TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Do wykrywania 7 mutacji w onkogenie K-RAS

Transkrypt

1 TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Do wykrywania 7 mutacji w onkogenie K-RAS Do stosowania w aparacie Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (Numer kat ) oraz Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (Numer części: ) Zawiera instrukcję użytkownika LightCycler Adapt Software v1.1 z Roche Diagnostics (Numer kat ) dla TheraScreen : Zestaw CE-IVD do wykrywania mutacji K-RAS Instrukcja użytkowania Kody produktów Wielkość zestawu Kod produktu DxS 20 reakcji KR reakcji KR Numer produktu do składania zamówień w firmie Roche Diagnostics Wersja instrukcji: DU001g Data uaktualnienia: Maj 2009 Przechowywać w temperaturze od -18 C do -25 C Strona 1 z 39

2 Zawartość 1. Przeznaczenie/wskazania dotyczące stosowania Informacje ogólne i wyjaśnienia dotyczące testu Technologie Odczynniki OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Przechowywanie, stabilność i warunki transportu Aparatura Próbki Protokół wykrywania mutacji K-RAS Ograniczenia testu Charakterystyka działania testu Wsparcie techniczne Informacje dotyczące producenta i dystrybutora Data wydania ostatniej wersji Przypisy Informacje dla nabywcy Strona 2 z 39

3 WAŻNE: Przed rozpoczęciem użytkowania należy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje i zapoznać się ze wszystkimi elementami zestawu K-RAS. 1. Przeznaczenie/wskazania dotyczące stosowania Przeznaczenie DxS TheraScreen : Zestaw do wykrywania mutacji K-RAS (K-RAS Kit) jest testem diagnostycznym in vitro przeznaczonym do wykrywania siedmiu mutacji somatycznych w onkogenie K-RAS. Umożliwia również ocenę jakościową statusu mutacji. Zestaw K-RAS jest przeznaczony do stosowania przez wyszkolony personel w warunkach laboratoryjnych z próbkami DNA pobranymi z utrwalonej formaliną, zanurzonej w parafinie tkanki jelita grubego. Wskazania w zakresie użytkowania Wyniki uzyskane za pomocą zestawu K-RAS ułatwiają lekarzowi rozpoznawanie pacjentów cierpiących na nowotwór jelita grubego, w przypadku których terapia skierowana przeciw receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), z zastosowaniem na przykład panitumumabu lub cetuksimabu, może być nieskuteczna. Zestaw K-RAS nie jest przeznaczony do diagnozy nowotworów jelita grubego. Ma on na celu uzupełnienie innych czynników prognostycznych, używanych do wskazywania pacjentów, których leczenie powinno przebiegać z wykorzystaniem terapii przeciw EGFR w oparciu o status mutacji pacjenta. Przy podejmowaniu decyzji dotyczącej leczenia pod uwagę brany jest status mutacji pacjenta oraz inne czynniki związane z chorobą. Żadna decyzja dotycząca leczenia pacjentów z nowotworem nie powinna być oparta wyłącznie o status mutacji K-RAS. 2. Informacje ogólne i wyjaśnienia dotyczące testu Zestaw K-RAS jest wyrobem diagnostycznym oznaczonym znakiem CE zgodnie z unijną dyrektywą dotyczącą wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro 98/79/WE. Mutacje w onkogenie K-RAS są często spotykane w ludzkich nowotworach (1-4). Obecność tych mutacji jest związana z brakiem reakcji na terapie przeciwnowotworowe określonymi inhibitorami EGFR u pacjentów z metastatycznym nowotworem jelita grubego (5-10)(14-21). Wykrycie siedmiu mutacji w genie K-RAS jest możliwe na tle genomowego DNA typu dzikiego w teście reakcji PCR w czasie rzeczywistym opartej na technologii DxS Scorpions. Metoda ta jest wysoce selektywna. Przy wystarczającej liczbie kopii DNA możliwe jest wykrycie około 1% mutacji na tle genomowego DNA typu dzikiego. Zestaw K-RAS wykrywa siedem mutacji K-RAS w kodonach 12 i 13 onkogenu K-RAS, jak pokazano w tabeli 1. Strona 3 z 39

4 Tabela 1: Mutacje K-RAS wykryte przez zestaw DxS Numery identyfikacyjne COSMIC pochodzą z Katalogu mutacji somatycznych w nowotworach Mutacja Zmiana zasady Nr identyfikacyjny COSMIC Gly12Ala (GGT > GCT) 522 Gly12Asp (GGT > GAT) 521 Gly12Arg (GGT > CGT) 518 Gly12Cys (GGT > TGT) 516 Gly12Ser (GGT > AGT) 517 Gly12Val (GGT > GTT) 520 Gly13Asp (GGC > GAC) Technologie Do wykrywania mutacji w testach PCR w czasie rzeczywistym zestaw K-RAS wykorzystuje dwie technologie: ARMS i Scorpions (11, 12, 13). ARMS Amplifikacja specyficzna dla alleli lub mutacji jest dokonywana z wykorzystaniem technologii ARMS. Polimeraza DNA Taq jest szczególnie skuteczna w rozróżnianiu dopasowania i niedopasowania nukleotydów przy końcu 3. primera PCR. Określone zmutowane sekwencje mogą być selektywnie amplifikowane, nawet w próbkach, w których większość sekwencji nie zawiera mutacji, na przykład: Kiedy primer jest w pełni dopasowany, amplifikacja zachodzi z pełną wydajnością. Kiedy zasada przy końcu 3. nie jest dopasowana, zachodzi jedynie amplifikacja tła niskiego poziomu. Scorpions Wykrywanie amplifikacji jest przeprowadzane z wykorzystaniem sond typu Scorpions. Scorpions to dwufunkcyjne cząsteczki zawierające primer PCR kowalencyjnie związany z sondą. Fluorochrom w takiej sondzie oddziałuje z wygaszaczem, który również jest wykorzystywany w sądzie, co zmniejsza fluorescencję. Podczas reakcji PCR, kiedy sonda wiąże się z amplikonem, flourochrom i wygaszacz zostają rozdzielone. Prowadzi to do wzrostu poziomu fluorescencji w probówce reakcyjnej. Analiza danych: Metoda Ct Testy typu Scorpions w czasie rzeczywistym wykorzystują szereg cykli PCR niezbędnych do wykrycia sygnału fluorescencji powyżej sygnału tła jako miarę ilości badanych cząsteczek na początku reakcji. Punkt, w którym sygnał powyżej fluorescencji tła zostaje wykryty jest nazywany progiem cyklu (cycle threshold Ct). Strona 4 z 39

5 Wartości Ct dla próbek są obliczane jako różnica pomiędzy Ct testu mutacji oraz Ct próby kontrolnej z tej samej próbki. Próbki są klasyfikowane jako zawierające mutację, jeśli wykazują wartość Ct mniejszą niż 1% wartości Ct dla testu. Powyżej tej wartości, próbka może zawierać mniej niż 1% mutacji (poza progiem wykrycia testu) lub nie być zmutowana. W przypadku używania primerów ARMS, możliwe jest niewydajne wiązanie primerów, powodujące bardzo późne Ct tła pochodzące od DNA niezawierającego mutacji. Wszystkie wartości Ct wyliczone na podstawie amplifikacji tła będą w takich warunkach większe od 1% wartości Ct i próbka zostanie sklasyfikowana jako niezawierająca mutacji. Zestaw K-RAS jest oznaczony symbolem CE odnośnie zastosowań diagnostycznych in vitro z urządzeniem Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument) format 96 dołkowy, numer części Roche: lub Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, numer części (ABI7500). Dla urządzenia LightCycler 480 Instrument, zestaw K-RAS musi być wykorzystywany łącznie z oprogramowaniem LightCycler Adapt Software v1.1 dla zestawu do wykrywania mutacji K-RAS TheraScreen CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Oprogramowanie to zostało opracowane w celu automatyzacji wywoływania krzywej amplifikacji dla próbek pozytywnych lub negatywnych pod względem mutacji oraz obliczania odpowiedniego progu, na podstawie którego można otrzymać wartości Ct. Są one wykorzystywane do obliczania wartości Ct próbek, które są porównywane z 1% wartości granicznych. Oprogramowanie sygnalizuje pozytywny lub negatywny wynik testu mutacji oraz eliminuje czynniki subiektywne analizy i interpretacji danych z zestawu K-RAS. Format zestawu K-RAS W zestawie K-RAS znajduje się osiem testów. Jedna próba kontrolna. Siedem testów mutacji. Wszystkie mieszaniny reakcyjne zawierają egzogenną próbę kontrolną (kontrolę wewnętrzną) oznakowaną HEX (wykrywaną przez detektor JOE w urządzeniu ABI7500). Pozwala to na kontrolę obecności inhibitorów, które mogą prowadzić do wyników fałszywie negatywnych. Próba kontrolna Próba kontrolna, oznakowana symbolem FAM, jest używana do oszacowania całkowitej ilości DNA w próbce. Próba kontrolna amplifikuje region eksonu 4 genu K-RAS. Primery oraz sonda zostały zaprojektowane tak, aby pominąć wszystkie znane polimorfizmy. Strona 5 z 39

6 Testy mutacji Każdy test mutacji oznaczony symbolem FAM zawiera jeden primer Scorpions oraz jeden primer ARMS, dla rozróżnienia pomiędzy DNA typu dzikiego a zmutowanego DNA wykrytego przez test PCR w czasie rzeczywistym. 4. Odczynniki Zestaw K-RAS zawiera odczynniki wystarczające do przeprowadzenia jakościowej oceny próbek oraz przeprowadzenia testów K-RAS dla 20 lub 80 reakcji, w zależności od wielkości zestawu. Wielkość zestawu Kod produktu DxS Numer produktu do składania zamówień w firmie Roche Diagnostics 20 reakcji KR reakcji KR Liczba próbek, które mogą zostać zbadane, zależy od wielkości partii próbek. Tabela 2: Zawartość zestawu K-RAS Dostarczone odczynniki 20 reakcji 80 reakcji Objętość Objętość Probówka Mieszanina do reakcji kontrolnej 1300 µl 5200 µl 1 Mieszanina reakcyjna 12ALA 650 µl 2600 µl 2 Mieszanina reakcyjna 12ASP 650 µl 2600 µl 3 Mieszanina reakcyjna 12ARG 650 µl 2600 µl 4 Mieszanina reakcyjna 12CYS 650 µl 2600 µl 5 Mieszanina reakcyjna 12SER 650 µl 2600 µl 6 Mieszanina reakcyjna 12VAL 650 µl 2600 µl 7 Mieszanina reakcyjna 13ASP 650 µl 2600 µl 8 Mieszanina wzorca 300 µl 1000 µl 9 Taq polimeraza DNA 60 µl 240 µl 10 Sprzęt oraz odczynniki niedostarczane wraz z zestawem K-RAS Użytkownik będzie potrzebował następujących urządzeń oraz materiałów eksploatacyjnych: Aparat LightCycler 480 Instrument lub urządzenie ABI7500 Realtime PCR Machine, zdolne do prowadzenia cykli w sposób zdefiniowany w punkcie 9; protokół detekcji mutacji K-RAS. Oprogramowanie LightCycler Adapt Software v1.1 firmy Roche Diagnostics (numer katalogowy ). Mikropłytki PCR o objętości 0,2 ml, wolne od DNazy (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, numer katalogowy , lub mikropłytki ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate, numer części , z filmem adhezyjnym MicroAmp Optical Adhesive Film, numer części ). Sterylne probówki do przygotowania mieszanin do PCR. Strona 6 z 39

7 Dedykowane pipety przeznaczone do przygotowania mieszaniny do PCR. Pipety przeznaczone do dozowania matrycy DNA. Jałowa, wolna od nukleaz H 2 O. 5. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Do celów diagnostyki in vitro. Zestaw K-RAS nie jest przeznaczony do badań przesiewowych lub do diagnostyki żadnego rodzaju nowotworów, w tym nowotworów jelita grubego. Jest on przeznaczony do stosowania jako uzupełnienie innych czynników prognostycznych stosowanych do identyfikowania pacjentów, u których terapia anty-egfr może być nieskuteczna. Wybór sposobu leczenia pacjentów z nowotworami nie powinien być dokonywany w oparciu wyłącznie o status mutacji genu K-RAS. Lekarz powinien brać pod uwagę zarówno status mutacji pacjenta jak i inne czynniki chorobowe. Składniki zestawu K-RAS mogą być zamrażane i rozmrażane do ośmiu razy bez niekorzystnego wpływu na wyniki testu. NIE NALEŻY zamrażać i rozmrażać odczynników zestawu K-RAS więcej niż osiem razy. Należy zauważyć, że próbki nowotworów nie są jednorodne, a dane z tych próbek mogą nie odpowiadać danym z innych fragmentów tego samego nowotworu. Próbki nowotworu nogą zawierać również tkankę nienowotworową. W DNA z tkanek nienowotworowych nie jest spodziewana obecność mutacji K-RAS wykrywanych przez zestaw K-RAS. Wszystkie testy w zestawie K-RAS pozwalają na uzyskanie krótkich produktów PCR. Jednak zestaw K-RAS nie zadziała na silnie sfragmentowanym DNA. Ocena DNA powinna być oparta o PCR i może różnić się od oceny ilościowej opartej na odczycie gęstości optycznej. Dostarczana jest dodatkowa mieszanina do reakcji kontrolnej, pozwalająca na ocenę jakości i ilości DNA w próbkach przed zastosowaniem zestawu K-RAS. Odczynniki w zestawie K-RAS zostały optymalnie rozcieńczone. Dalsze rozcieńczanie odczynników nie jest zalecane i skutkuje utratą wydajności. Nie zaleca się używania objętości reakcji mniejszej niż 25 µl, ponieważ zwiększa ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych. Wszystkie odczynniki w zestawie K-RAS są opracowane specjalnie do użycia z wyżej określonymi testami. Aby utrzymać optymalną wydajność zestawu K-RAS, nie należy zamieniać odczynników. Aby zapewnić optymalną aktywność i działanie, należy chronić primery Scorpions przed światłem, zapobiegając fotowybielaniu (podobnie ja w przypadku wszystkich cząstek znakowanych fluorescencyjnie). Strona 7 z 39

8 Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu reakcji PCR syntetycznym materiałem kontrolnym. Zaleca się używanie osobnych pipet do przygotowania mieszanin reakcyjnych i dodawania matrycy DNA. Przygotowywanie i rozdzielanie mieszanin reakcyjnych powinno być przeprowadzane w innym miejscu niż dodawanie matrycy. Nie wolno otwierać probówek po reakcji PCR. Każdy test dostarczany w zestawie K-RAS ma własną charakterystykę. Obliczanie wyników musi być wykonywane z uwzględnieniem odpowiednich parametrów testu, (patrz sekcja Raport/interpretacja danych ). Wartości Ct mutacji 38 lub wyższe muszą być uznane za negatywne lub poniżej progu wykrycia zestawu. Testy zawierają egzogenną reakcję kontrolną (kontrolę wewnętrzną) jako dodatek do reakcji głównej (patrz sekcja Technologie ). Jeśli oba testy nie dały poprawnych wyników, danych nie należy brać pod uwagę, ponieważ możliwa jest obecność inhibitorów prowadzących do wyników fałszywie negatywnych. Rozcieńczenie próbki może zmniejszyć wpływ inhibitorów, ale spowoduje także rozcieńczenie DNA. Należy stosować się do ogólnych laboratoryjnych środków ostrożności, a więc między innymi: a) Nie należy pipetować ustami. b) Nie należy palić, spożywać pokarmów lub płynów w miejscach przeznaczonych do pracy z próbkami lub odczynnikami zestawu. c) Należy myć ręce po przeprowadzeniu testu. Należy używać wyłącznie polimerazy Taq (Taq) dostarczonej z zestawem. Nie należy zastępować jej polimerazą Taq z innych zestawów takiego samego lub innego rodzaju lub polimerazą Taq od innego producenta. Rozmrażać należy wyłącznie taką ilość odczynników, jaka jest wymagana do każdego testu. Aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania/ rozmrażania, nie należy rozmrażać za każdym razem całego zestawu. Informacje dotyczące bezpieczeństwa Ostrzeżenie: Wszystkie środki chemiczne oraz materiał biologiczny należy traktować jako potencjalnie niebezpieczne. Próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Zestaw K-RAS powinien być używany wyłącznie przez osoby przeszkolone w zakresie odpowiednich technik laboratoryjnych. W czasie pracy ze składnikami zestawu K-RAS należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. Po użyciu składniki zestawu K-RAS powinny być usuwane tak jak odpady medyczne. Strona 8 z 39

9 6. Przechowywanie, stabilność i warunki transportu Przechowywanie Wszystkie składniki zestawu K-RAS powinny być natychmiast po dostarczeniu umieszczone w zamrażarce o stałej temperaturze od -18 C do -25 C, bez dostępu światła. Należy unikać zbędnego mrożenia i rozmrażania składników zestawu K-RAS. Stabilność Nie należy używać zestawu K-RAS po upływie terminu ważności. Składniki zestawu K-RAS są stabilne do czasu upływu terminu ważności, jeśli są przechowywane w zalecanych warunkach i w oryginalnym opakowaniu. Składniki zestawu K-RAS mogą być zamrażane i rozmrażane do ośmiu razy bez niekorzystnego wpływu na wyniki testu. NIE NALEŻY zamrażać i rozmrażać odczynników zestawu K-RAS więcej niż osiem razy. Warunki transportu Składniki zestawu K-RAS są transportowane na suchym lodzie i powinny być zamrożone w momencie odbioru przesyłki. Jeśli zestaw K-RAS nie jest zamrożony w chwili odbioru, opakowanie zewnętrzne zostało otwarte podczas transportu, przesyłka nie zawiera listy zawartości opakowania, instrukcji użycia lub odczynników, należy skontaktować się z biurem firmy Roche Diagnostics (dane kontaktowe zawarte są w sekcji 12, Wsparcie techniczne ). 7. Aparatura Aby uzyskać pełne instrukcje dotyczące instalacji i użytkowania aparatu do PCR w czasie rzeczywistym, należy skorzystać z podręcznika użytkownika. 8. Próbki Materiał próbek musi być ludzkim DNA genomowym, wyekstrahowanym z utrwalonych formaliną i zanurzonych w parafinie próbek tkanki nowotworowej z jelita grubego. Pobranie i przygotowanie próbek 1. Transport próbek: standardowe metody stosowane w patologii zapewniają odpowiednią jakość próbek. 2. Zalecany proces pobierania próbek: ekstrakcja DNA z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji DNA z tkanek Qiagen QIAamp DNA FFPE (numer katalogowy 56404). Należy wprowadzić następujące poprawki do protokołu Qiagen: Skrawki uzyskane z tkanki zanurzonej w parafinie należy umieszczać na szkiełkach. Należy usunąć nadmiar parafiny z okolic tkanki, używając czystego, sterylnego skalpela. Strona 9 z 39

10 Należy zdrapać materiał z wycinka tkanki do probówek mikrowirówkowych, używając nowego czystego skalpela dla każdej próbki, która ma zostać wyekstrahowana. Należy prowadzić trawienie proteinazą K aż do jego ukończenia. Może to zająć nawet 48 godzin. Próbki powinny być rozpuszczone w 200 µl buforu ATE z zestawu do ekstrakcji Qiagen. W przypadku stosowania innych metod przygotowania próbek użytkownik jest odpowiedzialny za sprawdzenie ich prawidłowości. 3. Przechowywanie wyekstrahowanego DNA: Przed analizą przechowywać w temperaturze -20 C. Protokół oceny próbek Do oceny całkowitej ilości DNA w próbce należy użyć dodatkowej mieszaniny dla próby kontrolnej dostarczanej w zestawie K-RAS. Próba kontrolna amplifikuje region eksonu 4 genu K-RAS. Próbki powinny być przygotowywane wyłącznie z próbą kontrolną z użyciem mieszaniny wzorca jako kontroli pozytywnej i wody jako kontroli bez matrycy. Aby uzyskać optymalne wykorzystanie odczynników zestawu K-RAS, należy testować próbki partiami. Kontrole konieczne są w przypadku wszystkich testów eksperymentalnych. Testowanie pojedynczych próbek powoduje zużycie większej ilości odczynników i zmniejszenie liczby próbek, które mogą być badane za pomocą jednego zestawu K-RAS. Protokół oceny próbek przygotowanie płytek 1. Rozmrozić mieszaninę do reakcji kontrolnej i mieszaninę wzorca z zestawu K-RAS w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu mieszać każdy roztwór przez obracanie każdej probówki 10 razy, aby uniknąć lokalnego gromadzenia się soli. Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny dla próbek DNA, jednej reakcji ze mieszaniną wzorca i jednej reakcji kontrolnej bez matrycy oraz nadmiarowo dla dwóch reakcji. 2. Aby przygotować mieszaninę do PCR, należy użyć takiej ilości odczynników w reakcji, jak podano w tabeli 3. Tabela 3: Objętości mieszaniny do PCR w próbie kontrolnej Test Mieszanina do PCR Mieszanina reakcyjna (µl)x1 Taq (µl)x1 Próba kontrolna 19,8 0,2 3. NIE wirować Taq lub mieszanin reakcyjnych zawierających Taq, ponieważ może to prowadzić do inaktywacji enzymu. Strona 10 z 39

11 4. Przed użyciem należy upewnić się, że Taq ma temperaturę pokojową. Odwirować probówkę, upewniając się, że polimeraza Taq jest zebrana na jej dnie, a następnie pipetować, umieszczając końcówkę pipety tuż pod powierzchnią roztworu Taq, aby zminimalizować ryzyko pokrycia końcówki nadmiarową ilością Taq. 5. Mieszać roztwór do reakcji PCR przez delikatne pipetowanie 6. Natychmiast dodać 20 µl mieszaniny do PCR dla reakcji kontrolnej do każdego dołka reakcyjnego. 7. Jak najszybciej dodać 5 µl próbki, mieszaniny wzorca lub wody (do kontroli bez matrycy), do dołków reakcyjnych. 8. Płytki muszą być przygotowane z mieszaniną wzorca dodaną do dołka A1 i kontrolą bez matrycy (woda) dodaną do A2. Pozostałe używane dołki powinny zawierać próbki. 9. Zamknąć i wymieszać krótko płytki do PCR w celu zebrania odczynników z dna dołków. 10. Postępować zgodnie z instrukcjami przygotowania aparatu dotyczącymi odpowiedniej platformy. Protokół oceny próbek przygotowanie aparatu LightCycler 480 Instrument 1. Jak najszybciej umieścić płytkę w aparacie LightCycler 480 Instrument. 2. Kliknąć ikonę LightCycler 480 Software na pulpicie stacji roboczej dołączonej do aparatu. Zalogować się do programu i na ekranie Overview wybrać pozycję New Experiment from Template. Z programów obecnych na liście wybrać K-RAS LC480II Run Template. Program ten ma następujące parametry: 1. Format detekcji to DxS IVD Assays. 2. Objętość reakcji wynosi Krok wstępnej denaturacji w 95 C przez 4 minuty stopniowa amplifikacja przez 45 cykli z denaturacją w 95 C przez 30 sekund i hybrydyzacja primerów w 60 C przez 1 minutę. Rejestracja fluorescencji to jednokrotna rejestracja w kroku 60 C. 3. Wybrać zakładkę Sample Editor i w kroku Step 1: Select Workflow zaznaczyć pole Abs Quant. Upewnić się, że w obszarze Select Filter Combinations, wybrane są oba filtry ( nm i nm). Określić nazwy próbek w krokach Step 2 i Step 3. Opcja Quantification Sample Type powinna być ustawiona jako unknown. Kolumna powtórzeń powinna pozostać pusta. Strona 11 z 39

12 4. Wybrać przycisk Experiment i kliknąć przycisk Start Run, aby zachować eksperyment i rozpocząć cykle. 5. Po ukończeniu testu, wybrać zakładkę Analysis i wybrać pozycję Abs Quant/2nd Derivative Max z okna Create New Analysis. Potwierdzić ustawienia domyślne na ekranie Create New Analysis. Upewnić się, że przycisk Filter Comb jest ustawiony na i wybrać przycisk Calculate. Wartości Ct są wyświetlone w tabeli Samples. 6. Wybrać przycisk Filter Comb i zmienić filtry na nm. Wybrać przycisk Calculate, aby uzyskać wartości kontroli egzogennej z tabeli Samples. Protokół oceny próbek ustawienie aparatu ABI7500 Instrument 1. Jak najszybciej umieścić płytkę w aparacie ABI Kliknąć ikonę 7500 System Software na pulpicie stacji roboczej dołączonej do aparatu. Otworzyć plik nowego testu w menu plików w programie 7500 Sequence Detection Software version W obszarze Assay wybrać pozycję Standard Curve (Absolute Quantification). Jako Run Mode wybrać Standard Przejść do okna ustawień detektora przez wybranie przycisku Next. Dodać detektor FAM i JOE do listy detektorów, z wygaszaczami ustawionymi na none. Jeśli te detektory jeszcze nie zostały utworzone, wybrać przycisk New Detectors i ustawić detektor FAM i JOE z wygaszaczem ustawionym na none. 5. Ustawić opcję Passive Reference na None i wybrać przycisk Next. 6. Wybrać całą płytkę i zaznaczyć pola wyboru dla detektorów FAM i JOE, aby upewnić się, że w każdym dołku oba barwniki są monitorowane. Wybrać przycisk Finish. 7. W zakładce Instrument ustawić cykle jak w tabeli 4. Tabela 4: Ustawienia cykli ABI7500 Temperatura Czas Cykle Uzyskiwanie danych Etap 1 95 C 4 min 1 Etap 2 95 C 30 sec 60 C 1 min 40 FAM, JOE 8. Wybrać przycisk Start, aby zachować eksperyment i rozpocząć cykle. Strona 12 z 39

13 9. Po ukończeniu testu upewnić się, że pasywny wzorzec jest ustawiony na none na ekranie kontroli dołków. W zakładce Amplification Plot zaznaczyć wszystkie używane dołki i wybrać barwnik JOE z menu rozwijanego detektora. 10. Sprawdzić sygnał JOE z każdej próbki i porównać z sygnałem JOE w dołku NTC. Zanotować wszystkie próbki z późniejszą krzywą amplifikacji lub brakiem amplifikacji dla kontroli egzogennej w porównaniu z NTC. 11. W zakładce Amplification Plot zaznaczyć wszystkie używane dołki i wybrać barwnik FAM z menu rozwijanego detektora. Zastosować automatyczne ustawienie początkowe i ręczne Ct, a następnie ręcznie ustawić próg na środku fazy wykładniczej za pomocą skali logarytmicznej dla osi Y zgodnie z opisem w instrukcji użytkownika urządzenia ABI Wybrać przycisk Analyse, aby uzyskać wartości Ct. Interpretacja oceny próbek Należy ocenić wartości Ct dla NTC, aby upewnić się, że nie wystąpiło zanieczyszczenie dające pozytywny wynik amplifikacji w kanale FAM (Ct niższe niż 40) lub nieprawidłowy wynik reakcji egzogennej kontroli w kanale HEX (brak Ct), wskazujący na problem z ustawieniami. W przypadku mieszaniny wzorca Ct dla próby kontrolnej (kanał FAM) wynik powinien wynosić na aparacie ABI7500 i 29 na aparacie LightCycler 480. Danych nie należy brać pod uwagę, jeśli wyniki dowolnego z testów są nieprawidłowe. Ct próby kontrolnej 29-35: zalecana ostrożność przy interpretacji, ponieważ bardzo niskie stężenia mutacji mogą nie zostać wykryte. Ct próby kontrolnej 35-38: w takich próbkach obecnych jest tylko kilka kopii DNA, które można poddać procesowi amplifikacji, a mutacje zostaną prawdopodobnie wykryte tylko, jeśli większość kopii jest zmutowana. Ct próby kontrolnej 38: należy odrzucić próbkę, ponieważ obecna jest minimalna ilość DNA i zestaw K-RAS nie będzie w stanie wykryć mutacji. Należy zaznaczyć, że jeśli próbka daje opóźniony próg Ct próby kontrolnej, wartość Ct egzogennej kontroli próbki powinna być porównana z egzogenną kontrolą NTC. Jeśli egzogenna kontrola próbki jest opóźniona lub negatywna w porównaniu z NTC, może to świadczyć o obecności inhibitora. Możliwe jest zmniejszenie wpływu inhibitorów przez rozcieńczenie próbki, chociaż spowoduje to także rozcieńczenie DNA. Rozcieńczenie próbki: Ct kontroli < 24 spowoduje przeładowanie testów mutacji. Próbki dające Ct kontrolne < 24 należy rozcieńczyć. Należy pamiętać, że dla aparatu LightCycler 480 Instrument, wartości Ct uzyskane dzięki metodzie obliczania 2. pochodnej mogą być różne od wyników uzyskanych dzięki oprogramowaniu LightCycler Adapt Software. Strona 13 z 39

14 Zaleca się rozcieńczanie stężonych próbek tak, aby ich wartości Ct znajdowały się w zakresie > 24, < 29 (wartości Ct uzyskane w programach 7500 Sequence Detection Software lub LightCycler 480 Instrument Software) z wykorzystaniem założenia, że rozcieńczenie o ½ zwiększa Ct o Protokół wykrywania mutacji K-RAS Przed rozpoczęciem użytkowania należy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje i zapoznać się ze wszystkimi elementami zestawu K-RAS. W celu efektywnego wykorzystania zestawu K-RAS próbki powinny być podzielone na partie po 10 (aby wypełnić jedną płytkę z 96 dołkami). Testowanie mniejszych partii spowoduje zmniejszenie ilości próbek, które można przebadać za pomocą jednego zestawu K-RAS. Ustawienia eksperymentalne aparatu LightCycler 480 Instrument Aby uniknąć odchyleń związanych z różnicami w przebiegu testów, dla każdej próbki DNA próby kontrolne i testy mutacji powinny być analizowane w tej samej reakcji PCR. 1. Rozmrozić mieszaninę do reakcji i mieszaninę wzorca z zestawu K-RAS w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu mieszać każdy roztwór przez obracanie każdej probówki 10 razy, w celu uniknięcia lokalnego gromadzenia się soli. Przygotować wystarczającą ilość mieszanin dla próbek DNA, mieszaniny wzorca i kontroli bez matrycy oraz dodatkowo dla 2 reakcji na mieszaninę, jak pokazano w tabeli 5. Tabela 5: Objętości mieszanin do PCR testu K-RAS Test Mieszaniny do PCR Mieszanina reakcyjna (µl)x1 Taq (µl)x1 Mieszanina reakcyjna (µl) na płytkę (x14) Strona 14 z 39 Taq (µl) na płytkę (x14) Próba kontrolna 19,8 0,2 277,2 2,8 Testy mutacji 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NIE wirować Taq lub mieszanin reakcyjnych zawierających Taq, ponieważ może to prowadzić do inaktywacji enzymu. 3. Przed użyciem należy upewnić się, że Taq ma temperaturę pokojową. Odwirować probówkę, upewniając się, że polimeraza Taq jest zebrana na jej dnie, a następnie pipetować, umieszczając końcówkę pipety tuż pod powierzchnią Taq, aby zminimalizować ryzyko pokrycia końcówki nadmiarową ilością Taq. 4. Wymieszać mieszaninę do PCR przez delikatne pipetowanie. 5. Jak najszybciej dodać 20 µl mieszaniny do PCR dla reakcji kontrolnej do każdego dołka reakcyjnego.

15 6. Jak najszybciej dodać 5 µl próbki, mieszaniny wzorca lub wody (do kontroli bez matrycy), do dołków reakcyjnych. Każda próbka DNA musi być testowana zarówno z kontrolą jak i wszystkimi testami mutacji. Ustawienie płytek zaprezentowano w tabeli 6. Tabela 6: Rozkład płytek w zestawie K-RAS Ustawienie dla 96 dołków Test A Mieszanin a wzorca Kontrola B Mieszanin 12ALA a wzorca C Mieszanin 12ASP a wzorca D Mieszanin 12ARG a wzorca E Mieszanin 12CYS a wzorca F Mieszanin 12SER a wzorca G Mieszanin 12VAL a wzorca H Mieszanin 13ASP a wzorca NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka 10 NTC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Próbka 9 Próbka Zamknąć i przez krótki czas mieszać płytki do PCR w celu zebrania odczynników z dna dołków. 8. Jak najszybciej umieścić płytkę w aparacie LightCycler 480. Ustawienia aparatu LightCycler 480 Instrument 1. Kliknąć ikonę oprogramowania LightCycler 480 Instrument na pulpicie stacji roboczej dołączonej do aparatu. Zalogować się do programu i na ekranie ogólnym wybrać pozycję New Experiment from Template. 2. Wybrać pozycję K-RAS LC480II Run Template z listy programów (szczegółowe informacje zawiera sekcja Ocena próbek aparatu LightCycler 480 Instrument). 3. Wybrać zakładkę Sample Editor i w Step 1: Select Workflow zaznaczyć pole Abs Quant. Upewnić się, że w obszarze Select Filter Combinations wybrane są oba filtry ( nm i nm). Ustawić nazwy próbek w krokach Step 2 i Step 3. W kolumnie 1 nazwą próbki powinno być Mixed Standard. W kolumnie 2 nazwą próbki powinno być NTC. Należy wprowadzić nazwy próbek w kolumnach Nazwy muszą być jednakowe dla wszystkich dołków w kolumnie 1. Dla pozycji Quantification Sample Type powinna być ustawiona wartość unknown. Kolumna powtórzeń powinna pozostać pusta, ponieważ powtórzenia nie są brane pod uwagę w programie LightCycler Adapt Software. Strona 15 z 39

16 4. Wybrać przycisk Experiment i kliknąć przycisk Start Run, aby zachować eksperyment i rozpocząć cykle. Analiza próbek w aparacie LightCycler 480 Instrument 1. Po ukończeniu testu w aparacie LightCycler 480 Instrument należy za pomocą okna nawigacji wyeksportować eksperyment (plik.ixo) do odpowiedniej lokacji, do której dostęp ma oprogramowanie LightCycler Adapt Software. 2. WAŻNE: Zezwala się na korzystanie z oprogramowania LightCycler Adapt Software tylko na jednym systemie komputerowym, będącym jednostką sterowania (stacją roboczą) dostarczoną przez firmę Roche Diagnostics do użycia z jednym aparatem LightCycler 480 Instrument II. Zezwolenie na korzystanie z oprogramowania LightCycler Adapt Software dotyczy obecnie wyłącznie jednostki sterowania, która jest autonomicznym komputerem (niepodłączonym do sieci). Korzystanie z innego komputera jest zabronione, ponieważ oprogramowanie może nie działać we właściwy sposób. 3. Uruchomić oprogramowanie LightCycler Adapt Software, klikając ikonę LightCycler Adapt Software na pulpicie stacji roboczej i wypełnić pole nazwy użytkownika. Nazwa ta zostanie wykorzystana jako nazwa autora raportu. 4. W oknie głównym za pomocą przycisku przeglądarki wybrać pojedynczy plik testu aparatu LightCycler 480 Instrument (aby usunąć wybór, program musi zostać zamknięty i uruchomiony ponownie). 5. Wybrać typ raportu (pdf lub csv). Jeśli wybrany został typ csv, automatycznie tworzona jest również dodatkowa wersja pdf. 6. Wybrać pozycję Analyse, aby utworzyć raport wyników. Raport jest automatycznie zapisywany w folderze zawierającym plik testu. Nadawana mu jest taka sama nazwa jak w przypadku pliku testu. 7. Raport zostanie automatycznie wyświetlony. 8. Wyniki włączane do raportu wyświetlane są w kolumnie Mutation Status w tabeli Sample Result Table. Interpretacja raportu z oprogramowania LightCycler Adapt Software 1. Raport z oprogramowania LightCycler Adapt Software zawiera ogólne informacje na temat analizy Autorem raportu jest użytkownik, który uruchomił program i utworzył raport Podana jest data i czas wykonania analizy. 2. Raport zawiera przegląd analizy z wyszczególnionymi informacjami, takimi jak nazwa pliku testu, plik definicji algorytmu i sekwencja algorytmu. Informacje dotyczące algorytmu są określone na stałe i nie można ich zmienić. Strona 16 z 39

17 3. Sekcja wyników zawiera pełną nazwę i ścieżkę dostępu do oprogramowania LightCycler 480 Instrument oraz następujące informacje: 3.1. Numer seryjny aparatu LightCycler 480 Instrument Instrument Name identyfikator nadany aparatowi LightCycler 480 Instrument w oprogramowaniu LightCycler 480 Instrument Run Date data i czas działania aparatu LightCycler 480 Instrument Run Operator imię użytkownika zalogowanego w programie LightCycler 480 Instrument w czasie trwania testu Experiment Name nazwa pliku testu Software Version wersja oprogramowania używanego w aparacie LightCycler 480 Instrument Lot Number pochodzący z pola Lot No na ekranie ustawień eksperymentu w programie LightCycler 480 Instrument. 4. Ustawienie płytki wyszczególnione jest wraz z nazwami próbek pochodzącymi z ekranu edytora próbek oprogramowania LightCycler 480 Instrument. 5. Po zakwalifikowaniu testu jako Ważny lub Nieważny wyświetlany jest raport Run Summary Result. Jest to zależne od prób kontrolnych testu zapisanych w kolumnach 1 i Próby kontrolne testu 6.1. Oprogramowanie LightCycler Adapt Software automatycznie oblicza wartość Ct dla mieszaniny wzorca z wykorzystaniem wzoru Ct mutacji-ct kontroli = Ct 6.2. Oprogramowanie LightCycler Adapt Software porównuje uzyskane wartości z wartościami oczekiwanymi podanymi w tabeli 7. Tabela 7: Oczekiwane wartości Ct w LightCycler Adapt Software Test Ct mieszaniny wzorca 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0, Wartości Ct i Ct dodawane są do raportu Dla prób kontrolnych testu, w kolumnach 1 i 2 raportowane są następujące flagi/ostrzeżenia: Strona 17 z 39

18 Tabela 8: Flagi/Ostrzeżenia dla prób kontrolnych testu w LightCycler Adapt Software Flagi/ostrzeżenia CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Znaczenie Ct dla FAM próby kontrolnej jest poza skalą. Wartość Ct kontroli egzogennej dla mieszaniny wzorca jest < 30 lub negatywna, jeśli wynik FAM jest negatywny. Wartości Ct mutacji są poza ustaloną skalą. Egzogenna reakcja kontrolna nie powiodła się w NTC. Reakcja FAM ma pozytywną wartość Ct w NTC Poniżej zamieszczono bardziej szczegółowe wyjaśnienia znaczeń znaczenia flag/ostrzeżeń: CT_OUT_OF_RANGE Próba kontrolna dla mieszaniny wzorca musi mieć wartość Ct wynoszącą 26,60 ±2. Jeśli test jest poza tą skalą ta flaga/ostrzeżenie jest wyświetlana dla wszystkich dołków mieszanin wzorca, ponieważ wartości Ct nie są obliczane, a mieszaniny wzorca są nieprawidłowe. Oznacza to, że próba kontrolna nie działa prawidłowo EXO_FAIL Ta flaga/ostrzeżenie jest wyświetlana, jeśli egzogenna próba kontrolna w dowolnym dołku z mieszaniną wzorca daje wynik poniżej 30, co może oznaczać, że w tej mieszaninie obecne jest zanieczyszczenie PCR. Jeśli egzogenna próba kontrolna nie jest udana, w przypadku nieudanej reakcji FAM w dowolnym z dołków z mieszaniną wzorca flaga/ostrzeżenie EXO_FAIL jest również wyświetlane. Wskazuje to na problem z testem, który może prowadzić do wyników fałszywie negatywnych. Mieszanina wzorca jest nieważna z powodu błędu FAM DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Jeśli wartości Ct mieszaniny wzorca znajdują się w zakresie ±2,00 wartości podanych w tabeli 7, oprogramowanie uzna je za ważne. Jeśli wartość Ct jest poniżej oczekiwanego zakresu, wynik zostanie uznany za nieważny i wyświetlona zostanie niniejsza flaga/ostrzeżenie. Wskazuje to na problem z testem, który może prowadzić do fałszywych wyników EXO_CONTROL_INVALID W dołkach kontroli bez matrycy, egzogenna próba kontrolna musi dać wynik pozytywny we wszystkich 8 dołkach (Ct < 41). Jeśli uzyskany zostanie wynik negatywny wyświetlana jest niniejsza flaga/ostrzeżenie i wyświetlany jest status nieważny. Wskazuje to na problem z testem, który może prowadzić do fałszywych wyników. Strona 18 z 39

19 TARGET_CHANNEL_INVALID W 8 dołkach kontroli bez matrycy wynik FAM musi być negatywny (Ct > 38). Każda amplifikacja wskazuje na zanieczyszczenie. Wynik pozytywny powoduje wyświetlenie niniejszej flagi/ostrzeżenia i unieważnienie kontroli bez matrycy W przypadku statusu nieważnego dla któregokolwiek dołka z mieszaniną wzorca lub kontroli bez matrycy raport Run Summary Result będzie miał wartość Run Invalid. Nazwy próbek i wartości Ct kontroli zostaną dołączone do raportu w tabeli Sample Result Table, status mutacji zostanie zgłoszony jako invalid. Mieszaniny wzorca wskazują, że wszystkie testy są prawidłowe. W innym przypadku może dojść do błędnego zakwalifikowania próbki jako pozytywnej lub negatywnej pod względem mutacji. Kontrola bez matrycy wskazuje, że nie wystąpiły zanieczyszczenia w mieszaninach do PCR oraz że kontrola egzogenna daje oczekiwane wyniki W rzadkich przypadkach, kiedy oprogramowanie LightCycler Adapt Software wyświetla komunikat błędu, należy skontaktować się z pomocą techniczną, patrz sekcja Wyniki próbek 7.1. W tabeli Sample Result Table wyszczególnione są nazwy próbek wprowadzone do programu LightCycler 480 Instrument oraz wartości Ct prób kontrolnych Program LightCycler 480 Adapt Software obliczy wartości Ct i określi, czy w próbce występuje mutacja na podstawie 1% wartości granicznej podanej w tabeli 9. Tabela 9: 1% wartości granicznej w LightCycler Adapt Software Test 1% delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9, Jeśli wartość Ct mutacji dla próbki jest poniżej odpowiadającej 1% wartości granicznej, Ct próbka uznawana jest za pozytywną pod względem mutacji. Program LightCycler Adapt Software zasygnalizuje, która mutacja jest obecna, ale zgłosi tylko pojedynczą mutację. Jeśli obecne są 2 pozytywne wartości Ct zgłoszona zostanie niższa z nich. Zakłada się, że druga wartość jest wynikiem przesłuchu przy przyłączaniu się primerów jednej mutacji i primingu z innej mutacji. Strona 19 z 39

20 W rzadkich wypadkach, kiedy obecna jest podwójna mutacja, decyzja lekarza będzie taka sama jak w przypadku obecności pojedynczej mutacji Jeśli wartości Ct próbki są wyższe niż 1% wartości Ct, próbka jest zgłaszana jako niezawierająca mutacji (może ona zawierać mutację, ale poniżej progu wykrycia testu) Flagi/ostrzeżenia Program LightCycler Adapt Software może wyświetlić określone Flagi/ostrzeżenia dla próbek w tabeli Sample Result Table jak opisano w tabeli 10. Tabela 10: Flagi/ostrzeżenia dla próbek w LightCycler Adapt Software Flaga/ostrzeżenie Znaczenie REP_DILUTION Ct kontroli jest niższe niż 24. CONF_LEVEL Ct kontroli jest wyższe niż 28,9 i nie jest zgłaszana obecność mutacji. LIMITED Ct kontroli jest wyższe niż 35. EXO_FAIL Próba kontroli egzogennej nie powiodła się w przypadku, gdy reakcja FAM także dała nieprawidłowe wyniki w reakcji mutacji, lub Ct kontroli egzogennej jest niższe niż 30. FAIL Program nie może określić krzywej jako negatywnej lub pozytywnej Poniżej zamieszczono bardziej szczegółowe wyjaśnienia znaczeń znaczenia flag/ostrzeżeń: REP_DILUTION Ct kontroli < 24. Testy zostały uznane za ważne dla poziomu DNA, który daje Ct kontrolne o wartości 24 lub większej. Jeśli próbka daje niższe Ct próby kontrolnej, powinna zostać rozcieńczona w celu zagwarantowania, że mieści się w odpowiednich granicach CONF_LEVEL Ct kontroli > 28,9. Flaga/ostrzeżenie CONF_LEVEL zostanie wyświetlona w próbce negatywnej pod względem mutacji z Ct kontroli > 28,9. Wartości Ct mutacji są klasyfikowane jako negatywne lub poza zasięgiem wykrywania zestawu, kiedy są większe niż lub równe 38. Uzyskanie wartości Ct kontroli 28,9 lub niższej jest konieczne, aby zagwarantować, że obecna jest wystarczająca ilość DNA pozwalająca na wykrycie 1% mutacji, przy założeniu 1% wartości granicznej i wartości granicznej Ct na poziomie 38. Jeśli Ct kontroli jest wyższe niż 28,9 i wykryta została mutacja, wskazywana jest informacja o obecności mutacji, a niniejsza flaga nie jest wyświetlana, ponieważ próbka zawiera mutację. Jeśli jednak Ct kontrolne jest powyżej 28,9 i próbka wydaje się nie zawierać mutacji, niniejsza flaga/ostrzeżenie jest wyświetlana jako ostrzeżenie informujące, że niskie poziomy mutacji mogły zostać pominięte. W miarę wzrostu Ct kontrolnego powyżej wartości 28,9 czułość wykrywania mutacji zmniejsza się. Strona 20 z 39