ENDOKRYNOLOGIA POLSKA

Transkrypt

1 E P ENDOKRYNOLOGIA POLSKA POLISH JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY ORIGINAL PAPERS

2 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X Analysis of pendrin expresion in human thyroid tissues with use of antipendrin antibodies Joanna Skubis-Zegadło 1, Anna Nikodemska 1, Anna Łyczkowska 1, Ewa Przytuła 2, Jolanta Czerwińska 2, Krzysztof Bardadin 2, Ireneusz Kozicki 3, Janusz Pachucki 4, Barbara Czarnocka 1 1 Departament of Biochemistry, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw 2 Departament of Pathology, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw 3 Departament of Surgery, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw 4 Departament of Internal Medicine and Endocrinology, Medical University of Warsaw Summary The first step of hormones production in the thyroid gland is iodide uptake into follicular cells and translocation to the follicular lumen where biosynthesis takes place. It has been postulated that pendrin might be one of the transporting proteins involved in the transportation of iodide from the cells to the lumen. Pendrin belongs to solute carrier family SLC26A and consists of 78 amino acids with 12 transmembrane domains. To investigate pendrin protein expression and localization we generated antipendrin antibodies. The polyclonal antibodies were purified by affinity chromatography with bed coupled with synthetic peptide. Obtained antibodies were characterized by high specifity and affinity to the pendrin protein. These antibodies were used for immunological methods e.g. immunohistochemistry and Western blotting. In Western-blot antibodies detected the single polypeptide band about 115 kda. In immunohistochemistry antibodies recognized the protein localized in apical membrane of the thyrocyte in normal thyroid, in thyroid glands from patients with Graves disease or nodular goiter. Expression of pendrin was also confirmed on the mrna level by Northern-blotting method where single band 5 kb corresponding to PDS transcript was detected. Examining the pattern of pendrin expression and localization in thyroid diseases could be a step forward to understand the mechanisms of transport and distribution of the iodide in thyroid. (Pol J Endocrinol 24; 6(55): ) Key words: antipendrin antibodies, pendrin, thyroid, PDS Joanna Skubis-Zegadło Departament of Biochemistry Medical Centre for Postgraduate Education. 99 Marymoncka St. Warsaw 69

3 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy ludzkiej z użyciem przeciwciał antypendrynowych Joanna Skubis-Zegadło 1, Anna Nikodemska 1, Anna Łyczkowska 1, Ewa Przytuła 2, Jolanta Czerwińska 2, Krzysztof Bardadin 2, Ireneusz Kozicki 3, Janusz Pachucki 4, Barbara Czarnocka 1 1 Zakład Biochemii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa 2 Zakład Patomorfologii, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa 3 Klinika Chirurgii Ogólnej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa 4 Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii Akademii Medycznej w Warszawie Streszczenie Pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy T3 i T4 jest transport jodu z krwioobiegu do wnętrza tyreocyta, a następnie do światła koloidu. Postuluje się, że jednym z białek transportujących jod do światła koloidu jest pendryna. Jest ona białkiem błonowym, zbudowanym z 78 aminokwasów, posiadającym 12 transmembranowych domen. Wykorzystanie otrzymanych antypendrynowych przeciwciał prezentowanych w tej pracy pozwoliło na scharakteryzowanie lokalizacji oraz poziomu ekspresji pendryny w tkankach tarczycy. Przeciwciała, po oczyszczeniu z wykorzystaniem kolumnowej chromatografii powinowactwa z odpowiednim antygenem związanym ze złożem, charakteryzowały się wysokim stopniem wiązania do antygenu. Wysoko specyficzne przeciwciała zostały użyte w metodach immunologicznych: immunohistochemii i Westernblottingu. W metodzie Western-blotting przeciwciała wiązały się z białkiem o ciężarze ok. 115 kda. Przeciwciała reagowały immunohistochemicznie z białkiem zlokalizowanym na szczytowej części błony tyreocyta w tkankach prawidłowych tarczycy, w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i z wolem wieloguzkowym. Analiza Northern-blotting pozwoliła na zidentyfikowanie pojedynczego prążka 5 kb odpowiadającego transkryptowi genu PDS. Zbadanie występowania i lokalizacji pendryny w tarczycy może być kolejnym krokiem dla zrozumienia mechanizmów transportu i dystrybucji jodu w gruczole tarczowym. (Endokrynol Pol 24; 6(55): ) Słowa kluczowe: przeciwciała antypendrynowe, pendryna, tarczyca, PDS Joanna Skubis-Zegadło Zakład Biochemii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego ul. Marymoncka 99, Warszawa Grant: CMKP /64/2 Wstęp Jod jest pierwiastkiem niezbędnym w biosyntezie hormonów tarczycy. Jego transport zarówno z krwi do komórek pęcherzykowych otaczających koloid, jak i z ich wnętrza do światła pęcherzyka jest ściśle regulowany. Pierwszy etap transportu jonów jodu do wnętrza tyreocyta katalizuje zlokalizowany w błonie podstawnej symporter sodowo-jodowy NIS [13, 14, 15, 16]. Etap drugi, translokacja wewnątrzkomórkowego jodu przez błonę szczytową do koloidu, gdzie odbywa się proces jego organifikacji i wbudowania w cząsteczki hormonów tarczycy, możliwy jest dzięki pendrynie, jednemu z opisanych szczytowych transporterów [7, 8, 9, 1]. Gen PDS, którego uszkodzenie odpowiedzialne jest za obserwowany w zespole Pendreda wrodzony brak słuchu i wole został niedawno zidentyfikowany [6, 13, 19]. Pendryna, produkt tego genu, jest białkiem błonowym należącym do rodziny transporterów anionowych (SLC26A). Poza tarczycą występuje również w nerce, uchu wewnętrznym, endometrium oraz łożysku. W tych tkankach funkcjonuje jako transporter lub wymiennik jonowy [2, 5, 6, 3]. W tarczycy pendryna zlokalizowana jest w błonie szczytowej tyreocyta, gdzie transportuje jod poprzez błonę komórkową do światła koloidu natomiast chlor do wnętrza komórek tarczycy [1, 7, 8, 9]. Badanie ekspresji i lokalizacji białka w komórkach i tkankach tarczycy stało się możliwe, między innymi, dzięki zastosowaniu swoistych przeciwciał. W niniejszym artykule przedstawiono otrzymywanie 1 poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych. Przeciwciała te, po oczyszczeniu na kolumnie powinowactwa charakteryzowały się wysoką specyficznością w stosunku do pendryny, stając się bardzo cennym narzędziem w metodach immunologicznych takich jak: immunohistochemia oraz Western-blotting. 691

4 Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy Skubis-Zegadło J. Materiały i metody Tkanki tarczycy Tkanki tarczycy otrzymano z kliniki chirurgii ogólnej Szpitala Klinicznego nr 1 im. W. Orłowskiego, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego w Warszawie. W metodzie Western-blotting analizowano następujące tkanki: 15 tarczyc prawidłowych (TP), 8 tkanek od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) i 5 tkanek od pacjentów z wolem guzkowym nadczynnym. Do analizy Northern-blotting użyto następujących tarczyc: 2 przypadki tkanek prawidłowych, 3 tkanki od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, 3 wola guzkowate nadczynne. Otrzymane pooperacyjnie tkanki przechowywano w temperaturze -8 C. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono z zaparafinowanych tkanek, które obejmowały następujące przypadki: 47 tkanek prawidłowych (TP), 1 tkanek od pacjentów z chorobą Gravesa- Basedowa (GB), 28 wól wieloguzkowych (W). Otrzymywanie króliczych poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych Otrzymywanie peptydów Peptydy odpowiadające określonej sekwencji łańcucha aminokwasowego pendryny [2] zsyntetyzowano konwencjonalną metodą w fazie stałej (Mimotopes a MitoKor Company, Australia). Obejmowały one następujące sekwencje białkowe: 1 peptyd odpowiadający fragmentowi N- końcowemu pendryny: aminokwasy 1-15 (MAAPGGRSEPPQLPE),. 2 peptyd: aminokwasy (LNTTMIDTAARD- TAR); 3 peptyd: aminokwasy (IVKSIPRGVLPP); 4 peptyd: aminokwasy (SRTAVQESTGGK- TQ); 5 peptyd: aminokwasy (LDVQDEAMR- TLA) odpowiadający C-końcowemu fragmentowi pendryny; 6 peptyd: aminokwasy (PDEHFLVSSSNG- TVL); 7 peptyd: aminokwasy (SQLQIVLNVSTK); 8 peptyd: aminokwasy (TKNYNGVLSIIY); 9 peptyd: aminokwasy (ANLEKNYNAGIV); 1 peptyd: aminokwasy (PPELPPVSLFSEM). Do każdego peptydu została dołączona cząsteczka cysteiny, poprzez którą sprzęgano peptydy z białkiem nośnikowym. Produkcja przeciwciał antypendrynowych Syntetyczne peptydy sprzęgano z hemocyjaniną szkarłatki (KLH keyhole limpet hemocyanin, Pierce) przy użyciu Sulfo-SMCC (Pierce) jako czynnika wiążącego. Powstałe koniugaty (peptyd + KLH) w ilości 5 µg z dodatkiem kompletnego adjuwantu Freuda używano do immunizacji króli zgodnie ze standardowym protokołem. Przed szczepieniem pobierano surowicę kontrolną (preimmun). Króle doszczepiano koniugatami po dwóch i po czterech tygodniach oraz dwukrotnie w czterotygodniowych odstępach. W trakcie doszczepiania kontrolowano poziom wytwarzanych przeciwciał antypeptydowych. W 2 tygodnie po ostatnim szczepieniu króle skrwawiono. Surowice testowano na obecność przeciwciał antypendrynowych metodą ELISA. Oczyszczanie przeciwciał antypendrynowych Swoiste przeciwciała antypendrynowe otrzymywano oczyszczając surowice króli metodą chromatografii powinowactwa na kolumnach ze złożem (SulfoLink Coupling Gel Kit, Pierce) związanym z odpowiednim peptydem. Kolumnę inkubowano z surowicą rozcieńczoną PBS 1:1 przez godzinę w temperaturze pokojowej (RT), następnie płukano PBS (,15M NaCl w,1m buforze fosforanowym o ph 7,4). Związane do peptydów IgG eluowano,1 M roztworem glicyny o ph 2,4 i natychmiast neutralizowano poprzez dodanie 5 µl TRIS, ph 9. Stężenie białka w oczyszczonych frakcjach mierzono spektrofotometrycznie (UV-211PC, Shimadzu), przy długości fali 28 nm. Przeciwciała przechowywano w 4 C w 1,5% roztworze wołowej albuminy (BSA), z dodatkiem 2,9 mm azydku sodu (NaN 3 ). ELISA Metodą ELISA badano obecność przeciwciał antypendrynowych w surowicach otrzymanych po skrwawieniu króli oraz powinowactwo oczyszczonych przeciwciał do antygenu. Płytki polistyrenowe (Nunc - Immuno Plate, Maxisorb) opłaszczano roztworem odpowiedniego peptydu w stężeniu,2 µg/1 µl w buforze węglanowym o ph 9,6. Po nocnej inkubacji w 4ºC płytki płukano wodą dwukrotnie destylowaną. Pozostałe aktywne miejsca wysycano 1% roztworem BSA przez dwie godziny w 37 C. Badane przeciwciało nakładano w rozcieńczeniach od 1:1-1:1, inkubowano 2 h w 37 C, a następnie trzykrotnie płukano w PBST (PBS +,1% Tween 2 (SERVA). Ilość związanych z antygenem przeciwciał wykrywano przy pomocy drugiego przeciwciała przeciwko króliczej globulinie sprzężonego z HRP (affinity purified, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc), w rozcieńczeniu 1:1. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki płukano trzykrotnie PBST. Reakcję wywoływano TMB i mierzono absorbancję przy długości fali 45 nm. Swoistość przeciwciał badano metodą immunoprecypitacji. Przeciwciała antypendrynowe w stałym stężeniu, odpowiadającym 5% maksymalnego wiązania do peptydu, preinkubowano dwie godziny w łaźni lodowej ze wzrastającym stężeniem peptydu. Mieszaninę nakładano na płytkę opłaszczoną tym samym peptydem i postępowano zgodnie z procedurą opisaną powyżej. 692

5 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) Metoda Western Blotting Tkanki tarczycy homogenizowano w buforze (,25 M sacharoza,,2 M Tris,,1 M EDTA o ph 7,4) zawierającym inhibitory proteaz (PMSF - 5µM, aprotynina 1 µg/ml, leupeptyna 1 µg/ml, pepstatyna 1 µg/ml). Homogenaty wirowano 15 min, 1 x g. Osad odrzucono a supernatanty wirowano przez godzinę przy 1 x g, 4 C. Otrzymaną surową frakcję błon rozdzielano na 8% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących (SDS-PAGE). Białko, w ilości 5 µg na studzienkę, redukowano merkaptoetanolem przez 3 min w 37 C. Elektroforezę prowadzono 5 min przy napięciu prądu 15 V. Rozdzielone na żelu białka elektrotransferowano na membranę Immobilon P (PVDF, Bio-Rad), 9 min, 1 V. Membrany, po uprzednim wysyceniu 5% roztworem odtłuszczonego mleka w PBSN3- (noc w 4 C), inkubowano dwie godziny w temperaturze pokojowej z roztworem przeciwciał w stężeniu 5 µg/ml. Następnie błony płukano 3 x PBST i inkubowano godzinę z II przeciwciałem, antykróliczymi globulinami znakowanymi HRP, w rozcieńczeniu 1:1. Błonę ponownie płukano 3 x PBST. Powstałe kompleksy przeciwciało - pendryna uwidaczniano kolorymetrycznie, używając jako chromogenu wzmocnionego DAB (Roche Diagnostics GmbH), lub chemiluminescencyjnie z użyciem SuperSignal West Pico (Pierce). Wizualizację prążków przeprowadzono naświetlając filmy BioMax MS (Sigma - Aldrich, Corp.). Kontrolę negatywną stanowiły surowice króli pobrane przed immunizacją, precypitacja przeciwciała odpowiednim peptydem oraz kontrola reakcji drugiego przeciwciała. Oznaczanie stężenia białka Stężenie białka mierzono metodą BCA (Pierce) według standardowego protokołu. Izolacja RNA Northern Blotting Całkowite RNA izolowano ze 1 mg tkanek tarczycy z użyciem odczynnika TRIzol (Invitrogen) zgodnie z metodą Chomczyński i Sacchi [12]. Ilość otrzymanego RNA mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 26 nm. Czystość otrzymanego RNA oznaczano na podstawie stosunku wartości pomiarów wykonanych przy długościach fal: 26 nm / 28 nm oraz rozdzielenia elektroforetycznego na,8% agarozowym żelu podjednostek 28S i 18S rrna. Obecność RNA oraz wydajność transferu do membrany sprawdzano wybarwiając żel bromkiem etydyny. Wyizolowane RNA przechowywano w -8 C. Transfer RNA oraz hybrydyzację Northern przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną wcześniej [21]. RNA (1 µg) rozdzielone elektroforetycznie na,8% żelu agarozowym transferowano osmotycznie na membranę GeneScreen w 1x SSPE (3 M NaCl,.25 M NaH2PO4 x H2O,.2 M EDTA ph 7,7). Następnie membranę inkubowano z sondą. W badaniach zastosowano sondę będącą fragmentem genu PDS (nukleotydy cdna pendryny, GeneBank No. GI:455696) zawierającą radioaktywnie wyznakowany [P32α] dctp (3 Ci/mmol, 1 mci/ml, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc.). Hybrydyzację membrany z sondą prowadzono w następujących buforach: 5% formamid, 5x SSPE, 1x odczynnik Denhardta i 5 µg/ml DNA spermy łososia. Następnie membranę płukano 3 razy w SSPE. Do ostatniego płukania, które przeprowadzono w 42ºC, dodano,1% SDS. Ilość otrzymanego mrna sprawdzano z użyciem ImageQuant v. 5. program (Molecular Dynamics), następnie eksponowano na filmie Kodak BioMax (Sigma - Aldrich, Corp.) przez 1 2 dni. Wyniki Immunohistochemiczne barwienie tkanek (IHC) Skrawki tkanek tarczycy (3 µm) inkubowano przez noc w 6 C na silanizowanych szkiełkach. Materiał odparafinowywano w ksylenie i uwadniano w gradiencie etanolu i wody. Antygen odsłaniano inkubując szkiełka w łaźni wodnej (96 C) przez 2 min w 1mM buforze cytrynianowym (ph 6,). Po przepłukaniu preparatów w PBS nakładano przeciwciała antypendrynowe w stężeniu,25 µg/ml. Preparaty inkubowano przez noc w 4 C. Następnie płukano je PBS i inkubowano z LSAB 2 Kit (DAKO). Reakcję wizualizowano przy pomocy chromogenu DAB (DAKO). Preparaty podbarwiono hematoksyliną Mayera. Reakcję immunohistochemiczną oceniano używając następujących kryteriów: - brak reakcji, ++ reakcja średnio pozytywna, +++ reakcja silnie pozytywna. Dwóch niezależnych patologów oceniało losowo wybrane preparaty. Charakterystyka przeciwciał antypendrynowych Wysoko oczyszczone przeciwciała otrzymane w wyniku immunizacji króli syntetycznymi peptydami wiązały się z antygenem (ryc. 1). Widoczny przebieg krzywych wiązania przeciwciał sugeruje ich różne powinowactwo do pendryny. Stwierdzono, że pełne wysycenie antygenu przeciwciałami osiągano przy rozcieńczeniu 1:1 dla przeciwciał #6 i #1, 1:1 dla #1, #2, #3, #4, #5, podczas gdy dla #7 i #8 przy rozcieńczeniu 1:1. Tylko jedno przeciwciało przeciwko peptydowi 8, charakteryzowało się brakiem wyraźnej różnicy między wiązaniem się do antygenu surowicy kontrolnej a oczyszczonymi przeciwciałami. Zostało zatem pominięte w następnych testach. Swoistość oczyszczonych przeciwciał badano metodą immunoprecypitacji. Dodanie odpowiedniego peptydu do roztworu przeciwciał powodowało hamowanie ich wiązania. Tabela I przedstawia 693

6 OD 45 nm OD 45 nm Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy Skubis-Zegadło J. Tabela I. Hamowanie wiązania przeciwciał do antygenu (%). Table I. Inhibition of antibodies binding to antigen (%). Nr Ilość peptydu (µg/ml) przeciwciała 6,25 x 12,5 x 25 x 5 x 1 x 1 15,7% 21,1% 31,6% 43% 9 % 2 15,7% 21,1% 31,6% 43% 58% 3 17,5% 25% 43,75% 5% 62,5% 4 44,4% 55,6% 77,8% 88,9% 92,77% 5 42,72% 54,55% 69,1% 72,73% 83% 6 11,1% 16,7% 22,3% 44,5% 55% 9 47% 57,6% 69,42% 82,36% 88,23% 1 6,36% 4,44% 18,18% 22,72% 41,6% 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, -,5 1E-3,1,1 1 1 Stê enie peptydu (ug/ml) 1E-3,1,1 1 1 Stê enie peptydu (ug/ml) IgG 1 preimmun 1 IgG 2 preimmun 2 IgG 3 peimmun 3 IgG 4 preimmun 4 IgG 5 preimmun 5 IgG 6 preimmun 6 IgG 7 preimmun 7 IgG 8 preimmun 8 IgG 9 preimmun 9 IgG 1 preimmun 1 Ryc. 1. Wiązanie przeciwciał do syntetycznych peptydów. Krzywe rozcieńczeń poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych i surowic kontrolnych (preimmun). Ryc. 1. The binding of antibodies to the synthetic peptides. The dilution curves of policlonal antibodies and control sera (preimmun). wyrażone w procentach hamowanie wiązania przeciwciał. Stwierdzono, że inkubacja przeciwciał ze 1 - krotnym nadmiarem peptydu powoduje obniżenie wiązania w około 41 62% dla przeciwciał #1, #6, #3, #2, natomiast w 83 93% dla przeciwciał #9, #5, #1, #4 (tabela I). Krzywe hamowania wiązania przeciwciał do antygenu przedstawia rycina 2. Wyznaczone na podstawie tych krzywych przybliżone powinowactwo miało wartości rzędu 1-7 M M. Wartości te wskazują, że większość Hamowanie wi¹zania (%) Hamowanie wi¹zania (%) stê enie peptydu (ug/ml) stê enie peptydu (ug/ml) IgG 1 IgG 2 IgG 3 IgG 4 IgG 5 IgG 6 IgG 7 IgG 9 IgG 1 Ryc. 2. Wpływ syntetycznych peptydów na wiązanie się przeciwciał do antygenu. Ryc. 2. Effect of synthetic peptides on binding antibodies to the antigene. otrzymanych przeciwciał charakteryzuje wysokie powinowactwo do pendryny. Jakkolwiek wszystkie wysoko oczyszczone przeciwciała antypendrynowe reagowały z antygenem, do dalszych badań użyto przeciwciał: #1 i #5. Peptydy, przeciwko którym je wyprodukowano odpowiadają N-końcowi (peptyd 1) i C-końcowi (peptyd 5) białka pendryny. Metoda Western-blottingu Przeciwciała antypendrynowe reagowały z białkiem pendryny obecnym w surowej frakcji błon tarczycy zgodnie z liniową zależnością. Wzrastającemu stężeniu białka odpowiada wzrastająca intensywność immunoreakcji (ryc. 3A). Liniową zależność reakcji przeciwciał z pendryną obserwowano w zakresie od 15 do 1 µg białka surowej frakcji błon. W warunkach redukujących przeciwciała rozpoznawały prążek, którego wyznaczony ciężar cząsteczkowy wynosił około kda (ryc. 3 B). Kontrolę negatywną w doświadczeniu stanowiły: reakcja surowicy pobranej od króli przed immunizacją, preinkubacja przeciwciała #1 lub #5 z nadmiarem peptydu oraz kontrola niespecyficznej reakcji drugiego przeciwciała. 694

7 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) Metoda barwienia immunohistochemicznego Przeciwciała antypendrynowe #1 i #5 immunoznakowały pendrynę. Zarówno w tkance prawidłowej, wolu wieloguzkowym, jak i w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa oba przeciwciała reagowały z białkiem zlokalizowanym w części szczytowej tyreocyta (ryc. 5 ABCD). W prawidłowej tarczycy reakcja, zarówno w pęcherzykach jak i w komórkach, była heterogenna, co sugeruje ich różną aktywność funkcjonalną. W tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i wolach wieloguzkowych obserwowano silniejszą reakcję ograniczoną do błony szczytowej pęcherzyków. Szczególnie intensywną immunoreakcję zauważono w małych pęcherzykach o dużej aktywności proliferacyjnej. Metoda Northern-blottingu Ekspresję genu PDS w analizowanych tkankach tarczycy badano metodą Northern-blotting. We wszystkich analizowanych tkankach transkrypt genu PDS został rozpoznany w przewidzianej dla niego wielkości 5kb (ryc. 4). W prawidłowych tkankach tarczycy poziom transkryptu genu PDS charakteryzował się zmiennością w zależności od ocenianych tkanek. Poziom ekspresji genu PDS zarówno w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, jak i wolu nadczynnym był, w porównaniu do prawidłowej tarczycy, wyższy i podobnie jak wykazano dla tkanek prawidłowych charakteryzowała go zmienność. Ryc. 3. Charakterystyka ludzkiej pendryny metodą Western-blottingu. A. Pół-ilościowa analiza pendryny. B. Ekspresja pendryny w tkankach tarczycy: prawidłowej (TP), Gravesa-Basedowa (GB), wolu nadczynnym (W), wzorzec molekularny (M). Ryc. 3. Characteristic of human pendrin by Westenblotting. A. Semiquantitative detection of pendrin. B. Expression of pendrin in thyroid tissues: normal thyroid (TP), Graves disease (GB), nodular goiter (W), molecular marker (M). Ryc. 4. Poziom genu PDS w badanych tkankach tarczycy: tkanka prawidłowa (TP), od pacjenta z chorobą Gravesa- Basedowa, wole nadczynne (W). Ryc. 4. PDS mrna levels in thyroid tissues examined: normal thyroid (TP), Graves disease (GB), nodular goiter (W). Dyskusja Biosynteza hormonów tarczycy T3 i T4 oraz metabolizm jodu jest regulowany przez wysoko wyspecjalizowane białka. Postuluje się, że pendryna jest jednym z białek katalizujących transport jodu z wnętrza tyreocyta do światła koloidu [7, 8, 9, 1]. W niniejszej pracy przedstawiono otrzymywanie poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko różnym fragmentom ludzkiej pendryny. Przeanalizowano ich stopień powinowactwa do pendryny oraz swoistość reakcji. Stwierdzono, że otrzymane przeciwciała antypendrynowe charakteryzowały się wysokim powinowactwem do antygenu, przez co stały się cennym narzędziem do prowadzenia dalszych badań nad lokalizacją i ekspresją pendryny z użyciem metod immunologicznych (immunohistochemia, Westernblotting). Stosując te przeciwciała potwierdzono, że pendryna zlokalizowana jest w błonie szczytowej tyreocyta, tak jak inne białka kluczowe dla procesu biosyntezy hormonów tarczycy: peroksydaza tarczycowa, NADPH-oksydaza produkująca H2O2 i tyreoglobulina [21]. Ekspresja pendryny w tkankach tarczycy, jak sugerują otrzymane wyniki, związana jest z poziomem funkcjonalnym zarówno komórek tarczycy, jak i pęcherzyków. Heterogenna lokalizacja pendryny w tarczycy opisana przez innych badaczy [9,17] została potwierdzona również przez nas. Wysoki poziom białka pendryny i transkryptu genu PDS obserwowany w tarczycach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa wskazuje również, że ekspresja pendryny związana jest z aktywnością metaboliczną tarczycy. Jednakże w tarczycach patologicznych nie obserwowano, typowej dla prawidłowej tarczycy, heterogennej ekspresji białka. 695

8 Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy Skubis-Zegadło J. Ryc. 5. Ekspresja i lokalizacja białka pendryny w tkankach tarczycy: A - prawidłowej; B - od pacjenta z chorobą Gravesa-Basedowa; C - wolu wieloguzkowym; D - kontrola negatywna. Ryc. 5. Expression and localization of pendrin protein in thyroid tissues: A - normal thyroid; B - from a patient with Graves disease; C - nodular goiter; D- negative control. Otrzymane swoiste przeciwciała antypendrynowe o wysokim powinowactwie do antygenu pozwoliły na wstępną charakterystykę pendryny w prawidłowych i patologicznych tkankach tarczycy. Stanowi to ważny etap w badaniach ekspresji białka i genu pendryny w złośliwych patologiach tarczycy. Piśmiennictwo 1. Porra V, Bernuer-Valentin F, Trouuttet-Masson S et al. Characterization and Semiquantitative Analyses of Pendrin Expressed in Normal and Tumoral Human Thyroid Tissues. Clin Endo & Met 22; 87(4): Soleimani M, Greeley T, Petrovic S et al. Pendrin: an apical Cl - /OH - /HCO 3 - exchanger in the kidney cortex. Am J Physiol Renal Physiol 21; 28: F356-F Royaux I, Wall S, Karniski L et al. Pendrin, encoded by the Pendred syndrome gene, resides in the apical region of renal intercalated cells and mediates bicarbonate secretion. Proc Natl Acad Sci USA 21; 98(7): Rillema J and Hill M. Prolactin regulation of the pendriniodide transporter in the mammary gland. Am J Physiol Endocrinol Metab 23; 284: E25-E28 5. Suzuki K, Royaux I, Everett L et al. Expression of PDS/pds, the Pendred Syndrome Gene, in Endometrium. The J Clin Endo & Met 22; 87(2): Everett L, Morsli H, Wu D et al. Expression pattern of the mouse ortholog of the Pendred s syndrome gene (Pds) suggests a key role for pendrin in the inner ear. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 96: Arturi F, Russo D, Bidart J et al. Expression pattern of the pendrin and sodium/iodide symporter genes in human thyroid carcinoma cell lines and human thyroid tumors. Europ J Endocrinol 21;145: Rodriguez A-M, Perron B, Lacroix L et al. Identification and Characterization of a Putative Human Iodide Transporter Located at the Apical Membrane of Thyrocytes. J Clinic Endocrinol & Metab 22; 87(7): Kondo T, Nakamura N, Suzuki K et al. Expression of Human Pendrin in Diseased Thyroids. J Histochem Cytochem 23; 51: Royaux I, Suzuki K, Mori A et al. Pendrin, the Protein Encoded by the Pendred Syndrome Gene (PDS), Is an Apical Porter of Iodide in the Thyroid and Is Regulated by Thyroglobulin in FRTL-5 Cells. Endocrinology 2; 141(2): Yoshida A, Taniguchi S, Hisatome I et al. Pendrin Is an Iodide-Specific Apical Porter Responsible for Iodide Efflux from Thyroid Cells. J Clinic Endocrinol & Metab 22; 87(7): Royaux IE, Belyantseva IA, Wu T, Kachar B et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. J Assoc Res Otolaryngol 23; 4(3): Carrasco N. Iiodide transport in the thyroid gland. Biochemical et Biophysical Acta 1993; 1154: Spitzweg Ch, Morris J. The sodium iodide symporter: its pathophysiological and therapeutic implications. Clin Endocrinology 22; 57: Dai G, Levy O, Carrasco N Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter. Nature 1996; 379: Smanik PA, Liu Q, Furminger L et al. Cloning of the human sodium iodide symporter. Biochem Biophys Res Commun 1996; 226: Bidart JM, Mian C, Lazar V et al. Expression of pendrin and the Pendred syndrome (pds) gene in human thyroid Tissues. J Clin Endocrinol Metab 2; 85: Taylor J P, Roussel A, Metcalfe A et al. Mutations of the pds gene, encoding pendrin, are associated with protein mislocalization and loss of iodide efflux: Implications for thyroid dysfunction in Pendred syndrome. J Clin Endocrinol Metab 22; 87: Everett LA, Glaser B, Beck JC, et al. Pendred syndrome is caused by mutations in a putative sulphate transporter gene (PDS). 1997; Nat Ggenet 17: Taurog A Hormone synthesis: thyroid iodide metablolism Braverman LE, Utiger RD, et al. Werner and Ingbar s The Thyroid: a fundamental and clinical text. 8 th Ed. Philadelphia: Lippincott, Wiliams & Wilkins: 2:

9 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X Iodine supplementation and thyroid autoimmunity markers in children with non toxic diffuse goiter Paweł Matusik 1, Ewa Małecka-Tendera 1, Aleksandra Januszek-Trzciąkowska 1, Joanna Janowska 2, Mieczysław Szalecki 3 1 Department of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Silesian University School of Medicine, Katowice 2 Department of Pathophysiology Silesian University School of Medicine, Katowice 3 City Hospital, Kielce Summary Background: There is a body of evidence that introduction of iodine prophylaxis in iodine deficient region may increase the occurrence of autoimmune thyroid disorders. The aim of the study was to evaluate the influence of iodine supplementation on concentration of thyroid autoimmunity markers in children with nontoxic diffuse goiter. Material and Methods: 24 children (22 girls, 2 boys) with a mean age of 12,9 ± 2,2 years with non-toxic diffuse goiter were treated for 12 months with 1 µg daily of iodine (Iodid, Merck). None of them suffered from autoimmune disorder and they all had negative family history of autoimmune disease. Before and after 3, 6, and 12 months of therapy antibodies to thyroglobulin (TgAb) and to thyroid peroxidase (TPOAb) as well as interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNFα), soluble intercellular adhesion molecule - 1 (sicam-1) and soluble vascular cell adhesion molecule 1 (svcam-1) levels were measured. After 3 months of therapy TgAb level increased significantly and remained elevated at 6th and 12th month of treatment. After 6 months a significant increase of sicam 1 level was noted. TNFα increased significantly after 12 months compared to the baseline value. There were no significant differences in TPOAb, IL 6 and svcam-1 levels during therapy. In all children TSH and ft4 levels were not significantly different between all study points and remained in normal range during the study. Conclusion: Significant increase of TgAb, TNFα and sicam-1 levels during iodine therapy in children with non-toxic diffuse goiter may indicate that this treatment modality can increase the risk of thyroid autoimmunity in iodine sufficient regions. (Pol J Endocrinol 24; 6(55): ) Key words: non-toxic diffuse goiter, inorganic iodine, autoimmunity, antithyroid antibodies, cytokines 697

10 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X Wpływ suplementacji jodem nieorganicznym na wskaźniki procesu autoimmunologicznego tarczycy u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym Paweł Matusik 1, Ewa Małecka-Tendera 1, Aleksandra Januszek-Trzciąkowska 1, Joanna Janowska 2, Mieczysław Szalecki 3 1 Katedra i Klinika Pediatrii, Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach 2 Katedra i Zakład Patofizjologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach 3 Wojewódzki Szpital Dziecięcy w Kielcach Streszczenie Wstęp: W populacjach które zostały poddane powszechnej profilaktyce jodowej pojawiły się doniesienia o wzroście występowania schorzeń tarczycy o podłożu autoimmunologicznym, co może przemawiać za immunogennym wpływem suplementacji jodem na tkankę gruczołu tarczowego. Celem pracy była ocena wpływu terapii preparatem jodu na poziomy markerów procesu immunologicznego u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym. Materiał i metody: Badaniem objęto grupę 24 dzieci (22 dziewczynki, 2 chłopców) w wieku 12,9±2,2 lat z wolem rozlanym nietoksycznym. Zarówno u pacjentów jak i ich najbliższych krewnych nie występowały choroby o podłożu autoimmunologicznym. Wszystkie dzieci były leczone prze 12 miesięcy preparatem jodu nieorganicznego (Jodid, Merck) w dawce 1 µg/d. Przed leczeniem oraz po 3, 6 i 12 miesiącach terapii oznaczono w surowicy krwi przeciwciała przeciwmikrosomalne (TPO) i przeciwtyreoglobulinowe (TgAb), interleukinę 6 (IL-6), czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) oraz formy rozpuszczalne molekuł adhezyjnych (sicam- 1 i svcam-1). Po 3 miesiącach terapii stwierdzono znamienny wzrost stężenia TgAb w stosunku do wartości wyjściowej, który utrzymywał się w kolejnych miesiącach badania. W 6 i 12 miesiącu terapii stwierdzono również istotny statystycznie wzrost stężenia sicam, a w 12 miesiącu istotny wzrost stężenie TNFα w porównaniu do wartości wyjściowej (p<,5). Stężenia pozostałych oznaczanych parametrów nie różniły się znamiennie statystyczne w stosunku do stężeń wyjściowych. U wszystkich dzieci stężenia TSH i ft4 przez cały czas terapii utrzymywały się w granicach normy i nie różniły się znamiennie pomiędzy poszczególnymi oznaczeniami. Wniosek: Znamienny wzrost stężeń niektórych parametrów stanu zapalnego (TgAb, sicam-1, TNFα) w trakcie terapii jodem nieorganicznym może świadczyć o immunogennym wpływie leczenia u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym na terenie o wystarczającej podaży jodu w diecie. (Endokrynol Pol 24; 6(55): ) Słowa kluczowe: wole rozlane nietoksyczne, jod nieorganiczny, autoimmunizacja, przeciwciała przeciwtarczycowe, cytokiny Prof. Ewa Małecka-Tendera Katedra i Klinika Pediatrii, Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej Śląskiej AM Ul. Medyków Katowice Tel. (32) ; Fax. (32) etendera@slam.katowice.pl Wstęp Najczęstszą przyczyną wola rozlanego nietoksycznego jest niedostateczna podaż w diecie jodu nieorganicznego [1]. Pomimo wprowadzenia powszechnej profilaktyki jodowej w naszym kraju, nadmierna objętość gruczołu tarczowego jest nadal częstym powodem kierowania dzieci i młodzieży do poradni endokrynologicznych. Ze względu na brak możliwości rutynowego wykonania badania wydalania jodu z moczem, preparaty jodu są w dalszym ciągu często stosowane przez wielu lekarzy jako lek pierwszego rzutu w przypadku stwierdzenia wola rozlanego nietoksycznego. Suplementacja jodem może jednak u osób predysponowanych wywołać odpowiedź autoimmunologiczną w gruczole tarczowym. Pierwszych dowodów na immunogenny wpływ dużych dawek jodu nieorganicznego dostarczyły prace doświadczalne na modelach zwierzęcych, gdzie u zwierząt predysponowanych genetycznie za pomocą dużych dawek jodu wywoływano autoimmunologiczne zapalenie tarczycy [2]. Pośrednim dowodem na związek jodu z występowaniem schorzeń autoimmunologicznych tarczycy są badania epidemiologiczne, w których stwierdzono niższą zapadalność na zapalenie tarczycy Hashimoto oraz chorobę Graves`a na terenach z niedoborem tego pierwiastka [2, 3]. Publikacje pochodzące z krajów, które od wielu lat prowadzą powszechną 698

11 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) profilaktykę jodową wskazują na wzrost zachorowalności na choroby tarczycy o podłożu autoimmunologicznym [2, 3, 4, 5, 6]. Doniesienia te opierają się głównie na grupach osób dorosłych, natomiast badania na temat wpływu autoimmunizacyjnego suplementacji jodem u dzieci są nieliczne [7, 8, 9]. Cel pracy Celem naszej pracy była ocena stężeń wybranych parametrów odpowiedzi autoimmunologicznej na leczenie suplementacyjne jodem nieorganicznym u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym w czasie rocznej obserwacji. Materiał i metody Badaniem objęto grupę 38 dzieci (36 dziewczynek i 2 chłopców) w wieku od 1 do 15 roku życia, pacjentów Wojewódzkiej Poradni Endokrynologicznej dla Dzieci i Młodzieży w Katowicach. Dzieci były kwalifikowane do badania na podstawie następujących kryteriów włączenia: 1. Wole < Ib o wg WHO 2. Jednorodność echa w badaniu USG tarczycy Kryteriami wyłączenia były: 1. Nieprawidłowe wyniki badań hormonalnych (TSH, ft4; ft3) wskazujące na za zaburzoną funkcję tarczycy 2. Podwyższone wyjściowe stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych 3. Wole guzkowe 4. Schorzenia o podłożu autoimmunologicznym u pacjenta lub jego rodziny 5. Schorzenie infekcyjne przebyte w ciągu ostatnich 3 tygodni przed pobraniem krwi do badań Wszystkim badanym dzieciom włączono leczenie preparatem jodu nieorganicznego (Jodid, Merck ) w dawce 1 µg/d. Przed leczeniem oraz po 3, 6, 12 miesiącach terapii oznaczano w surowicy krwi stężenie TSH, ft4, a także przeciwciała przeciwmikrosomalne (TPO) (N: <154 IU/ml: ELISA - Cambridge Life Sciences ) i przeciwtyreoglobulinowe (TgAb) (N: <36 IU/ml: ELISA - Cambridge Life Sciences ), interleukinę 6 (IL-6), czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) oraz formy rozpuszczalne molekuł adhezyjnych (sicam-1 i svcam-1). Oznaczenia zostały przeprowadzone metodą ELISA z wykorzystaniem zestawów firmy Bender Med System. Badanie ultrasonograficzne gruczołu tarczowego przeprowadzono u wszystkich dzieci na wstępie oraz po 6 i 12 miesiącach terapii preparatem jodu. W trakcie badania z grupy wyłączono 4 dziewczynki, u których po 3 i 6 miesiącach terapii stwierdzono narastanie wartości przeciwciał antytpo do wartości ponad trzykrotnie przekraczającej górną granicę normy z jednoczesnym wzrostem stężenia TSH powyżej 1 miu/l. W wykonanej biopsji cienkoigłowej u wszystkich czterech pacjentek stwierdzono obraz cytologiczny charakterystyczny dla wola Hashimoto. Z grupy wyłączono również kolejne 1 dziewczynek z powodu nie zgłoszenia się do badań kontrolnych oraz infekcji wirusowej lub bakteryjnej przebytej w okresie 3 tygodni przed badaniem kontrolnym. Ostatecznie badaniem objęto 24 dzieci (22 dziewczynki; 2 chłopców) w wieku (średnia ± SD) 12,9 ± 2,2 lat,. Wszystkie dzieci były w okresie dojrzewania, pomiędzy II a IV stopniem według skali Tannera. Parametry antropometryczne badanych dzieci przedstawiały się następująco (średnia ± SD): wzrost 153,9 ± 14,6 cm, masa ciała 43 ± 9,76 kg, BMI 18,1 ± 2,3. Uzyskane wyniki przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD) dokonując analizy statystycznej przy użyciu testu t-studenta dla grup zależnych. Poziom istotności statystycznej p <,5 uznano za znamienny. Na wykonanie badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach. Wyniki Uzyskane wyniki dwunastomiesięcznych profili stężeń poszczególnych parametrów procesu autoimmunologicznego tarczycy przedstawiono w Tabeli 1. Podczas rocznej obserwacji leczenia preparatem jodu nieorganicznego stężenia TgAb utrzymywały się w granicach normy (N: 36 IU/ml) jednak po 3 miesiącach leczenia stwierdzono znamienny wzrost stężenia tych przeciwciał w stosunku do wartości wyjściowej (p<,5). W 6 i 12 miesiącu obserwacji stężenia te utrzymywały się na podobnym poziomie istotności statystycznej (p<,5) w stosunku do stężenia uzyskanego przed włączeniem leczenia. (ryc. 1). Stężenie TNFα w 12 miesiącu leczenia było znamiennie statystycznie wyższe w porównaniu do wartości wyjściowej oraz do wartości w 6 miesiącu leczenia (p<,5) (ryc. 2). Znamienny wzrost stwierdzono także w przypadku stężeń rozpuszczalnej formy cząsteczki adhezji międzykomórkowej (sicam-1) w 6 i 12 miesiącu terapii w stosunku do stężenia wyjściowego (odpowiednio p<,5 i p<,5) (ryc. 3). Stężenia przeciwciał przeciwko peroksydazie tarczycowej nie różniły się znamiennie podczas dwunastomiesięcznej obserwacji utrzymując się na górnej granicy normy (N: 154 IU/ml) (tab. 1). Wartości pozostałych parametrów - interleukiny 6 (IL-6) (ryc. 2) oraz formy rozpuszczalnej molekuły adhezyjnej naczyń (svcam-1) (ryc. 3) nie różniły się znamiennie w poszczególnych odstępach czasowych podczas rocznej terapii preparatem jodu. 699

12 Jod a autoimmunologia tarczycy u dzieci Matusik P. Tabela I. Stężenia poszczególnych parametrów procesu autoimmunologicznego Table I. Levels of autoimmunologic process markers * p <,5 vs IU/ml pg/ml * * p<,5 vs * p<,5 vs, 6 * 3 miesiące 3 months 6 miesięcy 6 months 12 miesiące 12 months TPO 1 ± 112,6 122,1 ± 121,5 94,9 ± 13,9 113 ± 94,9 TgAb 22 ± 11,1 284,3 ± 23* 35 ± 15,5* 319,5 ± 3,1* IL 6 15,1 ± 12,9 16,7± 11,6 16,6 ± 9,3 19,5 ± 31,2 TNFα 7,9 ± 9,6 9,8 ± 14,1 7,9 ± 8,6 23,2 ± 31,4* ICAM 1 446,5 ± 156,5 624,3 ± 624,7 694,2 ± 381,7 685,5 ± 439,5 VCAM 1 465,5 ± 158,9 488,3 ± 187,9 548 ± 318,1* 537,9 ± 28,5* * * TgAb Miesiące Months Ryc. 1. Profil stężeń przeciwciał przeciwko tyreoglobulinie (TgAb) Fig. 1. Antithyroglobulin antibody (TgAb) profile ng/ml * * * p<,5 vs Miesiące Months Miesiące Months IL-6 TNF alfa Ryc. 2. Profil stężeń interleukiny 6 (Il 6) i czynnika martwicy nowotworów alfa (TNFα) Fig. 2. Interleukin 6 (Il 6) and tumor necrosis factor alpha (TNFα) profiles svcam-1 sicam-1 Ryc. 3. Profile stężeń rozpuszczalnych form cząsteczki adhezji komórkowej naczyń (svcam - 1) i cząsteczki adhezji międzykomórkowej (sicam 1) Fig. 3. Soluble forms of vascular cell adhesion molecule (svcam 1) and intercellular adhesion molecule (sicam 1) profiles Uzyskane wyniki stężeń TSH i ft4 pozostawały podczas terapii w granicach normy. Po roku leczenia stwierdzono znamienny spadek objętości gruczołu tarczowego (p <,5) odpowiednio przed leczeniem V = 1,3 ± 3,1 ml vs V 12 = 8,1 ± 1,8 ml po leczeniu. W wykonanych kontrolnych badań USG tarczycy nie stwierdzano cech mogących sugerować rozwój procesu autoimmunologicznego w gruczole tarczowym. Omówienie Problem niedoboru jodu w Polsce był zauważany już w okresie międzywojennym ubiegłego wieku, kiedy to po raz pierwszy wprowadzono profilaktykę jodową polegającą na jodowaniu soli kuchennej. Jednak dopiero powołanie w 1991 roku Polskiej Komisji ds. Kontroli Zaburzeń z Niedoboru Jodu, która przeprowadziła szerokie badania populacyjne częstości wola, pozwoliło na wprowadzenie programu powszechnej profilaktyki jodowej. Na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku częstość wola w populacji polskiej kształtowała się na poziomie 3 4% zarówno wśród dzieci jak i osób dorosłych. W 1997 roku Minister Zdrowia wprowadził profilaktykę jodową polegającą na jodowaniu soli kuchennej (2-4 mg KJ/ 1 kilogram soli) oraz na jodowaniu mieszanek dla niemowląt na poziomie minimum 1 µg KJ/ 1 ml. Tak prowadzona profilaktyka jodowa pozwoliła na zaliczenie Polski w roku 22, na podstawie badań populacyjnych przeprowadzonych przez WHO, do krajów o wystarczającej podaży jodu. Częstość występowania wola zmniejszyła się poniżej poziomu endemicznego tj. poniżej 5% populacji [7, 1]. Obserwacje przeprowadzone w krajach, które wprowadziły powszechną profilaktykę jodową wskazują na zwiększenie ilości pacjentów z powiększeniem tarczycy o podłożu autoimmunologicznym (zapalenie tarczycy typu Hashimoto, choroba Graves`a). Po 1 latach stosowania profilaktyki jodowej Doufas i wsp.[5] przeprowadzili epidemiologiczne badania porównawcze w grupie greckich dzieci w okresie przedpokwitaniowym. Na podstawie biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej stwierdzili wzrost częstości występowania schorzeń autoimmunologicznych tarczycy w grupie dzieci z wolem z 6% do 14 %. W Polsce Bobeff i wsp [7] stwierdzili u dzieci makroregionu łódzkiego wzrost 7

13 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) częstości występowania przewlekłego zapalenia tarczycy z 3,7% w latach do 11,2% w latach Wole rozlane nietoksyczne u młodzieży jest w naszym kraju leczone często przez lekarzy rodzinnych, którzy nie mają możliwości wykonywania szerszych badań diagnostycznych. Również w Poradniach Endokrynologicznych dla Dzieci nie wykonuje się badania wydalania jodu z moczem u pacjentów zgłaszających się z powodu wola. Wielu lekarzy stosuje nadal preparaty jodu nieorganicznego jako lek pierwszego rzutu u dzieci z powiększoną tarczycą. W przeprowadzonej przez nas rocznej obserwacji stężeń markerów procesu autoimmunologicznego u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym leczonych preparatem jodu wartości TgAb nie przekraczały zakresu normy. Stwierdziliśmy jednak znamienny wzrost stężenia przeciwciał przeciwtyreoglobulinowych (TgAb) w 3 miesiącu leczenia, który utrzymywał się na podobnym poziomie podczas dalszej obserwacji. Wzrost stężenia TgAb w przebiegu terapii jodem może być związany, jak wskazują niektóre badania, z podwyższoną ilością jonów jodu obecnych w cząsteczce tyreoglobuliny. Podobne wyniki opisali Papanastasiou i wsp. [4], którzy stwierdzili znamienny wzrost stężenia TgAb u 4 pacjentów z wolem rozlanym nietoksycznym w szóstym miesiącu po podaniu domięśniowym 1 ml jodowanego oleju. Uzyskane przez tych autorów stężenia TgAb także nie przekraczały górnej granicy normy. U czterech dziewczynek wyłączonych z badania po 3 i 6 miesiącach podawania preparatu jodu nieorganicznego wystąpiły klasyczne cechy limfocytarnego zapalenia tarczycy. Trudno określić w jakim stopniu zastosowana terapia wpłynęła na ujawnienie się choroby, nie można jednak wykluczyć, że mogła przyczynić się do jej wystąpienia. W ocenianej przez nas grupie dzieci roczne leczenie doustnymi preparatami jodu było związane z znamiennym wzrostem stężenia czynnika martwicy nowotworów alfa w 6 i 12 miesiącu obserwacji w stosunku do wartości wyjściowej. Na podstawie przeprowadzonych obserwacji, m.in. na modelach doświadczalnych, stwierdzono, że podwyższone stężenie jodu, zwłaszcza przed utlenieniem przez peroksydazę tarczycową, może indukować wytwarzanie wolnych rodników oraz powodować uszkodzenia śródbłonka naczyń. Powoduje to odpowiedź zapalną, której jednym z mediatorów jest TNFα [2]. W badanej grupie stwierdzono także znamienny wzrost stężenia formy rozpuszczalnej cząsteczki adhezji międzykomórkowej 1 (sicam-1) w 6 i 12 miesiącu leczenia w porównaniu do stężenia wyjściowego. Cząsteczki adhezyjne takie jak ICAM-1 odgrywają kluczową rolę w procesie migracji komórek układu odpornościowego do ogniska zapalnego poprzez umożliwienie pokonania bariery jaką jest ściana naczynia. W patogenezie rozwoju zapalenia tarczycy Hashimoto infiltracja gruczołu tarczowego przez komórki limfocytarne jest najważniejszym mechanizmem. Schuppert i wsp. [11] oraz Marazuela i wsp [12] w oparciu o badania nad ekspresją receptora TSH w preparatach tarczycy pobranych od pacjentów z chorobą Gravesa i Hashimoto stwierdzili, że cząsteczki ICAM-1 i VCAM-1 odgrywają istotną rolę w inicjacji procesu autoimmunologicznego w tym narządzie. Mansard i wsp. [13] uważają, że stężenie sicam-1 jest najbardziej czułym wskaźnikiem prognostycznym w chorobie Gravesa. W przeprowadzonym przez Kahaly i wsp. [6] randomizowanym, podwójnie zaślepionym, kontrolowanym placebo badaniu w grupie osób leczonych doustnym preparatem jodu zaobserwowano większy stopień infiltracji limfocytarnej w porównaniu do grupy placebo. Stwierdzono także regresję nacieków limfocytarnych po odstawieniu preparatu jodu. Papanastasiou i wsp. [4] stwierdzili 2,5-krotny wzrost obecności infiltracji limfocytarnej w gruczole tarczowym po podaniu jodowanego oleju osobom z wolem rozlanym nietoksycznym. W profilach stężeń pozostałych parametrów (TPO, Il-6, svcam-1) nie stwierdzono znamiennych różnic podczas rocznej terapii doustnym preparatem jodu nieorganicznego. Rejestr indukowanej jodem nadczynności tarczycy prowadzony w Polsce nie wykazał wzrostu tego zjawiska do poziomu endemii jak również narastanie stężenia przeciwciał antytpo nie wykazało korelacji z jodurią [14]. Jednak w dwa latach po wprowadzeniu obligatoryjnego jodowania soli w Danii Bullow-Pedersen i wsp. [15] stwierdzili istotny wzrost zachorowań na nadczynność tarczycy. Autorzy tej publikacji uważają, że można zapobiec temu negatywnemu trendowi poprzez stopniowe zwiększanie spożycia jodu w diecie i nie przekaczanie rekomendowanej dawki 15 µg/dobę. Kahaly i wsp. [16] uzyskali zbliżony efekt zmniejszenia się objętości wola u pacjentów leczonych lewotyroksyną w porównaniu z pacjentami leczonymi jodem nieorganicznym w dawce 5 µg/dobę, jednak w tej ostatniej grupie u 19% chorych stwierdzono istotne narastanie miana przeciwciał anty TPO i antytg, które uległo obniżeniu po odstawieniu preparatu jodu. Markou i wsp [17] po podaniu przez 6 dni 1 kropli płynu Lugola zdrowym dzieciom greckim w okresie pokwitania zaobserwowali u 75% z nich przejściową hypertyreotropinemię. Autorzy tej pracy uważają, że przewlekłe podawanie dużych dawek jodu jest nie wskazane u dzieci przed ukończeniem procesu dojrzewania. Wyniki naszej pracy, w połączeniu z doniesieniem Bobeff i wsp, [7] wskazują, że terapia wola 71

14 Jod a autoimmunologia tarczycy u dzieci Matusik P. rozlanego nietoksycznego polegająca na dodatkowym podawaniu preparatu jodu powinna być stosowana u polskich dzieci dopiero po wykluczeniu autoimmunologicznej przyczyny powiększenia gruczołu tarczowego. Ponieważ badanie wydalania jodu z moczem nie jest powszechnie dostępne i wykorzystywane jest jedynie do badań naukowych, u pacjentów otrzymujący jod winno się na wstępie terapii i okresowo w trakcie jej trwania oceniać stężenie przeciwciał przeciwtarczycowych celem wykluczenia procesu autoimmunologicznego w tarczycy. Wniosek Znamienny wzrost stężeń niektórych parametrów stanu zapalnego przeciwciał antytyreoglobulinowych, czynnika martwicy nowotworów α i formy rozpuszczalnej molekuły adhezyjnej (sicam) w trakcie terapii jodem nieorganicznym może świadczyć o immunogennym wpływie tego typu leczenia u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym. 12. Marazuela M, Postigo AA, Acevedo A, Diaz-Gonzalez F et al. Adhesion molecules from the LFA-1/ICAM-1,3 and VLA-4/VCAM-1 pathways on T lymphocytes and vascular endothelium in Graves and Hashimoto s thyroid glands. Eur J Immunol 1994;24: Massart C, Sonet E, Gibassier J, Maugendre D et al. Clinical validity of intercellular adhesion molekule-1 (ICAM-1) and TSH receptor antibodies in sera from patients with Graves disease. Clin Chim Acta 1997;265: Lewiński A, Szybiński Z, Bandurska-Stankiewicz E et al. Iodine induced hyperthyroidism an epidemiological survey several years after institution of iodine prophylaxis in Poland. J Endocrinol Invest 23;26 (suppl 2): Bulow-Pedersen I, Knudsen N, Joergensen T et al. Large differences in incidence of overt hyper- and hypothyroidism associated with small differences in iodine intake: A prospective comparative register-based population survey. JCEM 22;87: Kahaly GJ, Dienes HP, Beyer J, Hommel G. Iodide induces thyroid autoimmunity in patients with endemic goiter: a randomized, double-blind, placebo controlled trial. Eur J Endocrinol 1998;139: Markou KB, Paraskevopoulou P, Kartaiskos KS, Makri M et al. Hyprthyrotropinemia during iodide administration in normal children and in children born with neonatal transient hypothyroidism. ICEM 23;88: Piśmiennictwo 1. World Health Organization, United Nations Children s Found, International Council for Control of Iodine Deficiency Disorders: Indicators for Assessing Iodine Deficiency Disorders and Their Control through Salt Iodination. Publication WHO/NUT/94,6 World Health Organization, Geneva 1994, Foley Jr TP. The relationship between autoimmune thyroid disease and iodine intake: a review. Pol J Endocrinol 1992; 43 (suppl 1): Weetman AP. Autoimmune thyroid disease: propagation and progression. Eur J Endocrinol 23; 148: Papanastasiou L, Alevizaki M, Piperingos G, Mantzos E et al. The effect of iodine administration on the development of thyroid autoimmunity in patients with nontoxic goiter. Thyroid 2; 1: Doufas AG, Mastorakos G, Chatziioannou S, Tseleni Balafouta S et al. The predominant form of non-toxic goiter in Greece is now autoimmune thyroiditis. Eur J Endocrinol 1999; 14: Kahaly G, Dienes HP, Beyer J, Hommel G. Randomized, double blind, placebo controlled trial of low dose iodide in endemic goiter. JCEM 1997; 82: Bobeff I, Pniewska Siark B, Zygmunt A, Lewiński A. Wpływ wprowadzenia obligatoryjnego modelu profilaktyki jodowej na niektóre wskaźniki podaży tego pierwiastka oraz na częstość poszczególnych rozpoznań cytologicznych w guzkach tarczycy u dzieci makroregionu łódzkiego. Endokrynol Ped 23; 2: Kabelitz M, Liesenkötter KP, Stach B, Willgerodt H et al. The prevalence of anti-thyroid peroxidase antibodies and autoimmune thyroiditis in children and adolescents in an iodine replete area. Eur J Endocrinol, 23; 148: Marwaha R.K., Tandon N., Karak A.K., Gupta N et al. Hashimoto`s thyroiditis: countrywide screening of goitrous healthy young girls in postiodization phase in India. JCEM 2; 85: Szybiński Z. Aktualne wyniki i dalsze perspektywy profilaktyki jodowej w Polsce. Endokrynol Pol, 24; 3: Schuppert F, Reiser M, Muhlen A. TSH-receptor and adhesion molecules in autoimmune thyroid disease. Exp Clin Endocrinol 1992;1:

15 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X Wpływ VIP i leptyny na wydzielanie cytokin, hormonów tarczycowych i nadnerczowych w czasie eksperymentalnego ostrego zapalenia Wojciech Bik 1, Agnieszka Baranowska Bik 2, Ewa Wolińska Witort 1, Magdalena Chmielowska 1, Lidia Martyńska 1, Boguslawa Baranowska 1 1 Zakład Neuroendokrynologii Klinicznej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego, Warszawa 2 Oddział Chorób Wewnetrznych, Hematologii i Endokrynologii Centralny Szpital Kliniczny MSWiA, Warszawa Streszczenie Wstęp: Naczynioruchowy peptyd jelitowy (VIP) i leptyna mogą wywierać działanie modulujace na odpowiedź układu odpornościowego. Wydaje się, że VIP jest czynnikiem działającym przeciwzapalnie, natomiast leptyna może pobudzać wydzielanie cytokin prozapalnych. Poza układem immunologicznym w czasie ostrego zapalenia istotna rolę odgrywa układ endokrynny, przede wszystkim poprzez pobudzenie osi podwzgórze przysadka nadnercza. Cel badań: Celem badań była ocena wpływu egzogennego podawania VIP lub leptyny na stężenie cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych (TNF α, IL 6, IL 1) oraz wydzielanie hormonów tarczycowych (T3 i T4), TSH i nadnerczowych (kortykosteron) w czasie ostrego zapalenia indukowanego przez lipopolisacharydy (LPS) bakterii Gram ujemnych. Materiał i metody: Szczury samce rasy Wistar Kyoto podzielono na grupy otrzymujące odpowiednio placebo (,9% NaCl), LPS, leptynę, VIP, LPS + leptynę, LPS + VIP. Stężęnie cytokin prozapalnych w surowicy (TNF α, IL 6) oznaczano po 2 godzinach a przeciwzapalnych (IL 1) po 4 godzinach. Wszystkie hormony oznaczano po 2 i 4 godzinach. Stężenie cytokin oznaczano metodą ELISA a a hormonów metodą RIA. Wyniki: Leptyna nie wpływała na stężenie cytokin w warunkach ostrego zapalenia, natomiast stymulowała syntezę kortykosteronu. Podanie VIP wraz z LPS spowodowało spadek poziomu IL 6 oraz kortykosteronu w stosunku do grupy otrzymujacej LPS. Natomiast VIP nasilał hamujący wpływ LPS na wydzielanie hormonów tarczycy. Wnioski: Wydaje się, że leptyna moduluje odpowiedź układu endokrynnego w warunkach ostrego eksperymentalnego zapalenia, natomiast VIP wpływa zarówno na odpowiedź układu immunologicznego i wtórnie endokrynnego w czasie ostrego zapalenia indukowanego przez LPS. (Endokrynol Pol 24; 6(55): 73-71) Słowa kluczowe: Leptyna, VIP, cytokiny, hormony, ostre zapalenie Prof. dr hab. Bogusława Baranowska Zakład Neuroendokrynologii Klinicznej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego Warszawa ul. Marymoncka 99 Tel/fax: e mail: zncmkp@polbox.com, zncmkp@free.polbox.pl 73

16 / ORIGINAL PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/24 ISSN X The influence of VIP and leptin on cytokines, thyroid and adrenal hormones secretion during experimental acute inflammation Wojciech Bik 1, Agnieszka Baranowska Bik 2, Ewa Wolińska Witort 1, Magdalena Chmielowska 1, Lidia Martyńska 1, Boguslawa Baranowska 1 1 Neuroendocrinology Department Medical Centre of Postgraduate Education, Warsaw, Poland. 2 Department of Internal Medicine, Endocrinology and Haematology, Central Hospital of Ministry of Home Affairs and Administration, Warsaw, Poland Abstract Introduction: Vasoactive intestinal peptide (VIP) and leptin can modify immune response. It is suggested that VIP can act as an anti-inflammatory factor and leptin can stimulate proinflammatory cytokine production. The endocrine system, especially hypothalamo pituitary adrenal axis, is also involved in the physiological response during acute inflammation. The aim of our study was to estimate the effects of the administration of VIP or leptin on serum cytokines concentrations (IL-6, TNF-α and IL-1) and on TSH, the thyroid and adrenal hormones in response to lipopolisaccharide ( LPS ) induced acute inflammation. Materials and Methods: Male rats Wistar Kyoto were divided into six groups, which received respectively: placebo, LPS, leptin, VIP, LPS and leptin or LPS and VIP. The TNF α and IL 6 serum concentrations were measured after 2 h, IL 1 after 4 h and all hormones after 2 and 4 h. Cytokine concentrations were estimated using ELISA tests and hormones concentrations were measured using RIA tests. Results: Leptin did not have an effect on cytokines concentrations during acute inflammation. Leptin enhanced LPS induced increasing of corticosterone secretion. VIP administrated with LPS decreased LPS - induced increasing of IL 6 and corticosterone concentrations. VIP also enhanced LPS - induced thyroid hormones suppressions. Conclusions: We conclude that leptin modulates hormone response during LPS induced acute inflammation and VIP can change not only immune response but also hormonal response during acute inflammation. (Pol J Endocrinol 24; 6(55): 73-71) Key words: leptin, VIP, cytokines, hormones, acute inflammation Boguslawa Baranowska, MD, PhD Neuroendocrinology Department Medical Centre of Postgraduate Education, Marymoncka 99, Warsaw, Poland. Tel/fax: e mail: zncmkp@polbox.com. e mail: zncmkp@free.polbox.pl This work was supported by scientific program Medical Centre of Postgraduate Education / Introduction Vasoactive intestinal peptide (VIP) is a 28 amino acid polypeptide, which was isolated by Said and Mutt and has a wide range of biological functions including relaxation of smooth muscles and stimulation of exocrinal gland [1]. It has been reported that VIP can be produced by immune cells and was identified in macrophages, lymphocytes and nervous system [2, 3, 4, 5]. On the other hand there are specific receptors for VIP in the immune cells. The biological activity of VIP in immune system is mediated through these specific receptors [2, 6, 7, 8]. It is known that VIP can play an important role in modulation of immunological response at the time of inflammation [4, 8, 9]. VIP modulates development and function of T lymphocytes [6,1] and inhibits T cell mediated cytotoxicity and antigen induced apoptosis of mature T lymphocytes [11, 12, 13]. Moreover, many agents such as proinflammatory cytokines: tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukine 6 (IL-6),interleukine 1 (IL- 1) as well as lipopolisaccharide (LPS) stimulate the production and release of VIP from murine lymphocytes [9, 14]. VIP inhibits production of endogenous proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6, interleukine 12 (IL-12), interferon γ (INF γ) and enhances production of antinflammatory cytokines such as interleukine 1 (IL-1) [15, 16, 17]. Leptin product of OB gene, is peptide adipocyte derived hormone. Leptin and neuropeptide Y (NPY) are known to keep a key position in the regulation of food intake and energy balance [18, 19, 2, 21]. Leptin exerts its actions through its receptor (OB R), which has high affinity to gp 13 receptor, structurally related to I-st class cytokine 74

17 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) receptors. Leptin s receptor was found in different organs such as: kidneys, liver, heart, lungs, pituitary gland, testes, ovaries, uterus, adipose tissues and haematopoetic tissues [21, 22, 23]. It was shown in experimental studies that leptin administration in ob/ob mice decreased LPS induced lethality and sensitivity for LPS [24, 25]. Exogenous leptin regulates phagocytic function of macrophages in ob/ob mice [25]. This hormone stimulates interleukine 2 (IL-2) and IFN-γ productions by T helper 1 (Th1) lymphocytes [26]. The endocrine system, apart from the immune system, is always involved in response to acute inflammation by mobilizing hypothalamus pituitary adrenal axis and decreasing activity of pituitary thyroid axis. The interactions between these two systems play an important role in balance among proinflammatory and anti-inflammatory reactions [5, 27, 28]. VIP s and leptin s influences on the endocrine system are still not clear [19, 29, 3, 31, 32, 33]. It is suggested that VIP stimulates hypothalamus pituitary adrenal axis, mainly by enhancing corticotropin releasing hormone (CRH) and adrenocoticotrophic hormone (ACTH) secretion [34,35] and leptin suppress hypothalamic pituitary adrenal axis [31, 32, 36, 37]. The aim of our study was to estimate the effects of exogenous VIP or leptin administration on the serum concentrations of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6) and anti-inflammatory cytokine (IL-1) as well as VIP s or leptin s influence on the TSH, thyroid gland and adrenal serum hormones concentractions in response to LPS-induced acute inflammation. Materials and Methods For all experiments male Wistar Kyoto rats (25 3 g) were used. The animals were kept under controlled light (LD 1 : 14 h) and temperature (22 C) with free access to pelleted food and water ad libitum. The animals were divided into following groups which received itraperitoneally respectively: Experiment I-estimation of VIP s action group 1: 2 animals received 15 µl.9% NaCl. group 2: 2 animals received 6 µg LPS (Esherichia coli; 55: BT; Sigma, USA). group 3: 15 animals received 3 nmol VIP (Sigma, USA). group 4: 16 animals received 6 µg LPS (Esherichia coli; 55: BT; Sigma, USA) and 3 nmol VIP (Sigma, USA). Experiment II-estimation of leptin s action group 1: 14 animals received 15 µl.9% NaCl. group 2: 17 animals received 6 µg LPS (Esherichia coli; 55: BT; Sigma, USA). group 3: 15 animals received 3 µg murine leptin. (PeproTech, England). group 4: 19 animals received 6 µg LPS (Esherichia coli; 55: BT; Sigma, USA) and 3 µg murine leptin. (PeproTech, England). Then the animals were killed by decapitation after 2 or 4 h. Trunk blood was collected and the serum separated and stored at 2 o C. All experimental procedures and protocols were approved by the First Warsaw Ethic Committee for Experimental on Animals (The M. Nencki Institute of Experimental Biology, The Polish Academy of Science). The cytokines IL 6 (Endogen, USA) and TNF α (Amersham Pharmacia Biotech, England) were measured using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) tests after 2 h. The cytokine IL 1 (Endogen, USA) was measured using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA test after 4 h. The following hormones were evaluated by radioimmunoassay (RIA) after 2 and 4 h: triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) using kits (Orion Diagnostica, Finland); corticosterone using kits (ICN Biomedicals Inc, USA); thyroid stimulating hormone (TSH) using kits Rat TSH (Biocode SA., Belgium) Data were analysed by Mann - Whitney test to determine significant differences between groups. Results are expressed as the mean ± SEM and the statistical significance is accepted at p <.5 Results Experiment I - estimation of VIP s action LPS administration caused increasing TNF α and IL 6 serum concentrations after 2 h and IL 1 after 4 h in comparison with the control group (p<.1, p<.1, p<.1 respectively Table 1). LPS administration decreased serum concentrations of T3 and TSH after 2 hours (p <.5, p<.1 respectively; Table 2), LPS administration increased serum corticosterone concentrations after 2 and 4 h (p <.1, p<.1, respectively; Table 2). VIP administration decreased serum IL 1 concentrations after 4 hours (p <.5; Table 3). VIP administration increased serum corticosterone concentration after 4 h compared to the control group (p<.5; Table 3) and decreased serum T 3 concentrations after 2 hours (p <.5; Table 3) The following results were recorded by comparison group that received LPS and VIP with group received only LPS: 1. Decreasing serum IL 6 concentration after 2 hours (p<.1 Figure 1); there were not statistical differences in TNF α and IL 1 serum concentrations between the group receiving LPS plus VIP compared to the group receiving only LPS. 2. Decreasing corticosterone serum concentration after 2 h (p<.5; Fig. 2) 75

18 Wpływ VIP i leptyny na ostre zapalenie Bik W. Table I Mean (± SEM) serum cytokine concentrations after LPS administration after 2 and 4 h in comparison with control group (experiment I with VIP). Cytokine LPS.9 % NaCl p IL 6 (pg/ml) (2 h) ± 1911 (n =1) ± 3.42 (n = 1) <.1 TNF alfa (pg/ml) (2 h) 1914 ± 216 (n = 1) 9.47 ± (n =1) <.1 IL 1 (pg/ml) (4 h) 1449 ± 251 (n = 1) ± 6.31 (n =1) <.1 Table II Mean (± SEM) serum hormones concentrations after LPS administration after 2 and 4 hours in comparison with control group (experiment I with VIP). Table III Mean (± SEM) serum hormones and cytokine concentrations after VIP administration after 2 and 4 hours in comparison with control group (experiment I with VIP). Hormones LPS.9 % NaCl p T3 (nmol/l) (2 h).87 ±.5 (n = 1) 1.1 ±.7 (n = 1) <.5 TSH (ng/ml) (2 h) 1.2 ±.9 (n = 1) 1.94 ±.18 (n = 1) <.5 Corticosterone (nmol/l) (2 h) 1647 ± 95.3 (n = 1) 582 ± 32.7 (n = 1) <.1 Corticosterone (nmol/l) (4 h) 139 ± 6.8 (n = 1) 616 ± (n = 1) <.1 Hormones and cytokine VIP.9 % NaCl p IL 1 (pg/ml) ( 4 h) ± 4.63 ( n = 8) ± 6.31 ( n = 1) <.5 T3 (nmol/l) (2 h).88 ±.4 (n = 7) 1.1 ±.7 (n = 1) <.5 Corticosterone (nmol/l) (4 h) 865 ± (n = 8) 616 ± 66.8 (n = 1) <.5 Table IV Mean (± SEM) serum cytokine concentrations after LPS administration after 2 and 4 h in comparison with control group (experiment II with leptin). Cytokine LPS.9 % NaCl p IL 6 (pg/ml) (2 h) 2627 ± 3686 (n = 7) 51.4 ± 1.87 (n = 7) <.1 TNF alfa (pg/ml) (2 h) 1427 ± 255 (n = 7) 11.5 ± 1.57 (n = 7) <.1 IL 1 (pg/ml) (4 h) 268 ± 198 (n = 1) ± 9.74 (n = 7) <.1 Table V Mean (± SEM) serum hormones concentrations after LPS administration after 2 and 4 hours in comparison with control group (experiment II with leptin). Hormones LPS.9 % NaCl p T4 (nmol/l) (2 h) 36.3 ± 2.12 (n = 7) 47.8 ± 4.91 (n = 7) <.5 Corticosterone (nmol/l) (2 h) 1238 ± 8.8 (n = 7) 728 ± 175 (n = 7) <.5 TSH (ng/ml) (2 h) 1.16 ±.2 ( n = 7) 2.49 ±.29 ( n = 7) <.1 T3 (nmol/l ) ( 4 h) 1.1 ±.5 (n = 1) 1.42 ±.5 (n= 7) <.1 T4 (nmol/l ) (4 h) 37.6 ± 1.8 (n = 1) 5.39 ± 4 (n = 7) <.1 Corticosterone (nmol/l) (4 h) 1245 ± 18 (n =1) ± 22 (n = 7) <.5 TSH (ng/ml) (4 h) 1.54 ±.22 (n = 1) 2.43 ±.29 ( n = 7) <.5 Table VI Mean (± SEM) serum hormones concentrations after leptin administration at 2 and 4 hours in comparison with control group (experiment II with leptin). Hormones leptin.9 % NaCl p Corticosterone (nmol/l) (2 h) 313 ± 15.6 (n = 7) 728 ± 175 (n = 7) <.5 TSH (ng/ml) ( 4 h) 4.47 ±.46 (n = 8) 2.43 ±.29 ( n = 7) <.5 3.Decreasing corticosterone serum concentration after 4 h (p<.5; Fig. 3) 4. Decreasing T3 and T 4 serum concentrations after 4 hours (p<.5 p <.5, respectively; Fig. 4 and 5). Experiment II - estimation of leptin s action LPS administration caused increasing TNF α and IL 6 serum concentrations after 2 h and IL 1 after 4 h in comparison with the control group (p<.1, p<.1, p<.1, respectively; Table 4). LPS decreased serum concentrations of T4 and TSH after 2 h (p <.5, p<.1, respectively; Table 5) and T3, T4, TSH, after 4 h (p <.1, p<.1, p<.5, respectively; Table 5), however serum corticosterone levels were increased in response to LPS after 2 h and after 4 h (p <.5, p<.5 respectively Table 5). Leptin administration demonstrated decreasing of corticosterone serum concentration after 2 h compared to the control group (p<.5; Table 6) and increasing of TSH serum concentration after 4 h compared to the control group (p<.5; Table 6). The following results were recorded by comparison group that received LPS and leptin with group received only LPS: 1. Increasing corticosterone serum concentration after 2 h (p<.1 Figure 2), 2. There is no differences in serum cytokine concentrations between group received LPS plus leptin compared to group receiving only LPS. 76

19 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 24; 6 (55) Figure 1 Serum IL 6 concentration after 2 h. Discussion pg / ml LPS vs LPS + VIP p<.1 LPS vs LPS+Leptin ns LPS (I) LPS +VIP LPS (II) LPS + leptin X (pg/ml) N SEM Figure 2 Serum corticosterone concentration after 2 h nmol / l LPS vs LPS+VIP p<.5 LPS vs LPS+Leptin p<.1 LPS (I) LPS +VIP LPS (II) LPS + leptin X (nmol/l) N SEM Figure 3 Serum corticosterone concentration after 4 h nmol / l LPS vs LPS+VIP p<.5 LPS vs LPS+Leptin ns LPS (I) LPS +VIP LPS (II) LPS + leptin X (nmol/l) N SEM It is suggested that leptin plays an important role in regulation of immune response. It can stimulate production of proinflammatory cytokines and modulates proliferation and activity of lymphocytes and monocytes [23, 38, 39, 4, 41]. It was shown that leptin stimulates IL 2 and IFN γ production by Th 1 lymphocytes [26, 38] and inhibits IL 4 production by Th 2 lymphocytes [26]. Based on these facts we can say that leptin up regulates inflammatory response during acute inflammation. Our study indicates that leptin did not modulate serum cytokine levels (proinflammatory TNF α and IL 6 and anti-inflammatory IL 1) in response to LPS induced acute inflammation. It is important to say that majority of studies were followed in vitro not in vivo and it is well known that cytokines concentrations are significantly higher in tissues than in serum. It is suggested that leptin inhibits the hypothalamic pituitary adrenal axis through reducing corticotrophin releasing hormone CRH mrna production and inhibition of adrenal steroidogenesis (via Ob-R expressed in adrenal gland) [31, 32, 36, 42, 43]. The existence of negative feedback between leptin and HPA is suggested and the consequence of this fact may be inverse circadian rhythm of these hormones [37]. However it should be noticed that leptin can stimulate corticosterone secretion in dispersed rat adrenocortical cells and glucocorticoids stimulate leptin s secretion [21, 32, 33]. The leptin s influence on pituitary thyroid axis is not elucidated. Thyroid hormones likewise leptin increase energy expediture and thermogenesis. These effects can be mediated through three types β receptors which are connected with mitochondrial uncoupled protein. It is also suggested that leptin modulates the hypothalamic pituitary thyroid axis by up regulation of TRH (especially pro TRH mrna in paraventricular nuclei) [21, 32, 33, 44]. In our study we demonstrated that leptin inhibited serum corticosterone concentration after 2 h and increased serum TSH concentration after 4 h, but did not affect thyroid hormones. 77

20 Wpływ VIP i leptyny na ostre zapalenie Bik W. Our study showed that leptin enhanced LPS induced increase of corticosterone secretion. We did not observe leptin s influence on pituitary thyroid axis during acute inflammation. We did not observe changing of serum cytokines concentrations and based on this fact we think that leptin can modulate the endocrine response during acute inflammation through other mechanisms. VIP is an important immunomodulatory peptide. Its biological and immunological actions are mediated via specific receptors (VPAC 1 and VPAC 2 bind VIP and PACAP but third type of receptor PAC 1 selectively binds PACAP) [8, 45]. The immune cells such as lymphocytes and thymocytes can produce VIP [3,7] VIP inhibits the production and secretion of many proinflammatory agents (TNF α, IL 6, IL 12, NO, INF γ) and can stimulate the production of the antiinflammatory cytokines such as IL 1 [13, 15, 16, 17, 46] during acute inflammation. These effects are mediated first of all through VPAC 1 receptor [2]. In our study VIP significantly decreased (p<.1) serum IL 6 levels in response to LPS induced inflammation, but there was no significant differences in TNF α levels between both group (LPS vs LPS and VIP). VIP also did not change serum IL 1 levels between groups receiving LPS to LPS and VIP. These results could be concerned with the fact that immunomodulatory effect of VIP is dose dependent and in our experiment the dose of VIP is recognized as average. The hypothalamic pituitary adrenal axis is the most important part of the endocrine system which is activated during acute inflammation. The acute inflammations increase productions of many proinflammatory cytokines (such as IL 1, IL 6, TNFα) which stimulate hypothalamic pituitary adrenal axis [5, 47]. These cytokines stimulate CRH and ACTH secretions and directly adrenal corticosterone secretion Glucocorticoids also take part an important role in regulation antiinflammatory response because of their immunosupresive actions [5, 47]. VIP stimulates not only hypothalamus pituitary axis but also stimulates directly glucocorticoids secretion via paracrine and autocrine mechanisms [34, 35]. The interactions between pituitary thyroid axis and VIP are very controversial in in vivo and in vitro studies [48, 49]. Figure 4 Serum T 3 concentration after 4 h nmol / l 1,2 1,8,6,4,2 LPS vs LPS+VIP p<.5 LPS vs LPS+Leptin ns LPS (I) LPS +VIP LPS (II) LPS + leptin X (nmol/l) N SEM Figure 5 Serum T 4 concentration after 4 h nmol / l LPS vs LPS+VIP p<.5 LPS vs LPS+Leptin ns LPS (I) LPS +VIP LPS (II) LPS + leptin X (nmol/l) N SEM The increasing of proinflammatory cytokines such as IL 1, IL 6 and TNF α during acute inflammation inhibits hypothalamic pituitary thyroid axis [27, 47]. These cytokines inhibit TSH and thyroid hormones secretions. In our study VIP inhibited T3 secretion after 2 hours and stimulated corticosterone secretions after 4 hours in basal conditions (VIP vs placebo). Our data showed that VIP decreased LPS induced increase of corticosterone secretion. Inhibitory effect of VIP on LPS induced corticosterone secretion is probably concerned with VIP dependent decreasing of proinflammatory cytokine. These results also demonstrated that VIP enhanced the inhibiting role of LPS in thyroid 78