JONY METASTABILNE I FRAGMENTACJA POD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ

Transkrypt

1 SPEKTRMETRIA MAS W CHEMII RGANICZNEJ, ANALITYCZNEJ I BICHEMII WYKŁADY 7 i 8 Jony metastabilne i fragmentacja pod wpływem energii zderzeń GC/MS HPLC/MS Instytut Chemii rganicznej PAN, Warszawa JNY METASTABILNE I FRAGMENTACJA PD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ

2 Widmo EI kwasu octowego Jony fragmentacyjne Intensywność względna 5 15 C H 3 18 C M = H Jon molekularny m/z Terminologia procesów fragmentacji M + P + + N jon macierzysty (parent ion lub precursor ion) jon potomny (daughter ion lub product ion) fragment obojętny (neutral fragment) Energia jonów fragmentacyjnych M + P + + N E M = E P + E N E P =E M M M P M (jeśli pominąć energię uwalnianą w reakcji fragmentacji

3 Rodzaje pomiarów MS/MS Widmo jonów potomnych Widmo jonów macierzystych Q1 Product Ion Scan Q3 Q1 Precursor Ion Scan Q3 m 1 m 2 m 1 m 1 m 2 m 1 Wybór jonu macierzystego Skanowanie jonów potomnych Skanowanie jonów macierzystych Wybór jonu potomnego Widmo jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Q1 m 1 m 2 Neutral Loss Scan Skanowanie Q1 i Q3 ze stałą różnicą masy m Q3 m 1 - m m 2 - m Śledzenie wybranych reakcji fragmentacji Multiple Reaction Monitoring (MRM) m 1 m 2 (m 3, m 4...) Wybór jonu macierzystego Wybór jonu potomnego (lub kilku jonów potomnych) Rozkład energii populacji jonów molekularnych w źródle jonów EI P(E) Fragmentacja w źródle jonów M + Czas przebywania jonu w źródle: s Czas przelotu jonu przez spektrometr AMD 64: M= 1 u s EI (Energia jonizacji) Jony metastabilne M= 4 u s E

4 Metody badania fragmentacji w spektrometrze o podwójnym ogniskowaniu i geometrii BE Szczelina wejściowa Analizator magnetyczny Drugi obszar wolny od pola (II FFR) Komory zderzeń Widma jonów potomnych MIKES (Mass-analyzed Ion Kinetic Energy Spectrum) Analizator elektryczny Pierwszy obszar wolny od pola (I FFR) Szczelina wyjściowa Źródło jonów Widma jonów potomnych B/E=const. Widma jonów macierzystych B 2 /E = const. Widma jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Powielacz elektronów Widmo EI 1-metylo-4-nitrobenzosultamu N S 2 Intensity (%age) N 2 M = Low Resolution M/z

5 Widma jonów potomnych MIKE i CA-MIKE dla jonu EI Intensity (Volts) Intensity (%age) Low Resolution M/z 164 MIKE dla jonu Low Resolution M/z Intensity (Volts) Low Resolution M/z CA-MIKE dla jonu Widma jonów potomnych B/E i CA-B/E dla jonu EI Intensity (%age) B/E dla jonu Intensity (Volts) Low Resolution M/z Intensity (Volts) Low Resolution M/z Low Resolution M/z CA-B/E dla jonu

6 Widma jonów macierzystych B 2 /E dla jonów 147 i 14 Intensity (Volts) B 2 /E dla jonu 147 Intensity (%age) EI Low Resolution M/z Low Resolution M/z Intensity (Volts) B 2 /E dla jonu Low Resolution M/z Widma utraty obojętnego fragmentu o masie 64 i 28 Intensity (%age) Intensity (%age) EI Low Resolution M/z CNL dla Low Resolution M/z Intensity (Volts) CNL dla Low Resolution M/z

7 SPEKTRMETR MAS TYPU API 3 +MS2 (137.) CE (1):.31 to 1.52 min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 7.7e5 cps. Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń + N N H H [M + H + ] = e5 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 1.5e5 CE = 1V M + H + 1.e5 5.e MS2 (137.) CE (1): 1.93 to min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 4.9e5 cps. +MS2 (137.) CE (1): 4.27 to min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 3.9e5 cps. 4.9e5 4.5e5 CE = 15V e5 3.8e5 3.6e5 CE = 25V e5 3.4e5 3.2e5 3.5e5 3.e5 2.8e5 3.e5 2.5e5 M + H e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.5e5 1.2e5 1.e e5 5.e e4 6.e4 4.e4 2.e4 16. M + H

8 Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń -MS2 (227.2):.15 to 1.53 min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 8.2e5 cps. -MS2 (227.2): 3.5 to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 2.4e5 cps. 8.e5 7.5e5 CE = 1V [M H] e5 2.2e5 CE = 2V e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 N S 2 1.8e5 1.6e [M H] 4.5e5 1.4e5 4.e5 1.2e e5 N 2 1.e5 3.e5 2.5e5 M = e4 6.e e5 1.e5 4.e4 5.e e MS2 (227.2): 1.73 to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 4.3e5 cps. -MS2 (227.2): 4.58 to 5.76 min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 2.6e5 cps. 4.3e5 4.2e5 4.e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4 CE = 15V [M H] e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4 CE = 25V [M H] Praca w trybie MS Spektrometr typu Q-TF Praca w trybie MS/MS

9 Spektrometr Q-TF z analizatorem TF typu W Widma fragmentacji peptydu (Q-TF)

10 Widma fragmentacji peptydu (Q-TF) Spektrometr ESI - Ion Trap firmy Agilent

11 Widma kolejnych fragmentacji glikozydu (pułapka jonowa LCQ; jony ujemne) Fragmentacja w źródle jonów electrospray (cone voltage fragmentation) Gaz rozpylający (N 2 ) Dysza Płytka osłonowa Ciśnienie atmosferyczne bszar fragmentacji U Zbierak Declusteringpotentiallub nozzle potential lub skimmer potential Q ~ 2 Torr 8 x 1-3 Torr Roztwór próbki Przechodzenie jonów do fazy gazowej Gaz osłonowy (N 2 ) Pompa wstępna Pompa turbomolekularna

12 Cone voltage fragmentation [M+2H + ] 2+ MARINER Nozzle potential 1V [M+H + ] B 2 A [M+2H + ] 2+ Y MARINER Nozzle potential 28V Y [M+H + ] Y 3 B Y B B Y 6 Y 7 [M+Na + ] Widma MS/MS peptydu (M = 1239,6) B 2 A [M+2H + ] 2+ Y MARINER (ESI-TF) Nozzle potential 28V Y 6 Y 7 Y [M+H + ] Y 3 B Y B B [M+Na + ] B 2 [M+2H + ] API 365 (ESI-QQQ) Product Ion Scan dla jonu m/z621 [M+2H + ] 2+ Y Y Y B A 2 Y 7 Y Y 4 B B B B 6 8 A

13 Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas GC/MS Problemy związane z techniką GC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf gazowy Spektrometr mas Próbka w formie pary rozcieńczonej dużą ilością gazu EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI:wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: pozbycie się dużej ilości gazu nośnego szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Lotność(ew. po derywatyzacji) dporność na wysoką temperaturę

14 Budowa zestawu chromatograf gazowy spektrometr mas (GC/MS) strzykawka z próbką komora termostatowana kolumna kapilarna źródło jonów linie transmisji danych hel Chromatograf gazowy Spektrometr mas Komputer Spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym Źródło jonów EI Analizator kwadrupolowy Detektor do pompy do pompy sygnał do wzmacniacza

15 Analiza GC/MS mieszaniny wzorcowej Abundance 6.43 TIC: EVALDEM.D Time--> Abundance 6 Average of to min.: EVALDEM.D (-) m/z--> Identyfikacja związku z wykorzystaniem biblioteki widm masowych Abundance 9 Average of to min.: EVALDEM.D (-) 188 Widmo zmierzone m/z--> Abundance Widmo biblioteczne m/z--> #7274: 3-Chlorobiphenyl $$ 1,1'-Biphenyl, 3-chloro- (CAS) Cl

16 Chromatogram gazowy mieszaniny nitrotoluenów HN 3 H 2 S 4 N N 2 N α-pinen (96 %) ChromatogramGC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a β-pinen (97 %) 3.17 sabinen (97 %) mircen 3.33 (96%) limonen (99 %) γ-terpinen (97%) 5.82 linalool (97%) p-cymen (97%) α-terpinolen 6.4 (98%) 6.66 octan linalylu (91%) α-bergamoten (98 %) 12.3 β-kariofilen (99 %) β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) α-terpineol (91 %) geranial (96%) octan geranylu (91 %) min. Liczby w nawiasach określająw procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego

17 Chromatogram całkowitego prądu jonowego i chromatogram dla wybranej masy jonu Chromatogramydla wybranych mas w warunkach pomiaru wysokiej rozdzielczości

18 Analiza GC/MS 1-metylo-4-nitrobenzosultamu N S 2 N S 2 - S 2 N A N 2 M = 228 N 2 M = 228 N 2 M = 164 N CH 2 A N 2 M = 164 M + N CH 2 N 2 M = 164 Analiza GC/MS 4-nitrobenzosultamu H N S 2 t - S 2 N 2 N 2 8a M = 15 M = 214 N 2 NH 2 N 9a M = 3 H N Generation and Reactions of Aza-orthoxylylenesintheInjectorofGC/MS System, W. Danikiewicz, K. Wojciechowski, M. lejnik, Tetrahedron Lett., 36, 199 (1995). N 2 Abundance a 15.8 Time--> Abundance m/z--> N 2 M = 214 Scan 118 (15.8 min) H N S t ? 9a 9a M + M +. 3

19 Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Identyfikacja zanieczyszczeńw lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. profil kwasowy) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas LC/MS lub HPLC/MS

20 Problemy związane z techniką LC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf cieczowy Spektrometr mas Próbka w formie rozcieńczonego roztworu, często z zawartością bufora EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI:wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: konieczność odparowania dużej ilości rozpuszczalnika problem substancji buforujących szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Niska lotność Rozpuszczalność w wybranym rozpuszczalniku (eluencie) Trwałość w warunkach HPLC Dopasowanie rodzaju źródła jonów do warunków chromatografii cieczowej Średnica wewnętrzna kolumny chromatograficznej Przepływ eluenta Rodzaj źródła jonów 4 4,6 mm,5 1 ml/min TurboIonSpray, APCI 1-2 mm 5 2 µl/min Electrospray standardowy, APCI 1 1 µm,5 5 µl/min Microspray 1 1 µm 1 5 nl/min Nanospray Podstawowa zależność: dwukrotnie mniejsza średnica = czterokrotnie mniejszy przepływ

21 Warunki, które muszą być spełnione podczas pomiaru HPLC/MS Próbka musi byćwystarczająco polarna, aby ulec jonizacji w technice electrospray (ESI), ewentualnie APCI. Analiza z zastosowaniem faz odwróconych. Akceptowalne eluentyto: metanol, woda, acetonitryl, izopropanol i ich mieszaniny. Dopuszczalny jest pomiar w gradiencie składu eluenta. Kolumna z wypełnieniem najlepiej C-18, C-8 lub analogicznym, służącym do analiz w fazach odwróconych. Eluentnie może zawieraćnielotnych buforów, np. fosforanowych. Dopuszczalne sąoctan i mrówczan amonu, kwasy octowy i mrówkowy itp. lotne związki. Czas analizy nie powinien przekraczać 6 min. Uwaga: technika jonizacji APPI (fotosprej) umożliwia pracęz zastosowaniem faz normalnych, ale wymaga jeszcze dopracowania. ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ DIGKSYNY H H H H H H

22 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H ANALIZA DIGKSYNY H Widmo APCI(-) digoksynyw układzie MeH-CHCl 3. Jon pseudomolekularny[m + Cl] - ulega fragmentacji tracąc kolejne reszty cukrowei zachowując jon Cl -. M + Cl - H - Q1: to min from CH3ClDigoxin. wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e H H H H = = = e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e = e6 1.e e e5 4.e ANALIZA DIGKSYNY Chromatogram całkowitego prądu jonowego 3.1e8 3.e8 2.8e8 2.6e8 2.4e8 2.2e8 2.e8 1.8e8 1.6e8 1.4e8 1.2e8 1.e8 8.e7 6.e7 4.e7 2.e7 TIC of -Q1: from CH3ClDigoxin.wiff Max. 3.1e8 cps Chromatogramprądu jonowego wybranych jonów(jony [M+Cl] - digoksyny i acetylodigoksyny) 8.4e7 8.e7 7.5e7 7.e7 6.5e7 6.e7 5.5e7 5.e7 4.5e7 4.e7 3.5e7 3.e7 2.5e7 2.e7 1.5e7 1.e7 5.e Time, min XIC of -Q1: 856. to 86 amu from CH3ClDigoxin.wiff, Added <XIC of -Q1: 815. to 819. amu fro... Max. 8.4e7 cps Time, min

23 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H H H H = = = H H = e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc+ Cl] - M= Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H Ac H H = = H H = = e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc+ Cl] - M= Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e

24 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H Ac H H H = = H H = = e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc+ Cl] - M= Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e WYKRYWANIE PACLITAXELU (TAKSLU) W MATERIALE BILGICZNYM NHBz Ac H H H H Bz Ac

25 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1:.1 to 1.2 min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff 4.3e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu Max. 4.3e6 cps. 6.e5 4.e [M + Na + ] + NHBz H Ac H H Bz Ac H Paclitaxel(taksol) M = Product (876.5): 1.32 to min from Sample 2 (fragmentacja CE 35) of taxol.wiff 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. cps Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym TIC of +Q1: from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 9.4e7 cps. 9.4e7 9.e Chromatogram całkowitego prądu jonowego badanej mieszaniny 8.5e7 8.e7 7.5e7 7.e7 6.5e7 6.e7 5.5e7 5.e7 4.5e7 4.e7 3.5e7 3.e e7 2.e7 1.5e7 1.e7 5.e Time, min Base Peak Chrom. of +Q1: from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 4.2e6 cps. 4.2e Chromatogram maksymalnych pików badanej mieszaniny 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e Time, min

26 WYKRYWANIE TAKSLU W MATERIALE BILGICZNYM XIC of +Q1: 875. to 877. amu from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 2.2e5 cps. Chromatogramjonu m/z876,4 badanej mieszaniny 2.1e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e Time, min Q1: to 238 min from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff, subtracted ( to 1... Max. 5.9e4 cps. Widmo masowe (po odjęciu tła) dla piku z powyższego chromatogramu 5.9e4 5.5e4 5.e4 4.5e4 4.e4 3.5e4 3.e4 2.5e4 2.e4 1.5e4 1.e Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1:.1 to 1.2 min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff 4.3e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu Max. 4.3e6 cps. 6.e5 4.e [M + Na + ] + NHBz H Ac H H Bz Ac Paclitaxel(taksol) M = Product (876.5): 1.32 to min from Sample 2 (fragmentacja CE 35) of taxol.wiff 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e H Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. cps

27 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Max. 12 cps. XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/531.2 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Max. 14 cps Chromatogram MRM Chromatogram MRM Time, min Time, min XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/38.2 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Chromatogram MRM Max. 4 cps Time, min XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Nałożone chromatogramymrm Max. 12 cps Time, min Zastosowania techniki LC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza białek i produktów ich hydrolizy enzymatycznej Identyfikacja zanieczyszczeńw lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne(np. oznaczanie stężenia leków i ich metabolitów we krwi) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska