Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Volume 47 Number Praca oryginalna Original Article Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej Identification of microorganisms comparision of biochemical and mass spectrometry method Justyna Azarko, Urszula Wendt Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o. Streszczenie Celem pracy było porównanie dwóch metod identyfikacji drobnoustrojów biochemicznej oraz spektrometrii masowej opartej na analizie profili białek wewnątrzkomórkowych charakterystycznych dla poszczególnych rodzajów i gatunków drobnoustrojów. Metodą biochemiczną (Vitek, Api) i metodą spektrometrii masowej poddano identyfikacji łącznie 8 szczepów drobnoustrojów wyizolowanych z różnych próbek materiałów biologicznych pochodzących od pacjentów. Obydwiema metodami do poziomu gatunku zgodnie zidentyfikowano 59 (88%) szczepów, zaś do poziomu rodzaju 76 (97%) szczepów. Wysoką zgodność wyników identyfikacji bakterii metodą biochemiczną i spektrometrii masowej stwierdzono w szczególności dla gronkowców, pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae i pałeczek niefermentujących. Różnice w identyfikacji stwierdzono dla bakterii należących do paciorkowców zieleniejących. Dodatkowo, metodą spektrometrii masowej przebadano szczepy wzorcowe pochodzące z kolekcji ATCC, uzyskując poprawną identyfikację do gatunku dla (94%) szczepów. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką zgodność metody biochemicznej i spektrometrii masowej w identyfikacji drobnoustrojów. Summary The purpose of the study was the comparison of two methods of identification of microorganisms biochemical method and mass spectrometry which is based on analysis of intracellular proteins profile characteristic for particular genus and species. The identification of 8 clinical isolates from various biological materials from patients was performed by biochemical method (Vitek, Api) and mass spektrometry. The number of 59 (88%) of clinical strains were identified to species level with the same results by both methods, whereas 76 (97%) of them were accordingly identified to genus level. High accordance of identification results obtained with biochemical and mass spectrometry methods was characteristic for staphylococci, Enterobactericeae rods and non-fermenting gram-negative rods. Discrepancies in identification of microorganisms were observed for streptococci viridans. Additionally, overall (94%) of the ATCC reference strains tested were correctly identified to species level by mass spectrometry method. Most of the identification results described in the study indicate high accordance of biochemical and mass spectrometry methods in identification of microorganisms. Słowa kluczowe: identyfikacja drobnoustrojów, spektrometria masowa, białka rybosomalne, biochemiczna metoda identyfikacji drobnoustrojów Key words: identification of microorganisms, mass spectrometry, ribosomal proteins, biochemical method of identification of microorganisms Wstęp Jednym z zasadniczych etapów klasycznego badania mikrobiologicznego jest identyfikacja wyhodowanego drobnoustroju. Wydaje się, że skrócenie czasu trwania tego właśnie etapu badania, może wpłynąć na istotne skrócenie czasu trwania całego badania i jak najszybsze wydanie wyniku. Klasyczne metody identyfikacji drobnoustrojów, powszechnie stosowane w rutynowych laboratoriach mikrobiologicznych, to metody oparte na badaniu i analizie zestawu właściwości biochemicznych drobnoustrojów oraz metody oparte na reakcji antygen-przeciwciało. W ciągu ostatnich lat obserwuje się coraz większą automatyzację metod identyfikacji opartych na badaniu cech biochemicznych drobnoustrojów, zaś doskonalenie metod serologicznych i lateksowych, powoduje znaczne zwiększenie różnorodności szybkich testów identyfikacyjnych. Mimo to, czas oczekiwania na wynik identyfikacji w dalszym ciągu jest dość długi i w zależności od metody, a także systemu analitycznego, waha się od

2 Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej godzin dla metod zautomatyzowanych do ok. 4 godzin dla metod półautomatycznych. Skrócenie czasu niezbędnego dla zidentyfikowania drobnoustroju jest możliwe poprzez wykorzystywanie coraz doskonalszych możliwości technologicznych dostępnych w rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej. Taką nową metodą służącą do bardzo szybkiej i poprawnej identyfikacji drobnoustrojów, zarówno bakterii jak i drożdżaków, jest metoda spektrometrii masowej []. Technologia wykorzystująca tę metodę to MALDI TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry). Metoda ta oparta jest na analizie unikatowego, niepowtarzalnego profilu białkowego drobnoustroju, określanego jako molekularny odcisk palca [7, ]. W metodzie tej, czysta kultura drobnoustroju nanoszona jest w postaci cienkiej warstwy na specjalną płytkę ze stali nierdzewnej (target plate). Następnie, na warstwę drobnoustroju nakładany jest roztwór tzw. matrycy (matrix), składający się z kwasu α-cjano-4 hydroksy-cynamonowego rozpuszczonego w organicznym rozpuszczalniku. Matryca służy jako środowisko do ekstrakcji i krystalizacji białek bakteryjnych, głównie rybosomalnych, które w komórkach drobnoustroju występują w największej ilości i podobnej liczbie kopii [9]. Podczas odparowywania rozpuszczalnika, procesowi krystalizacji ulegają zarówno białka bakteryjne, jak i matryca. Tak przygotowana próbka, poddawana jest pulsacyjnemu bombardowaniu promieniami lasera. Podczas tego procesu kryształy matrycy absorbują fotony o wysokiej energii i określonej długości fali, co powoduje desorpcję i jonizację cząsteczek matrycy oraz desorpcję cząsteczek białek. W wysokiej próżni, protony matrycy zderzają się z obojętnymi cząsteczkami białek przekazując im ładunek dodatni, przez co cząsteczki białek i peptydów ulegają jonizacji [5, ]. Dodatnie jony matrycy i białek przyspieszane są w polu elektrostatycznym i przemieszczają się w kierunku elektrody, której specjalna konstrukcja umożliwia przejście przez elektrodę i dalszą migrację cząsteczek. Szybkość przechodzenia pojedynczych jonów przez elektrodę jest odwrotnie proporcjonalna do ich masy i ładunku. Po przejściu przez elektrodę, jony migrują w kierunku detektora, swobodnie przemieszczając się przez region, w którym nie działa już pole elektrostatyczne (drift region). Różnice w masie cząsteczkowej oraz wielkości ładunku powodują, że każda cząsteczka ma inny czas dotarcia do detektora, tzw. czas przelotu [5, ]. Detektor rejestruje czas przelotu jonów i automatycznie generuje widmo pików odpowiadające jonom białkowym i peptydowym o różnym stosunku masy cząsteczkowej do ładunku. Następnie, uzyskane widmo białek szczepu badanego jest porównywane z widmami wzorcowymi drobnoustrojów, po czym automatycznie zostaje mu przypisana identyfikacja drobnoustroju. Celem niniejszej pracy było porównanie dwóch metod identyfikacji drobnoustrojów - biochemicznej i spektrometrii masowej. Badania przeprowadzono w pracowni mikrobiologii Medycznego Laboratorium Diagnostycznego BRUSS w Gdyni. Materiał i metody Kultury bakteryjne W badaniach wykorzystano 8 szczepów wyizolowanych z różnych materiałów biologicznych, wśród których znalazły się między innymi mocz, kał, płyny ustrojowe, tkanki, wymazy i inne. Poszczególne rodzaje materiałów biologicznych poddane badaniu i ich liczebność przedstawiono w tabeli I. Do badań użyto szczepy izolowane z materiałów biologicznych poddanych rutynowym badaniom mikrobiologicznym w okresie od maja do lipca roku. Dodatkowo, metodą spektrometrii masowej, przebadano szczepy wzorcowe bakterii i grzybów z kolekcji ATCC, którymi dysponuje laboratorium. Identyfikacja drobnoustrojów metodą biochemiczną Biochemiczną identyfikację drobnoustrojów przeprowadzano przy użyciu półautomatycznego systemu Api (ATB Expression, biomerieux) oraz zautomatyzowanego systemu Vitek Compact (biomerieux). Badania identyfikacji wykonywano zgodnie z instrukcjami wytwórcy obu systemów, wykorzystując odpowiednie paski (Api E, Api NH) oraz karty do identyfikacji bakterii (GP, GN, NH, ANC). W wybranych przypadkach, w celu wyjaśnienia istotnych różnic w identyfikacji drobnoustrojów pomiędzy obiema metodami, zastosowano niektóre z rekomendowanych testów takich jak, test z optochiną (biomerieux) i test na wytwarzanie oksydazy (biomerieux). Identyfikacja drobnoustrojów metodą spektrometrii masowej W celu wykonania badania, niewielką ilość czystej kolonii drobnoustroju pochodzącej z 8-4 godzinnej hodowli, na- Tabela I. Materiały biologiczne, z których izolowano szczepy do identyfikacji metodami biochemiczną i spektrometrii masowej. Rodzaj materiału Liczba próbek danego materiału biologicznego krew płyn mózgowo-rdzeniowy mocz 7 płyn z jamy otrzewnej 4 płyn z jamy opłucnej wydzielina z drzewa oskrzelowego 7 ropa 8 tkanka wymaz z rany wymaz z odleżyny 4 wymaz z owrzodzenia 5 wymaz ze skóry wymaz z ucha wymaz z nosa wymaz z odbytu kał 9 końcówka cewnika 5 dren rurka tracheostomijna SUMA 78 4

3 J. Azarko i U. Wendt noszono w postaci cienkiego biofilmu na metalową płytkę (target plate) i pozostawiano w temperaturze pokojowej do wyschnięcia. Następnie, na warstwę bakterii nakładano po μl roztworu matrycy, czyli nasyconego roztworu HCCA (mg HCCA/ml) rozpuszczonego w organicznym rozpuszczalniku o składzie 5% acetonitril,,5% TFA i ponownie pozostawiano do wyschnięcia. Wykonanie identyfikacji wzorcowych szczepów drożdżaków z rodzaju Candida sp., poprzedzał dodatkowy etap wstępnej ekstrakcji białek z użyciem etanolu i kwasu mrówkowego. W tym celu, pojedynczą kolonię świeżej 8-4 godzinnej hodowli zawieszano w, ml wody dejonizowanej, po czym dodawano,9 ml czystego etanolu i dokładnie mieszano. Następnie, próbkę wirowano przez minuty przy obrotach 4 rpm/min. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie dodawano,9ml czystego etanolu i wirowano. Do uzyskanego osadu dodawano kolejno 5 μl kwasu mrówkowego i 5 μl acetonitrilu, po czym dokładnie mieszano. Po odwirowaniu (4 rpm/min. przez minuty) pobierano μl supernatantu, który nakładano na metalową płytkę i pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie, nakładano po μl roztworu matrycy i pozostawiano do wyschnięcia. Metalową płytkę z nałożonymi próbkami umieszczano w komorze aparatu MALDI Biotyper i poddawano analizie. Automatyczny pomiar widma i jego analiza porównawcza z widmami wzorcowymi drobnoustrojów były wykonane przez spektrometr masowy Microflex LT w połączeniu z programem MALDI-Biotyper. (Bruker Daltonik, Niemcy). Prawdopodobieństwo poprawnej identyfikacji w systemie MALDI Biotyper wyrażane było w postaci wskaźnika punktowego. I tak, wartość wskaźnika w zakresie:, -, wskazywała na wiarygodną identyfikację drobnoustroju do poziomu gatunku,, -,99 wskazywała na wiarygodną identyfikację Tabela II. Wyniki identyfikacji szczepów referencyjnych z kolekcji ATCC uzyskane metodą spektrometrii masowej Wyniki identyfikacji do gatunku Szczep wzorcowy Nr kolekcji ATCC Liczba zbadanych szczepów Liczba szczepów poprawnie zidentyfikowanych Liczba szczepów niepoprawnie zidentyfikowanych Bakterie gram-ujemne Acinetobacter baumannii Bacteroides fragilis Campylobacter jejuni Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Neisseria gonorrhoeae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Shigella sonnei ATCC BAA-747 ATCC 585 ATCC BAA-5 ATCC 7 ATCC 58, ATCC 59 ATCC 4947, ATCC 97 ATCC 76 ATCC 74 ATCC 944 ATCC 68 ATCC 785 ATCC 76 ATCC 59 Bakterie gram-dodatnie Clostridium perfringens Corynebacterium striatum Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus Streptococcus equi Streptococcus pneumoniae ATCC 4 ATCC 9 ATCC 77 ATCC 9, ATCC 599 ATCC 59, ATCC 59, ATCC 9, ATCC BAA- 977, ATCC BAA- 976 ATCC BAA-75 ATCC 479 ATCC Drożdżaki Candida glabrata Candida krusei Candida lusitaniae Candida parapsilosis ATCC 95 ATCC 658 ATCC 4449 ATCC 9 SUMA 4

4 Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej drobnoustroju do poziomu rodzaju oraz prawdopodobny wynik identyfikacji do poziomu gatunku,,7 -,999 wskazywała na prawdopodobny wynik identyfikacji do poziomu rodzaju. Wartość wskaźnika w zakresie od zera do,699 oceniana była jako niewiarygodny wynik identyfikacji. W celu wykonania badań identyfikacji drobnoustrojów metodą spektrometrii masowej użyto następujących odczynników: alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA, Bruker Daltonik), 99% kwas tri-fluoro-octowy (TFA, Sigma Aldrich), alkohol etylowy 99,8% czda (Chempur/Alchem). Acetonitryl (AN) oraz kwas mrówkowy 7% pochodziły z firmy Fluka Analytical. Wyniki Porównanie wyników identyfikacji szczepów klinicznych metodą biochemiczną i metodą spektrometrii masowej Wyniki identyfikacji uzyskane metodą spektrometrii masowej porównywano do wyników identyfikacji uzyskanych metodą biochemiczną. Analizowano liczbę szczepów o jednakowej identyfikacji gatunkowej lub jednakowej identyfikacji do poziomu rodzaju. Zgodność identyfikacji wyrażano jako liczbę szczepów o jednakowej identyfikacji uzyskanej metodą spektrometrii masowej w porównaniu do metody biochemicznej. Stopień zgodność identyfikacji pomiędzy obiema metodami wyrażano w procentach przyjmując całkowitą liczbę badanych szczepów jako %. Metodą biochemiczną i metodą spektrometrii masowej, poddano identyfikacji łącznie 8 szczepów izolowanych z materiałów biologicznych pobranych od pacjentów. Wyniki identyfikacji szczepów klinicznych do gatunku metodą biochemiczną i metodą spektrometrii masowej przedstawiono w Tabeli III. Stopień zgodności obu metod w identyfikacji głównych grup drobnoustrojów o znaczeniu klinicznym do poziomu rodzajów i gatunków przedstawia tabela IV. Obydwiema metodami zgodnie zidentyfikowano do gatunku 59 szczepów, do rodzaju - 76 szczepów, co stanowiło odpowiednio - 88% i 97% wszystkich 8 przebadanych szczepów pochodzących z materiałów biologicznych od pacjentów. Dla 9 spośród 4 szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, uzyskano zgodną identyfikację obu metod do poziomu gatunku. Całkowitą zgodność obu metod w identyfikacji do gatunku stwierdzono dla szczepów Escherichia coli. Wysoką zgodność identyfikacji stwierdzono też w grupie Proteae, obejmującej rodzaje Proteus, Morganella, Providencia. W grupie tej, tylko w jednym przypadku stwierdzono niezgodność identyfikacji - metodą biochemiczną (Vitek ) z prawdopodobieństwem 9 % uzyskano wynik identyfikacji drobnoustroju do grupy Shigella, podczas gdy metodą spektrometrii masowej, drobnoustrój ten został zidentyfikowany jako Morganella morganii (wskaźnik identyfikacji,65). W obrębie grupy KESC, całkowitą zgodność identyfikacji do gatunku stwierdzono dla bakterii z rodzaju Serratia. Spośród 6 szczepów z rodzaju Klebsiella sp., szczepy zostały jednakowo zidentyfikowane obiema metodami. Pozostałe 4 szczepy, metodą biochemiczną zostały zidentyfikowane jako Klebsiella pneumoniae ( szczepy, prawdopodobieństwo odpowiednio 97%, 99%, Vitek ), Raoultella planticola ( szczep, prawdopodobieństwo 95%, Vitek ) oraz Raoultella spp./klebsiella oxytoca ( szczep, prawdopodobieństwo odpowiednio 5,4% i 5,%, ATB Expression). Metodą spektrometrii masowej szczepy te zostały zidentyfikowane jako Klebsiella oxytoca (wskaźniki identyfikacji,4;,45;,76;,6). Spośród 4 szczepów z rodzaju Enterobacter sp., identyfikację zgodną do poziomu gatunku stwierdzono dla szczepów. Metodą biochemiczną, jeden ze szczepów został zidentyfikowany jako Enterobacter sakazakii (prawdopodobieństwo 88,%, ATB Expression), podczas gdy metodą spektrometrii masowej został on zidentyfikowany jako (wskaźnik identyfikacji,79). Pozostałe szczepy, metodą biochemiczną (Vitek ), zostały zidentyfikowane jako (prawdopodobieństwo 99%, 96%, 9%) podczas gdy, metodą spektrometrii zostały zidentyfikowane odpowiednio jako E. kobei/e. asburiae (wskaźniki identyfikacji,88/,58), E. kobei/e. cloacae (wskaźniki identyfikacji,5/,) oraz E. asburiae/e. cloacae (wskaźniki identyfikacji,7 i,69). W przypadku rodzaju Citrobacter Sp., na 7 przebadanych szczepów, zgodną identyfikację gatunkową uzyskano dla 5 szczepów. Spośród pozostałych dwóch szczepów, metodą biochemiczną, jeden szczep został zidentyfikowany jako Citrobacter freundii (prawdopodobieństwo 9%, Vitek ), a metodą spektrometrii masowej jako C. murliniae (wskaźnik identyfikacji,78). Drugi szczep, metodą biochemiczną został zidentyfikowany jako C. farmeri (prawdopodobieństwo 99%, Vitek ), zaś metodą spektrometrii jako C.braakii (wskaźniki identyfikacji,48). Przebadano również szczepy z rodzaju Salmonella sp., z których zgodną identyfikację obiema metodami, uzyskało 8 szczepów. W przypadku 4 pozostałych szczepów, które metodą biochemiczną zostały zidentyfikowane do gatunku jako Salmonella enterica, metodą spektrometrii uzyskano identyfikację jedynie do rodzaju jako Salmonella sp. Spośród 4 przebadanych szczepów z grupy pałeczek niefermentujących, zgodność obu metod identyfikacji do gatunku stwierdzono dla szczepów (9%). Jednakową identyfikację stwierdzono dla wszystkich szczepów z gatunku Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia i szczepów z rodzaju Acinetobacter sp. Jeden szczep, który metodą spektrometrii został zidentyfikowany jako Acinetobacter lwoffii (wskaźnik identyfikacji,5), przypadku metody biochemicznej (Vitek ) został zidentyfikowany jako Pseudomonas stutzeri (prawdopodobieństwo 89%). Szczep ten okazał się szczepem oksydazo ujemnym, co wskazuje na poprawność identyfikacji uzyskanej metodą spektrometrii. W przypadku jednego szczepu z rodzaju Aeromonas 4

5 J. Azarko i U. Wendt Tabela III. Porównanie wyników identyfikacji szczepów klinicznych wykonanych metodą biochemiczną i spektrometrii masowej (MALDI TOF MS) Identyfikacja biochemiczna Aeromonas veronii Identyfikacja MALDI TOF MS Aeromonas culicicola Liczba zbadanych szczepów Wyniki identyfikacji do gatunku Liczba szczepów o zgodnej identyfikacji Liczba szczepów o niezgodnej identyfikacji Acinetobacter baumannii Acinetobacter haemolyticus Pseudomonas stutzeri Acinetobacter radioresistensis Acinetobacter baumannii Acinetobacter haemolyticus Acinetobacter lwoffii Acinetobacter radioresistensis 4 Citrobacter braakii Citrobacter farmeri Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter freundii Citrobacter braakii Citrobacter braakii Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter murliniae 7 Corynebacterium minutisimum /diphteriae Corynebacterium striatum Corynebacterium afermentans Corynebacterium striatum Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes Enterobacter kobei/e.asburiae Enterobacter kobei/e.cloacae Enterobacter asburiae/e.cloacae Enterobacter sakazakii Enterococcus avium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Streptococcus uberis Enterococcus avium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium 5 Escherichia coli Escherichia coli 8 8 Klebsiella oxytoca Raoultella sp./k.oxytoca Raoultella planticola Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumonia Klebsiella oxytoca 4 Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Morganella morganii Shigella group Morganella morganii 9 8 Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Proteus mirabilis Providencia rettgeri Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Providencia rettgeri Pseudomonas aeruginosa 6 6 Salmonella sp. Salmonella enterica Salmonella sp. 8 4 Serratia liquefaciens Serratia marcescens Serratia liquefaciens Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 4 4 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus 5 Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus pluranimalium/ Kocuria rosea Gemella morbillorum Streptococcus oralis Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus anginosus/ Streptococcus intermedium Streptococcus cristatus/ sinensis Streptococcus pneumoniae 6 Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica SUMA

6 Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej sp. niezgodność identyfikacji dotyczyła gatunku metodą biochemiczną uzyskano identyfikację A.veronii (prawdopodobieństwo 99%), podczas gdy metodą spektrometrii masowej, szczep ten został zidentyfikowany jako A. culicicola (wskaźnik identyfikacji,6). W przypadku gronkowców, zarówno Staphylococcus aureus, jak i szczepów Staphylococcus sp. koagulazo-ujemnych, stwierdzono % zgodność identyfikacji gatunkowej dla obu metod. Z 5 przebadanych szczepów należących do enterokoków, 4 szczepy (8%) zostały zgodnie zidentyfikowane do rodzaju i gatunku. Jeden szczep metodą biochemiczną został zidentyfikowany jako Streptococcus uberis (prawdopodobieństwo 97%, Vitek ), podczas gdy, metodą spektrometrii maswej - jako Enterococcus faecium (wskaźnik identyfikacji,48). Jedynie 5% zgodność identyfikacji pomiędzy obydwiema metodami zaobserwowano w grupie paciorkowców, z której przebadano 6 szczepów. Dla szczepów ( szczep Streptococcus agalactiae i szczepy S. anginosus) uzyskano zgodną identyfikację do gatunku, za każdym razem uzyskując wysokie, ponad 95% prawdopodobieństwo dla metody biochemicznej, i punktację przekraczającą, punkty w metodzie spektrometrii masowej. Pozostałe dwa szczepy metodą biochemiczną zostały zidentyfikowane jako Streptococcus oralis i Gemella morbillorum (prawdopodobieństwo odpowiednio 99% i 95%, Vitek ), podczas gdy metodą spektrometrii uzyskały identyfikację jako odpowiednio Streptococcus pneumoniae (wskaźnik identyfikacji,85) oraz S.cristatus/S. sinensis (wskaźniki identyfikacji,894 /,8). Natomiast, w przypadku jednego szczepu obiema metodami otrzymano różne wyniki identyfikacji o niskim poziomie prawdopodobieństwa. Metodą biochemiczną (Vitek ) uzyskane wyniki identyfikacji to Streptococcus pluranimalium i Kocuria rosea (w obu przypadkach prawdopodobieństwo wyniosło 5%), zaś metodą spektrometrii - Streptococcus anginosus (wskaźnik identyfikacji,74) i S. intermedius (wskaźnik identyfikacji,85). Wyniki identyfikacji szczepów referencyjne metodą spektrometrii masowej W celu potwierdzenia poprawności identyfikacji drobnoustrojów metodą spektrometrii masowej, badanu poddano szczepy macierzyste (referencyjne) pochodzące z kolekcji ATCC. Spośród przebadanych szczepów bakterii i drożdżaków, szczepów (94%) zostało prawidłowo zidentyfikowanych do poziomu gatunku (Tabela II). Szczep Salmonella enterica ATCC 76, został poprawnie zidentyfikowany do poziomu rodzaju jako Salmonella sp. Natomiast, szczep Shigella sonnei ATCC 59 został zidentyfikowany jako Escherichia coli. Uzyskane metodą spektrometrii masowej, wyniki identyfikacji szczepów referencyjnych, są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami []. Dyskusja i wnioski Wyniki przedstawione w niniejszej pracy wskazują na wysoką zgodność identyfikacji drobnoustrojów przy użyciu metody biochemicznej i metody spektrometrii masowej (MALDI TOF MS). Chociaż przebadano jedynie 8 szczepów izolowanych z materiałów biologicznych pochodzących od pacjentów, uzyskując 88% zgodność identyfikacji do poziomu gatunku oraz 97% zgodność do poziomu rodzaju, to jednak wyniki te są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami przeprowadzonymi na znacznie większej liczbie szczepów klinicznych []. Dlatego też, w Tabeli IV przedstawiono wyniki uzyskane nawet dla tych grup drobnoustrojów, które reprezentowane były przez niewielką liczbę badanych szczepów klinicznych. Zgodność identyfikacji gronkowców zarówno Staphylococcus aureus oraz pozostałych przebadanych gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych (CNS) wyniosła %. Jest to istotna obserwacja, gdyż jak stwierdzono, metody identyfikacji oparte na analizie cech biochemicznych, w przypadku gronkowców, mogą mieć ograniczoną zdolność rozróżniania gatunków w obrębie grupy CNS [6]. Jest to też cenna obserwacja, gdyż metoda spektrometrii masowej wykorzystując analizę składu białek gatunkowo charakterystycznych, umożliwia identyfikację nie tylko gatunków, ale Tabela IV. Stopień zgodności wyników identyfikacji szczepów klinicznych do gatunku i rodzaju uzyskanych metodą biochemiczną i spektrometrii masowej Stopień zgodności identyfikacji Grupa mikroorganizmów Liczba zbadanych Do gatunku Do rodzaju szczepów Liczba zgodnych Stopień zgodności Liczba zgodnych Stopień zgodności identyfikacji (%) identyfikacji identyfikacji (%) identyfikacji Enterobacteriaceae Pałeczki niefermentujące Gronkowce Gram-ujemne ziarniaki Enterokoki Paciorkowce Maczugowce 5 SUMA

7 J. Azarko i U. Wendt nawet podgatunków należących do rodziny Micrococcaceae [6]. Wysoką zgodność identyfikacji między obiema metodami stwierdzono również w przypadku enterokoków. Chociaż przebadano tylko 5 szczepów enterokoków, uzyskując 8% zgodność identyfikacji, to jednak dane literaturowe dla znacznie większej liczby enterokoków, wskazują, że jest ona znacznie wyższa [, 6]. Podobnie, wysoką zgodność obu metod identyfikacji, stwierdzono dla bakterii należących do paciorkowców beta-hemolizujących [6]. Istotne różnice stwierdzono natomiast w identyfikacji bakterii należących do paciorkowców zieleniejących, co w szczególności, dotyczyło rozróżnienia pomiędzy Streptococcus oralis i Streptococcus pneumoniae. Szczep określony metodą biochemiczną jako Streptococcus oralis uzyskał wysoki, sięgający 99% poziom prawdopodobieństwa identyfikacji, co znalazło swoje potwierdzenie w teście oporności Streptococcus oralis na optochinę. Metodą spektrometrii masowej, szczep ten uzyskał identyfikacją jako Streptococcus pneumoniae przy stosunkowo niskim wskaźniku identyfikacji równym,85, co wskazuje na prawdopodobną identyfikację badanego szczepu jedynie do rodzaju. Prawidłowa identyfikacja szczepu wzorcowego Streptococcus pneumoniae ATCC 4969 metodą spektrometrii masowej, w tym przypadku wskazuje jedynie na sprawne działanie systemu MALDI Biotyper, ale nie umożliwia wyjaśnienia stwierdzonej niezgodności identyfikacji szczepu klinicznego. Jednak, także metody biochemiczne nie zawsze umożliwiają poprawną identyfikację gatunkową paciorkowców zieleniejących, bakterii o wyjątkowej heterogenności, wśród których wyodrębniono ponad gatunków podzielonych na 5 grup - mutans, salivarius, anginosus, mitis, bovis [, 4]. W przypadku obu porównywanych metod, biochemicznej i spektrometrii masowej, nieprawidłowa identyfikacja gatunków należących do paciorkowców zieleniejących może wynikać z wysokiego stopnia ich pokrewieństwa filogenetycznego. Wskazuje na to sięgająca aż 99% homologia sekwencji nukleotydowych genów 6S rdna, kodujących białka rybosomalne takich gatunków jak Streptococcus mitis, S. oralis, S. pseudopneumoniae i S. pneumoniae [, 8, ]. Z tego powodu, nawet metody sekwencjonowania 6S rdna nie zawsze są skuteczne w prawidłowej identyfikacji tych drobnoustrojów, co w szczególności zaobserwowano dla gatunków paciorkowców należących do grupy mitis []. W przypadku pneumokoków, dodatkowym czynnikiem, mogącym wpływać na poprawność identyfikacji metodą spektrometrii masowej może być występowanie form atypowych, które mimo, że genetycznie i fenotypowo przypominają S. mitis, mogą posiadać geny kodujące białkowe czynniki wirulencji, takie jak autolizyny i pneumolizyny charakterystyczne dla S. pneumoniae. Co więcej, paciorkowce zieleniejące posiadają także wyjątkową zdolność naturalnej transformacji związaną ze zdolnością pobierania DNA ze środowiska [, 8]. Może to skutkować zmianami profilu białkowego, na tyle istotnymi, że uniemożliwiają one porównanie profilu szczepu badanego z profilem szczepu wzorcowego, co w konsekwencji wpływa na obniżenie prawdopodobieństwa prawidłowej identyfikacji. W przypadku pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, a szczególnie bakterii Escherichia coli, zgodność identyfikacji wynosiła %. Wszystkie wyizolowane z materiałów biologicznych pacjentów szczepy należące do rodzaju Salmonella sp. oraz szczep wzorcowy Salmonella enterica ATCC 76, metodą spektrometrii masowej, zostały zidentyfikowane jedynie do poziomu rodzaju jako Salmonella sp. Zgodnie z obowiązującą klasyfikacją określenie gatunków w obrębie tego rodzaju oparte jest na różnicach w budowie antygenów somatycznych i rzęskowych. Jest to powodem, dla którego określenie gatunku możliwe jest dzięki zastosowaniu metod serologicznych opartych na reakcji specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko określonym antygenom somatycznym i rzęskowym bakterii. Ponieważ identyfikacja metodą spektrometrii masowej opiera się na analizie wewnątrzkomórkowych białek rybosomalnych, jest to powodem, dla którego metodą MALDI TF MS możliwa jest identyfikacja tych bakterii tylko do rodzaju. Metodą spektrometrii masowej szczep wzorcowy Shigella sonnei ATCC 59 został zidentyfikowany jako Escherichia coli. Wynika to z bardzo bliskiego pokrewieństwa filogenetycznego obu gatunków [], a co za tym idzie, bardzo podobnych profili białkowych [, 8]. Jest to też powód, dla którego w bazie danych analizatora MALDI Biotyper nie umieszczono widma wzorcowego dla rodzaju Shigella. Problemy nieprawidłowej identyfikacji bakterii z rodzaju Shigella sp. zaobserwowano także przypadku metody biochemicznej, dlatego też w laboratoriach medycznych, szczepy Shigella sp. identyfikowane są głównie na podstawie oceny charakterystycznego wzrostu na podłożach selektywnych oraz przy użyciu metod serologicznych [7]. Z pośród bakterii z grupy KESC obejmującej rodzaje Klebsiella, Enterobacter, Serratia i Citrobacter, szczególną uwagę warto zwrócić na rodzaj Klebsiella sp. i Enterobacter sp. W przypadku szczepów z rodzaju Klebsiella sp. stwierdzono niezgodność identyfikacji między metodami biochemiczną oraz spektrometrii masowej. Niezgodność ta dotyczyła głównie prawidłowego rozróżnienia między Klebsiella oxytoca a Klebsiella pneumoniae i rodzajem Raoultella sp. Przyczyną różnic identyfikacji tych drobnoustrojów przy użyciu obu metod, jest wysoki stopień pokrewieństwa, co w konsekwencji skutkuje bardzo podobnymi profilami białkowymi oraz zbliżonymi zestawami cech biochemicznych badanych drobnoustrojów. W tym przypadku możliwość właściwego rozróżnienia pomiędzy gatunkami, a więc możliwość lepszej identyfikacji dają metody molekularne oparte na analizie materiału genetycznego [, 9, 7, 5, 9]. W przypadku trzech szczepów, zidentyfikowanych metodą biochemiczną jako, metodą spektrometrii masowej uzyskano podwójne wyniki identyfikacji z równie wysoką punktacją. Prawdopodobnie wynika to 45

8 Identyfikacja drobnoustrojów porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej z faktu, że bakterie z gatunku E. kobei, E. asburiae i E. cloacae należące do grupy taksonomicznej określanej jako E. cloacae complex group, wykazują bardzo wysoki stopień pokrewieństwa [, 9, ]. Wysoką zgodność wyników identyfikacji bakterii metodą biochemiczną i spektrometrii masowej stwierdzono dla pałeczek niefermentujących z rodzaju Acinetobacter sp. oraz Pseudomonas aeruginosa i Stenotrophomonas maltophilia. Niezgodność identyfikacji stwierdzono dla jednego szczepu oksydazo-ujemnego, zidentyfikowanego metodą MALDI TOF MS jako Acinetobacter lwoffii, a metodą biochemiczną jako Pseudomonas stutzeri. Różnica ta, może wynikać z właściwości biologicznych pałeczek niefermentujących, które charakteryzują się wolniejszym tempem metabolizmu komórkowego [4,, 4]. Co więcej, stwierdzono także, iż pałeczki niefermentujące istotne dla zdrowia człowieka, mają nie tylko wolniejszy metabolizm, ale także mogą utracić swoje cechy fenotypowe, szczególnie podczas przewlekłych infekcji, np. towarzyszących mukowiscydozie. Jest to powodem, dla którego identyfikacja pałeczek niefermentujących metodą biochemiczną może być znacznie utrudniona i nie zawsze prawidłowa [8, 8]. Stwierdzono, natomiast wysoką zgodność identyfikacji tej grupy bakterii, między metodą spektrometrii masowej i metodą referencyjną, tj. sekwencjonowaniem genu 6S rdna 8 oraz uzyskano bardzo dobre wyniki identyfikacji szczepów izolowanych od pacjentów z mukowiscydozą [8]. Prawdopodobnie jest to związane z faktem, iż pomimo utraty lub osłabienia aktywności biochemicznej białek obecnych w komórce bakteryjnej, zmiany te nie wpływają na profil białkowy charakterystyczny dla danego gatunku drobnoustroju. Przedstawione wyniki wskazują, że identyfikacja drobnoustrojów przy użyciu metody spektrometrii masowej (MALDI TOF MS) oparta na analizie widm białek wewnątrzkomórkowych jest porównywalna z metodami opierającymi się na wykrywaniu i analizie właściwości biochemicznych drobnoustrojów powszechnie stosowanymi w laboratoriach medycznych. Wydaje się, że metoda MALDI TOF MS, w niektórych sytuacjach może być bardziej skuteczna od biochemicznej metody identyfikacji, czego przykładem są grupy bakterii o niskiej aktywności biochemicznej, takie jak pałeczki niefermentujące, które są trudne do identyfikacji stosowanymi metodami biochemicznymi. Szereg publikacji wskazuje także, iż metoda spektrometrii masowej prawdopodobnie będzie miała coraz większe zastosowanie do identyfikacji szerokiego spektrum mikroorganizmów takich jak gronkowce [6], paciorkowce beta-hemolizujące [,, 6], pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae [], pałeczki niefermentujące [8], pałeczki z rodzaju Haemophilus sp, [7], Campylobacter sp. (5), Listeria sp. [], beztlenowce [, 6], prątki Mycobacterium sp. [4], zarodniki Bacillus sp. [5], czy drożdżaki [6, 6]. Przewiduje się także, że w przyszłości metoda spektrometrii masowej (MALDI TOF MS) będzie wykorzystywana do szybkiego rozróżniania szczepów S. aureus metycylino-opornych (MRSA) od S. aureus metycylino-wrażliwych (MSSA) w oparciu o analizę widma z pikami białkowymi swoistymi dla szczepów MRSA []. Niewątpliwą zaletą metody spektrometrii masowej jest bardzo krótki czas wykonania badania i możliwość szybkiego uzyskania wyniku badania identyfikacji drobnoustrojów. W przypadkach stanu zagrożenia życia pacjenta, np. w posocznicach, zakażeniach krwi, układu nerwowego itp., szybko uzyskana informacja o patogenie, umożliwia niezwłoczne przekazanie lekarzowi informacji o wyhodowanym drobnoustroju i podjęcie przez niego decyzji terapeutycznych odnośnie włączenia stosownej terapii empirycznej. Piśmiennictwo. Aitken A. Identification of proteins by MALDI-TOF MS, p.9-4. In J.M.Walker (ed.),the proteomics protocols handbook, Humana Press Inc.,Totowa, NC, 5.. Barbuddhe SB, Naier T, Schwarz G i wsp. Rapid identification and typing of Listeria species by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology 8; 74: Bizzini A, Durussel C, Bille J i wsp. Performance of matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol ; 48: Bosshard PP, Abels S, Altwegg M i wsp. Comparison of conventional and molecular methods for identification of aerobic catalase-negative gram-positive cocci in the clinical laboratory. J Clin Microbiol 4; 4: Bruker Daltonics. Maldi theory mass spectrometry, 4; p Carbonelle E, Beretti JL, Cottyn S i wsp. Rapid identification of staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 7; 45: Carroll KC, Glanz BD, Borek AP i wsp. Evaluation of the BD Phoenix automated microbiology system for identification and antimicrobial susceptibility testing of Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 6; 44: Degand N, Carbonelle E, Dauphin B i wsp. Matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry for identification of nonfermenting gram-negative bacilli isolated from cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol 8; 46: Drancourt M, Bollet C, Carta A i wsp. Phylogenetic analyses of Klebsiella species delineate Klebsiella and Raoultella gen. nov.,with description of Raoultella terrigena comb.nov.and Raoultella planticola comb.nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology ; 5: Edwards-Jones V, Claydon MA, Evason DJ i wsp. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicilin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry. J Med Microbiol ; 49: Eigner U, Holfelder M, Oberdorfer K i wsp. Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory. Clin Lab 9; 55(7-8): Fox A. Mass spectrometry for species or strains identification after culture or without culture: past, present, and future. J Clin Microbiol 6; 44: Friedrichs C, Rodloff AC, Chhatwal GS i wsp. Rapid identification of viridians streptococci by mass spectrometric discrimination. J Clin Microbiol 7; 45: Funke G, Monnet D, Bernardis C i wsp. Evaluation of the VITEK system for the identification of medically relevant gram-nega- 46

9 J. Azarko i U. Wendt tive rods. J Clin Microbiol 998; 6: Granier SA, leflon-guibout V, Goldstein FW i wsp. Enterobacterial repetitive intergenic consensus R PCR assay for detection of Raoultella sp. Isolates among strains identified as Klebsiella oxytoca in the clinical laboratory. J Clin Microbiol ; 4: Grosse-Herrenthey A, Maier T, Gessler F i wsp. Challenging the problem of clostridial identification with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI- TOF MS). Anaerobe 8; 4: Haag AM, Taylor SN, Johnson KH i wsp. Rapid identification and speciation of Haemophilus bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 998; : Holland RD, Wilkes JG, Raffi F i wsp. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrixassisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry 996; : Hsien S-Y,Tseng C-L, Lee Y-S i wsp. Highly efficient classification and identification of human pathogenic bacteria by MALDI- TOF MS. Molecular and Cellular proteomics 8; 7: Johnson J.R. Shigella and Escherichia coli at the crossroads: Machiavellian masqueraders or taxonomic treachery? J Clin Microbiol ; 49: Joyanes P, Conejo M del C, Martinez LM i wsp. Evaluation of the VITEK system for the identification and susceptibility testing of three species of nonfermenting gram-negative rods frequently isolated from clinical samples. J Clin Microbiol ; 9: Kawamura Y, Hou XG, Sultana F i wsp. Determination of 6S rrna sequences of Streptococcus mitis and Streptococcus gordonii and phylogenetic relationships among members of the genus Streptococcus. Int J Syst Bacteriol 995; 45: Lay J.O.Jr. Maldi-tof mass spectrometry of bacteria. Mass spectrometry reviews ; : Ling TKW, Tam PC, Liu ZK i wsp. Evaluation of VITEK Rapid Identification and susceptibility testing against gram-negative clinical isolates. J Clin Microbiol ; 9: Mandrell RE, Harden LA, Bates A i wsp. Speciation of Campylobacter coli, C.jejuni, C.helveticus, C.lari, C.sputorum, and C.upsaliensis by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology 5; 7: Marklein G, Josten M, Klanke U i wsp. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates. J Clin Microbiol 9; 47: Marvin LF, Roberts MA i wsp. Matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta ; 7: Mellmann A, Cloud J, Maier T i wsp. Evaluation of matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 6S rrna gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J Clin Microbiol 8; 46: Menozzi MG, Eigner U, Covan S i wsp. Two-center collaborative evaluation of performance of the BD Phoenix automated microbiology system for identification and antimicrobial susceptibility testing of gram-negative bacteria. J Clin Microbiol 6; 44: Moura H, Woolfitt AR, Carvalho MG i wsp. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for differentiation of invasive and noninvasive Streptococcus pyogenes isolates. FEMS Immunol Med Microbiol 8; 5: -4.. Nagy E, Maier T, Urban E i wsp. Species identification of clinical isolates of Bacteroides by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Clin Microbiol Infect 9; 5: Paauw A, Caspers MPM, Schuren FHJ i wsp. Genomic Diversity within complex. PLoS ONE. 8; (8): e8.. Palani Kumar M, Vairamani M, Prasada Raju R i wsp. Rapid discrimination between strains of beta haemolytic streptococci by intact cell mass spectrometry. Indian J Med Res 4; 9: Pignone M, Greth KM, Cooper J i wsp. Identification of mycobacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 6; 44: Ryzhov V, Hathout Y, Fenselau C. Rapid characterization of spores of Bacillus cereus group bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology ; 66: Stevenson LG, Drake SK, Murray PR. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry. J Clin Microbiol ; 48: Van Veen SQ, Claas EC, Kuijper EJ. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J Clin Microbiol ; 48: Whatmore AM, Efstratiou A, Pickerill AP i wsp. Genetic relationships between clinical isolates of Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis and Streptococcus mitis: Characterization of atypical pneumococci and organisms allied to S.mitis harboring S.pneumoniae virulence factor-encoding genes. Infect Immun ; 68: Zaakceptowano do publikacji:.. Adres do korespondencji: Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o Gdynia, ul. Powstania Styczniowego 9B Tel. (58) Fax (58) urszula.wendt@lmbruss.pl 47