EKSPRESJA GENU AKWAPORYNY W SIEWKACH Pharbitis nil CHOISY W WARUNKACH CIĄGŁEJ CIEMNOŚCI 1

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 524: EKSPRESJA GENU AKWAPORYNY W SIEWKACH Pharbitis nil CHOISY W WARUNKACH CIĄGŁEJ CIEMNOŚCI 1 GraŜyna Dąbrowska, Paweł Mordaka, Justyna Prusińska, Karol Stawki, Anna Goc Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp Kontrola warunków wodnych ma decydujące znaczenie dla utrzymania homeostazy organizmu roślinnego. Symplastyczna i transkomórkowa droga transportu wody regulowana jest przez przepuszczalność cząsteczek wody przez błony biologiczne, zaleŝna od ilości i aktywności kanałów wodnych. Białka budujące kanały wodne - akwaporyny, są silnie konserwowane i tworzą rodzinę integralnych białek błonowych MIP (ang. Membrane Integral Protein) [za DĄBROWSKA, GŁOWACKA 2005; za MORDAKA, DĄBROWSKA 2007]. Genomy roślinne wykazują bardzo duŝą róŝnorodność genów kodujących kanały wodne. Zsekwencjonowanie genomu Arabidopsis thaliana doprowadziło do identyfikacji 38 genów kodujących akwaporyny [WEIG i in. 1997]. Akwaporyny roślinne na podstawie subkomórkowej lokalizacji kanałów i homologii podzielono na: - akwaporyny błony komórkowej PIPs (ang. Plasma membrane Intrinsic Proteins), - akwaporyny tonoplastu TIPs (ang. Tonoplast Intrinsic Proteins), - NIP (homologi białka NOD26) oraz SIPs, białka o niskiej homologii z AQP1 człowieka (ang. Small basic Intrinsic Proteins) [WALLACE, ROBERTS 2004]. Akwaporyny biorą udział w wielu róŝnych procesach fizjologicznych takich jak ruch liści i płatków, rozmnaŝanie, elongacja komórek, kiełkowanie nasion, osmoregulacja. Geny kodujące akwaporyny wykazują złoŝony system regulacji ekspresji na poziomie transkrypcji, niektóre ulegają ekspresji konstytutywnej, inne podlegają regulacji czynnikami zewnętrznymi takimi jak: deficyt wody, wysokie zasolenie czy zmiana warunków świetlnych lub ulegają ekspresji zaleŝnej od poziomu fitohormonów [MAUREL 2007]. Celem badań była analiza ekspresji genu PnPIP1akwaporyny zlokalizowanej w błonie plazmatycznej Pharbitis nil CHOISY w odpowiedzi na działanie ciągłej ciemności. Materiał i metody Materiał doświadczalny stanowiły liścienie, pędy i korzenie siewek Pharbitis nil CHOISY odmiany Violet (Marutane Seed Co., Kyoto, Japan). Nasiona skaryfikowano mechanicznie skalpelem, a następnie pozostawiano na noc w wodzie destylowanej. Rośliny uprawiano przez pięć dni na świetle ciągłym [DĄBROWSKA i in. 2006]. Materiał roślinny zbierano po 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 i 48 godzinach od 1 Praca finansowana z grantu UMK nr 452B.

2 478 G. Dąbrowska i inni przeniesienia roślin do ciemności. Ze 100 mg liścieni, korzeni i łodyg siewek P. nil wyizolowano RNA [CHOM- CZYŃSKI, SACCHI 1987]. Rozdział całkowitego RNA i jego przeniesienie na membranę nylonową (SIGMA) przeprowadzano według protokołu SAMBROOK i in. [1989]. Sondę molekularną do analizy northern stanowiło cdna kodujące u P. nil akwaporynę błony plazmatycznej PIP1 [DĄBROWSKA i in. 2004], wyznakowane radioizotopowo w reakcji transkrypcji in vitro z uŝyciem zestawu T7 Transcription Kit (Fermentas). Hybrydyzację prowadzono w buforze Denhardta (1% w/v Ficoll (typ 400), 1% w/v poliwinylopirolidon, 1% w/v BSA) w temperaturze 65 C przez 12 godzin. Błony nylonowe przepłukiwano trzykrotnie (10 minut w temperaturze 50 C) w roztworze 0,2 x SSC i 0,5% SDS. Błonę nylonową powtórnie hybrydyzowano z sondą molekularną kodującą fragment genu 25S rrna pszenicy [GERLACH, BEDBROOK 1979]. Wizualizację przeprowadzano przy pomocy zestawu Phosphoimager FLA3000 (Fuji). Wyniki i dyskusja Wiele róŝnych procesów metabolicznych jak i wzrostowych jest regularnie powtarzalnych w czasie. Rytm moŝe mieć charakter endogenny, kiedy powtarzalność nie wykazuje zsynchronizowania z warunkami środowiskowymi lub egzogenny. Rytm egzogenny jest skorelowany z cyklicznie zmieniającymi się warunkami środowiskowymi takimi jak natęŝenie światła, zmiany temperatury [KOPCEWICZ, LEWAK 2002]. Podjęto więc próbę odpowiedzi na pytanie, czy zmiany te mogą być związane ze zróŝnicowaną ekspresją genów kodujących akwaporyny w okresie dnia i nocy. Gen PnPIP1 został zidentyfikowany w wyniku przeszukiwania biblioteki cdna sondą uzyskaną w wyniku reakcji róŝnicowego profilowania ekspresji genów. Wstępne doświadczenia sugerowały regulację ekspresji genu PnPIP1 w siewkach P. nil przez światło [DĄBROWSKA i in. 2004; GŁOWACKA i in. 2005]. W celu sprawdzenia czy transkrypcja genu akwaporyny P. nil podlega regulacji poprzez zegar okołodobowy 5-dniowe siewki przeniesiono ze światła ciągłego do ciemności. Następnie co 4 godziny przez dwie doby zbierano liścienie roślin (próby: 0, 4, 8, 12, 16, 24, 28, 32, 36, 40, 48). Zebrano takŝe liścienie roślin kontrolnych rosnących na świetle ciągłym (K). Wyizolowane RNA rozdzielono w denaturującym Ŝelu agarozowym z bromkiem etydyny (rys. 1A) i hybrydyzowano z radioizotopowo wyznakowaną sondą RNA PnPIP1. Uzyskano specyficzny sygnał hybrydyzacyjny do transkryptu wielkości 1200 pz (rys. 1B). Autoradiogram oraz zdjęcie Ŝelu prąŝka analizowano w programie Image Gauge pod kątem siły sygnału hybrydyzacyjnego RNA o wielkości 1200 pz oraz siły sygnału fluorescencji 28S rrna. Poziom transkryptu w stosunku do ilości RNA w poszczególnych ścieŝkach przedstawia rysunek 2. Eksperyment powtórzono, a uzyskane wyniki pozwalają na przypuszczenia, Ŝe ekspresja genu PnPIP1 nie podlega regulacji rytmem endogennym. W obu doświadczeniach poziom transkryptu badanego genu akwaporyny spadał na początku okresu ciemności, a wzrastał w połowie lub pod koniec drugiej doby ciemności (rys. 2).

3 EKSPRESJA GENU AKWAPORYNY W SIEWKACH Pharbitis. nil Rys. 1. Fig. 1. Wynik hybrydyzacji northern pokazujący zmiany ekspresji genu PnPIP1 w liścieniach roślin uprawianych w ciemności. ŚcieŜki: M - marker RNA RiboRuler TM (Fermentas) i warianty ciemności 0, 4, 8, 12, 16, 24 28, 32, 36, 40 i 48 godzin. Całkowite RNA wyizolowanego z liścieni P. nil. Autoradiogram uzyskany po hybrydyzacji z sondą RNA PnPIP1 Results of northern hybridization indicating relative changes of PnPIP1 expression in cotyledons of plants cultivated in darkness. The lanes: M - RiboRuler TM RNA marker (Fermentas) and probes 0, 4, 8, 12, 16, 24 28, 32, 36, 40 and 48 hours of darkness. A. Total RNA isolated from cotyledons of P. nil. B. The autoradiogram of northern hybridisation with PnPIP1 molecular probe Pierwszą akwaporynę (δ-tip) regulowaną rytmem endogennym, zidentyfikowano u Arabidopsis [HARMER i in. 2000]. LOPEZ i in. [2003] przeanalizował przepływ wody z komórki do komórki u kukurydzy w warunkach, gdy transport wody jest niezaleŝny od transpiracji, a transfer wody ksylemem jest utrzymywany przez parcie korzeniowe. W badaniach stwierdzono, Ŝe większość akwaporyn (10 z 13) ulegało ekspresji w korzeniach kukurydzy [CHAUMONT i in. 2001]. Akwaporyny PIP1 (ZmPIP1-1 i ZmPIP1-5) i dwie akwaporyny PIP2 (ZmPIP2-1 i ZmPIP2-5), które w głównej mierze ulegały ekspresji w korzeniach przeanalizowano, uwzględniając ich ekspresję w periodzie światło-ciemność w porównaniu z warunkami ciągłej ciemności. Poziom mrna tych genów był wyŝszy w czasie fazy jasnej niŝ w czasie fazy ciemnej z maksimum w 4 godzinie po rozpoczęciu fazy jasnej. Zaobserwowano fluktuacje ekspresji wymienionych genów w warunkach ciągłej ciemności, co świadczyło o tym, Ŝe są regulowane rytmem endogennym.

4 480 G. Dąbrowska i inni Rys. 2. Fig. 2. Ekspresja genu PnPIP1 w liścieniach w warunkach ciągłej ciemności w stosunku do 25S rrna Gene expression of PnPIP1 in the cotyledons during continuous darkness related to 25S rrna level Oscylacje okołodobowe ekspresji genów akwaporyn wykazano w korzeniach Lotus japonicus. Zmiany w przewodzeniu wody przez korzenie tej rośliny są prawdopodobnie powiązane z syntezą i/lub degradacją kanałów wodnych [HENZLER i in. 1999]. Wykazano równieŝ istnienie korelacji pomiędzy zmianami przewodzenie wody w korzeniach roślin a brakiem azotu i fosforu w podłoŝu hodowlanym. Brak tych pierwiastków powoduje zmniejszenie dobowych oscylacji przewodzenia wody w korzeniach roślin [CLARKSON i in. 2000]. Badania genów kodujących kanały wodne u ryŝu wykazały istnienie zarówno genów podlegających dobowym oscylacjom, ale takŝe takich, które nie wykazują cyklicznych fluktuacji [SAKURAI i in. 2005]. Jest to związane z fizjologicznymi funkcjami analizowanych genów. Okazało się, Ŝe do genów nie podlegających fluktuacjom okołodobowym naleŝą akwaporyny podrodziny PIP1 do której naleŝy takŝe badany gen P. nil. Badania HENZLER i in. [1999] i LOPEZ i in. [2003] dotyczą genów kanałów wodnych ulegających ekspresji w korzeniach. Z naszych niepublikowanych badań wiadomo, Ŝe PnPIP1 ulega wysokiej ekspresji w liścieniach, a tylko nieznacznie jest aktywowany w korzeniach. Dlatego ekspresję genu PnPIP1 w warunkach ciemności badano w liścieniach, a nie korzeniach, co moŝe stanowić o róŝnicach w poziomie ekspresji wspomnianych w dyskusji akwaporyn. Analiza poziomu transkryptu genu PnPIP1 wykazała, Ŝe gen ten najprawdopodobniej naleŝy do akwaporyn, których ekspresja nie podlega oscylacjom rytmu endogennego. Literatura CHAUMONT F., BARRIEU F., WOJCIK E., CHRISPEELS M.J., JUNG R Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize. Plant Physiol. 125: CHOMCZYŃSKI P., SACCHI N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:

5 EKSPRESJA GENU AKWAPORYNY W SIEWKACH Pharbitis. nil CLARCKSON D.T., CARVAJAL M., HENZLER T., WATERHOUSE R.N., SMYTH A.J., COOKE D.T., STEUDLE E Root hydraulic conductance: diurnal aquaporin expression and the effects of nutrient stress. J. Exp. Bot. 51: DĄBROWSKA G., DOSS R., GOC A., SMOLIŃSKI D Gen akwaporyny Pharbitis nil. 53 Zjazd Polskiego Towarzystwa Botanicznego, Toruń-Bydgoszcz 6-11 IX. DĄBROWSKA G., GŁOWACKA B Akwaporyny - nowe spojrzenie na transport wody w roślinach. Postępy Bioch. 50(4): DĄBROWSKA G., PRUSIŃSKA J., GOC A Identyfikacja cdna genu RSH (RelA/SpoT homolog) zaangaŝowanego w odpowiedź Pharbitis nil na warunki stresowe. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 509: GERLACH W.L., BEDBROOK J.R Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from wheat and barley. Nucl. Acids Res. 7: GŁOWACKA K., DĄBROWSKA G., LIGMAN S. B., GÓRECKI R. J., TRETYN A Analysis of aquaporin gene expression in Pharbitis nil during the photoperiodic flower induction. Biol. Lett. 42(2): 116. HARMER S.L., HOGENESCH R.N., STRAUME M., CHANG H.S., HAN B., ZHU T., WANG X., KREPS J.A., KAY S.A Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsis by the circadian clock. Science 290: HENZLER T., WATERHOUSE R.N., SMYTH A.J., CARVAJAL M., COOKE D.T., SCHÄFFNER A.R., STEUDLE E., CLARKSON D.T Diurnal variations in hydraulic conductivity and root pressure can be correlated with the expression of putative aquaporins in the roots of Lotus japonicus. Planta 210: KOPCEWICZ J., LEWAK S Fizjologia roślin. Wydawn. Nauk. PWN Warszawa: LOPEZ F., BOUSSER A., SISSOËFF I., GASPAR M., LACHAISE B., HOARAU J., MAHÉ A Diurnal regulation of water transport and aquaporin gen expression in maize roots: contribution of PIP2 proteins. Plant Cell Physiol. 44: MAUREL C Plant aquaporins: novel functions and regulations properties, FEBS Lett. 581: MORDAKA P., DĄBROWSKA G RóŜnorodność i regulacja kanałów wodnych w świecie roślin. Postępy Bioch. 53(1): SAKURAI J., ISHIKAWA F., YAMAGUCHI T., UEMURA M., MAESHIMA M Identification of 33 rice aquaporin genes and analysis of their expression and function. Plant Cell Physiol. 46: SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York: WALLACE I.S., ROBERTS D.M Homology modeling of representative subfamilies of Arabidopsis major intrinsic proteins. Classification based on the aromatic/arginine selectivity filter. Plant Physiol. 135: WEIG A., DESWARTE C., CHRISPEELS M.J The major intrinsic protein family of Arabidopsis has 23 members that from three distinct groups with functional aquaporins in each group. Plant Physiol. 114: Stosowane skróty: AQP- akwaporyna; aquaporin BSA - albumina wołowa; bovine albumin 0,2 x SSC - roztwór 0,03 mol dm -3 chlorku sodowego i 0,003 mol dm -3 cytrynianu

6 482 SDS - G. Dąbrowska i inni sodowego; sodium chloride 0.03 mol dm -3 and sodium citrate mol dm -3 sodowy siarczan dodecylu; sodium dodecyl sulphate Słowa kluczowe: ekspresja genu, kanały wodne, Pharbitis nil, rytm endogenny Streszczenie Kanały wodne odgrywają znaczącą rolę w rozwoju roślin i ich adaptacji do zmieniającego się środowiska zewnętrznego. Wpływ na ekspresję genów kodujących białka kanałów wodnych, akwaporyn, wywierają takie czynniki jak: hormony, susza, wysokie stęŝenia soli, temperatura czy światło. Gen PnPIP1, kodujący akwaporynę P. nil został zidentyfikowany w wyniku przeszukiwania biblioteki cdna sondą - uzyskaną w wyniku reakcji róŝnicowego profilowania ekspresji genów. Wstępne doświadczenia sugerowały regulację ekspresji genu PnPIP1 poprzez światło. Celem prezentowanej pracy było sprawdzenie poziomu transkrypcji genu akwaporyny P. nil w liścieniach siewek uprawianych w warunkach ciągłej ciemności. Stosując technikę hybrydyzacji typu northern z uŝyciem sondy molekularnej RNA znakowanej radioizotopowo uzyskano sygnał hybrydyzacyjny do transkryptu wielkości 1200 pz. Ekspresja genu spadała w pierwszych godzinach nocy, a wzrastała w połowie drugiej doby. Maksimum akumulacji transkryptu stwierdzono w 48 godzinie ciemności. Wyniki badań sugerują, Ŝe ekspresja genu akwaporyny PIP1 w liścieniach P. nil nie jest regulowana rytmem endogennym. EXPRESSION OF PIP1 AQUAPORIN GENE IN SEEDLINGS OF Pharbitis nil DURING CONTINUOUS DARKNESS GraŜyna Dąbrowska, Paweł Mordaka, Justyna Prusińska, Karol Stawki, Anna Goc Department of Genetics, Nicolaus Copernicus University, Toruń Key words: gene expression, water channel, Pharbitis nil, endogenous circadian rhythms Summary Water channels play an im portant role in plant development and their adaptation to constantly changing environment. At the transcriptional level the water channel genes are up- or down- regulated in response to hormones, drought, salnity, temperature or light. After screening of a cdna library by differential display product a gene encoding water channel of P. nil was identified. Preliminary results suggested the regulation of PnPIP1 gene by light. The aim of presented work was the transciptional level verification of aquaporin gene expression in cotyledons of seedlings P. nil growing under continuous darkness. We observed the specific hybridisation signal to 1200 bp transcript using northern hybridisation with radioactive labelled molecular probe of RNA. The PnPIP1 gene expression analysis during 48 hours of darkness showed a decrease of transcript amount at the beginning of the darkness period and its increase after 40 hours of the darkness as

7 EKSPRESJA GENU AKWAPORYNY W SIEWKACH Pharbitis. nil compared with plants growing in continuous light conditions. The result shows that gene of PnPIP1 is not regulated by circadian rhythm. Dr GraŜyna Dąbrowska Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina TORUŃ browsk@uni.torun.pl