Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 24

Transkrypt

1 Wrzesień 2010 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 24 Wersja nr 1 Do celów diagnostyki in vitro PL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R PL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Technologie badań i oznaczania próbek QIAGEN jest wiodącym dostawcą innowacyjnych technologii badań i oznaczania służących do izolowania i wykrywania zawartości dowolnych próbek biologicznych. Dzięki wysokiej jakości nasze zaawansowane produkty i usługi zapewniają pomyślne przeprowadzanie badań na każdym etapie od próbek po wyniki. QIAGEN wyznacza standardy w następujących dziedzinach: oczyszczanie DNA, RNA i białek oznaczanie kwasów nukleinowych i białek badania microrna oraz irna automatyka technologii badań i oznaczania próbek Naszą misją jest umożliwienie klientom osiągania doskonałych i przełomowych wyników badań. Więcej informacji można znaleźć na stronie

3 Zawartość Zawartość zestawu 4 Symbole 5 Transport i przechowywanie 6 Przeznaczenie 6 Ograniczenia w zakresie stosowania produktu 7 Pomoc techniczna 7 Kontrola jakości 8 Informacje dotyczące bezpieczeństwa 8 Wstęp 9 Zasada działania i procedura 10 Charakterystyka działania testu 11 Sprzęt i odczynniki zapewniane przez użytkownika 14 Ważne informacje 15 Ogólne środki bezpieczeństwa 15 Materiał próbek 15 Izolacja DNA 15 Kontrola 16 Protokóły 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q : Reakcja PCR przy użyciu odczynników do PCR dostarczonych z zestawem therascreen EGFR Pyro 20 3: Immobilizacja produktów reakcji PCR na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance 23 4: Przygotowanie próbek przed pirosekwencjonowaniem w aparacie PyroMark Q : Obsługa systemu PyroMark Q : Analiza testu PyroMark Q24 32 Przewodnik rozwiązywania problemów 40 Załącznik A: Przygotowywanie oznaczeń za pomocą zestawu therascreen EGFR Pyro 43 Załącznik B: Opróżnianie pojemnika na odpady oraz wanienek 48 Literatura 49 Informacje dotyczące zamawiania 50 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010 3

4 Zawartość zestawu Zestaw therascreen EGFR Pyro (pudełko 1 z 2) Zestaw therascreen EGFR Pyro (24) Nr katalogowy Liczba reakcji 24 Primer sekwencjonujący EGFR µl Primer sekwencjonujący EGFR Ex 19 Del 24 µl Primer sekwencjonujący EGFR µl Primer sekwencjonujący EGFR µl Primer sekwencjonujący EGFR µl Primer PCR EGFR µl Primer PCR EGFR Ex19 Del 24 µl Primer PCR EGFR µl Primer PCR EGFR µl Mieszanina do PCR PyroMark, 2x 2 x 850 µl Koncentrat CoralLoad, 10x 1,2 ml H 2 O 5 x 1,9 ml Niemetylowany kontrolny DNA, 10 ng/µl 100 µl 4 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

5 Bufory i odczynniki therascreen (pudełko 2 z 2) Bufory i odczynniki therascreen Bufor do wiązania PyroMark Bufor do hybrydyzacji PyroMark Roztwór do denaturacji PyroMark* Bufor do płukania PyroMark, 10x Mieszanina enzymów Mieszanina substratów 2 x 10 ml 2 x 10 ml 2 x 250 ml 2 x 25 ml 2 fiolki 2 fiolki datpαs 2 x 1180 µl dctp 2 x 1180 µl dgtp 2 x 1180 µl dttp 2 x 1180 µl Instrukcja obsługi 1 * Zawiera wodorotlenek sodu. Symbole <N> Zawiera ilość odczynników wystarczającą na przeprowadzenie <N> testów. Termin przydatności Wyrób diagnostyczny do badań metodą in vitro Numer katalogowy Numer partii Numer materiału Składniki Zawartość Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010 5

6 Numer Zakres dopuszczalnych temperatur Oficjalny producent Należy zapoznać się z instrukcją obsługi Ważna informacja Transport i przechowywanie Zestaw therascreen EGFR Pyro jest dostarczany w dwóch pudełkach. Zestaw therascreen EGFR Pyro (pudełko 1 z 2) jest dostarczany na suchym lodzie. Mieszanina do PCR PyroMark, koncentrat CoralLoad, niemetylowany kontrolny DNA oraz wszystkie primery po otrzymaniu powinny być przechowywane w temperaturze od 25 do 15 C. Bufory i odczynniki therascreen (pudełko 2 z 2) zawierające bufory, mieszaninę enzymów, mieszaninę substratów, datpαs, dctp, dgtp i dttp (odczynniki do pirosekwencjonowania (Pyrosequencing )) są dostarczane w opakowaniach termicznych. Składniki te po otrzymaniu należy przechowywać w temperaturze od 2 do 8 C. Aby zminimalizować ryzyko obniżenia aktywności składników, zaleca się przechowywać mieszaninę enzymów i mieszaninę substratów w dostarczonych fiolkach. Rekonstytuowane mieszaniny enzymów i substratów są stabilne przez co najmniej 5 dni w temperaturze od 2 do 8 C. Mieszaniny te można zamrażać i przechowywać w odpowiednich fiolkach w temperaturze od 25 do 15 C. Nie należy zamrażać i rozmrażać odczynników więcej niż 3-krotnie. Nie należy zamrażać nukleotydów. Zestaw therascreen EGFR Pyro jest stabilny do daty ważności, jeśli jest przechowywany w zalecanych warunkach. Przeznaczenie Zestaw therascreen EGFR Pyro jest testem in vitro przeznaczonym do wykrywania sekwencji kwasów nukleinowych techniką pirosekwencjonowania. Służy do ilościowego wykrywania mutacji w eksonach 18, 19, 20 i 21 ludzkiego fenu EGFR w genomowym DNA uzyskanym z próbek tkanki ludzkiej. Zestaw therascreen EGFR Pyro ułatwia lekarzom wyselekcjonowanie pacjentów z nowotworami kwalifikujących się do leczenia inhibitorami kinazy tyrozynowej. 6 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

7 Zestaw przeznaczony wyłącznie do stosowania z systemami PyroMark Q24. Systemy PyroMark Q24 zawierają następujące elementy: aparat PyroMark Q24 oraz aparat PyroMark Q24 MDx (określany w dalszej części dokumentu jako PyroMark Q24); stacja podciśnieniowa PyroMark Q24 oraz stacja podciśnieniowa PyroMark Q24 MDx (określana w dalszej części dokumentu jako stacja podciśnieniowa PyroMark Q24); oprogramowanie PyroMark Q24 oraz oprogramowanie PyroMark Q24 MDx (określane w dalszej części dokumentu jako oprogramowanie PyroMark Q24). Produkt może być obsługiwany przez wykwalifikowanych pracowników, takich jak technicy czy lekarze przeszkoleni w dziedzinie procedur diagnostyki in vitro, technik biologii molekularnej oraz obsługi systemu PyroMark Q24. Ograniczenia w zakresie stosowania produktu Wszelkie wyniki diagnostyczne należy interpretować łącznie z innymi obserwacjami klinicznymi lub laboratoryjnymi. Użytkownik odpowiada za walidację działania systemu w zakresie procedur laboratoryjnych nieobjętych badaniami działania przeprowadzonymi przez firmę QIAGEN. Pomoc techniczna Firma QIAGEN szczyci się wysoką jakością i dostępnością swojej pomocy technicznej. W naszych serwisach pracują doświadczeni naukowcy mający rozległą wiedzę praktyczną i teoretyczną w dziedzinie technologii badań i oznaczania próbek oraz stosowania produktów firmy QIAGEN. W przypadku pytań lub ogólnych problemów dotyczących zestawu therascreen EGFR Pyro lub produktów firmy QIAGEN prosimy o niezwłoczny kontakt z naszą firmą. Klienci firmy QIAGEN są kluczowym źródłem informacji o zaawansowanych lub specjalistycznych zastosowaniach naszych produktów. Informacje te pomogą innym naukowcom i badaczom prowadzącym projekty dla firmy QIAGEN. Z tego względu zachęcamy do kontaktowania się z naszą firmą w przypadku propozycji dotyczących działania produktu lub nowych zastosowań i technik. W celu uzyskania pomocy technicznej prosimy o kontakt z Centrum pomocy technicznej pod adresem lub telefon do jednego z serwisów lub lokalnych dystrybutorów firmy QIAGEN (informacje znajdują się na tylnej okładce oraz na stronie Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010 7

8 Kontrola jakości Zgodnie z poświadczonym certyfikatem ISO systemem zarządzania jakością firmy QIAGEN każda partia zestawów therascreen EGFR Pyro przechodzi testy zgodności ze wstępnie określoną specyfikacją w celu zapewnienia spójnej jakości produktu. Informacje dotyczące bezpieczeństwa W czasie pracy ze środkami chemicznymi należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. W celu uzyskania dodatkowych informacji należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS). Są one dostępne online w wygodnym formacie PDF pod adresem Na tej stronie można wyszukiwać, wyświetlać i drukować karty charakterystyki dla wszystkich zestawów i składników zestawów firmy QIAGEN. Całodobowa informacja w nagłych sytuacjach Informacja medyczna w nagłych sytuacjach jest dostępna przez całą dobę w języku angielskim, francuskim i niemieckim pod następującym numerem telefonu: Centrum Informacji Toksykologicznej, Moguncja (Niemcy) Tel.: Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

9 Wstęp Zestaw therascreen EGFR Pyro umożliwia ilościowe wykrywania mutacji w kodonach 719, 768, 790 i , a także delecji i mutacji złożonych w eksonie 19 ludzkiego genu EGFR. Zestaw składa się z 4 oznaczeń PCR: pierwsze służy do wykrywania mutacji w kodonie 719 (ekson 18), drugie do wykrywania mutacji w kodonach 768 i 790 (ekson 20), trzecie służy do wykrywania mutacji w kodonach od 858 do 861 (ekson 21), natomiast czwarte oznaczenie przeznaczone jest do wykrywania delecji i mutacji złożonych w eksonie 19. Te cztery obszary są amplifikowane osobno przez reakcję PCR i sekwencjonowane w określonym obszarze. Amplikon obejmujący kodony 768 i 790 jest podzielony na dwie reakcje sekwencjonowania. Sekwencje otaczające zdefiniowane pozycje pełnią rolę wartości normalnych i referencyjnych oraz służą do oceny ilościowej oraz jakościowej w analizie. Ekson 18 (kodon 719) FP 719 Seq 719 GGC TCCGGTG Ekson 19 FP Seq Ex 19 del 2229 TATCAAGGAATTAAGAGAAGC... RPB Ekson 20 (kodony 768 I 790) FP Seq 768 C AGC GT RPB Ex 19 del RPB FP Seq 790 ATC ACG CA RPB Ekson 21 (kodony ) FP Seq CTG GCCAAA CTG CTGGG RPB Rysunek 1. Ilustracja oznaczania mutacji w genie EGFR. Przedstawiona sekwencja jest analizowaną sekwencją normalnej próbki. FP: primery PCR przednie; RPB: primery PCR wsteczne (B oznacza biotynylację); Seq: primery sekwencjonujące. Wszystkie testy są sekwencjonowane zgodnie z kierunkiem replikacji. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010 9

10 Zestaw składa się z mieszaniny primerów PCR oraz primera sekwencjonującego dla poszczególnych oznaczeń. Primery są dostarczane w postaci roztworu. Każda fiolka zawiera 24 µl primera lub mieszaniny primerów. Zasada działania i procedura Poniższy schemat ilustruje procedurę oznaczania. Po reakcji PCR przy użyciu primerów ukierunkowanych na eksony 18, 19, 20 i 21 następuje immobilizacja aplikonów na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance. Zostaje przygotowana pojedyncza nić DNA, a odpowiednie primery sekwencjonujące ulegają hybrydyzacji z DNA. Próbki są następnie analizowane w systemie PyroMark Q24 przy użyciu pliku konfiguracji testu oraz pliku testu. Do analizy testu zaleca się zastosowanie narzędzia EGFR Plug-in Report. Test można także przeanalizować za pomocą narzędzia zintegrowanego z systemem PyroMark Q24. Następnie można dostosować sekwencję do analizy w celu wykrywania różnych delecji w eksonie 19 i rzadkich mutacji w innych eksonach po przeprowadzeniu testu (patrz Protokół 6: Analiza testu PyroMark Q24 na stronie 32 oraz Załącznik A na stronie 43). Schemat procedury dla zestawu therascreen EGFR Pyro Przygotowanie oznaczenia i testu Przygotowanie pliku oznaczenia (Załącznik A) Przygotowanie pliku testu (Protokół 1) Przygotowanie próbki Reakcja PCR (Protokół 2) Immobilizacja (Protokół 3) Przygotowanie próbek (Protokół 4) Test przy użyciu systemu PyroMark Q24 (Protokół 5) Analiza testu przy użyciu systemu PyroMark Q24 (Protokół 6) Raport 10 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

11 Charakterystyka działania testu Próg zerowy i próg wykrywalności Próg zerowy (LOB) oraz próg wykrywalności (LOD) zostały ustalone dla określonej liczby mutacji przy użyciu mieszaniny plazmidów (tabela 1, strona 12). Progi LOB i LOD zostały ustalone zgodnie z wytyczną EP17-A instytutu CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Protocol for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline (Zatwierdzona wytyczna w zakresie protokołu określania progów wykrywalności i progów ilościowych). Błędy α i β (odpowiednio dla wyniku fałszywie pozytywnego i fałszywie negatywnego) ustawiono na poziomie 5%. Wartości LOB przedstawiają zmierzoną częstotliwość uzyskaną przy użyciu próbki typu dzikiego. Wartości LOD przedstawiają najniższą wartość sygnału (zmierzoną częstotliwość), którą można uznać za pozytywny wynik odpowiadający odpowiedniej mutacji. Mutacja CTG CGG w eksonie 21: W przypadku tej mutacji pomiary próbek z niskim poziomem mutacji dały rozkład niegaussowski. Z tego względu wartość LOD została określona inną metodą zgodnie z wytyczną EP17-A instytutu CLSI. Dla najniższych sygnałów oznaczających wystąpienie mutacji (LOD) w tych pozycjach wybrano wartość o 2% wyższą niż odpowiedni poziom bazowy określony przez 95. percentyl uzyskany w wyniku pomiaru zerowego. Gdy analizowano próbkę o poziomie mutacji 5,5%, 95% wyników (n = 72) wywoływało sygnał, który można było potraktować jako wynik pozytywny ( LOD, tzn. 2,6%). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

12 Tabela 1. Wartości LOB i LOD określone dla specyficznych mutacji Mutacja Delecje w eksonie 19 LOB (%) LOD (%) Nr identyfikacyjny COSMIC* (V47) 2233del15 0,6 1, _2248>AATTC 0,8 1, _2252>AAT 1,1 2, del15 0,9 1, del15 0,2 1, _2252>T 0,8 2, _2255>T 0,6 1, del15 0,9 1, del18 0,5 1, _2248>GC 0,8 2, _2252>GCA 0,2 0, del18 0,3 1, _2248>C 1,8 2, _2251>C 0,6 1, _2258>CA 1,3 3, del18 0,6 1, del9 2,0 3, del12 0,4 1, del15 0,9 1, del18 0,9 1, * Z katalogu nowotworowych mutacji somatycznych dostępnego online na stronie ośrodka Sanger Institute pod adresem Dalsza część tabeli na następnej stronie 12 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

13 Tabela 1. Ciąg dalszy Mutacja Kodon 719 w eksonie 18 (GGC) LOB (%) LOD (%) Nr identyfikacyjny COSMIC* (V47) AGC 0,9 1, TGC 1,0 1, GCC 4,7 9, Kodon 768 w eksonie 20 (AGC) ATC 2,6 5, Kodon 790 w eksonie 20 (ACG) ATG 7,0 10, Kodon 858 w eksonie 21 (CTG) CGG 0,6 2,6 (5,5) 6224 Kodon 861 w eksonie 21 (CTG) CAG 3,2 4, CGG 1,9 4, * Z katalogu nowotworowych mutacji somatycznych dostępnego online na stronie ośrodka Sanger Institute pod adresem Najniższy poziom mutacji w próbce mający odzwierciedlenie w zmierzonej częstotliwości LOD. Powyższe wartości ustalono na podstawie testów, w których otrzymano sygnał o wartości 30 względnych jednostek świetlnych (RLU) uzyskiwany z 10 ng DNA wyizolowanego z utrwalonej formaliną i zanurzonej w parafinie tkanki. Zaleca się potwierdzenie metody w warunkach laboratoryjnych. Na stronie dostępne są dodatkowe informacje na temat działania zestawu therascreen EGFR Pyro. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

14 Sprzęt i odczynniki zapewniane przez użytkownika W czasie pracy ze środkami chemicznymi należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. W celu uzyskania dodatkowych informacji należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) uzyskanymi od producentów poszczególnych produktów. Zestaw do izolacji DNA (patrz Izolacja DNA na stronie 15) Pipety z regulacją* Sterylne końcówki do pipet z filtrami do przygotowania reakcji PCR Mikrowirówka* Termocykler* i odpowiednie probówki PCR Sefaroza sprzężona ze streptawidyną (Streptavidin Sepharose High Performance) (GE Healthcare, nr katalogowy ; PyroMark Q24 (nr katalogowy lub )* Oprogramowanie PyroMark Q24 (nr katalogowy lub ) Płytka PyroMark Q24 (nr katalogowy ) Kaseta PyroMark Q24 (nr katalogowy ) Stacja ciśnieniowa PyroMark Q24 (nr katalogowy lub )* Blok grzewczy* z możliwością ogrzewania do temperatury 80 C Płytka 24-dołkowa PCR lub paski probówek do reakcji PCR Probówki na pasku z zatyczkami Woda o wysokiej czystości (Milli-Q 18,2 MΩ x cm lub odpowiednik). W zestawie PCR znajduje się ilość wody wystarczająca do rozpuszczenia mieszaniny enzymów, mieszaniny substratów oraz do przygotowania roztworu do reakcji immobilizacji DNA. Dodanie wody o wysokiej czystości jest wymagane do rozcieńczenia buforu do płukania PyroMark, 10x. Etanol (70%) * Należy upewnić się, że dokonano sprawdzenia i kalibracji aparatów zgodnie z zaleceniami producenta. Z oznaczeniem CE-IVD zgodnie z dyrektywą UE 98/79/WE. Pozostałe wyszczególnione produkty nie mają oznaczenia CE-IVD zgodnego z dyrektywą UE 98/79/WE. 14 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

15 Ważne informacje Ogólne środki bezpieczeństwa Użytkownik powinien zawsze zwracać uwagę na następujące kwestie: W celu uzyskania optymalnych wyników należy ściśle przestrzegać wytycznych zawartych w instrukcji obsługi. Rozcieńczanie odczynników wbrew opisowi zawartemu w niniejszej instrukcji obsługi nie jest zalecane i skutkuje utratą wydajności. Używać sterylnych końcówek do pipet z filtrami. Materiały pozytywne (próbki materiałów, pozytywne próbki kontrolne i amplikony) przechowywać i ekstrahować oddzielnie względem innych odczynników i dodawać je do mieszaniny reakcyjnej w osobnym miejscu. Przed rozpoczęciem testu rozmrozić składniki do temperatury pokojowej (15 25 C). Po rozmrożeniu wymieszać składniki (przez wielokrotne pipetowanie lub energiczne wytrząsanie) i krótko odwirować. Materiał próbek Wszystkie próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiał próbek musi być ludzkim DNA pobranym z krwi lub z utrwalonych formaliną i zanurzonych w parafinie próbek tkanki. Nie używać próbek tkanki ludzkiej od pacjentów, którym podawano heparynę. Nie używać próbek krwi pobranych do probówek zawierających antykoagulant (heparynę). Heparyna wpływa na przebieg reakcji PCR. Izolacja DNA Działanie systemu zostało przygotowane przy użyciu zestawu EZ1 DNA Tissue oraz zestawu QIAamp DNA FFPE Tissue do ekstrakcji DNA z utrwalonych formaliną i zanurzonych w parafinie próbek tkanki nowotworu. W przypadku minizestawu do ekstrakcji DNA z próbek krwi QIAamp DSP działanie systemu zostało przygotowane przy użyciu próbek krwi od zdrowego dawcy częściowo zmieszanych z komórkami nowotworowymi. Zestawy firmy QIAGEN przedstawione w tabeli 2 (strona 16) są przeznaczone do oczyszczania DNA ze wskazanych próbek z tkanki ludzkiej i stosowania z zestawem therascreen EGFR Pyro. Oczyszczanie DNA należy wykonywać zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcjach obsługi zestawów. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

16 Tabela 2. Zestawy do oczyszczania DNA zalecane do stosowania z zestawem therascreen EGFR Pyro Materiał próbek Tkanka zanurzona w parafinie Krew Zestaw do izolacji kwasów nukleinowych QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Numer katalogowy (QIAGEN) Zestaw EZ1 DNA Tissue (48)* Minizestaw do ekstrakcji DNA z próbek krwi QIAamp DSP * Zgodnie z protokołem przeznaczony do stosowania z tkanką zanurzoną w parafinie. Zestaw EZ1 DNA Tissue należy stosować razem z produktem EZ1 Advanced (nr katalogowy lub ) oraz kartą EZ1 Advanced DNA Paraffin Section Card (nr katalogowy ), z produktem EZ1 Advanced XL (nr katalogowy ) oraz kartą EZ1 Advanced XL DNA Paraffin Section Card (nr katalogowy ) lub z produktem BioRobot EZ1 (nr katalogowy ; produkt niedostępny) oraz kartą EZ1 DNA Paraffin Section Card (nr katalogowy ). Z oznaczeniem CE-IVD zgodnie z dyrektywą UE 98/79/WE. Kontrola W zestawie jest dostarczane niemetylowane kontrolne DNA, które jest używane jako kontrola pozytywna dla reakcji PCR oraz sekwencjonowania. Ponadto powinna być zawsze dołączona kontrola negatywna (bez matrycy DNA). 16 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

17 Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 Ważna czynność do wykonania przed rozpoczęciem procedury W razie potrzeby można potwierdzić próg zerowy LOB, używając próbki normalnej do uzyskania pełnej płytki wyników. Aby uzyskać dodatkowe informacje, należy zapoznać się z wytyczną EP17-A instytutu CLSI Protocol for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline (Zatwierdzone wytyczne w zakresie protokołu określania progów wykrywalności i progów ilościowych). Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Jeśli nie zainstalowano narzędzia EGFR Plug-in Report, należy utworzyć przygotowanie oznaczenia zgodnie z opisem w załączniku A. Tę operację wystarczy przeprowadzić jeden raz przed pierwszym wykonaniem oznaczenia EGFR (patrz Załącznik A na stronie 43). Procedura 1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi. Zostanie utworzony plik nowego testu. 2. Wprowadzić parametry testu (patrz część Parametry testu na stronie 19). 3. Przygotować płytkę, dodając próby dla 5 różnych reakcji sekwencjonowania do dołków odpowiadających próbkom do analizy. Jako kontrolę zaleca się stosowanie dostarczonej w zestawie negatywnej próbki (bez matrycy DNA) oraz niemetylowanego kontrolnego DNA. 4. Po przygotowaniu testu do wykonania na aparacie PyroMark Q24 należy wydrukować listę wymaganych objętości mieszaniny enzymów, mieszaniny substratów i nukleotydów, a także parametry przygotowania płytki. Z menu Tools (Narzędzia) wybrać opcję Pre Run Information (Informacje przygotowawcze). Po wyświetleniu raportu kliknąć ikonę. 5. Zamknąć plik testu i skopiować go do pamięci USB (dostarczonej z systemem) przy użyciu Eksploratora Windows. Wydrukowanych informacji przygotowawczych można użyć jako szablonu do przygotowywania próbek (patrz część Protokół 3: Immobilizacja produktów reakcji PCR na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance na stronie 23). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

18 Informacje na temat przeprowadzania testu przy użyciu płytki na aparacie PyroMark Q24 znajdują się w części Protokół 5: Obsługa systemu PyroMark Q24 na stronie 29). 18 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

19 Parametry testu Run name (Nazwa testu): Instrument method (Metoda badania za pomocą aparatu): Plate ID (Identyfikator płytki): Bar code (Kod kreskowy): Kit and Reagent ID (Identyfikatory zestawu oraz odczynnika): Run note (Uwaga o teście): Nazwę testu podaje się podczas zapisywania pliku. Zmiana nazwy pliku powoduje także zmianę nazwy testu. Wybrać metodę badania zgodnie z odczynnikami i kasetą, które zostaną użyte do testu. Zapoznać się z instrukcjami dostarczonymi z produktem. Opcjonalnie: wprowadzić identyfikator płytki PyroMark Q24. Opcjonalnie: wprowadzić numer kodu kreskowego płytki lub, jeśli jest dostępny czytnik kodów podłączony do komputera, umieścić kursor myszy w polu tekstowym Barcode (Kod kreskowy), klikając to pole, i zeskanować kod kreskowy. Opcjonalnie: wprowadzić numer partii zestawu therascreen EGFR Pyro, który ma zostać użyty. Numer partii można znaleźć na etykiecie produktu. Zalecamy wprowadzenie zarówno identyfikatora odczynnika, jak i identyfikatora zestawu, aby monitorować ewentualne nieoczekiwane problemy z odczynnikami. Opcjonalnie: wprowadzić uwagę o zawartości lub celu testu. Dodawanie plików oznaczenia Aby dodać oznaczenie do dołka, można wykonać dowolną z następujących czynności: Kliknąć prawym przyciskiem dołek i wybrać z menu podręcznego opcję Load Assay (Załaduj oznaczenie). Wybrać oznaczenie w przeglądarce skrótów, a następnie kliknąć i przeciągnąć oznaczenie do dołka. Dołek jest oznaczony odpowiednim kolorem zgodnie z oznaczeniem załadowanym do dołka. Wprowadzanie identyfikatorów próbek oraz uwag Aby wprowadzić identyfikator próbki lub uwagę, należy zaznaczyć komórkę i wprowadzić tekst. Aby dokonać edycji identyfikatora próbki lub uwagi, należy zaznaczyć komórkę (zostanie zaznaczona jej bieżąca zawartość) lub kliknąć ją dwukrotnie. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

20 Protokół 2: Reakcja PCR przy użyciu odczynników do PCR dostarczonych z zestawem therascreen EGFR Pyro Ten protokół służy do 4 oddzielnych amplifikacji PCR obszarów zawierających kodon 719 (ekson 18), kodony 768 i 790 (ekson 20), kodony (ekson 21) lub delecje i mutacje złożone w eksonie 19 przy użyciu primerów therascreen EGFR Pyro. Ważne czynności do wykonania przed rozpoczęciem procedury Polimeraza DNA HotStarTaq w mieszaninie do PCR PyroMark wymaga przeprowadzenia aktywacji przez 15 minut w temperaturze 95 C. Wszystkie mieszaniny reakcyjne należy przygotowywać w miejscu oddzielonym od obszaru oczyszczania DNA, obszaru dodawania matrycy DNA do reakcji PCR, obszaru analizy produktów reakcji PCR lub obszaru przygotowania próbek do pirosekwencjonowania. W celu zminimalizowania wzajemnego zanieczyszczania materiału należy stosować jednorazowe końcówki z filtrami hydrofobowymi. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Przed otwarciem probówek z primerami PCR należy je krótko odwirować w celu zebrania zawartości na dnie probówki. W razie potrzeby dostosować stężenie roztworu kontrolnego oraz roztworu DNA próbki, tak aby wynosiło od 0,4 do 2 ng/µl. Procedura 1. Rozmrozić wszystkie niezbędne składniki (patrz tabela 3). Przed użyciem dobrze wymieszać. 2. Przygotować mieszaninę do reakcji dla każdego primera PCR przygotowanego zgodnie z informacjami w tabeli 3. Mieszanina do reakcji zawiera zwykle wszystkie składniki wymagane do reakcji PCR oprócz właściwej próbki. Przygotować objętość mieszaniny do reakcji większą od wymaganej dla łącznej liczby oznaczeń PCR do wykonania. 20 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

21 Tabela 3. Przygotowanie mieszaniny do reakcji dla każdej mieszaniny primerów PCR Składnik Objętość/reakcja Mieszanina do PCR PyroMark, 2x 12,5 µl Koncentrat CoralLoad, 10x 2,5 µl Primer PCR EGFR 719 lub Primer PCR EGFR Ex 19 Del lub Primer PCR EGFR 768 i 790 lub Primer PCR EGFR µl Woda (dostarczona w zestawie) 4 µl Łączna objętość 20 µl 3. Wymieszać dokładnie mieszaninę do reakcji i rozdzielić po 20 µl mieszaniny do probówek PCR. Nie jest wymagane przechowywanie probówek PCR na lodzie, ponieważ polimeraza DNA HotStarTaq DNA jest nieaktywna w temperaturze pokojowej. 4. Dodać 5 µl matrycy DNA (2 10 ng genomowego DNA) do poszczególnych probówek PCR (patrz tabela 4) i dokładnie wymieszać. Zawsze powinna być dołączona kontrola negatywna (bez matrycy DNA). Dodatkowo przygotować reakcję z niemetylowanym kontrolnym DNA, który jest używany jako kontrola pozytywna (patrz część Kontrola na stronie 16). Tabela 4. Przygotowanie reakcji PCR Składnik Objętość/reakcja Mieszanina do reakcji 20 µl DNA w próbce 5 µl Łączna objętość 25 µl 5. Zaprogramować termocykler zgodnie z instrukcjami producenta z uwzględnieniem warunków podanych w tabeli 5. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

22 Tabela 5. Protokół zoptymalizowanych cyklów Aktywacja początkowa: Cykl 3-etapowy: Denaturacja 20 s 95 C Hybrydyzacja 30 s 53 C Przedłużenie 20 s 72 C Liczba cykli 42 Wydłużanie końcowe: Komentarze 15 min 95 C Polimeraza DNA HotStarTaq jest aktywowana na tym etapie podgrzewania. 5 min 72 C 6. Umieścić probówki PCR w termocyklerze i uruchomić odpowiedni program. 7. Po amplifikacji przejść do instrukcji opisanych w części Protokół 3: Immobilizacja produktów reakcji PCR na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance na stronie Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

23 Protokół 3: Immobilizacja produktów reakcji PCR na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance Ten protokół służy do immobilizacji matrycy DNA na nośnikach Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) przed analizą w aparacie PyroMark Q24. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Przed rozpoczęciem poczekać, aż wszystkie odczynniki i roztwory osiągną temperaturę pokojową (15 25 C). Procedura 1. Delikatnie wstrząsnąć butelką zawierającą nośnik Streptavidin Sepharose High Performance aż do uzyskania roztworu jednorodnego. 2. Przygotować roztwór do reakcji immobilizacji DNA zgodnie z informacjami podanymi w tabeli 6. Przygotować objętość większą o 10% od objętości wymaganej dla łącznej liczby reakcji do wykonania. Tabela 6. Mieszanina do reakcji immobilizacji DNA Składnik Objętość/próbka Streptavidin Sepharose High Performance 2 µl Bufor do wiązania PyroMark 40 µl Woda (dostarczona w zestawie) 28 µl Łączna objętość 70 µl 3. Dodać 70 µl roztworu do reakcji do dołków na 24-dołkowej płytce lub na pasku probówek do reakcji PCR zgodnie z informacjami dotyczącymi przygotowania testu (patrz część Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 na stronie 17). 4. Dodać 10 µl biotynylowanego produktu PCR z protokołu 2 do każdego dołka z roztworem do reakcji zgodnie z informacjami dotyczącymi przygotowania testu (patrz część Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 na stronie 17). Łączna objętość dla dołka powinna wynosić 80 µl po dodaniu roztworu do reakcji oraz produktu PCR. 5. Zamknąć płytkę PCR (lub paski) za pomocą zatyczek. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

24 Upewnić się, że nie ma wycieków pomiędzy dołkami. 6. Wstrząsać płytkę PCR w temperaturze pokojowej (15 25 C) przez 5 10 min przy 1400 obr./min. Na tym etapie przygotować stację ciśnieniową PyroMark Q24 do przygotowania próbek zgodnie z opisem w podręczniku PyroMark Q24 User Manual. 7. Przejść natychmiast do instrukcji opisanych w części Protokół 4: Przygotowanie próbek przed pirosekwencjonowaniem w aparacie PyroMark Q24 na stronie 25. Nośniki z sefarozą ulegną szybkiej sedymentacji. Jeśli minęła ponad 1 minuta od wstrząsania płytki (lub pasków), należy powtórzyć wstrząsanie 1 minutę przed zebraniem nośników. 24 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

25 Protokół 4: Przygotowanie próbek przed pirosekwencjonowaniem w aparacie PyroMark Q24 Ten protokół służy do przygotowania jednoniciowego DNA oraz hybrydyzacji primera sekwencjonującego z matrycą przed pirosekwencjonowaniem w aparacie PyroMark Q24. Ważne czynności do wykonania przed rozpoczęciem procedury Przed otwarciem probówek z primerami sekwencjonującymi należy je krótko odwirować w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Dodać 5 różnych primerów sekwencjonujących w sposób analogiczny do przygotowania testu dla płytek (patrz część Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 na stronie 17), w zależności od obszaru analizy (kodon 719 [ekson 18], kodony 768 i 790 [ekson 20], kodony [ekson 21] lub ekson 19). Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Umieścić uchwyt płytki PyroMark Q24 na bloku grzewczym o temperaturze 80 C w celu przygotowania do czynności opisanych w punkcie 17. Bufor do płukania PyroMark jest dostarczany w postaci koncentratu 10x. Przed pierwszym użyciem należy rozcieńczyć go do roztworu roboczego 1x, dodając 225 ml wody o wysokiej czystości do 25 ml buforu do płukania PyroMark 10x (końcowa objętość powinna wynosić 250 ml). Procedura 1. Rozcieńczyć odpowiednią ilość primerów sekwencjonujących (Seq Primer EGFR 719, Seq Primer EGFR 768, Seq Primer EGFR 790, Seq Primer EGFR oraz Seq Primer EGFR Exon 19 Del) w buforze do hybrydyzacji PyroMark zgodnie z wartościami podanymi w tabeli 7. Przygotować objętość rozcieńczonego primera sekwencjonującego większą od wymaganej dla łącznej liczby próbek do sekwencjonowania (odpowiednia liczba próbek + jedna dodatkowa). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

26 Tabela 7. Przykładowe rozcieńczenia primerów sekwencjonujących Składnik primer sekwencjonujący EGFR 719 lub primer sekwencjonujący EGFR Ex 19 Del lub primer sekwencjonujący EGFR 768 lub primer sekwencjonujący EGFR 790 lub Primer sekwencjonujący EGFR Bufor do hybrydyzacji PyroMark Objętość/próbka Objętość dla reakcji 0,8 µl 8 µl 24,2 µl 242 µl Łączna objętość 25 µl 250 µl 2. Dodać 25 µl rozcieńczonego primera sekwencjonującego do dołków na płytce PyroMark Q24 zgodnie z informacjami dotyczącymi przygotowania testu (patrz część Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 na stronie 17). Trzymać jeden z uchwytów płytek PyroMark Q24 (dostarczonych ze stacją ciśnieniową PyroMark Q24) w temperaturze pokojowej (15 25 C) i podpierać nim płytkę podczas przygotowywania i przenoszenia. 3. Umieścić płytkę PCR (lub paski) z protokołu 3 oraz płytkę PyroMark Q24 na stole roboczym (rysunek 2). Upewnić się, że płytka jest umieszczona w takim samym kierunku co podczas ładowania próbek. 26 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

27 Rysunek 2. Umieszczanie płytki PCR (lub pasków) oraz płytki PyroMark Q24 w stacji podciśnieniowej. 4. Włączyć podciśnienie za pomocą przełącznika. 5. Ostrożnie opuścić probówki filtrujące stacji podciśnieniowej do płytki PCR (lub pasków) w celu zebrania nośników zawierających immobilizowaną matrycę. Przytrzymać probówki przez 15 s. Podczas podnoszenia stacji podciśnieniowej zachować ostrożność. Nośniki z sefarozą ulegną szybkiej sedymentacji. Jeśli minęła ponad 1 minuta od wstrząsania płytki (lub pasków), należy powtórzyć wstrząsanie 1 minutę przed zebraniem nośników. 6. Przenieść stację podciśnieniową do wanienki zawierającej 40 ml 70% etanolu (wanienka 1, rysunek 2). Przemywać probówki filtrujące przez 5 s. 7. Przenieść stację podciśnieniową do wanienki zawierającej 40 ml roztworu do denaturacji (wanienka 2, rysunek 2). Przemywać probówki filtrujące przez 5 s. 8. Przenieść stację podciśnieniową do wanienki zawierającej 50 ml buforu do płukania (wanienka 3, rysunek 2). Przemywać probówki filtrujące przez 10 s. 9. Podnieść stację podciśnieniową i odchylić o ponad 90 w pionie na 5 s, aby płyn mógł wydostać się z probówek filtrujących (rysunek 3). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

28 Rysunek 3. Ilustracja stacji podciśnieniowej podniesionej o ponad 90 w pionie. 10. Trzymając stację podciśnieniową nad płytką PyroMark Q24, należy zamknąć przełącznik podciśnienia stacji (w pozycji wyłączenia). 11. Zwolnić nośniki i umieścić je na płytce zawierającej primery sekwencjonujące, potrząsając delikatnie narzędziem na boki. 12. Przenieść stację podciśnieniową do wanienki zawierającej wodę o wysokiej czystości (wanienka 4, rysunek 2) i wstrząsać stacją przez 10 s. 13. Przemyć probówki filtrujące, zanurzając je w wodzie o wysokiej czystości (wanienka 5, rysunek 2) i stosując podciśnienie. Przemyć probówki 70 ml wody o wysokiej czystości. 14. Podnieść stację podciśnieniową i odchylić o ponad 90 w pionie na 5 s, aby płyn mógł wydostać się z probówek filtrujących (rysunek 3). 15. Zamknąć przełącznik podciśnienia na stacji podciśnieniowej (w pozycji wyłączenia) i umieścić stację w pozycji przechowywania (P). 16. Wyłączyć pompę podciśnieniową. Pod koniec dnia należy wylać resztki płynów i roztworów, a stację podciśnieniową PyroMark Q24 sprawdzić pod kątem występowania zabrudzeń i wycieków. Patrz Załącznik B na stronie Ogrzewać płytkę PyroMark Q24 z próbkami w 80 C przez 2 min przy użyciu ogrzanego uchwytu płytki PyroMark Q Zdjąć płytkę PyroMark Q24 z uchwytu i pozostawić próbki do schłodzenia do temperatury pokojowej (15 25 C) przez 5 10 min. 19. Przejść do instrukcji opisanych w części Protokół 5: Obsługa systemu PyroMark Q24 na stronie Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

29 Protokół 5: Obsługa systemu PyroMark Q24 Ten protokół opisuje umieszczanie odczynników PyroMark Gold w kasecie PyroMark Q24 oraz sposób zaczynania i kończenia testu w aparacie PyroMark Q24. Szczegółowy opis przygotowania testu znajduje się w dokumencie PyroMark Q24 podręcznik użytkownika. Ważna czynność do wykonania przed rozpoczęciem procedury Raport z informacjami przygotowawczymi znajdujący się w menu Tools (Narzędzia) (patrz część Protokół 1: Przygotowanie testu dla systemu PyroMark Q24 na stronie 17) zawiera informacje o objętości roztworów nukleotydów, enzymów i buforów substratów wymaganych do danego testu. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Włączyć aparat PyroMark Q24. Włącznik jest umieszczony z tyłu urządzenia. Procedura 1. Otworzyć pudełko zawierające bufory i odczynniki zestawu therascreen, a następnie wyjąć fiolki zawierające zamrożone mieszaniny enzymów i substratów oraz fiolki zawierające nukleotydy. 2. Rozpuścić zamrożone mieszaniny enzymów i substratów w 620 µl wody (dostarczonej w zestawie). 3. Delikatnie obrócić, aby wymieszać zawartość fiolki. Nie wirować. Pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej (15 25 C) przez 5 10 min. w celu jego całkowitego rozpuszczenia. Przed napełnieniem kasety PyroMark Q24 należy upewnić się, że roztwór nie jest mętny. Jeśli odczynniki nie będą używane bezpośrednio po przygotowaniu, należy umieścić fiolki zawierające odczynniki na lodzie* lub w lodówce. 4. Poczekać, aż odczynniki i kaseta PyroMark Q24 osiągną temperaturę pokojową (20 25 C). 5. Obrócić kasetę PyroMark Q24, tak aby etykieta była skierowana w stronę użytkownika. * W czasie pracy ze środkami chemicznymi należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. W celu uzyskania dodatkowych informacji należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) uzyskanymi od producentów poszczególnych produktów. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

30 6. Umieścić w kasecie PyroMark Q24 odpowiednie objętości mieszanin nukleotydów, enzymów i substratów w sposób pokazany na rysunku 4. Sprawdzić. czy pęcherze powietrza z pipety nie przedostały się do kasety. Rysunek 4. Kaseta PyroMark Q24 widziana z góry Przedstawione opisy znajdują się na fiolkach zawierających odczynniki. Dodać mieszaninę enzymów (E), mieszaninę substratów (S) i nukleotydy (A, T, C, G), przestrzegając wskazówek dotyczących objętości podanych w raporcie z informacjami przygotowawczymi wyświetlanym w menu Tools (Narzędzia) podczas przygotowywania testu. 7. Otworzyć osłonę kasety i włożyć napełnioną kasetę z odczynnikiem etykietą skierowaną na zewnątrz. Włożyć kasetę, a następnie docisnąć ją w dół. 8. Upewnić się, że z przodu kasety widoczna jest linia i zamknąć osłonę. 9. Otworzyć ramę płytki i umieścić płytkę na bloku grzewczym. 10. Zamknąć ramę i pokrywę aparatu. 11. Włożyć pamięć USB (zawierającą plik testu) do portu USB umieszczonego z przodu aparatu. Nie wyjmować pamięci USB z portu przed zakończeniem testu. 12. Wybrać opcję Run (Test) w menu głównym (za pomocą przycisków i poniżej ekranu), a następnie nacisnąć przycisk OK. 13. Wybrać plik testu za pomocą przycisków i na ekranie. Aby wyświetlić zawartość folderu, należy wybrać folder i nacisnąć pozycję Select (Wybierz). Aby powrócić do poprzedniego widoku, należy nacisnąć pozycję Back (Wstecz). 14. Po wybraniu pliku testu nacisnąć pozycję Select (Wybierz), aby rozpocząć test. 15. Gdy test zostanie zakończony, a aparat potwierdzi zapisanie pliku testu w pamięci USB, nacisnąć pozycję Close (Zamknij). 16. Wyjąć pamięć USB. 17. Otworzyć pokrywę aparatu. 18. Otworzyć osłonę kasety i wyjąć kasetę z odczynnikiem, podnosząc ją, a następnie wyciągając. 30 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

31 19. Zamknąć osłonę. 20. Otworzyć ramę płytki i wyjąć płytkę z bloku grzewczego. 21. Zamknąć ramę i pokrywę aparatu. 22. Wyrzucić płytkę i wyczyścić kasetę zgodnie z instrukcjami w karcie produktu dostarczonej z kasetą. 23. Przeprowadzić analizę testu zgodnie z opisem w części Protokół 6: Analiza testu PyroMark Q24 na stronie 32. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

32 Protokół 6: Analiza testu PyroMark Q24 Ten protokół opisuje analizę mutacji po zakończonym teście EGFR przy użyciu oprogramowania PyroMark Q24. Procedura 1. Włożyć pamięć USB (zawierającą przetwarzany plik testu) do portu USB w komputerze. 2. Przenieść plik testu z pamięci USB do odpowiedniej lokalizacji na komputerze przy użyciu Eksploratora Windows. 3. Otworzyć plik testu w trybie AQ oprogramowania PyroMark Q24, wybierając polecenie Open (Otwórz) w menu File (Plik) lub klikając dwukrotnie plik ( ) w przeglądarce skrótów. 4. Dostępne są 2 metody analizy testu. W przypadku korzystania z narzędzia EGFR Plug-in Report przejść do punktu 5. W przypadku korzystania z narzędzia do analizy AQ zintegrowanego z systemem PyroMark Q24 przejść do punktu 6. Zdecydowanie zalecane jest korzystanie z narzędzia EGFR Plug-in Report. Utworzony w ten sposób raport zapewnia wykorzystanie właściwych progów wykrywalności oraz automatyczne użycie różnych sekwencji analizowania w celu wykrycia wszystkich mutacji i delecji. 5. Korzystanie z narzędzia EGFR Plug-in Report: Aby wygenerować raport, z menu Reports (Raporty) wybrać kolejno polecenia menu AQ Add On Reports/EGFR (Dodatkowe raporty AQ/EGFR), a następnie polecenie Exon 18 Codon 719 (Kodon 719 w eksonie 18), Exon 19 Deletions (Delecje w eksonie 19), Exon 20 Codon 768 (Kodon 768 w eksonie 20), Exon 20 Codon 790 (Kodon 790 w eksonie 20) lub Exon 21 Codons 858 to 961 (Kodony w eksonie 21). 32 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

33 Materiał z dołków zostanie automatycznie przeanalizowany pod kątem występowania wszystkich mutacji, dla których określono próg wykrywalności w tabeli 8 (na stronie 36). Wyniki zostaną zaprezentowane w tabeli przeglądowej (patrz przykład poniżej) wraz ze szczegółowymi wynikami zawierającymi np. pirogramy oraz jakość analizy. 6. Korzystanie z analizy AQ: Aby przeanalizować test EGFR i uzyskać przegląd wyników, należy kliknąć jeden z przycisków analizy. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

34 Analiza wszystkich dołków. Analiza wybranego dołka. Wyniki analizy (częstości alleli) oraz ocena jakościowa są wyświetlane w śledzeniu Pirogram nad częścią zmienną. Szczegółowy opis analizy testu znajduje się w podręczniku PyroMark Q24 User Manual. 7. Aby wygenerować raport, należy w menu wybrać polecenie AQ Analysis Results (Wyniki analizy AQ) lub AQ Full Report (Pełny raport AQ). Z tego względu standardowa sekwencja w sposób określony w przygotowaniu analizy dotyczy najczęściej występujących mutacji w kodonach 719, 768, 790, 858 i 861, a także najczęściej występującej delecji w eksonie 19 (patrz Załącznik A na stronie 43). Jeśli próbka zawiera rzadziej występującą mutację, funkcję sekwencji do analizy można zmienić tak, aby był także analizowany status mutacji dla tej pozycji, zgodnie z opisem w Załączniku A. Aktualne częstości występowania mutacji w ludzkim genie EGFR są dostępne online na stronie ośrodka Sanger Institute pod adresem Zaleca się, aby pojedyncze wartości szczytowe przekraczały 20 RLU (względnych jednostek świetlnych) w przypadku oznaczenia kodonu 768 i 30 RLU w przypadku pozostałych 4 oznaczeń. Odpowiednio należy ustawić wartość 20 lub 30 RLU jako wartość szczytową wymaganą do potwierdzenia jakości w przygotowaniu oznaczenia (patrz Załącznik A oraz podręczniku PyroMark Q24 User Manual). Aby przeprowadzić poprawną ocenę ilościową kodonu 719 i 790, należy dostosować wysokość słupków histogramu w przygotowaniu oznaczenia (patrz Załącznik A, strona 43). Do ilościowego określenia alleli należy użyć raportu z wynikami analizy AQ. Dane przedstawione na pirogramie są zaokrąglane i nie stanowią dokładnych wielkości ilościowych. Ponowna analiza próbek bez mutacji wykrytych w standardowej procedurze sekwencji do analizy albo próbek dających niejednoznaczne lub nieprawidłowe wyniki oceny jakościowej Zdecydowanie zaleca się ponowną analizę wszystkich próbek bez mutacji wykrytych w standardowej procedurze sekwencji do analizy, a także próbek dających niejednoznaczne lub nieprawidłowe wyniki oceny jakościowej. Niejednoznaczne lub nieprawidłowe wyniki oceny jakościowej mogą wskazywać na występowanie mutacji w innej pozycji, co może skutkować 34 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

35 uzyskaniem nieprzewidywanych referencyjnych wartości szczytowych. Aby dokonać ponownej analizy i określenia rzadziej występujących mutacji, należy przejść do ekranu Analysis Setup (Przygotowanie analizy) i zmienić wartość ustawienia Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) na jeden z wariantów opisanych w Załączniku A. Kliknąć przycisk Apply (Zastosuj), a następnie kliknąć opcję To All (Do wszystkich) po wyświetleniu okna Apply Analysis Setup (Zastosuj przygotowanie analizy). Należy dostosować odpowiednio próg dla pojedynczej wartości szczytowej oraz wysokość słupków histogramu (patrz Załącznik A, strona 43). Ponowne testowanie próbek w celu wykrycia mutacji na niskim poziomie Zdecydowanie zaleca się, aby dla celów porównawczych w każdym teście stosować próbkę normalną. Próbki o większej częstości występowania mutacji w stosunku do odpowiedniej pozycji w próbce normalnej należy zbadać pod kątem danych zawartych w tabeli progów wykrywalności (patrz tabela 8, na stronie 36). W przypadku korzystania z narzędzia EGFR Plug-in Report operacje te są wykonywane automatycznie. Próbki, w których istnieje podejrzenie wystąpienia mutacji w zakresie od progu wykrywalności (LOD, tabela 8) do wartości LOD + 3 %, należy przeanalizować ponownie wraz z próbką normalną. W przypadku korzystania z narzędzia do raportowania (punkt 5) dla takich próbek będzie wyświetlane ostrzeżenie. Jeśli zduplikowane próbki dadzą takie same wyniki jak analiza pierwotna i są wyraźnie różne od próbki kontrolnej, taką próbkę można uważać za zawierającą mutację. Należy pamiętać, że decyzji dotyczącej leczenia pacjentów z nowotworami nie należy opierać wyłącznie o status mutacji genu EGFR. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

36 Tabela 8. Wartości LOB i LOD określone dla specyficznych mutacji Mutacja Delecje w eksonie 19 LOB (%) LOD (%) Nr identyfikacyjny COSMIC* (V47) 2233del15 0,6 1, _2248>AATTC 0,8 1, _2252>AAT 1,1 2, del15 0,9 1, del15 0,2 1, _2252>T 0,8 2, _2255>T 0,6 1, del15 0,9 1, del18 0,5 1, _2248>GC 0,8 2, _2252>GCA 0,2 0, del18 0,3 1, _2248>C 1,8 2, _2251>C 0,6 1, _2258>CA 1,3 3, del18 0,6 1, del9 2,0 3, del12 0,4 1, del15 0,9 1, del18 0,9 1, * Z katalogu nowotworowych mutacji somatycznych dostępnego online na stronie ośrodka Sanger Institute pod adresem Dalsza część tabeli na następnej stronie 36 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

37 Tabela 8. Ciąg dalszy Mutacja Kodon 719 w eksonie 18 (GGC) LOB (%) LOD (%) Nr identyfikacyjny COSMIC* (V47) AGC 0,9 1, TGC 1,0 1, GCC 4,7 9, Kodon 768 w eksonie 20 (AGC) ATC 2,6 5, Kodon 790 w eksonie 20 (ACG) ATG 7,0 10, Kodon 858 w eksonie 21 (CTG) CGG 0,6 2,6 (5,5) 6224 Kodon 861 w eksonie 21 (CTG) CAG 3,2 4, CGG 1,9 4, * Z katalogu nowotworowych mutacji somatycznych dostępnego online na stronie ośrodka Sanger Institute pod adresem Najniższy poziom mutacji w próbce mający odzwierciedlenie w zmierzonej częstotliwości LOD. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

38 Reprezentatywne wyniki Reprezentatywne wyniki pirogramów przedstawiono na rysunkach A: 1% G: 98% T: 1% 0 E S A T G T C 5 A C T C G 10 T G Rysunek 5. Wykres pirogramu po analizie próbki z prawidłowym genotypem w kodonie 719 z wartością Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) DGCTCCGGTGC. 75 G: 98% T: 2% E S T C G A G 5 T C G A T 10 Rysunek 6. Wykres pirogramu po analizie próbki z prawidłowym genotypem w kodonie 768 z wartością Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) CAKCGTG. 100 C: 100% T: 0% E S C A T C G 5 A C T G C 10 A Rysunek 7. Wykres pirogramu po analizie próbki z prawidłowym genotypem w kodonie 790 z wartością Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) ATCAYGCAG. 38 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

39 G: 1% T: 99% A: 2% G: 1% T: 97% E S A T C G T 5 G C A A G 10 C A T G C 15 T G Rysunek 8. Wykres pirogramu po analizie próbki z prawidłowym genotypem w kodonach z wartością Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) CKGGCCAAACDGCTGGGT : 1% GGAATTAAGAGAAGC: 99% E S C T A T C 5 A C T G T 10 C A G C T 15 C G A T C 20 G T C A T 25 C G T C A 30 C G C Rysunek 9. Wykres pirogramu po analizie próbki z prawidłowym genotypem w eksonie : 33% GGAATTAAGAGAAGC: 67% E S C T A T C 5 A C T G T 10 C A G C T 15 C G A T C 20 G T C A T 25 C G T C A 30 C G C Rysunek 10. Wykres pirogramu po analizie próbek z delecją GGAATTAAGAGAAGC w eksonie 19. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

40 Przewodnik rozwiązywania problemów Przewodnik może przydać się w przypadku wystąpienia ewentualnych problemów. Aby uzyskać więcej informacji, należy także zapoznać się ze stroną często zadawanych pytań w witrynie naszego Centrum pomocy technicznej pod adresem Naukowcy w działu serwisu firmy QIAGEN chętnie odpowiedzą na pytania dotyczące danych i protokołów opisanych w niniejszej instrukcji obsługi, a także technologii badań i oznaczania próbek (informacje kontaktowe znajdują się na tylnej okładce oraz na stronie Rozwiązywanie ogólnych problemów z aparatem opisano w podręczniku PyroMark Q24 User Manual. Komentarze i propozycje Sygnały w kontroli bez matrycy (kontrola negatywna) a) Zakłócenia między dołkami b) Zanieczyszczenie odczynników reakcji PCR Słaba lub nieoczekiwana sekwencja a) Niska jakość genomowego DNA Sygnał z jednego dołka jest wykrywany w sąsiednim dołku. W przypadku ponownego przeprowadzania testów należy unikać umieszczania próbek o intensywnych sygnałach obok dołków z kontrolą bez matrycy. Używać sterylnych końcówek do pipet z filtrami. Próbki materiałów, próbki kontrolne i aplikony przechowywać oddzielnie od innych odczynników PCR. Genomowe DNA o niskiej jakości może spowodować nieudaną reakcję PCR. Próbki PCR należy analizować techniką elektroforezy (na przykład przy użyciu systemu QIAxcel lub elektroforezy na żelu agarowym). 40 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

41 b) Nieoczekiwana rzadka mutacja Komentarze i propozycje Niejednoznaczne lub nieprawidłowe wyniki a) Rzadkie mutacje niezdefiniowane w przygotowaniu oznaczenia b) Niskie wartości szczytowe c) W oznaczeniu kodonu 790 jest wyświetlane ostrzeżenie Uncertain/Failed due to high peak height deviation at dispensation: 8 (Wynik niejednoznaczny lub nieprawidłowy spowodowany wysokim odchyleniem wartości szczytowej w grupie: 8). Próbki dające niejednoznaczne lub nieprawidłowe wyniki oceny jakościowej mogą być spowodowane nieoczekiwanym rozłożeniem wartości szczytowych. Dane te mogą wskazywać na nieoczekiwaną mutację, która nie jest analizowana przez standardową funkcję Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy). Takie próbki należy przeanalizować przy użyciu alternatywnej funkcji Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) uwzględniającej nieoczekiwane mutacje. Wybrać sekwencję do analizy w przygotowaniu oznaczenia (patrz Załącznik A na stronie 43), a następnie ponownie przeprowadzić analizę testu. Błędy w przygotowaniu reakcji PCR lub próbki przed pirosekwencjonowaniem mogą dawać w rezultacie niskie wartości szczytowe. Zaleca się ponowne przeanalizowanie próbki. Wartość poziomu szumu tła w grupie T8 znajduje się poniżej przewidywanego poziomu. Ustaw wartość domyślną (1.00) wysokości słupka harmonogramu (jest to możliwe wyłącznie w przypadku korzystania z narzędzia zintegrowanego z systemem PyroMark Q24). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

42 Duży szum tła Nieprawidłowe przechowywanie nukleotydów Komentarze i propozycje Nukleotydy należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przechowywanie w temperaturze od 15 do 25 C może zwiększyć szum tła. Brak sygnałów w kontroli pozytywnej (z niemetylowanym kontrolnym DNA) a) Niewystarczająca ilość mieszaniny enzymów lub substratów dla wszystkich dołków b) Nieprawidłowo przechowywane lub rozcieńczone odczynniki Kasetę PyroMark Q24 należy wypełnić zgodnie z danymi na ekranie Pre Run Information (Informacje przygotowawcze) w menu Tools (Narzędzia). Należy przygotować odczynniki zestawu therascreen zgodnie ze wskazówkami podanymi w części Protokół 5: Obsługa systemu PyroMark Q24 na stronie Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

43 Załącznik A: Przygotowywanie oznaczeń za pomocą zestawu therascreen EGFR Pyro Jeśli zainstalowano narzędzie EGFR Plug-in Report, należy używać konfiguracji dla kodonów 719, 768, 790 i oraz dla delecji w eksonie 19. Poniższe czynności można pominąć. Narzędzie EGFR Plug-in Report można uzyskać, wysyłając wiadomość na adres pyro.plugin@qiagen.com. Zdecydowanie zaleca się korzystanie z narzędzia EGFR Plug-in Report zamiast analizy ręcznej. Mutacji złożonych nie można dodać ręcznie do funkcji Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy), a ich analizę należy przeprowadzić przy użyciu wspomnianego narzędzia. Po zainstalowaniu narzędzia albo po każdej instalacji lub uaktualnieniu oprogramowania na komputerze należy sprawdzić prawidłowość działania narzędzia zgodnie z dokumentem EGFR Plug-In Quick Guide (Skrócony podręcznik narzędzia EGFR Plug-In). Jeśli narzędzie EGFR Plug-in Report nie zostało zainstalowane, plik oznaczenia należy przygotować ręcznie przed pierwszym oznaczeniem za pomocą zestawu therascreen EGFR Pyro. Należy skonfigurować oznaczenie mutacji w kodonie 719, kodonie 768, kodonie 790, kodonach i delecji w eksonie 19 genu EGFR, korzystając z oprogramowania PyroMark Q24 i postępując zgodnie z poniższymi wskazówkami. Procedura Kodon 719 genu EGFR A1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i wybrać opcję New AQ Assay (Nowe oznaczenie AQ). A2. W obszarze Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) wpisać następującą sekwencję: DGCTCCGGTGC Za pomocą tej sekwencji zostaną wykryte najczęściej występujące mutacje w kodonie 719 w nukleotydzie Wartość sekwencji do analizy można zmienić po zakończeniu testu w celu przeanalizowania mutacji w nukleotydzie Aby sprawdzić, czy mutacje nie występują w nukleotydzie 2156, należy zmienić wartość sekwencji na następującą: GSCTCCGGTGC Próg dla pojedynczej wartości szczytowej powinien wynosić 30 RLU. Ponadto należy upewnić się, że wysokość słupków histogramu jest odpowiednia (wskazówki znajdują się poniżej). Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

44 A3. Ręcznie wprowadzić następującą sekwencję: ATGTCACTCGTG A T G T C 5 A C T C G 10 T G Rysunek 11. Histogram dla kodonu 719 (nukleotyd 2155) z sekwencją do analizy DGCTCCGGTGC. Czerwony prostokąt umieszczony na dole słupka w grupie C5 pokazuje, w jaki sposób można dostosować wysokość słupka histogramu A T G T C 5 A C T C G 10 T G Rysunek 12. Histogram dla kodonu 719 (nukleotyd 2156) z sekwencją do analizy GSCTCCGGTGC. Czerwony prostokąt umieszczony na dole słupka w grupie C5 pokazuje, w jaki sposób można dostosować wysokość słupka histogramu. A4. Kliknąć kartę Analysis Parameters (Parametry analizy) i zwiększyć wartość Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Wartość szczytowa wymagana do potwierdzenia jakości): na 30. A5. Na histogramie dla grupy C5 umieścić kursor na górnej krawędzi słupka, a następnie kliknąć, przytrzymując przycisk Ctrl. Zostanie wyświetlone niewielkie okno zawierające domyślną wysokość słupka (1.00). Wartość tę należy zwiększyć do 1.04 w przypadku sekwencji DGCTCCGGTGC i do 2.04 w przypadku sekwencji GSCTCCGGTGC. A6. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i zapisać oznaczenie jako Kodon 719 EGFR. Kodon 768 genu EGFR A1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i wybrać opcję New AQ Assay (Nowe oznaczenie AQ). A2. W obszarze Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) wpisać następującą sekwencję: CAKCGTG 44 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

45 A3. Ręcznie dodać następującą sekwencję: TCGAGTCGAT 1 0 T C G A G 5 T C G A T 10 Rysunek 13. Histogram dla kodonu 768 (nukleotyd 2303) z sekwencją do analizy CAKCGTG. A4. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i zapisać oznaczenie jako Kodon 768 EGFR. Kodon 790 genu EGFR A1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i wybrać opcję New AQ Assay (Nowe oznaczenie AQ). A2. W obszarze Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) wpisać następującą sekwencję: ATCAYGCAG A3. Ręcznie dodać następującą sekwencję: CATCGACTGCA 1 0 C A T C G 5 A C T G C 10 A Rysunek 14. Histogram dla kodonu 790 (nukleotyd 2369) z sekwencją do analizy ATCAYGCAG. Czerwony prostokąt umieszczony na dole słupka w grupie T8 pokazuje, w jaki sposób można dostosować wysokość słupka histogramu. A4. Kliknąć kartę Analysis Parameters (Parametry analizy) i zwiększyć wartość Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Wartość szczytowa wymagana do potwierdzenia jakości): do 30. A5. Na histogramie dla grupy T8 umieścić kursor na górnej krawędzi słupka, a następnie kliknąć, przytrzymując przycisk Ctrl. Zostanie wyświetlone niewielkie okno zawierające domyślną wysokość słupka (1.00). Zwiększyć wartość do A6. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i zapisać oznaczenie jako Kodon 790 EGFR. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

46 Kodony genu EGFR A1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i wybrać opcję New AQ Assay (Nowe oznaczenie AQ). A2. W obszarze Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) wpisać następującą sekwencję: CKGGCCAAACDGCTGGGT A3. Ręcznie dodać następującą sekwencję: ATCGTGCAAGCATGCTG A T C G T 5 G C A A G 10 C A T G C 15 T G Rysunek 15. Histogram dla kodonów z sekwencją do analizy CKGGCCAAACDGCTGGGT. A4. Kliknąć kartę Analysis Parameters (Parametry analizy) i zwiększyć wartość Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Wartość szczytowa wymagana do potwierdzenia jakości): do 30. A5. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i zapisać oznaczenie jako Kodony EGFR. Ekson EGFR 19 del A1. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i wybrać opcję New AQ Assay (Nowe oznaczenie AQ). A2. W obszarze Sequence to Analyze (Sekwencja do analizy) wpisać następującą sekwencję: TATCAA[GGAATTAAGAGAAGC]AACATCTCCGAAAGCCAACAAGGA Najczęściej występująca delecja w eksonie 19 to 2235del15. Aby wykryć inne delecje, należy zmienić sekwencję do analizy zgodnie z wybraną delecją. Należy użyć sekwencji wt TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA ATCCTCGAT, a następnie dodać nawiasy kwadratowe w miejscach rozpoczęcia i zakończenia delecji. W przypadku delecji w eksonie 19 (2236del15) odznaczającą się drugą co do wielkości częstością występowania należy zmienić sekwencję do analizy na następującą: TATCAAG[GAATTAAGAGAAGCA]ACATCTCCGAAAGCCAACAAGGA A3. Ręcznie dodać następującą sekwencję: 46 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

47 CTATCACTGTCAGCTCGATCGTCATCGTCACGC C T A T C 5 A C T G T 10 C A G C T 15 C G A T C 20 G T C A T 25 C G T C A 30 C G C Rysunek 16. Histogram dla eksonu 19 del. A4. Kliknąć kartę Analysis Parameters (Parametry analizy) i zwiększyć wartość Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Wartość szczytowa wymagana do potwierdzenia jakości): do 30. A5. Kliknąć przycisk na pasku narzędzi i zapisać oznaczenie jako Ekson EGFR 19 del. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

48 Załącznik B: Opróżnianie pojemnika na odpady oraz wanienek OSTRZEŻENIE Niebezpieczne substancje chemiczne Używany ze stacją podciśnieniową roztwór do denaturacji zawiera wodorotlenek sodu, który jest szkodliwy dla oczu i skóry. Zawsze należy nosić okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Osoba odpowiedzialna (np. kierownik laboratorium) powinna podjąć wszelkie środki ostrożności w celu zapewnienia bezpieczeństwa w miejscu pracy oraz upewnić się, że operatorzy aparatów nie są narażeni na działanie wysokich stężeń substancji toksycznych (chemicznych lub biologicznych) zgodnie z wytycznymi w kartach charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) albo dokumentach organizacji OSHA*, ACGIH lub COSHH. Wentylacja oparów oraz utylizacja odpadów powinny odbywać się zgodnie z krajowymi przepisami w zakresie bezpieczeństwa i higieny pracy. * OSHA: Occupational Safety and Health Administration (Stany Zjednoczone) ACGIH: American Conference of Government Industrial Hygienists (Stany Zjednoczone) COSHH: Control of Substances Hazardous to Health (Wielka Brytania) Należy przestrzegać lokalnych przepisów ochrony środowiska w zakresie utylizacji odpadów laboratoryjnych. Ważna czynność do wykonania przed rozpoczęciem procedury Procedura wymaga użycia wody o wysokiej czystości (Milli-Q 18,2 MΩ x cm, lub odpowiednika). Procedura B1. Upewnić się, że w narzędziu nie ma podciśnienia. Sprawdzić, czy zamknięto zawór podciśnieniowy i wyłączono pompę podciśnieniową. B2. Wylać roztwory z wanienek. B3. Przepłukać wanienki wodą o wysokiej czystości lub w razie potrzeby je wymienić. B4. Opróżnić pojemnik na odpady. Pokrywę można zdjąć bez demontowania przewodów. 48 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

49 B5. Jeśli jest wymagane wyczyszczenie stacji podciśnieniowej (na przykład z powodu zabrudzeń i wycieków), należy postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w podręczniku PyroMark Q24 User Manual. Literatura Firma QIAGEN udostępnia obszerną, aktualną bazę danych online publikacji naukowych, w których stosowane są produkty QIAGEN. Zaawansowane opcje wyszukiwania umożliwiają znajdowanie potrzebnych artykułów według słów kluczowych lub zastosowań, obszarów badań, tytułów itp. W celu uzyskania listy pozycji literaturowych należy odwiedzić witrynę bazy online firmy QIAGEN pod adresem lub skontaktować się z działem serwisu lub lokalnym dystrybutorem firmy QIAGEN. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

50 Informacje dotyczące zamawiania Produkt Zawartość Nr katalogowy therascreen EGFR Pyro Kit (24) PyroMark Q24 MDx Na 24 reakcje w systemach PyroMark Q24: primery sekwencjonujące, primery PCR, niemetylowane kontrolne DNA, mieszanina do PCR PyroMark, koncentrat CoralLoad, bufor do wiązania PyroMark, bufor do hybrydyzacji PyroMark, roztwór do denaturacji PyroMark, roztwór do płukania PyroMark, mieszanina enzymów, mieszanina substratów, datpαs, dctp, dgtp, dttp i H 2 O Zestaw do równoległego pirosekwencjonowania 24 próbek PyroMark Q24 PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation* PyroMark Q24 Vacuum Workstation PyroMark Q24 MDx Software PyroMark Q24 Software Akcesoria PyroMark Q24 Plate (100) PyroMark Q24 Cartridge (3) Zestaw do równoległego pirosekwencjonowania 24 próbek Stacja podciśnieniowa (220 V) do równoległego przygotowywania 24 próbek z produktu PCR do jednoniciowej matrycy Stacja podciśnieniowa (220 V) do równoległego przygotowywania 24 próbek z produktu PCR do jednoniciowej matrycy * Aplikacja Oprogramowanie do analizy Mikropłytka reakcyjna do sekwencjonowania, 24-dołkowa Kasety do rozdzielania nukleotydów i odczynników * Tylko w Wielkiej Brytanii. W pozostałych krajach. 50 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

51 Produkt Zawartość Nr katalogowy PyroMark Vacuum Prep Filter Probe (100) PyroMark Control Oligo PyroMark Q24 Validation Oligo Produkty pokrewne QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) EZ1 DNA Tissue Kit (48) QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Probówki filtrujące wielokrotnego użytku do stacji podciśnieniowych PyroMark Q96 i Q24 Do sprawdzania systemu po instalacji Do sprawdzania prawidłowości działania systemu Na 50 badań DNA: 50 kolumn QIAamp MinElute, proteinaza K, bufory, probówki na próbki (2 ml) Na 48 badań: kasety na odczynniki (tkanki), jednorazowe końcówki z filtrami, jednorazowe uchwyty na końcówki, probówki z próbkami (2 ml), probówki elucyjne (1,5 ml), bufor G2, proteinaza K Na 50 badań: kolumny QIAamp Mini Spin, bufory, odczynniki, probówki, łączniki VacConnector Aktualne informacje licencyjne oraz wyłączenia odpowiedzialności dla poszczególnych produktów znajdują się w odpowiedniej instrukcji obsługi lub podręczniku użytkownika zestawu QIAGEN. Instrukcje obsługi lub podręczniki użytkownika zestawu QIAGEN są dostępne w witrynie Można je także zamówić w serwisie lub u lokalnego dystrybutora firmy QIAGEN. Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

52 Ta strona została celowo pozostawiona pusta 52 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

53 Ta strona została celowo pozostawiona pusta Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/

54 Ta strona została celowo pozostawiona pusta 54 Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi 09/2010

55 Znaki towarowe: QIAGEN, QIAamp, QIAxcel, BioRobot, CoralLoad, EZ1, HotStarTaq, MinElute, Pyro, Pyrogram, PyroMark, Pyrosequencing, therascreen (QIAGEN Group); Milli-Q (Millipore Corporation); Sepharose (GE Healthcare); Windows (Microsoft Corporation). Umowa ograniczonej licencji Korzystanie z tego produktu oznacza zgodę nabywcy lub użytkownika zestawu therascreen EGFR Pyro na następujące warunki: 1. Zestaw therascreen EGFR Pyro może być stosowany wyłącznie zgodnie z dokumentem Zestaw therascreen EGFR Pyro Instrukcja obsługi, wyłącznie z elementami znajdującymi się w tym zestawie. Firma QIAGEN nie udziela żadnej licencji w zakresie praw własności intelektualnych do użytkowania niniejszego zestawu z elementami nienależącymi do zestawu, z wyjątkiem elementów opisanych w dokumencie Zestaw therascreen KRAS Pyro Instrukcja obsługi oraz dodatkowych protokołów dostępnych na stronie 2. Z wyjątkiem wyraźnie określonych licencji firma QIAGEN nie gwarantuje, że niniejszy zestaw i/lub jego użytkowanie nie narusza praw osób trzecich. 3. Zestaw oraz jego elementy są przeznaczone do jednorazowego użytku. Nie są przeznaczone do ponownego użycia, regeneracji ani odsprzedaży. 4. Z wyjątkiem wyraźnie określonych licencji firma QIAGEN nie udziela innych licencji wyraźnych ani dorozumianych. 5. Nabywca i użytkownik zestawu zobowiązuje się nie podejmować kroków ani nie zezwalać innym osobom na podejmowanie kroków mogących doprowadzić do opisanych wyżej czynności zabronionych lub do ich umożliwienia. Firma QIAGEN może wnosić roszczenia wynikające z niniejszej Umowy ograniczonej licencji do dowolnego sądu i będzie rościć prawa do zwrotu wszelkich kosztów postępowań i kosztów sądowych, w tym wynagrodzeń prawników, związanych z egzekwowaniem postanowień Umowy ograniczonej licencji lub praw własności intelektualnej w zakresie zestawu i/lub jego elementów. Aktualne warunki licencyjne znajdują się w witrynie QIAGEN. Wszelkie prawa zastrzeżone.

56 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) PL Sample & Assay Technologies