WYKRYWANIE MICRODOCHIUM NIVALE VAR. NIVALE I M. NIVALE VAR. MAJUS W PSZENICY OZIMEJ UPRAWIANEJ W RÓŻNYCH SYSTEMACH PRODUKCJI

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (2) 2008 WYKRYWANIE MICRODOCHIUM NIVALE VAR. NIVALE I M. NIVALE VAR. MAJUS W PSZENICY OZIMEJ UPRAWIANEJ W RÓŻNYCH SYSTEMACH PRODUKCJI EWA SOLARSKA, AGNIESZKA FAJBUŚ Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii Skromna 8, Lublin ewa.solarska@up.lublin.pl I. WSTĘP Microdochium nivale jest głównym sprawcą pleśni śniegowej. Grzyb powoduje również przed i powschodową zgorzel siewek. najczęściej jest też jednym z kilku komponentów zespołu patogenów powodujących choroby podsuszkowe (Solarska i wsp. 2003). Patogen ten atakuje również liście i kłos. nie jest grzybem toksygenicznym, ale może powodować spadek żywotności ziarna siewnego (Turner i wsp. 2002). Wyróżnia się dwie odmiany tego gatunku: i. Różnice pomiędzy tymi odmianami związane są z morfologią form konidialnych, a także ze zróżnicowaniem w preferencji gospodarzy, wskutek różnej wrażliwości na kwasy hydroksamowe występujące w ich tkankach (Simpson i wsp. 2000). Często we wczesnych terminach wzrostu roślin objawy chorobowe powodowane przez są trudne do odróżnienia od powodowanych przez Pseudocercosporella herpotrichoides i Rhizoctonia cerealis, wchodzących w skład komponentu patogenów powodujących choroby podsuszkowe. Ponadto bardzo trudne jest odróznienie i za pomocą konwencjonalnej analizy mikologicznej. Dlatego w ostatnich latach coraz powszechniej stosuje się do tego celu PCR, który pozwala na specyficzną i szybką identyfikacje obu odmian oraz na wykrycie tego grzyba przy niskiej jego koncentracji w tkankach roślinnych, a więc również we wczesnych terminach wzrostu roślin. Celem badań przeprowadzonych w latach było określenie występowania na pszenicy ozimej uprawianej w różnych systemach produkcji przy użyciu makroskopowej oceny i molekularnego testu PCR oraz ocena możliwości wykorzystania tego testu do wczesnego wykrywania analizowanego patogena. II. MATERIAŁ I METODY Badania prowadzono na polach uprawnych pszenicy ozimej odmian Kobra i Roma, należących do Zakładu Doświadczalnego Osiny Instytutu Uprawy Nawożenia i Glebo-

2 Wykrywanie Microdochium nivale w pszenicy ozimej znawstwa PIB w Puławach. Uwzględniono trzy systemy produkcji pszenicy ozimej: integrowany, konwencjonalny i ekologiczny oraz monokulturę. Z każdego pola reprezentującego oddzielny system uprawy pszenicy w dwóch terminach pobrano losowo po trzydzieści roślin, z których pobrano wiosną pochwę liściową i kłosy w czasie dojrzałości mlecznej ziarna. Z fragmentów tkanki roślinnej i ziarna izolowano DNA. W reakcji PCR zastosowano specyficzne startery dla oraz dla var. majus o sekwencji podanej w literaturze (Doohan i wsp. 1998). Tkankę roślinną po uprzednim liofilizowaniu rozdrobniono w młynku elektrycznym. Ekstrakcję DNA przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Nicholsona i wsp. (1996). Do reakcji PCR używano 1 μl uzyskanego ekstraktu DNA. Jako kontrolę pozytywną reakcji stosowano kontrolny DNA dla badanych grzybów pochodzący z zestawów diagnostycznych firmy ADGEN. W kontroli negatywnej zamiast DNA użyto 1 μl wody destylowanej. Do amplifikacji fragmentów DNA specyficznych dla grzybów z badanych próbek roślinnych zastosowano program według Nicholsona i wsp. (1996). Produkty reakcji PCR analizowano w 1,5% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny i markerów wielkości M1 (puc 19/Mspl) lub M2 (Gene Ruler 100 bp DNA Lader Plus). III. WYNIKI W wyniku użycia testu PCR wykryto w roślinach odmian Kobra i Roma w różnych systemach produkcji. W 2001 roku wykryto jedynie Tabela 1. Wykrywanie za pomocą techniki PCR w pochwie liściowej pszenicy ozimej odmiany Kobra i Roma w różnych systemach produkcji w latach Table 1. Detection of using PCR in leaf sheath of winter wheat cv. Kobra and Roma in different production systems in Systemy produkcji Production systems Rok Year Gatunek grzyba Species of fungus ekologiczny organic integrowany integrated konwencjonalny conventional monokultura monoculture Kobra Roma Kobra Roma Kobra Roma Kobra Roma (+) pozytywny wynik reakcji PCR positive result of PCR reaction ( ) negatywny wynik reakcji PCR negative result of PCR reaction

3 534 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (2) 2008 pochwa liściowa leaf sheath kłos ear M1 KP KN 300 p.z. Rys. 1. Wykrywanie za pomocą techniki PCR w roślinach pszenicy ozimej uprawianej w różnych systemach produkcji w 2003 roku Fig. 1. Detection of using PCR in winter wheat plants cultivated in different production systems in , 9 monokultura, o. Kobra moculture cv. Kobra 2, 10 system integrowany, o. Kobra integrated system, cv. Kobra 3, 11 system ekologiczny, o. Kobra organic system, cv. Kobra 4, 12 system konwencjonalny, o. Kobra conventional system, cv. Kobra 5, 13 monokultura, o. Roma monoculture, cv. Roma 6, 14 system integrowany, o. Roma integrated system, cv. Roma 7, 15 system ekologiczny, o. Roma organic system, cv. Roma 8, 16 system konwencjonalny, o. Roma conventional system, cv. Roma M1 marker wielkości puc 19/Mspl size markeri puc 19/Mspl KP kontrola pozytywna positive control KN kontrola negatywna negative control Tabela 2. Wykrywanie za pomocą techniki PCR w kłosach pszenicy ozimej odmian Kobra i Roma w różnych systemach produkcji w 2002 roku Table 2. Detection of by using PCR in ears of winter wheat cv. Kobra and Roma in different production systems in 2002 Rok Year 2002 Gatunek grzyba Species of fungus ekologiczny organic Systemy produkcji Production systems integrowany integrated konwencjonalny conventional monokultura monoculture Kobra Roma Kobra Roma Kobra Roma Kobra Roma (+) pozytywny wynik reakcji PCR positive result of PCR reaction ( ) negatywny wynik reakcji PCR negative result of PCR reaction + +

4 Wykrywanie Microdochium nivale w pszenicy ozimej w pochwie liściowej roślin odmiany Roma w systemie integrowanym (tab. 1). W 2002 roku wykrywano w roślinach pszenicy ozimej z systemów: integrowanego, konwencjonalnego i monokultury, a tylko w roślinach odmiany Roma uprawianych w systemie konwencjonalnym (tab. 1). Natomiast w 2003 roku wykrywano tylko w roślinach odmiany Roma z systemów: ekologicznego, integrowanego i monokultury, a w roślinach odmiany Roma monokultury i w roślinach odmiany Kobra z systemu ekologicznego (tab. 1, rys. 1). W latach 2001 i 2003 nie wykrywano w kłosach. W 2002 wykryto w kłosach odmiany Kobra z systemu integrowanego i monokultury (tab. 2). IV. DYSKUSJA Zastosowanie testu PCR pozwoliło na wykrywanie w pszenicy w bardzo wczesnym okresie rozwoju tej rośliny, tj. podczas jej krzewienia. Umożliwiło także odróżnienie dwóch odmian i. Wykorzystywany test PCR był testem jakościowym, nie dającym możliwości oznaczenia biomasy grzyba w materiale roślinnym. W pochwie liściowej pszenicy ozimej wykrywano przede wszystkim. wykrywano w każdym roku z mniejszą częstotliwością niż. Podobne wyniki częstszego wykrywania w pochwie liściowej pszenicy ozimej uzyskał Turner i wsp. (2002). wykrywano również w kłosie tylko w jednym roku, tj. w 2002, kiedy najczęściej wykrywano tę odmianę grzyba w pochwie liściowej wiosną. V. WNIOSKI 1. Zastosowanie techniki PCR pozwoliło wykryć i var. majus w pochwie liściowej oraz w kłosach pszenicy ozimej. 2. Grzyby te powodują fuziarozy podstawy źdźbła i korzeni oraz liści i kłosa i są trudne do odróżnienia na podstawie analizy makroskopowej. 3. W pochwie liściowej oraz kłosach pszenicy ozimej wykrywano przede wszystkim. VI. LITERATURA Doohan F.M., Parry D.W., Jenkinson P., Nicholson P The use of species specific PCR based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat. Plant Pathol. 47 (2): Nicholson P., Lees A.K., Maurin N., Parry D.W., Rezanoor H.N Development of a PCR assay to identify and quantify and in wheat. Physiol. Mol. Plant Pathol. 48: Simpson D.R., Rezanor H.M., Parry D.W., Nicholson P Evidence for differential host preference in Microdochium nivale and Microdochium nivale. Plant Pathol. 49 (2):

5 536 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (2) 2008 Solarska E., Mróz A., Kuś J Występowanie chorób powodowanych przez grzyby na pszenicy ozimej uprawianej w różnych systemach produkcji. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 43: Turner A.S., Nicholson P., Edwards S.G., Bateman G.L., Morgan L.W., Tood A.D., Parry D.W., Marschall J., Nutall M Relationship between brown foot rot and DNA of Microdochium nivale, determined by quantitative PCR in stem bases of winter wheat. Plant Pathol. 51: EWA SOLARSKA, AGNIESZKA FAJBUŚ DETECTION OF MICRODOCHIUM NIVALE VAR. NIVALE AND M. NIVALE VAR. MAJUS IN WINTER WHEAT CULTIVATED IN DIFFERENT PRODUCTION SYSTEMS SUMMARY Polymerase chain reaction (PCR) for detection of Microdochium nivale and was compared with macroscopic analysis of winter wheat growing in different production systems: organic, integrated, conventional and monoculture. Leaf sheaths and ears were analysed in this aspect. Macroscopic analysis of winter wheat healthiness did not agree with results of PCR analysis. PCR analysis indicated a higher incidence of on leaf sheaths and ears of winter wheat than. Key words: winter wheat, production systems, PCR detection, Microdochium nivale,