ZAAWANSOWANE METODY USTALANIA BUDOWY ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH

Transkrypt

1 ZAAWANSWANE METDY USTALANIA BUDWY ZWIĄZKÓW GANICZNYC Witold Danikiewicz Instytut Chemii rganicznej PAN ul. Kasprzaka 44/52, Warszawa Listopad 215 styczeń 216 PDSTAWY INTEPETACJI WIDM MASWYC Spec #1[BP = 817.4, 2132] M Na 8 % Intensity M Na M Ph N M = 397 Ph M K Mass (m/z) α C 2 C C 2 5 C C m/z 43 (1%) 3 α C 2 C C 2 5 C m/z 57 (7%) 2 1

2 Pytania, na które może odpowiedzieć spektrometria mas 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 7 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego lub braku zgodności widm () i (-). 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Aby wyznaczyć masę cząsteczkową trzeba zaobserwować i zidentyfikować jon molekularny (lub pseudomolekularny) Metody: widmo EI 7 ev; łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, APCI, MALDI, FI) w celu zaobserwowania jonu molekularnego. 4 2

3 Terminologia Jon molekularny: jon o masie równej masie cząsteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu), powstający w wyniku oderwania lub (znacznie rzadziej) przyłączenia elektronu przez cząsteczkę. Jest to jon nieparzystoelektronowy (kationo- lub anionorodnik). Jon pseudomolekularny, quasimolekularny lub jon typu jonu molekularnego: jon powstający w wyniku przyłączenia prostego jonu (najczęściej, Na, - ) do cząsteczki badanego związku lub oderwania jonu od tej cząsteczki. becnie zaleca się stosowanie nazw typu: protonowana cząsteczka, deprotonowana cząsteczka itp. Jony tego typu są jonami parzystoelektronowymi. 5, , ,.15 e, , , Li, , , Be, , 1. B, , , 81.2 C,2 12., , 1.18 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków N, , ,.365, , , ,.24 F, , 1. Ne, , , , 8.82 Na, , 1. Mg, , , , Al, , 1. Si, , , , 3.12 P, , 1. S, , , , ,.17, , ,

4 Profile izotopowe jonów w funkcji ich masy C 3 7 N 2 C 6 12 N 2 3 C N 5 9 C 3 68 N 1 19 C N 2 39 C N Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia 7 eguła azotowa Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M, M, M Na, M itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI. Jony nieparzystoelektronowe: M powstają w wyniku jonizacji EI, FI i FD. 8 4

5 Liczba miejsc nienasycenia Dla cząsteczki o wzorze C x y N z n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N = x z 1 y gólniej: typ x: C, Si typ y:, F,, Br, I typ z: N, P typ n:, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż -,5. 9 Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI, FI lub FD (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach. 1 5

6 Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie CI, ESI, APCI lub MALDI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej, Na, - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klasterów typu (nm Kat), (nm Kat) lub (nm A), a także klasterów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M, a dodanie soli sodowej jonu M Na. 5. W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M i M ). 11 Widmo EI cholesterolu Abundance #22929: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth 386 M 3 C C m/z-->

7 Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 7 ev % Intensity [M 2 ] M = M/z MNa ESI w Me 7 6 M % Intensity MNa M ass (m/z) 13 Identyfikacja jonu molekularnego w ESI Q1: 2.39 to min from Sample 1 (MP 29) of mp3469.wiff (Turbo Spray) Max. 4.5e6 cps. I n te n s i t y, c p s 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.5e6 Widmo standardowe w Me M MNa MK 1.e e Widmo w Me z dodatkiem kwasu m/z, Da Widmo w Me z dodatkiem soli Na I n t e n s i t y, c p s Q1: 5.13 to min from Sample 2 (MP 29 ) of mp3469.wiff (Turbo Spray), Smoothed Max. 3.3e6 cps. 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e M m/z, Da MNa MK I n t e n s i t y, c p s Q1: to 3.42 min from Sample 4 (MP 29 Na) of mp3469.wiff (Turbo Spray), Smoothed, Smoothed Max. 3.1e6 cps. 3.1e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e5. M m/z, Da MNa MK 14 7

8 Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 Da, zawierającej grupy i C 1 9 8? 21.? Spec #1[BP = 21., 724] ESI () 724 C () m % Intensity F 149. F 279.1? F? F Mass (m/z) [2M Na ] () n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M ] ESI (-) % Intensity Mass (m/z) Widm ESI peptydu o masie 2524,6 Da [M 4 ] 4 Spec /1:8[BP = 632.1, 2248] M =,33 n = 3 6 % Intensity 5 4 [M 5 ] 5 3 [M 3 ] [M 2 ] Mass (m/z) 16 8

9 1 9 Widmo ESI peptydu o masie 3377 u [M4 ] 4 Spec /1:14[BP = 846.1, 396] M,25 n = % Intensity 5 4 M [M5 ] [M3 ] Mass (m/z) Spec /1:14=>DECNV[BP = 338.5, 571] % Intensity Mass (m/z) Widmo ESI peptydu o masie Da Widmo po dekonwolucji m 2 m 1 m 1 = (M n)/n m 2 = (M n 1)/(n 1) n = (m 2 1)/(m 1 m 2 ) ( m M = m 2 1)( m1 1) 1 m 2 ozdzielczość spektrometru zbyt niska, aby można było rozróżnić jony izotopowe. 18 9

10 Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 CAg ESI MALDI 19 Widma ESI kompleksów eterów makrocyklicznych z kationami litowców M Na M K M b m/z, amu N M = 29 N Ligand Na K b Cs (1:1:1:1:1) w Me 2 (7:3) M Cs 2M Na 63.5 M Na M K M Cs M b M = 62 N N Ligand Na K b Cs (1:1:1:1:1) w Me 2 (7:3) 2M K 2M b M Na M Cs m/z, amu 2 1

11 Widma ESI aldehydu o M = 269 Da w Me i Et Mariner Spec /27:32 (T /1.39:1.82) ASC[BP = 324.1, 611] 1 9 Widmo w Me M Me Na Aldehydy często tworzą hydraty i hemiacetale: ' % Intensity M Me M 2 Na M M Na Mass (m/z) ' Widmo w Et Mariner Spec /7:26 (T /.38:2.) ASC[BP = 338.2, 355] M Et Na % Intensity M 2 Na M Na Mass (m/z) Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub pseudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych; badanie profilu izotopowego

12 , , ,.15 e, , , Li, , , Be, , 1. B, , , 81.2 C,2 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków 12., , 1.18 N, , ,.365, , , ,.24 F, , 1. Ne, , , , 8.82 Na, , 1. Mg, , , , Al, , 1. Si, , , , 3.12 P, , 1. S, , , , ,.17, , , Ważne: Dokładny pomiar masy - wymagania Dokładny pomiar masy nie zastępuje analizy elementarnej, ponieważ nie dostarcza informacji o czystości próbki. Pozwala jedynie na stwierdzenie, że w widmie masowym badanej próbki znajduje się pik pochodzący od jonu o masie odpowiadającej założonemu wzorowi sumarycznemu. Czystość związku należy udowodnić w inny sposób. Wymagania większości czasopism odnośnie dokładnych pomiarów masy są następujące: 1. Pomiar musi dotyczyć jonu molekularnego lub pseudomolekularnego (a nie jonów fragmentacyjnych). 2. Dokładność pomiaru powinna wynosić 5 ppm (w niektórych czasopismach dopuszcza się 1 ppm, zwłaszcza dla wyższych mas). 3. Można mierzyć masy nie przekraczające 1 u

13 Zależność liczby możliwych wzorów sumarycznych od dokładności pomiaru masy i masy cząsteczkowej 25 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx MM286/1 z4_mm (.863) AM2 (Ar,3.,.,.); Cm (43:49) : TF MS ES 5.e6 581,371 Czy jon o m/z 581 jest jonem M czy MNa? % m/z

14 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx M = C Czy jon o m/z 581 jest S MNa = C jonem M czy MNa? Si Na 27 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx MM286/1 z4_mm (.863) AM2 (Ar,3.,.,.); Cm (43:49) : TF MS ES 5.e6 Jeśli jon m/z 581 jest jonem M, to jego klaster powinien mieć masę 2 x 58 1 = Jeśli jon m/z 581 jest jonem MNa, to jego klaster powinien mieć masę 2 x = % m/z

15 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx Najlepszy wzór: C Si 2 Na zgadza się ze wzorem: 2 x C Si Na 29 Profile izotopowe kombinacji pospolitych pierwiastków dwuizotopowych typu M2 3 15

16 Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego Widmo zmierzone Intensity (%age) Low esolution M/z Intensity (%age) Widmo obliczone dla składu: C F 6 N 2 5 u Mass Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI); stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego; stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych

17 Typowe zanieczyszczenia próbek obserwowane w widmach masowych 33 Węglowodory nasycone (na przykładzie triakontanu C 3 62 ) M =

18 Silikony Abundance 73 #275767: SILIKNFETT SE3 (GEVELS) Si Si n Si M = m/z--> 35 Ftalan di-n-butylu M =

19 Ftalan diizooktylu M = Widmo ESI ftalanów Spec /2:19 ASC[BP = 413.3, 542] ftalan diizooktylu Na % Intensity ftalan di-n-butylu Na (ftalan diizooktylu) 2 Na Mass (m/z)

20 4. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI; identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm; badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID); dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych; wymiana izotopowa; otrzymywanie i badanie pochodnych. 39 Identyfikacja produktu reakcji na podstawie widma masowego C 2 5 C 2 5 Na Et czy? x Intensity (%age) = C M Low esolution M/z 4 2

21 Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru 41 N 2 M = 137 Intensity (%age) Intensity (%age) Low esolution M/z Widmo standardowe Widma EI Widmo po kilkakrotnym odparowaniu próbki z D Low esolution M/z d d 2 d M Na M 16 Widma ESI Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru 42 N 2 M = 137 % Intensity % Intensity Mass (m/z) d 2 -M Na 162 d 2 -M D d 3 -M d 3 -M D d-m D d 2 -M M D d-m 163 d 3 -M Na d 1 -M Na Widmo w Me/ 2 Widmo w MeD/D Mass (m/z) 21

22 MECANIZMY FAGMENTACJI JNÓW ZWIĄZKÓW GANICZNYC 43 Cechy charakterystyczne zjawiska fragmentacji jonów Proces jednocząsteczkowy; szybkość fragmentacji jest mała w porównaniu z szybkością rozpraszania energii na wszystkie stopnie swobody jonu: proces quasirównowagowy; możliwość równoległego (konkurencyjnego) przebiegu wielu procesów fragmentacji danego jonu; możliwość przebiegu reakcji następczych (fragmentacja wieloetapowa); intensywność względna piku jonu fragmentacyjnego zależy od szybkości jego tworzenia i szybkości dalszego rozpadu

23 Możliwe warianty fragmentacji jonów dodatnich Jony E E EE E E N rozerwanie nieparzystej liczby wiązań, najczęściej 1, rzadziej 3 rozerwanie parzystej liczby wiązań, najczęściej 2 Jony EE EE EE N EE E sposób preferowany: rozerwanie parzystej liczby wiązań, najczęściej 2 sposób na ogół niekorzystny, ale są bardzo liczne wyjątki: rozerwanie nieparzystej liczby wiązań, najczęściej 1 Even electron rule reguła parzystości elektronów E - jony nieparzystoelektronowe; EE - jony parzystoelektronowe 45 Zależność szybkości fragmentacji od energii jonu P(E) (Populacja jonów) (AD )* M AD AB log k(e) (Logarytm stałej szybkości) 6 5 E ABCD AB CD (proste rozerwanie wiązania) ABCD AD BC (przegrupowanie) IE M (Energia jonizacji) AE AB AE AD (Energia pojawiania się jonu) E (Energia wewnętrzna jonu) 46 23

24 Stany przejściowe w reakcjach prostego rozerwania wiązania i przegrupowania eakcja prostego rozerwania wiązania kontrolowana przez entalpię A B C D A B C D "luźny stan przejściowy" (luźno związany) A B C D ównanie Eyringa-Polanyi ego kbt k = e h # G T kbt = e h # S e # T A B C D " ciasny stan przejściowy" (ciasno związany) eakcja przegrupowania kontrolowana przez entropię A D B C 47 Zależność wyglądu widma EI octanu etylu od energii elektronów proste rozerwanie wiązania przegrupowanie M C 3 C C 2 M =

25 Jakościowe teorie fragmentacji A. Tworzenie najtrwalszych produktów fragmentacji Zgodnie z tą teorią fragmentacja przebiega w taki sposób, aby jej produktami były możliwie najtrwalsze, czyli najlepiej stabilizowane (o najniższej energii) kationy i rodniki. Teoria ta jest zgodna z postulatem ammonda: fragmentacja jest procesem endoenergetycznym, dlatego też charakteryzuje się późnym, czyli zbliżonym do budowy produktu ( product-like ) stanem przejściowym: E A M współrzędna reakcji 49 Jakościowe teorie fragmentacji A. Tworzenie najtrwalszych produktów fragmentacji cd. W tej teorii stosuje się zapisy równań reakcji fragmentacji w postaci np.: Ph C 15 Ph C m/z 15 Nie dyskutuje się lokalizacji ładunku i miejsca rodnikowego, ani mechanizmu fragmentacji. 5 25

26 Jakościowe teorie fragmentacji B. Teoria inicjowania fragmentacji poprzez zlokalizowany ładunek i/lub niesparowany elektron Lokalizację ładunku w cząsteczce określa względna łatwość oderwania elektronu. Kolejność orbitali pod względem łatwości oderwania elektronu: n > π > σ Dla elektronów n (niewiążących): N > S > > I, Br,, F 51 Jakościowe teorie fragmentacji B. Teoria inicjowania fragmentacji poprzez zlokalizowany ładunek i/lub niesparowany elektron cd. Zgodnie z tą teorią stosuje się zapis przemieszczeń elektronów podczas fragmentacji: 1 elektron 2 elektrony (para) C 2 C 2 2 C C 2 We wzorach pomija się na ogół niewiążące pary elektronowe nie uczestniczące w reakcji

27 Najważniejsze mechanizmy fragmentacji inicjowane niesparowanym elektronem i/lub ładunkiem 1. ozerwanie wiązania σ w wyniku oderwania jednego z jego elektronów - e C - σ C C Proces ten ma znaczenie tylko dla alkanów i fluorowcoalkanów. Preferencje: tworzy się kation o najwyższej rzędowości; odrywa się największa grupa alkilowa ozerwanie wiązania σ w wyniku oderwania jednego z jego elektronów cd. Przykład: - C 3 7 m/z 57 (5%) - C 2 5 m/z 1 - m/z 71 (48%) m/z 85 (4%) 54 27

28 2. ozpad α inicjowany miejscem rodnikowym (rozpad homolityczny) ozpad α dotyczy tylko jonów E. Zdolność do inicjowania rozpadu α: N > S,, π >, Br > Miejsce rodnikowe dostarcza elektron do utworzenia wiązania z sąsiednim atomem z równoczesnym rozerwaniem następnego wiązania. Proces przebiega z zachowaniem położenia ładunku. Preferencje: odrywa się największa grupa alkilowa lub grupa o najwyższej rzędowości; tworzy się kation najlepiej stabilizowany ozpad α cd. 2a) Wariant nasycony 1 α 1 1 C 2 Y 2 C Y C 2 Y Przykład: α C 2 2 C m/z 31 (1%) C α C m/z 45 (55%) 56 28

29 2. ozpad α cd. 2b) Wariant nienasycony z heteroatomem C Y 1 Przykład: α 1 1 C Y C Y α C 2 C C 2 5 C C m/z 43 (1%) 3 α C 2 C C 2 5 C m/z 57 (7%) ozpad α cd. 2c) ozpad allilowy dla alkenów C 2 C C 2 - e C 2 C C - α 2 C 2 C C2 C C2 Przykład: C 2 C α C 2 C C 2 m/z 41 (1%) C C α C 2 C C 2 m/z 55 (4%) 58 29

30 3. ozpad inicjowany ładunkiem (indukcyjnie; rozpad heterolityczny) W rozpadzie tym ulega przemieszczeniu cała para elektronowa w kierunku atomu z ładunkiem dodatnim. ozpad ten może przebiegać zarówno dla jonów E, jak i EE. Następuje przeniesienie ładunku. Preferencje: Tworzy się trwalszy kation (większy lub o wyższej rzędowości). 3a) Wariant nasycony dla jonów E Przykład: 1 i Y 1 Y i C 2 5 C 2 C 5 C m/z 29 (4%) (ponadto C 2 = C 2 5, m/z 59, 4%, z rozpadu α) ozpad inicjowany ładunkiem cd. 3b) Wariant nienasycony dla jonów E C Y i 1 C Y 1 Przykład: C C i C C (ponadto C m/z 43, 36%, z rozpadu α) m/z 57 (1%) Praktycznie nie obserwuje się powstawania kationu dominuje powstawanie kationu o wyższej rzędowości 6 3

31 Konkurencja rozpadu α i rozpadu i Grupa alkilowa: I-rzędowa α i m/z 57 C m/z 43 C 1% 15% α C m/z 43 1% II-rzędowa i C 38% m/z 57 III-rzędowa α i C m/z 43 C 36% 1% m/z ozpad inicjowany ładunkiem cd. 3c) ozpad jonów EE - wariant nasycony Przykład: i Y 2 Y 2 C 2 5 CI i C C d) ozpad jonów EE - wariant nienasycony Przykład: i Y C 2 Y C 2 α C 2 C 2 C 5 C i i C2 5 C

32 4. Przegrupowanie wodoru do miejsca nienasycenia (przegrupowanie McLafferty ego) Przegrupowanie McLafferty ego przebiega poprzez 6-członowy, cykliczny stan przejściowy. Y r 1 Y 1 α Y 1 Y 1 Zachowanie ładunku - - jon zyskuje 1 atom Inna forma zapisu: Y 1 A B Y i 1 Y 1 Przeniesienie ładunku - - jon traci 1 atom r rearrangement of ydrogen Przegrupowanie McLafferty ego cd. Przykład związki karbonylowe: r α = = Ph 4% 5% i = = Ph 5% 1% 64 32

33 5. Przegrupowanie wodoru do miejsca nasyconego Przykłady efekt orto przebiegający poprzez 6-członowy stan przejściowy: Kwasy benzoesowe i ich estry podstawione z pozycji orto Y Y = C,, N r =, alkil Y i - odrywa się cząsteczka obojętna i pozostaje kationorodnik (E E ) Y C orto-nitrotoluen (i inne orto-nitroalkilobenzeny) N C C r α - N N N (możliwe też inne struktury) = alkil odrywa się rodnik i powstaje kation (E EE ) 65 A. Pierścień nasycony 6. eakcje otwarcia pierścienia α - e - σ m/z 56 (1%) B. Pierścień cykloheksenu (reakcja retro-dielsa-aldera) α - e - α α Zachowanie ładunku = 8% = Ph,4% i Przeniesienie ładunku = 3% = Ph 1% 66 33

34 Klasyfikacja podstawowych typów fragmentacji protonowanego łańcucha peptydowego x n 2 N C C y n 2 N z n C C (...) N C 1 2 n n1 x 1 C y 1 2 N z 1 C C 2 2 a 1 b 1 c 1 a n b n c n 67 Ustalanie sekwencji peptydu na podstawie widma ESI-CID-MS Μ = 129,3 Glu Spektrometr: Finnigan MAT LCQ J.. Yates III, J. Mass Spectrom., 33, 1 (1998) 68 34

35 IDENTYFIKACJA ZANIECZYSZCZEŃ CLPIDGELU S 3 C N 69 Widmo ESI() opidogrelu Q1: to 2.46 min from Sample 3 (9/1 ACN 2 Ac.6 ml/min 27 nm) of Max. 2.9e6 cps. 2.9e6 2.5e6 C 3 N S M 2.e6 1.5e e6 5.e m/z, amu 7 35

36 Fragmentacja opidogrelu MS2 (322.1) CE (1): to 5.39 min from Sample 1 (frag 322) of opidogrel2.wiff (Unknown Ion Source) 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 C 3 N S Max. 4.e5 cps. N S DA C 2 N S 2.4e5 2.2e5 2.e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e M m/z, amu MS2 (324.) CE (2): to min from Sample 2 (frag 324) of opidogrel2.wiff (Unknown Ion Source) 1.5e Max. 1.1e5 cps. m/z 322/324 m/z 212/214 -C predominates at low collision energy C 2 N -C 2 =N predominates at high collision energy C 1.e5 9.5e4 9.e4 8.5e4 m/z 184/186 m/z183/185 8.e4 7.5e4 7.e4 6.5e4 - -C 5.5e4 5.e4 4.5e4 4.e4 3.5e4 3.e4 2.5e M N -CN C 2 6.e4 2.e4 1.5e4 1.e m/z, amu m/z 152/154 m/z125/127 m/z155/ Chromatogramy PLC/UV i GC/MS opidogrelu Detector A, Channel 1 from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_Q1.wiff Max. 4.e6. 1.4e e5 1.2e5 1.1e e5 9.e4 8.e4 AU/uV 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e e4 1.e Time, min 7mg_mlMe_slit_1_1_start1stop operator: Marian lejnik clopid1527_ci 1 GCT Premier 1-ct-27 18:9: TF MS CI TIC % Time

37 Synteza opidogrelu (ostatni etap) S S N C 2 / N eakcja typu Picteta-Spenglera (wariant reakcji Mannicha) 73 Zanieczyszczenie opidogrelu o masie 351/353 Da EPI (352.4) CE (2): Exp 2, 5.98 to min from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_frag3... Max. 4.6e6 cps. EPI (322.5) CE (2): Exp 2, to min from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra... Max. 4.5e6 cps. 4.5e e e6 Zanieczyszczenie 4.e6 opidogrel 3.5e6 3.5e6 3.e6 3.e6 2.5e e e6 2.e6 1.5e6 1.e e6 1.e e e m/z, amu m/z, amu óżnica masy: 3 Da (np. C 2 ). Drogi fragmentacji: identyczne jak w opidogrelu powstają te same jony fragmentacyjne. Wnioski: badany związek ma grupę o masie 31 Da w pierścieniu tiofenowym N S Prawdopodobna struktura: 74 37

38 N 11/9/215 Zanieczyszczenie opidogrelu o masie 323/325 Da EPI (324.) CE (3): Exp 1, to min from Sample 2 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra e6 9.5e6 9.e6 8.5e6 8.e6 7.5e6 7.e6 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.5e6 1.e6 5.e Fragmentacja jonu m/z 324 ( 35 ) Max. 9.9e6 cps m/z, amu EPI (326.) CE (3): Exp 1, 1.97 to min from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 M M 6.e e e Max. 2.8e6 cps. Fragmentacja jonu m/z 326 ( 37 ) m/z, amu óżnica masy: 2 Da (2). Drogi fragmentacji: istotne różnice w porównaniu z opidogrelem, ale niektóre jony wspólne (183/185, 155/157). Wnioski: brak fragmentacji typu DA świadczy o nieobecności pierścienia 6-członowego z atomem azotu. N S Prawdopodobna struktura: 75 Proponowane drogi fragmentacji zanieczyszczenia o masie 323/325 C 2 N -C C 2 N S N S m/z 226/228 m/z 198/2 - C 2 =N- m/z 324/326 - C S C -C S m/z 183/185 m/z155/157 m/z 111 m/z 264/