WARTOŚĆ BADAŃ LABORATORYJNYCH W DIAGNOSTYCE WŁÓKNIENIA WĄTROBY THE VALUE OF LABORATORY TESTS IN THE DIAGNOSIS OF LIVER FIBROSIS

Transkrypt

1 Nowiny Lekarskie 2012, 81, 2, ALEKSANDRA BASZCZUK, LENA KĘSY, ZYGMUNT KOPCZYŃSKI WARTOŚĆ BADAŃ LABORATORYJNYCH W DIAGNOSTYCE WŁÓKNIENIA WĄTROBY THE VALUE OF LABORATORY TESTS IN THE DIAGNOSIS OF LIVER FIBROSIS Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. n. med. Zygmunt Kopczyński Streszczenie W diagnostyce laboratoryjnej włóknienia wątroby wykorzystuje się szereg różnorodnych badań laboratoryjnych, na podstawie których możliwa jest ocena zaburzeń wynikających z postępującego procesu włóknienia. Obecnie złotym standardem w rozpoznawaniu tego schorzenia jest ocena mikroskopowa bioptatu tkanki wątrobowej. Jest to badanie inwazyjne, stąd istnieje możliwość wystąpienia powikłań. Dodatkowo należy uwzględnić inne, niekorzystne czynniki związane z obróbką badanego fragmentu tkanki, które wpływają na ostateczny wynik. Z uwagi na brak nieinwazyjnego testu, który pozwoliłby na jednoznaczne postawienie diagnozy, a dodatkowo umożliwiał późniejsze monitorowanie postępującego procesu włóknienia wątroby i ocenę wdrożonego leczenia, wiele uwagi w badaniach naukowych poświęca się obecnie surowiczym markerom włóknienia. Markery pośrednie pozwalają na ocenę zaburzenia funkcji wątroby, natomiast markery bezpośrednie odzwierciedlają procesy nadmiernego gromadzenia się i degradacji macierzy pozakomórkowej. Poszczególne substancje oznacza się pojedynczo lub łączy się je w panele. Przykładem może być test ELF (Enhanced Liver Fibrosis), którego składowymi są kwas hialuronowy, aminokońcowy propeptyd prokolagenu typu III (PIIINP) oraz inhibitor metaloproteinazy 1 macierzy pozakomórkowej (TIMP-1). Przeprowadzone do tej pory badania naukowe oceniające przydatność tego testu w diagnostyce włóknienia wątroby potwierdzają możliwość wykorzystania go zarówno do rozpoznawania jak i oceny stopnia zaawansowania procesu włóknienia. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie roli badań laboratoryjnych w diagnostyce omawianego schorzenia ze szczególnym uwzględnieniem znaczenia nowych, surowiczych markerów włóknienia wątroby. SŁOWA KLUCZOWE: włóknienie wątroby, serologiczne markery włóknienia, test ELF. Summary The laboratory diagnosis of liver fibrosis uses a number of different laboratory tests, which are helpful in hepatic fibrosis assessment, from which it is possible to assess impairment resulting from a process of progressive fibrosis. Currently, the gold standard in the diagnosis of this disease is liver biopsy. It is an invasive test, which is associated with the occurrence of complications. Additionally, other disadvantageous factors connected with treatment of examined tissue s fragment which have influence on final outcome, should be taken into consideration. Due to the lack of a non-invasive test, which would let to formulate unambiguous diagnose and additionally made possibility for further monitoring of progression in liver fibrosis and evaluation of implemented treatment, a lot of attention in scientific researches is currently paid to serum biomarkers of fibrosis. Indirect markers create possibility for evaluation of liver disfunction, whereas direct markers reflect process of extracellular matrix s excessive gathering and degradation. Individual substances are marked singly or joined in panels. Test ELF (Enhanced Liver Fibrosis) could be an example. It consists of hyaluronic acid, procollagen III amino-terminal peptide (PIIINP) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP-1). The scientific researches that have been conducted so far and which evaluate the utility of this test in liver fibrosis diagnosis, confirm the possibility of taking advantage of this test both to identify and to evaluate the level of advancement in liver fibrosis. The aim of this paper is to present the role of laboratory tests in liver fibrosis diagnosis with particular reference to the importance of new serum biomarkers of fibrosis. KEY WORDS: liver fibrosis, serologic tests of fibrosis, the ELF test. Wprowadzenie Włóknienie wątroby jest procesem chorobowym, który zachodzi wskutek długotrwałego działania czynnika uszkadzającego o różnej etiologii. Istotą tego procesu jest zaburzenie równowagi między syntezą a degradacją składników macierzy pozakomórkowej (ang. extracellular matrix ECM), prowadzące do ich nadmiernego gromadzenia się, a w konsekwencji do przerostu, twardnienia i bliznowacenia tkanek [1, 2]. Dzieje się tak, gdy procesy naprawcze, tj. zastępowanie uszkodzonych hepatocytów zdrowymi i odtwarzanie tkanki łącznej przestają być podatne na mechanizmy je regulujące. Dochodzi wtedy do tworzenia przegród łącznotkankowych, zaburzenia prawidłowej architektury narządu oraz powstawania nieprawidłowych strukturalnie tzw. guzków regeneracyjnych. W ostatnim stadium rozwija się marskość wątroby [2, 3, 4, 5].

2 176 Aleksandra Baszczuk, Lena Kęsy, Zygmunt Kopczyński Najczęściej czynnikiem sprawczym włóknienia miąższu wątroby jest alkoholowa choroba wątroby, wirusowe zapalenie wątroby typu B, D lub C i choroby autoimmunologiczne. Do innych przyczyn zalicza się choroby metaboliczne, takie jak np. hemochromatoza czy choroba Wilsona oraz zaburzenia w drogach żółciowych, uszkadzający wpływ leków i toksyn, niewydolność krążenia i inne. Często jednak, mimo rozwoju diagnostyki, czynniki etiologiczne włóknienia wątroby zostają nieznane [6, 7]. Uważa się, że w patomechanizmie włóknienia wątroby kluczową rolę odgrywają miofibroblasty, które syntetyzują w nadmiarze składniki ECM. W procesie tym udział biorą zarówno miofibroblasty zlokalizowane w wątrobie, jak i powstałe w wyniku transformacji komórek pochodzących z innych tkanek i narządów. Źródłem miofibroblastów mogą być m.in. komórki śródbłonka przekształcane w procesie tzw. przemiany endotelialno-mezenchymalnej (ang. epithelial-mesenchymal transition EMT), fibrocyty krążące we krwi czy komórki pochodzące ze szpiku kostnego [2, 3, 8]. Jednak największy udział przypisuje się komórkom gwiaździstym wątroby (ang. hepatic stellate cells HSC) zlokalizowanym w przestrzeni Dissego [8]. W warunkach fizjologicznych magazynują one witaminę A, syntetyzują desminę, a także posiadają zdolność do fagocytozy [9]. Jest w nich również syntetyzowany kwas hialuronowy (ang. hyaluronic acid HA), glikozaminoglikan, którego degradacja zachodzi z kolei w komórkach zatokowych wątroby. U pacjentów z marskością wątroby obserwowano znaczne podwyższenie stężenia HA we krwi, co świadczy o niszczeniu komórek zatokowych i wskazuje na toczący się proces włóknienia [10]. Pod wpływem działania czynnika uszkadzającego w wątrobie zachodzą procesy, które prowadzą do aktywacji HSC, w wyniku czego komórki te nabywają zdolności do wzmożonej proliferacji, intensywnej produkcji kolagenu oraz nadmiernego odkładania składników ECM. Charakterystyczna jest również utrata przez nie przyjądrowych kropelek zawierających witaminę A, kurczenie się oraz zdolność chemotaksji do uszkodzonych fragmentów tkanki wątrobowej [11]. Za nieprawidłowe namnażanie się komórek gwiaździstych odpowiada szereg molekuł, z których największe znaczenie przypisuje się płytkowemu czynnikowi wzrostu (ang. Platelet-derived growth factor PDGF). Pełni on również rolę czynnika chemotaktycznego, dzięki czemu HSC mogą migrować do miejsc zmienionych chorobowo [9]. W procesie aktywacji HSC wyróżnić można dwie fazy, tj. fazę inicjacji oraz fazę rozwinięcia i podtrzymania aktywacji [12]. W fazie inicjacji dochodzi do stymulacji transformacji HSC przez substancje wydzielane z otaczających je komórek. Uszkadzanie hepatocytów generuje znaczne ilości wolnych rodników tlenowych. Ponadto apoptoza tych komórek wyzwala aktywację HSC na drodze receptorowej. Faza rozwinięcia i podtrzymywania aktywacji wynika z ciągłej stymulacji komórek w celu stałego utrzymania fenotypu aktywowanych komórek gwiaździstych i postępowania procesu włóknienia. Skutkiem tych procesów jest ostatecznie zastępowanie prawidłowego miąższu wątroby przez tkankę łączną [9]. Uważa się, że w patogenezie włóknienia udział biorą też komórki śródbłonka zatok, komórki Kupffera oraz płytki krwi [9]. Wydzielają one m.in. transformujący czynnik wzrostu TGF β1, który jest jedną z ważniejszych cytokin biorących udział w procesie włóknienia wątroby [3]. TGF β1 m.in. uczestniczy w apoptozie hepatocytów, aktywuje komórki zapalne w miejscu uszkodzenia tkanki wątrobowej oraz rekrutuje miofibroblasty z układu krążenia. Poza tym czynnik ten stymuluje przekształcanie innych komórek wątroby do miofibroblastów. Jest również najsilniejszym czynnikiem stymulującym produkcję kolagenu i innych cząstek wchodzących w skład macierzy pozakomórkowej [9]. Niemałe znaczenie w patomechanizmie włóknienia wątroby przypisuje się również metaloproteinazom. Jest to rodzina enzymów proteolitycznych biorących udział w degradacji białek macierzy pozakomórkowej. W warunkach fizjologicznych pozostają one w równowadze ze swoimi tkankowymi inhibitorami (ang. tissue inhibitors of metaloproteinases TIMP) [10]. Ze względu na pełnioną rolę w procesie włóknienia wątroby metaloproteinazy i ich inhibitory pozostają przedmiotem badań pod kątem wykorzystania ich jako ewentualne markery rozpadu nagromadzonej macierzy pozakomórkowej. Do niedawna uważano, że zaawansowany proces włóknienia miąższu wątroby jest nieodwracalny. Obecnie, w świetle najnowszych doniesień naukowych, wiadomo już, że możliwe jest spowolnienie, zahamowanie, a nawet odwrócenie powstałych zmian [1, 10]. Stąd celowe wydaje się poszukiwanie takiego parametru diagnostycznego, który pozwoli w sposób nieinwazyjny monitorować proces włóknienia wątroby, jak również ocenić postępy wdrożonej terapii. Diagnostyka włóknienia wątroby W diagnostyce włóknienia wątroby wykorzystuje się różnorodne badania, zarówno o charakterze inwazyjnym, jak i nieinwazyjnym (Rycina 1). W zastosowaniu są liczne parametry laboratoryjne oceniające stopień wydolności wątroby, badania obrazowe oraz badanie biopsyjne. Coraz więcej uwagi poświęca się również pośrednim i bezpośrednim markerom włóknienia wątroby, w poszukiwaniu których wykorzystuje się także badania proteomu osocza i surowicy [2]. Postawą rozpoznania marskości wątroby i oceny stopnia zaawansowania procesu jej włóknienia jest badanie histopatologiczne wycinka biopsyjnego tkanki wątrobowej. Badanie to uznawane jest obecnie za tzw. złoty standard w diagnostyce tego schorzenia [10, 13]. W analizie mikroskopowej bioptatu wątroby stosowane są różne systemy klasyfikacji. Najczęściej wykorzystuje się 5-stopniową skalę Metavir (Tabela 1), w której ocenie podlega zwłóknienie miąższu wątroby (F0 F4) oraz, oddzielnie, nasilenie aktywności martwiczo-zapalnej (A0-A4) [2].

3 Wartość badań laboratoryjnych w diagnostyce włóknienia wątroby 177 BADANIA OBRAZOWE BIOPSJA WĄTROBY ZŁOTY STANDARD DIAGNOSTYKA WŁÓKNIENIA WĄTROBY MARKERY POŚREDNIE MARKERY BEZPOŚREDNIE PROFILE PROTEOMICZNE Rycina 1. Schemat diagnostyki włóknienia wątroby [11]. Figure 1. The scheme of diagnosis of liver fibrosis [11]. Tabela 1. Skala Metavir [11] Table 1. Metavir score [11] Stopień Rozpoznanie Stopień Rozpoznanie F0 Brak oznak włóknienia A0 Brak aktywności F1 Wrotne i okołowrotne zwłóknienie, brak przegród A1 Łagodna aktywność F2 Wrotne i okołowrotne zwłóknienie, rzadkie przegrody A2 Umiarkowana aktywność F3 Wrotne i okołowrotne zwłóknienie, liczne przegrody A3 Ciężka aktywność F4 Marskość wątroby A4 Bardzo ciężka aktywność Mimo niezwykle dużej wartości diagnostycznej biopsja wątroby posiada wiele ograniczeń. Przede wszystkim ma ona charakter inwazyjny, w związku z czym możliwe jest wystąpienie powikłań, takich jak krwotok wewnętrzny, odma opłucnowa, a nawet zgon. Ponadto wymienić należy m.in. błędy spowodowane pobraniem zbyt małego fragmentu tkanki lub pobraniem materiału z miejsca niezmienionego chorobowo lub zmienionego w niewielkim stopniu, co wynika z faktu, że włóknienie wątroby jest procesem, którego nasilenie miejscowe może być różne. Obróbka pobranej tkanki jest bardzo czasochłonna i kosztowna, a i sama ocena mikroskopowa może nastręczać trudności. Wiąże się to z faktem, że interpretacja tego samego fragmentu tkanki wątrobowej zarówno przez kilku histopatologów, jak i tego samego histopatologa może być różna. Oszacowano, że skala tego zjawiska sięga nawet 20 30% [3, 14]. Pomocne w rozpoznaniu włóknienia i marskości wątroby są badania obrazowe, m.in. ultrasonografia, scyntygrafia, rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa czy elastografia. Spośród wymienionych metod na uwagę zasługuje elastografia. Jest to stosunkowo nowa technika cechująca się wieloma zaletami, w której na podstawie pomiaru sztywności tkanki wątrobowej ocenia się poziom zaawansowania zwłóknienia wątroby. Mimo wielu zalet, badania obrazowe posiadają również szereg ograniczeń i często pełnią rolę jedynie badań pomocniczych i nie można na ich podstawie jednoznacznie postawić rozpoznania [4, 10]. W diagnostyce włóknienia wątroby lekarz ma również do dyspozycji cały szereg rutynowych parametrów laboratoryjnych, których nieprawidłowe wyniki świadczą o toczącym się w wątrobie procesie chorobowym. Należą do nich m.in. aktywność aminotransferaz, fosfatazy alkalicznej, stężenie bilirubiny, białka całkowitego, albuminy, badania układu hemostazy, liczba płytek krwi i inne. Badania te charakteryzują się jednak niską swoistością dla omawianego schorzenia. Zmiany ich wartości mogą być bowiem wynikiem wielu innych zaburzeń czy chorób układowych, pierwotnie niezwiązanych z wątrobą. Należy również zaznaczyć, że u pacjentów ze stwierdzoną chorobą wątroby pojedyncze wyniki rutynowych badań laboratoryjnych mogą mieścić się w granicach wartości referencyjnych. Zatem prawidłowe wyniki tych oznaczeń nie upoważniają do wykluczenia choroby wątroby [15]. Wykonanie badania morfologicznego krwi obwodowej pozwala wykazać obecność małopłytkowości, niedokrwistości czy leukopenii, które są częstymi objawami stwierdzanymi u pacjentów z marskością wątroby [7]. Wzrost aktywności aminotransferaz wskazuje na nasilenie procesów zapalenia i martwicy. Jednakże w przypadku ostatniej fazy włóknienia, czyli marskości wątroby aktywności tych enzymów mogą być tylko nieznacznie podwyższone lub mieścić się w zakresie wartości referencyjnych [6]. Izolowany wzrost gamma-glutamylotranspeptydazy może wskazywać na etiologię alkoholową schorzenia [7]. Oznaczanie stężenia bilirubiny pozwala ocenić funkcję klirensową wątroby [6]. W przypadku wirusowego zapalenia wątroby wyższy poziom bilirubiny w surowicy odzwierciedla znaczne uszkodzenie narządu, natomiast w alkoholowym zapaleniu wątroby stężenie powyżej wartości 85,5 ěmol/l (5 mg/dl) wiąże się ze złym rokowaniem [15]. Wątroba jest miejscem wytwarzania wielu białek, w tym białek specyficznych np. dla układu krzepnięcia. Stąd znaczenie ma badanie

4 178 Aleksandra Baszczuk, Lena Kęsy, Zygmunt Kopczyński stężenia albuminy, na podstawie którego możliwe jest określenie zdolności narządu do syntezy protein. Istotna w diagnostyce chorób wątroby jest też ocena parametrów układu hemostazy, takich jak czas protrombinowy (PT), czas kaolinowo-kefalinowy (APTT) czy stężenie fibrynogenu. Zaburzenie produkcji czynników krzepnięcia wyraża się poprzez wydłużenie czasów krzepnięcia. Wydłużenie PT jest również ważnym czynnikiem rokowniczym. Wykazano, że jest to jeden z najczulszych parametrów wskazujących na niewydolność hepatocytów [6, 7]. Wzrost stężenia białka całkowitego w surowicy może wynikać ze zwiększenia poziomu globulin, co świadczy o rozwijającym się stanie zapalnym. Parametry gospodarki lipidowej u pacjentów z chorobą wątroby mieszczą się w zakresie wartości referencyjnych lub obserwuje się obniżenie ich poziomu. Znaczny spadek wartości cholesterolu całkowitego oraz frakcji LDL i HDL świadczy o większym nasileniu procesu uszkadzania hepatocytów [15]. Ponadto badania biochemiczne są przydatne w celu ustalenia czynnika sprawczego uszkodzenia wątroby na tle chorób metabolicznych, takich jak np. hemochromatoza czy choroba Wilsona. W pierwszym przypadku charakterystyczny będzie wzrost stężenia żelaza w surowicy oraz wysycenia transferyny. Natomiast w chorobie Wilsona przeważnie obserwuje się spadek stężenia miedzi i aktywności ceruloplazminy. Przy podejrzeniu zakażenia wirusami hepatotropowymi znaczenie mają testy serologiczne, które obejmują oznaczanie antygenów będących składowymi wirusa oraz skierowanych przeciwko nim przeciwciał [6]. Wymienione powyżej badania laboratoryjne mają niewątpliwie istotne znaczenie w diagnostyce schorzeń wątroby, jednakże są to badania pomocnicze. Nadal brakuje bowiem testu, który pozwalałby wiarygodnie potwierdzić i określić stopień zaawansowania włóknienia miąższu wątroby. Stąd wiele uwagi poświęca się poszukiwaniu surowiczych markerów włóknienia, co stanowi obecnie ważny przedmiot badań naukowych. W ostatnich latach w poszukiwaniu idealnego markera włóknienia wątroby zaczęto stosować badania niskocząsteczkowego proteomu osocza i surowicy, czyli tzw. profile proteomiczne. Jedną z podstawowych metod wykorzystywanych w proteomice jest spektrometria mas, opierająca się na różnych technikach jonizacji cząsteczek. Pozwala ona m.in. na oznaczanie masy cząsteczek w stężeniach attomolowych, co jeszcze do niedawna było praktycznie niemożliwe [16]. Opublikowane wyniki badań określonych profili proteomicznych krwi przeprowadzonych wśród chorych z WZW typu B wskazują na możliwość wykorzystania ich do różnicowania stopnia zwłóknienia wątroby [17]. Stwierdzono, że do białek, których zmiana stężenia we krwi koreluje z nasileniem procesu włóknienia można zaliczyć np. apoproteinę A1 i A4, α-1-antytrypsynę, transtyretynę czy topoizomerazę II [18]. W innych badaniach, których przedmiotem były glikowane białka krwi, uzyskano podobne wyniki dla osoczowego amyloidu P i ceruloplazminy [19]. Niewątpliwie uzyskiwane wyniki badań proteomu są niezwykle obiecujące, jednakże niewiele wskazuje, aby w najbliższym czasie zostały one wprowadzone do fazy klinicznej [2]. Surowicze markery włóknienia wątroby Celem zwiększenia skuteczności wykrywania i oceny stopnia zaawansowania włóknienia wątroby przeprowadzano liczne badania z wykorzystaniem złożonych paneli składających się z różnych markerów włóknienia wątroby, zarówno pośrednich, jak i bezpośrednich. Markery pośrednie pozwalają ocenić zaburzenia funkcji wątroby, natomiast markery bezpośrednie odzwierciedlają metabolizm macierzy pozakomórkowej (ECM) [2, 10, 20]. Początkowo analizie poddawano kombinacje cech klinicznych, jak np. wiek, płeć, wskaźnik masy ciała BMI oraz rutynowych testów laboratoryjnych. Stąd opracowano m.in. wskaźnik APRI (ang. AspAT-to-Platelet Ratio Index), wskaźnik PGA (ang. prothrombine time-gammaglutamylotranspeptidase-ggt), Fibrotest czy Actitest oraz wiele innych. Wskaźnik APRI jest jednym z najprostszych testów pośrednich. Polega na wyliczeniu stosunku aktywności aminotransferazy asparaginianowej do liczby krwinek płytkowych. Użyteczność tego wskaźnika oceniano w badaniach przeprowadzanych wśród pacjentów ze stwierdzonym wirusowym zapaleniem wątroby typu C oraz u pacjentów z alkoholową chorobą wątroby, jednakże wykazano duże różnice w zakresie czułości (37 80%) i swoistości diagnostycznej (30 100%). Innym, bardziej dokładnym testem jest wskaźnik PGA, gdzie pod uwagę brane są wartości wskaźnika protrombinowego, aktywności γ-glutamylotransferazy oraz stężenia apopoproteiny A1. Najwięcej badań z wykorzystaniem wskaźnika PGA przeprowadzano wśród pacjentów z alkoholową chorobą wątroby. Dokładność tego parametru w ocenie włóknienia i marskości wątroby oceniono na poziomie 66 72% [10, 20]. Fibrotest z kolei opiera się na analizie aż 6 parametrów, czyli α2-makroglobuliny, α2-globuliny, γ-globuliny, apopoproteiny A1, γ-glutamylotransferazy i stężenia bilirubiny całkowitej. Na postawie badań wykazano, że czułość diagnostyczna testu wynosi 75%, a swoistość 85%. Z kolei Actitest poza parametrami mającymi zastosowanie w Fibroteście, uwzględnia dodatkowo aktywność aminotransferazy alaninowej. Badania mające określić przydatność tych dwóch testów przeprowadzano wśród pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby typu C. Uważa się, że zarówno Fibrotest, jak i Actitest mogą być z powodzeniem stosowane jako alternatywa dla biopsji wątroby w monitorowaniu tej grupy chorych [21]. Biorąc jednak pod uwagę istotę włóknienia wątroby, w czasie którego zachodzą dynamiczne procesy związane z metabolizmem ECM, uważa się, że większe znaczenie w diagnostyce włóknienia mają panele uwzględniające takie parametry, które odzwierciedlać będą stałe, nadmierne odkładanie się składników ECM, aktywność miofibroblastów oraz syntezę i degradację kolagenu. Powszechnie bezpośrednie markery włóknienia

5 Wartość badań laboratoryjnych w diagnostyce włóknienia wątroby 179 wątroby dzieli się na markery związane z nadmiernym odkładaniem się ECM, markery związane z degradacją ECM oraz markery będące cytokinami i chemokinami, które są ściśle związane z procesem włóknienia miąższu wątroby [10]. Do pierwszej grupy zalicza się m.in. propeptydy prokolagenu typu I (PICP) lub III (PIIINP). Należą one do jednych z najdokładniej przeanalizowanych bezpośrednich markerów włóknienia. Jak wykazano w badaniach, poziom PIIINP bardzo dobrze koreluje z wynikami uzyskanymi z oceny mikroskopowej bioptatów wątroby wśród pacjentów ze stwierdzoną alkoholową chorobą wątroby, wirusowym zapaleniem wątroby lub pierwotną marskością żółciową. Co ciekawe, u pacjentów z alkoholową chorobą wątroby po okresie abstynencji poziom PIIINP we krwi znacząco obniżył się, w niektórych przypadkach nawet do poziomu wartości referencyjnych. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby po zastosowaniu leczenia immunosupresyjnego [10, 20]. Inni badacze natomiast przeprowadzili wśród pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C oznaczenia stężenia lamininy, glikoproteiny syntetyzowanej w komórkach gwiaździstych wątroby. Stwierdzono znaczny wzrost jej stężenia w tej grupie chorych. Jednakże, po wdrożeniu leczenia przeciwwirusowego nie stwierdzono znaczącego zmniejszenia się stężenia lamininy. Natomiast dowiedziono wartości oznaczania tego parametru jako czułego i swoistego markera ostrego alkoholowego zapalenia wątroby i w tym przypadku zaobserwowano spadek jego stężenia po okresie abstynencji alkoholowej [20]. Kolejnym markerem bezpośrednim jest kwas hialuronowy. Przeprowadzone badania naukowe wykazały jego użyteczność w ocenie zaawansowania włóknienia wątroby. Stwierdzono, że HA jest bardzo dobrym wskaźnikiem włóknienia oraz niezależnym czynnikiem predykcyjnym ciężkich powikłań zmian marskich wśród pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C, z alkoholową chorobą wątroby oraz z pierwotną marskością żółciową, przy czym wykazano, że HA jest lepszym markerem niż PIIINP [22, 23]. Z kolei do grupy drugiej, czyli do markerów związanych z rozpadem macierzy pozakomórkowej zalicza się enzymy z grupy metaloproteinaz oraz ich tkankowe inhibitory. Z całej rodziny metaloproteinaz zwracano głównie uwagę na MMP-2 i MMP-9, jednak uzyskane wyniki były na tyle rozbieżne, że trudno jednoznacznie ocenić ich przydatność jako bezpośrednich markerów włóknienia, dlatego też konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań [10]. Trzecią grupę markerów stanowią cytokiny i chemokiny biorące udział w procesie włóknienia wątroby. Szczególnie istotne znaczenia mają tu transformujący czynnik wzrostu α (ang. transforming growth factor α TGF-α), transformujący czynnik wzrostu β (ang. transforming growth factor β TGF-β), a także płytkowy czynnik wzrostu (ang. platelet derived growth factor PDGF). Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że u pacjentów ze schorzeniami wątroby o charakterze włóknienia stężenia tych związków znacząco wzrastają [10, 20]. Test ELF (Enhanced Liver Fibrosis) Jednym z proponowanych laboratoryjnych paneli diagnostycznych, pomocnych w rozpoznawaniu i ocenie stopnia zaawansowania procesu włóknienia wątroby, jest test ELF (Enhanced Liver Fibrosis). Opiera się on na pomiarze ilościowym trzech bezpośrednich markerów wątroby, tj. kwasu hialuronowego (HA), aminokońcowego propeptydu prokolagenu typu III (PIIINP) oraz inhibitora metaloproteinazy 1 macierzy pozakomór-kowej (TIMP-1). Zalecanym materiałem do wykonania oznaczeń składowych testu ELF jest surowica, przy czym można je przeprowadzić wyłącznie na analizatorach ADVIA Centaur. Zasada oznaczania poszczególnych składowych testu ELF opiera się na metodzie immunchemiluminescencji z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko oznaczanemu składnikowi. Sumaryczny wynik jest uzyskiwany poprzez połączenie w algorytmie wyników ilościowych wyżej wymienionych oznaczeń i jest to wartość liczbowa bez jednostek. Interpretacja otrzymanych wyników jest następująca: uzyskanie wartości poniżej 7,7 wskazuje na brak lub łagodne włóknienie wątroby. Wynik w zakresie od 7,7 do 9,8 świadczy o umiarkowanym stopniu zaawansowania tego procesu. Natomiast wartość powyżej 9,8 wskazuje na silnie zaawansowane włóknienie wątroby [24]. Jak dotąd na świecie przeprowadzono już szereg badań klinicznych z zastosowaniem testu ELF i innych markerów wśród pacjentów ze stwierdzonym włóknieniem wątroby. W 2004 roku opublikowano wyniki międzynarodowego badania z udziałem 1021 pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby o różnej etiologii. Oprócz składowych testu ELF w algorytmie uwzględniono także wiek pacjentów, a wyniki porównywano z oceną mikroskopową bioptatu wątroby. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że test ELF jest zarówno dobrym badaniem pozwalającym rozpoznać włóknienie wątroby (czułość diagnostyczna 90%), jak i je wykluczyć (wartość predykcyjna ujemna 92%). Ponadto umożliwia on identyfikację pacjentów z łagodnym i zaawansowanym włóknieniem. Stwierdzono również, że algorytm ten może być stosowany do rozpoznania i oceny stopnia włóknienia wątroby na równi z badaniem biopsyjnym [21, 25]. Z kolei w 2009 roku ukazały się wyniki badań przeprowadzonych wśród dzieci i młodzieży ze stwierdzonym niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby (ang. nonalcoholic fatty liver disease NAFLD). Test ELF wykonano w grupie 112 pacjentów (średnia wieku 13,8 lat). Uzyskane wyniki potwierdziły użyteczność tego testu w dokładnym rozpoznawaniu NAFLD wśród dzieci i młodzieży. Wykazano nawet wyższy stopień czułości i swoistości diagnostycznej testu w porównaniu z wynikami uzyskiwanymi u dorosłych. Jest to o tyle ważne, że NAFLD jest najczęściej występującą

6 180 Aleksandra Baszczuk, Lena Kęsy, Zygmunt Kopczyński przewlekłą chorobą wątroby wśród dzieci i młodzieży w krajach uprzemysłowionych. W związku z tym szybkie i pewne postawienie diagnozy, zwłaszcza u pacjentów z postępującym włóknieniem wątroby, ma tu istotne znaczenie [26]. Parkes i wsp. przeprowadzili badania kliniczne z wykorzystaniem testu ELF wśród 347 pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby typu C. Wykazano, że prezentowany algorytm może być stosowany do rozpoznawania włóknienia wątroby u tych pacjentów. Ponadto stwierdzono, że u osób z ciężkim włóknieniem wątroby wykonanie testu ELF pozwala (przy czułości i swoistości na poziomie 85%) nawet w 63% przypadków uniknąć wykonania biopsji wątroby [27]. W ostatnich latach pojawiły się również publikacje dotyczące wykorzystania bezpośrednich markerów włóknienia u pacjentów po przeszczepieniu wątroby. Wykazano m.in., że oznaczenie składowych testu ELF 6 miesięcy po przeszczepieniu pozwala stwierdzić, u których pacjentów dojdzie do nawrotu choroby w ciągu roku po wykonaniu transplantacji oraz czy włóknienie ma charakter łagodny, czy postępujący. Ponadto stwierdzono, że wykorzystywany w tym celu test ELF jest dokładniejszy niż, np. wskaźnik APRI [21, 28]. Zakończenie Włóknienie wątroby jest procesem niezwykle dynamicznym. Z tego względu obraz histopatologiczny bioptatu tkanki wątrobowej, przy aktualnym stanie wiedzy, nie zawsze pozwala na ustalenie właściwego postępowania klinicznego. Biorąc pod uwagę wszystkie opisane wyżej czynniki utrudniające diagnostykę włóknienia wątroby istnieje konieczność poszukiwania nowych badań laboratoryjnych, które pozwolą w sposób nieinwazyjny na postawienie jednoznacznej diagnozy i monitorowanie procesu włóknienia wątroby. W związku z tym przeprowadzanie wśród pacjentów ze schorzeniami tego narządu badań klinicznych, których przedmiotem jest ocena przydatności nieinwazyjnych markerów włóknienia ma bardzo duże znaczenie naukowe i praktyczne. Mając na uwadze potrzebę rozwoju badań diagnostycznych w omawianym schorzeniu w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej we współpracy z Oddziałem Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych Szpitala Klinicznego im. Heliodora Święcickiego oraz z Oddziałem Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Metabolicznych Szpitala Klinicznego Przemienienia Pańskiego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu zostały rozpoczęte badania, których celem jest ocena użyteczności testu ELF w diagnostyce włóknienia wątroby o różnej etiologii. Piśmiennictwo 1. Lebensztejn D.M.: Odwracalność zaawansowanego włóknienia wątroby możliwości terapeutyczne i biochemiczne monitorowania procesu chorobowego. Przegl. Epidemiol., 2005, 59, Baranova A., Lal P., Birerdinc A. i wsp.: Non-invasive markers for hepatic fibrosis. BMC Gastroenterology, 2011, 11, Błazik E., Durlik M.: Mechanizmy włóknienia wątroby i metody ich oceny. Med. Sci. Rev. Hepatol., 2010, 10, Guarino M., Tosoni A., Nebuloni M.: Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Hum. Pathol., 2009, 40, Pinzani M., Macias-Barragan J.: Update on the pathophysiology of liver fibrosis. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol., 2010, 4, 4, Juszczyk J.: Marskość wątroby. Przew. Lek., 2001, 4, 3, Gajewski P.: Choroby wewnętrzne. Kompendium medycyny praktycznej. Wyd. Medycyna Praktyczna, Kraków 2012, Brenner D.A.: Molecular pathogenesis of liver fibrosis. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc., 2009, 120, Kasztelan-Szczerbińska B., Słomka M., Daniluk J. i wsp.: Komórki gwiaździste jako główny regulator sygnalizacji międzykomórkowej w procesie włóknienia wątroby. Post. Nauk Med., 2010, 1, Gutkowski K., Kamińska E., Pluta A.: Rola diagnostyki nieinwazyjnej w ocenie zaawansowania procesu włóknienia wątroby. Gastroenterol. Pol., 2007, 14, 5, Friedman S.L.: Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol. Rev., 2008, 88, Friedman S.L.: Hepatic fibrosis Overview. Toxicology, 2008, 254, Afdhal N.H.: Biopsy or biomarkers: Is there a gold standard for diagnosis of liver fibrosis? Clin. Chem., 2004, 50, 8, Bedossa P., Dargere D., Paradis V.: Sampling variability of liver fibrosis in chronic hepatits C. Hepatology, 2003, 38, Wallach J.: Interpretacja badań laboratoryjnych. Wyd. Medipage, Warszawa 2011, Karczmarski J., Mikula M., Hennig E. i wsp.: Perspektywy poszukiwania biomarkerów chorobowych w peptydomie osocza lub surowicy krwi z użyciem spektrometrii mas. Post. Nauk Med., 2009, 2, Poon T.C., Hui A.Y., Chan H.L. i wsp.: Prediction of liver fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis B infection by serum proteomic fingerprinting: a pilot study. Clin. Chem., 2005, 51, He Q.Y., Lau G.K., Zhou Y. i wsp.: Serum biomarkers of hepatitis B virus infected liver inflammation: a proteomic study. Proteomics, 2003, 3, Comunale M.A., Mattu T.S., Lowman M.A. i wsp.: Comparative proteomic analysis of de-n-glycosylated serum from hepatitis B carriers reveals polypeptides that correlate with disease status. Proteomics, 2004, 4, Raszeja-Wyszomirska J., Mieżyńska-Kurtycz J., Marlicz W. i wsp.: Nieinwazyjne markery zaawansowania niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby. Pol. Merkuriusz Lek., 2008, XXV, 146, Fernandez-Varo G., Jimenz W.: Non-invasive markers of liver fibrosis. Europea Gastroenterology & Hepatology Review, 2011, 7, 2, Guechot J., Laudat A., Loria A. i wsp.: Diagnostic accuracy of hyaluronan and type III procollagen amino-terminal peptide serum assays as markers of liver fibrosis in chron-

7 Wartość badań laboratoryjnych w diagnostyce włóknienia wątroby 181 ic viral hepatitis C evaluated by ROC curve analysis. Clin. Chem., 1996, 42, Guechot J., Serfaty L., Bonnand A.M. i wsp.: Prognostic value of serum hyaluronan in patients with compensated HCV cirrhosis. J. Hepatol., 2000, 32, Test ELF, metodyka oznaczania. Siemens, Rosenberg W.M., Voelker M., Thiel R. i wsp.: Serum markers detect the presence of liver fibrosis: a cohort study. Gastroenterology, 2004, 127, Nobili V., Parkes J., Bottazzo G. i wsp.: Performance of ELF serum markers in predicting fibrosis stage in pediatric nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology, 2009, 136, Parkes J., Guha I.N., Roderick P. i wsp.: Enhanced Liver Fibrosis (ELF) test accurately identifies liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C. J. Viral Hepat., 2011, 18, 1, Carrión J.A., Fernαndez-Varo G., Bruguera M. i wsp.: Serum fibrosis markers identify patients with mild and progressive hepatitis C recurrence after liver transplantation. Gastroenterology, 2010, 138, 1, Adres do korespondencji: mgr Lena Kęsy Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Szamarzewskiego 82/84, Poznań tel lenakesy@wp.pl