab 3,64 a 2,11 a 12,26 a 55,08 a Analizowane próbki gleby rizosferowej różniły się populacją poszczególnych grup mikroorganizmów w zależności od gatunku uprawianych roślin. W rizosferze ziemniaka odnotowano większą ogólną liczbę bakterii fluorescencyjnych z rodzaju Pseudomonas i grzybów mikroskopowych oraz mniejszą populacją promieniowców i bakterii wytwarzających formy przetrwalnikowe. W rizosferze cebuli zidentyfikowano najmniejsze populacje analizowanych grup mikroorganizmów. Gleba rizosferowa roślin marchwi charakteryzowała się największą liczebnością promieniowców bakterii wytwarzających formy przetrwalnikowe oraz ogólną populacją diazotrofów. Pantoea sp.

67 Liczebność wybranych grup mikroorganizmów w glebie w zależności od traktowania Próbka Ogólne populacja bakterii x 10^5 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja bakterii wytwarzających formy przetrwalnikowe x 10^4 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja fluorescencyjnych bakterii z rodzaju Pseudomonas x 10^3 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja diazotrofów x 10^5 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja promieniowców x 10^4 w 1 g s.m.p. Ogólna populacja grzybów mikroskopowych x 10^3 w 1 g s.m.p. Kontrola 214,72 a 181,22 ab 12,66 a 1,98 ab 33,99 a 71,27 a Mikroorganizmy Probiotyczne 133,28 a 148,79 a 4,2 a 1,18 a 41,52 a 57,26 a Baza 235,24 a 164,19 ab 22,74 a 1,97 ab 33,44 a 64,48 a Mikroorganizmy Skierniewickie (MS) + Mikroorganizmy Probiotyczne Mikroorganizmy Skierniewickie (MS) 154,21 a 216,85 b 6,64 a 4,84 bc 44,01 a 72,92 a 160,53 a 166,54 ab 2,66 a 6,17 c 54,87 a 62,58 a Aplikacja Mikroorganizmów Skierniewickich oraz Mikroorganizmów Skierniewickich łącznie z Mikroorganizmami Probiotycznymi wpłynęła na zwiększenie ogólnej populacji diazotrofów, bakterii wytwarzających formy Paecilomyces przetrwalnikowe, lilacinus grzybów mikroskopowych oraz promieniowców.

68 Identyfikacja bakterii pozyskanych z gleby traktowanej pożytecznymi mikroorganizmami w doświadczeniach nad opracowaniem naturalnych metod upraw warzyw (marchew, pietruszka, cebula, ziemniak) w ramach projektu ŻywNatur 1. Celem analiz było stwierdzenie obecności w glebie, w uprawie roślin warzywnych, pożytecznych szczepów bakterii Pi22B, Pi25C oraz N2 po dwóch miesiącach od ich aplikacji. 2. Z gleby pozyskano 8 izolatów bakterii wykazujących cechy morfologicznie podobne do szczepów bakterii aplikowanych do gleby. 3. Izolaty bakterii Pseudomonas: Ps19GN, PS 44GJ, Ps11 GS, Ps45GJ, Ps29GU porównano do szczepów Pi22B oraz Pi25C. Izolaty bakterii wiążących azot atmosferyczny: N47, N18, N51 porównano do szczepu N2. 4. Zastosowano technikę rep-pcr - repetitve sequence PCR PCR sekwencji powtarzalnych z użyciem starterów ERIC, BOX i REP.

69 ERIC-PCR REP-PCR BOX-PCR Podsumowanie 1. W wyniku analiz stwierdzono, że profile DNA testowanych izolatów bakterii z rodzaju Pseudomonas oraz bakterii wiążących azot atmosferyczny różniły się od profili DNA szczepów bakterii aplikowanych do gleby. 2. Uzyskane wyniki wskazują, iż w celu potwierdzenia obecności w glebie pożytecznych szczepów bakterii aplikowanych do upraw roślin warzywnych istnieje potrzeba zastosowania technik opartych na analizie DNA bezpośrednio w glebie.

70 Wnioski Zastosowanie pożytecznych mikroorganizmów z Instytutu Ogrodnictwa - Mikroorganizmów Skierniewickich oraz Mikroorganizmów Probiotycznych wpłynęło pozytywnie na wzrost korzeni oraz nadziemnych części roślin marchwi, pietruszki i ziemniaka. Uzyskane wyniki badań będą zastosowane do opracowania i wprowadzenia do praktyki naturalnych metod uprawy marchwi i pietruszki dla produkcji wysokiej jakości warzyw przydatnych dla przemysłu przetwórczego, farmaceutycznego, zielarskiego, kosmetycznego oraz w chowie trzody chlewnej. Opracowanie innowacyjnych bioproduktów wzbogaconych mikrobiologicznie umożliwi rozwój naturalnych technologii uprawy warzyw oraz przyczyni się do rozwoju firm wytwarzających biopreparaty mikrobiologiczne.

71 Projekt współfinansowany przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju w ramach programu INNOWACJE SPOŁECZNE pn.: Opracowanie modelu ograniczenia strat żywności produkowanej metodami naturalnymi Prezentowane materiały jak również wszelkie inne wyniki projektu ŻYWNATUR stanowiąwłasność intelektualnąkonsorcjum w składzie Polska Izba Technologii i Wyrobów Naturalnych, Instytut Ogrodnictwa w Skierniewicach, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie oraz EkoTrend Maciej Łoś. Wszelkie próby kopiowania i rozpowszechniania ww. materiałów oraz wiedzy bez pisemnej zgody Konsorcjum będzie traktowane jako naruszenie Ustawy o Prawie Autorskim. Wszelkie komercyjne formy wykorzystania wypracowanej w projekcie ŻYWNATUR technologii, w szczególności upowszechnianie wiedzy i stosowanie technologii w praktyce sąmożliwe po zawarciu pisemnego porozumienia z uprawnionym w ramach Konsorcjum dysponentem praw do komercjalizacji EkoTrend Maciej Łoś.

72 f f f f f f f f f f f f f f f f f flli Dziękuję za uwagę