PODSTAWY INTERPRETACJI WIDM MASOWYCH. Copyright 2005 Witold Danikiewicz

Transkrypt

1 PODSTAWY INTERPRETACJI WIDM MASOWYCH

2 1. Ustalanie masy cząsteczkowej Metody: widmo EI 7 ev i np. 12 ev; łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, APCI, MALDI, FI) w celu otrzymania jonu molekularnego.

3 TERMINOLOGIA Jon molekularny: jon o masie równej masie cząsteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu) powstający w wyniku oderwania lub (znacznie rzadziej) przyłączenia elektronu przez cząsteczkę. Jon pseudomolekularny, quasimolekularny lub jon typu jonu molekularnego: jon powstający w wyniku przyłączenia prostego jonu (najczęściej H +, Na +, Cl - ) do cząsteczki badanego związku lub oderwania jonu H + od tej cząsteczki. Obecnie zaleca się stosowanie nazw typu: protonowana cząsteczka, deprotonowana cząsteczka itp.

4 REGUŁA AZOTOWA Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M + H +, M H +, M + Na +, M + Cl itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI Jony nieparzystoelektronowe: M + powstają w wyniku jonizacji EI i FI

5 LICZBA MIEJSC NIENASYCENIA Dla cząsteczki o wzorze C x H y N z O n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N = x z 1 y Ogólniej: typ x: C,Si typ y: typ z: 1 H, F, Cl, Br, I N, P typ n: O, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż.5.

6 Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach.

7 5. W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M + H + i M H + ). Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie LSIMS, ESI lub APCI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej H +, Na +, Cl - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klasterów typu (nm+ Kat) +, (nm Kat) lub (nm+ A), a także klasterów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M + H +, a dodanie soli sodowej jonu M + Na +.

8 Zależność wyglądu widma EI octanu etylu od energii elektronów M + O C H 3 C O CH 2 CH 3 M = 88

9 PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 3 H 68 N 1 O 19 C 6 H 138 N 2 O 39 C 15 H 348 N 5 O Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia

10 Przykład widma związku cynoorganicznego Sn, ,.95, ,.65, ,.34, , 14.24, , 7.57, , 24.1, , 8.58, , 32.97, , 4.71, , 5.98, 1 Sn M = 236 M +

11 Widmo ESI związku o małej cząsteczce (M = 397, MeOH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 1 2M + Na Ph O 8 N O Ph % Intensity M + H + M + Na OH M = 397 O M + K Mass (m/z)

12 Widma ESI aldehydu o M = 269 Da w MeOH i EtOH Mariner Spec /27:32 (T /1.39:1.82) ASC[BP = 324.1, 611] 1 9 Widmo w MeOH M + MeOH + Na R Aldehydy często tworzą hydraty i hemiacetale: O H + R' OH % Intensity M + MeOH + H M + H 2 O + Na + M + H + M + Na Mass (m/z) R OH H OR' Mariner Spec /7:26 (T /.38:2.) ASC[BP = 338.2, 355] Widmo w EtOH M + EtOH + Na % Intensity M + H 2 O + Na + M + Na Mass (m/z)

13 Widma ESI trietylenotetraminy w różnych rozpuszczalnikach N H 2 H N Aminy mogą reagować z formaldehydem (powstającym w wyniku anodowego utleniania metanolu), dając kationy imoniowe: N H NH 2 % Intensity Widmo w MeOH Mariner Spec /9:18 (T /.42:.88) ASC[BP = 147.1, 4623] Mass (m/z) M + H + M + Na H O R N R + CH 2 OH R N R H C H + H + - H 2 O CH 2 R N + R % Intensity Widmo w MeOH/H 2 O/NaOAc Mariner Spec /2:42 (T /.5:2.13) ASC[BP = 147.1, 26] M + H M + CH 2 O - H 2 O + H + formalnie: [M + CH] Taka reakcja jest dość rzadko spotykana w ESI, ale trzeba się z nią liczyć Mass (m/z)

14 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub peudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych; badanie profilu izotopowego.

15 H, 2 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków , ,.15 He, , , Li, , , Be, , 1. B, , , 81.2 C, 2 12., , 1.18 N, , ,.365 O, , , ,.24 F, , 1. Ne, , , , 8.82 Na, , 1. Mg, , , , Al, , 1. Si, , , , 3.12 P, , 1. S, , , , ,.17 Cl, , , 24.6

16 Definicje zdolności rozdzielczej spektrometru mas R 1% = M M M FWHM = M M h M h,5 h,1 h M,5 h 1%-owa dolina (R 1% ) - odpowiada szerokości na poziomie 5% M Szerokość połówkowa (FWHM Full Width at Half Maximum)

17 Wpływ definicji zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma R 1% FWHM Widma dla takiej samej nominalnie rozdzielczości R 1% i FWHM

18 Przykład wymagań dotyczących rozdzielczości niezbędnej dla rozróżnienia pików M M R CO 27,9949, N 2 28,62, C 2 H 4 28,312

19 Wpływ zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma R = R = R = 3 M 1 =1, M 2 =1,2

20 Wpływ masy jonów przy stałej różnicy masy i rozdzielczości na wygląd widma R = 1 M = 1 M =, R = 1 M = 2 M =, R = 1 M = 35 M =,2

21 Ważne: Dokładny pomiar masy - wymagania Dokładny pomiar masy nie zastępuje analizy elementarnej, ponieważ nie dostarcza informacji o czystości próbki. Pozwala jedynie na stwierdzenie, że w widmie masowym badanej próbki znajduje się pik pochodzący od jonu o masie odpowiadającej założonemu wzorowi sumarycznemu. Czystość związku należy udowodnić w inny sposób. Wymagania większości czasopism odnośnie dokładnych pomiarów masy są następujące: 1. Pomiar musi dotyczyć jonu molekularnego lub pseudomolekularnego (a nie jonów fragmentacyjnych). 2. Dokładność pomiaru powinna wynosić 5 ppm (w niektórych czasopismach dopuszcza się 1 ppm, zwłaszcza dla wyższych mas). 3. Można mierzyć masy nie przekraczające 8 u.

22 Wpływ dokładności pomiaru masy na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:2 H1:3 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 2 mmu (ok. 8 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:l S:.7 C:18 H:12 N: O:2 S: Elements: C12:2 H1:3 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 5 mmu (ok. 19 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:5 H:16 N:4 O:6 S:l. C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S: 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4. C:15 H:16 N: O:2 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 S:.7 C:18 H:12 N: O:2 S:

23 Wpływ wyboru pierwiastków na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:12 H1:3 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:1 H:16 N:2 O:4 S:l Elements: C12:16 H1:3 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S: 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4. C:15 H:16 N: O:2 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 S: Elements: C12:16 H1:3 N14:4 O16:4 Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:13 H:12 N:2 O:4 -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 Elements: C12:2 H1:2 O16:2 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:15 H:16 O:2 S:l.7 C:18 H:12 O:2 S:

24 Profile izotopowe kombinacji pospolitych pierwiastków dwuizotopowych typu M+2

25 Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego Widmo zmierzone Intensity (%age) Intensity (%age) Low Resolution M/z Widmo obliczone dla składu: C 35 H 38 F 6 N 2 O 5 Ru Mass

26 3. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI); stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego; stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych.

27 Badanie zachowania próbki podczas parowania w źródle jonów EI

28 4. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI; identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm; badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID); dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych; wymiana izotopowa; otrzymywanie i badanie pochodnych.

29 Identyfikacja produktu reakcji na podstawie widma masowego O OC 2 H 5 OH OH OC 2 H 5 NaOH EtOH czy? x = C 3 H 7 O Intensity (%age) M Low Resolution M/z

30 α-pinen (96 %) 2.33 β-pinen (97 %) 3.17 Chromatogram GC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a sabinen (97 %) mircen 3.33 (96 %) limonen (99 %) γ-terpinen (97 %) 5.82 linalool (97 %) octan linalylu (91 %) α-bergamoten (98 %) 12.3 β-kariofilen (99 %) p-cymen (97 %) α-terpinolen (98 %) β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) α-terpineol (91 %) geranial (96 %) octan geranylu (91 %) min. Liczby w nawiasach określają w procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego

31 Statystyka procedury porównywania widm Average of to min.: CYTR6.D olejek cytrynowy w heksanie.2 ul PBM Search of library d:\database\wiley275.l Name MolWt Formula Qual 1..BETA.-BISABOLENE 24 C15H beta.-Farnesene $$ 1,6,1-Dodecatriene, 24 C15H NEROL 154 C1H18O 9 4. trans-.beta.-farnesene $$ (E)-.beta.-Far 24 C15H beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H BETA.-BISABOLENE 24 C15H beta. bisabolene $$ BETA-BISABOLENE 24 C15H (Z)-.beta.-Farnesene $$ 1,6,1-Dodecatri 24 C15H BROMO-3-PENTENE $$ 1-Pentene, 5-bromo- 148 C5H9Br 6 1. CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 24 C15H alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H ALPHA.-HUMULENE $$ ALPHA-HUMULENE 24 C15H alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 24 C15H beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H24 38

32

33

34 Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH Intensity (%age) Intensity (%age) Widmo standardowe Widma EI Low Resolution M/z Widmo po kilkakrotnym odparowaniu próbki z CH 3 OD Low Resolution M/z d d 2 d

35 Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH % Intensity % Intensity M + H + M + Na Widma ESI Widmo w MeOH/H 2 O Mass (m/z) d 2 -M + D + d 3 -M + H + d-m + D + d 2 -M + H + M + D + d-m + H d 2 -M + Na d 3 -M + D d 3 -M + Na + d 1 -M + Na + Widmo w MeOD/D 2 O Mass (m/z)

36 Typowe zanieczyszczenia próbek obserwowane w widmach masowych

37 Węglowodory nasycone (na przykładzie triakontanu C 3 H 62 ) M = 422

38 Silikony Abundance 73 #275767: SILIKONFETT SE3 (GREVELS) 9 CH 3 CH RO CH 3 Si O CH 3 Si O CH 3 n Si OR CH M = m/z-->

39 Ftalan di-n-butylu M = 278

40 Ftalan diizooktylu M = 39

41 Widmo ESI ftalanów Spec /2:19 ASC[BP = 413.3, 542] ftalan diizooktylu + Na % Intensity ftalan di-n-butylu + Na (ftalan diizooktylu) 2 + Na Mass (m/z) 83

42 Siarka (widmo rzeczywistej próbki zanieczyszczonej siarką) S 2 S 9 8 Intensity (%age) S 5 16 S S S S Low Resolution M/z