Wstęp. Streszczenie. Abstract

Transkrypt

1 Streszczenie Distamycyna i netropsyna to naturalne antybiotyki o aktywności przeciwnowotworowej, wiążące się odwracalnie z DNA za pomocą wiązań wodorowych, oddziaływań van der Waalsa i elektrowalencyjnych, z wyraźną preferencją do regionów zawierających pary zasad A-T. Cząsteczki obu związków to oligopeptydy zbudowane z reszt kwasu 4-amino-1-metylopirolowego i silnie zasadowych łańcuchów bocznych, o kształcie izohelikalnym do węższej bruzdy DNA. Antybiotyki te, mimo, że charakteryzują się wielokierunkową aktywnością, są zbyt toksyczne, by znaleźć zastosowane w leczeniu nowotworów. Sposób wiązania distamycyny i netropsyny z DNA zainspirował poszukiwanie związków o podobnym mechanizmie działania, niektóre z nich weszły do fazy badań klinicznych. Grupa syntetycznych oligopeptydów projektowanych na wzór omawianych antybiotyków, selektywnych wobec określonych par zasad DNA, otrzymała nazwę leksitropsyn. Analogi zawierające benzen w miejscu pierścienia N-metylopirolowego wykazują antyproliferacyjną aktywność wobec linii komórkowych raka sutka. Karbocykliczne leksitropsyny zbudowane z przynajmniej trzech podjednostek benzenowych hamują działanie topoizomeraz DNA oraz amidolityczną aktywność enzymów proteolitycznych, takich jak plazmina i urokinaza.. Opisane, niektóre tylko rezultaty z zakresu modyfikacji struktury analogów netropsyny i distamycyny dają nadzieję, że zostanie otrzymany związek o pożądanej aktywności, który będzie mógł być stosowany jako środek leczniczy w terapii przeciwnowotworowej. Abstract Distamycin and netropsin are natural antibiotics with anticancer activity, binding reversibly within DNA by hydrogen bonds, van der Waals contacts and electrostatic interactions, with high specificity for regions containing A-T base pairs. The molecules both of compounds are oligopeptides constructed with 4-amino-1-methylpyrrole acid moieties and strong basic side chains, with isohelical to minor groove DNA shapes. These antibiotics, although are characterized multidirectional activity, are too toxic to find the application in cancer therapy. The manner in which distamycin and netropsin bind to DNA inspired the searching of compounds with similar mode of action, some of them were came in clinical trial phases. The group of synthetic oligopeptides projected on pattern of described antibiotics, selective to specific base pairs of DNA, obtained the name lexitropins. The analogues containing the benzene in place of N-methylpyrrole rings show the antiproliferative activity against breast cancer cell lines. The carbocyclic lexitropsins built with at least three benzene units inhibit the topoisomerases DNA activity and amidolytic activity of proteolytic enzymes such plasmin or urokinase. The described results in the field of distamycin and netropsin structures modification raise possibility to obtain the compound with required activity; which will be suitable for application in anticancer therapy. Key words: Distamycin, netropsin, anticancer agents, minor groove binders Słowa kluczowe: Distamycyna, netropsyna, związki przeciwnowotworowe, związki wiążące się z DNA Wstęp Przez wiele lat zabieg operacyjny i radioterapia były wyłącznymi sposobami leczenia nowotworów. Nowa, rozwijająca się zwłaszcza w ostatnim czterdziestoleciu, metoda leczenia chorób nowotworowych za pomocą naturalnych i syntetycznych leków cytostatycznych, zwana chemioterapią, uzupełnia chirurgiczną terapię przeciwnowotworową. Zakres zastosowań leków przeciwnowotworowych znacznie wzrósł, poznano mechanizmy ich działania, jednak wciąż stanowią one grupę leków o wąskim indeksie terapeutycznym i dużej toksyczności [1]. Poznanie molekularnych mechanizmów procesów nowotworowych umożliwia poszukiwanie nowych substancji działających skutecznie na

2 czym tworzą się wielokrotne wiązania wodorowe pomiędzy cząsteczką antybiotyku i sąsiadującymi zasadami DNA, zaś jego kationowe fragmenty wiążą się elektrowalencyjnie z resztami fosforanowymi [2]. Syntetyczne związki tego rodzaju nie są jeszcze stosowane klinicznie, mimo, że prace nad poszukiwaniem analogów związków wiążących się w węższej bruździe, są bardzo intensywne w ostatnich latach. Struktura i aktywność biologiczna distamycyny i netropsyny Ryc.1. Struktury netropsyny (I) i distamcyny (II). wybrane cele molekularne. Do badań tych można zaliczyć nowoczesną grupę związków o właściwościach przeciwnowotworowych, działających poprzez selektywne wiązanie się z węższą bruzdą B-DNA, w tym netropsyny (I) i distamycyny (II) (Ryc.1) oraz ich analogów. Do grupy związków wiążących się w węższej bruździe podwójnej helisy DNA należą także Hoechst (III), berenil (IV), DAPI (V) oraz grupa bisamidyn (VI-pentamidyna) (Ryc. 2). Związki te nie wywołują głębokich zmian w konformacji DNA. Wręcz przeciwnie, to kształt cząsteczki tych związków upodabnia się do kształtu tej części B-DNA, przy Distamycyna i netropsyna, są naturalnymi antybiotykami o silnym działaniu przeciwnowotworowym, wyizolowanymi z Streptomyces netropsis i Streptomyces distallicus [3]. Związki te z powodu zbyt dużej toksyczności nie znalazły zastosowania w praktyce klinicznej, służą jednak jako modele, wzorce i nośniki grup czynnych w poszukiwaniu nowych środków przeciwnowotworowych. Pod względem chemicznym związki te są oligopeptydami zbudowanymi z pierścieni metylopirolowych połączonych wiązaniami peptydowymi. Fragmentem C-terminalnym każdego z antybiotyków jest grupa 2-amidynoetyloaminowa, a N-terminalnym formylowa w przypadku distamycyny i guanidynoacetylowa w przypadku netropsyny. W warunkach fizjologicznych distamycyna jest kationem jedno-, a netropsyna dwudodatnim. Ryc. 2. Struktury związków wiążących się z węższą bruzdą B-DNA.

3 Ryc. 3. Struktury leksitropsyn poddanych badaniom klinicznym. Stwierdzono, że cząsteczki tych antybiotyków, zbudowane z reszt kwasu 4-amino-1-metylopirolo-2-karboksylowego, tworzą łuk, w którym grupy N-metylenowe są po stronie zewnętrznej krzywizny, natomiast grupy NH wiązań amidowych, są po stronie wklęsłej łuku. Dzięki takiej strukturze mogą tworzyć wiązania wodorowe w pozycji C-2 tyminy i N-3 adeniny. Kierunek wiązań amidowych CONH w obu antybiotykach jest zgodny z kierunkiem C5 C3 łańcucha polinukleotydowego [4]. Wykazano, że oba związki charakteryzują się wysoką selektywnością wiązania regionu DNA bogatych w pary A-T, przy czym distamycyna oddziałuje z pięcioma a netropsyna z czterema parami zasad [5]. Distamycyna i netropsyna wiążąc się silnie z B-DNA, wnikają głęboko do wnętrza mniejszej bruzdy, dzięki czemu hamują działanie polimeraz, wpływając na proces replikacji i transkrypcji [6]. Związki te powodują zatrzymanie fazy G2 i poliploidyzację w ludzkich diploidalnych fibroblastach [7], hamują również aktywność topoizomerazy I [8] oraz różnego rodzaju enzymów restrykcyjnych [9]. Netropsyna hamuje wzrost bakterii G(+) i G(-), prątków kwasoodpornych pierwotniaków oraz namnażanie się wirusów zwierzęcych [10]. Distamycyna hamuje syntezę wirusowego DNA Herpes simplex, a także wiąże się z fragmentami retrowirusa HIV-1 [11]. Obydwa antybiotyki wykazują właściwości cytotoksyczne in vitro i in vivo w stosunku do nowotworów Ehrlicha i Walkera [12]. Ryc. 4. Schemat tworzenia bibliotek kombinatorycznych analogów distamycyny. Mimo tak wielokierunkowej aktywności, omawiane związki nie znalazły zastosowania w terapii nowotworów z powodów wysokiej cytotoksyczności skierowanej przeciwko komórkom zdrowym. Distamycyna ma słabsze działanie toksyczne niż netropsyna, dzięki czemu bywa stosowana w okulistyce przy zakażeniach wirusem opryszczki [13] i niektórych infekcjach wirusowych skóry [14]. Leksitropsyny cząsteczki selektywnie rozpoznające sekwencje DNA Mechanizm działania distamycyny i netropsyny z B-DNA stał się inspiracją do poszukiwania związków, które mając kształt izohelikalny względem węższej bruzdy B-DNA, wiążą się nieinterkalacyjnie z DNA, specyficznie wobec określonych par zasad i charakteryzują się mniejszą cytotoksycznością. Grupa syntetycznych heteroaromatycznych oligopeptydów, projektowanych na wzór omawianych antybiotyków otrzymała nazwę leksitropsyn. Wszystkie te związki mogą wykazywać działanie zarówno przeciwwirusowe, jak i przeciwnowotworowe, wpływają także hamująco na aktywność topoizomeraz [2]. Pomimo ogromnego postępu w projektowaniu leksitropsyn o wysoce selektywnym sposobie działania nie uzyskano dotychczas związków, których właściwości pozwoliłyby na ich zastosowanie lecznicze [15]. Wraz z analogami innych związków wiążących się z mniejszą bruzdą DNA, leksitropsyny znalazły zastosowanie jako nośniki związków o ugruntowanym działaniu przeciwnowotworowym, wiążąc je w ściśle określonych rejonach DNA [2]. Jednym z przykładów jest tallimustyna, analog distamycyny z dołączonym fragmentem iperytowym (Ryc. 3), która wykazała cytotoksyczność wobec komórek białaczki L1210 większą o rząd wielkości

4 wydajności syntezy. W wyniku badań i syntez otrzymano ligandy wykazujące tysiąckrotnie większą cytotoksyczność (IC 50 29nM) niż distamycyna A [20]. Leksitropsyny karbocykliczne Ryc. 5. Struktury karbocyklicznych leksitropsyn. w porównaniu do melfalanu [16]. Ponieważ związek ten powodował silną niedokrwistość, badania kliniczne tallimustyny przerwano w II fazie [17]. Innym związkiem o interesującym mechanizmie działania jest brostallicyna (Ryc. 3), analog distamycyny z fragmentem α-bromoakrylamidowym. Związek ten wiąże się z DNA tylko w obecności glutationu (GSH) i transferazy S-glutationowj (GSH), które są produkowane w większym stopniu w komórkach nowotworowych niż normalnych [18]. Brostallicyna jest obecnie w II fazie badań klinicznych [19]. Poszukiwanie leksitropsyn o optymalnej aktywności biologicznej jest kontynuowane w wielu ośrodkach naukowych, także z zastosowaniem syntezy kombinatorycznej. Przykładem jest otrzymanie 2640 analogów distamycyny metodą typową dla syntez oligopeptydów, gdzie w przypadku pierścienia nr 1 było użytych 10 rodzajów podstawników, w przypadku pierścienia nr 2 było to 11 podstawników, a w miejscu pierścienia nr 3 wstawiano kolejno 12 związków (Ryc. 4) [20]. Pochodne były tworzone w dwóch seriach po 132 mieszaniny zawierające 10 związków. Wykonanie biblioteki składało się z ośmiu operacji, co pozwoliło uzyskać 40% Badania prowadzone w Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku skoncentrowano na analogach karbocyklicznych distamycyny i netropsyny, czyli związkach, w których pierścienie N-metylopirolowe zastąpiono benzenowymi. Pochodne te charakteryzują się większą stabilnością w różnych warunkach reakcji oraz łatwością syntezy, a substratami są ogólnie dostępne nitrowe pochodne benzenu. Związki te po redukcji, w reakcji z odpowiednimi chlorkami kwasowymi, prowadzą do uzyskania pochodnych amidowych. Modelowanie molekularne potwierdza, iż mają one odpowiednią budowę, by wiązać się w małym rowku B-DNA [21, 22]. Większy stopień specyficzności wiązania karbocyklicznych analogów z DNA, wobec regionów bogatych w sekwencje A-T w porównaniu do G-C potwierdzono także metodą wypierania bromku etydyny (ang. ethidium displacement assay) [23, 24]. Analogi 5A i 7A (Ryc. 5) wykazały aktywność wobec linii komórkowej raka sutka MCF-7, z wartościami IC 50 odpowiednio i μm. Analogi z grupami metoksylowymi w pozycji orto do grupy amidowej były mniej aktywne wobec komórek MCF-7 [25], ale wszystkie analogi zawierające trzy grupy benzenokarboksyamidowe wykazały aktywność wobec topoizomerazy I [23]. Karbocykliczne leksitropsyny z alifatycznym łącznikiem (4 lub 6 grup CH 2 ) pomiędzy środkowymi pierścieniami benzenowymi oraz z niepodstawioną terminalną grupą NH 2 (Ryc. 5 9A), hamowały in vitro zarówno aktywność topoizomerazy typu pierwszego, jak i drugiego [26]. Opisane leksitropsyny z N-terminalnie przyłączoną jednostką chlorambucylu przejawiały aktywność wobec linii komórkowej raka sutka MCF-7 [24], a z grupą 5-[N,Nbis(2-chloroetylo)amino]-2,4-dinitrobenzoilową wobec raka wątroby HEP G2 w warunkach hipoksyjnych [27].

5 Przyłączenie kwasu benzotriazolo-5-karboksylowego pozwoliło otrzymać pochodne mające właściwości przecinające nici DNA [28]. Osiem analogów distamycyny zawierających obok benzenowych, także pierścienie tiazolowe i pirydynowe, otrzymane drogą syntezy tradycyjnej, hamowało proliferację komórek raka sutka MCF-7 (IC 50 w zakresie μm) i MDA-MB-231 ( μm). Związki te wiązały się z DNA, choć nieco słabiej niż distamycyna, a także hamowały działanie topoizomeraz I i II DNA [29]. Stwierdzono, że związki 4-6 (Ryc. 5) poza aktywnością wobec linii komórkowych raka sutka i hamowaniem działania topoizomeraz DNA, charakteryzują się także aktywnością wobec enzymów proteolitycznych, plazminy i urokinazy [30]. Podsumowanie Zbadanie budowy i oddziaływania netropsyny i distamycyny z DNA przyczyniło się w znacznym stopniu do zrozumienia zasady rozpoznawania sekwencji DNA przez leki, a co za tym idzie do zsyntezowania kilku klas nowych związków potencjalnie użytecznych w chemioterapii przeciwnowotworowej [2]. Chemiczna struktura analogów netropsyny i distamycyny może być modyfikowana w szerokim zakresie, co pozwala osiągnąć pożądaną aktywność i selektywność wobec DNA. Z tego powodu wydaje się, że opisane antybiotyki będą nadal inspirować projektowanie i syntezę nowych związków o aktywności przeciwnowotworowej, mimo że niewiele, jak dotąd, analogów tych związków zostało poddanych badaniom klinicznym. Piśmiennictwo 1. Chabner AB i wsp. Leki przeciwnowotworowe. W: Farmakologia Goodmana & Gilmana. (Red. Brunton LL, Lazo JS, Parker KL, Wyd. I, (Red. Polska: Krzemiński TF, Buczko W, Czuczwar SJ) Czelej 2007; T. II: (a) Bailly C, Chaires JB, Sequence-specific DNA minor groove binders. Design and synthesis of netropsin and distamycin analouges, Bioconjugate Chem 1998; 9: (b) Dervan PB, Molecular Recognition of DNA by Small Molecules, Bioorg Med Chem 2001; 9: (a) Finlay AC i wsp., Netropsin, a new antibiotic produced by Streptomyces, J Am Chem Soc 1951; 73: (b) Arcamone FS i wsp., Structure and sintesis of distamycin A, Nature 1964; 203: Goodsell D, Dickerson RE, Isohelical analysis of DNA groove binding drugs, J Med Chem 1986; 29: Berman HM i wsp., Synthesis, DNA binding and antiviral activity of distamycins analogues containing different heterocyclic moieties, Bioochim Biophys Acta 1979; 561: Wartell RM, Larson JE, Wells RD, Netropsin. A specific probe for A-T regions of duplex deoksyribonucleic acid, J Biol Chem 1974; 249: Chandra P, Zimmer Ch, Thrum H, Effect of distamycin A on the structure and tamplate activity of DNA in RNA polymerase system, FEBS Lett. 1970; 7: Poot M i wsp., The minor-groove binding DNA-ligands netropsin, distamycin A and berenil cause polyploidisaton via impairment of the G2 phase of the cell cycle, Cell Struct Funct 1990; 15: Chen AY i wsp., DNA minor groove-binding ligands: A different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: (a) Sidorova NY, Gazoni P, Rau DC, Competition between netropsin and restriction nuklease EcoR1 for DNA binding, J. Biomol. Struct. Dyn. 1995; 13: (b) Turner PR, Denny WA, The mutagenic properties of DNA minor-groove binding ligands, Mutation Res 1996; 355: Di Marco A i wsp., Experimental studies on distamycin A- a new antibiotic with cytotoxic activity, Cancer Res Rep 1962; 18: Feriotto G, Misachiati C, Gambari R, Sequence specific recognition of the HIV-1long terminal repeat by distamycin: a DNA-ase I footprinting study, Biochem J 1964; 299: Raczyńska-Bojanowska K, Antybiotyki w badaniu procesów biochemicznych, PWN, Warszawa 1974, 200 i Pawełczyk E., Chemia leków. Podręcznik dla studentów farmacji, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1986, Remers WA, Lyengar BS, Antitumor antibiotics. W: Foye W. O. Red. Cancer Chemotherapeutic Agents, American Chemical Society, Washington 1995, Caia X, Gray PJ Jr., Von Hoff DD, DNA minor groove binders: Back in the groove, Cancer Treat Rev, 2009; 35: Broggini M i wsp., Selective DNA Interaction of the Novel Distamycin Derivative FCE 24517, Cancer Res 1991; 51: Pindur U, Jansen M, Lemster T, Advances in DNA-ligands with groove binding, intercalating and/or alkylating activity: chemistry, DNA-binding and biology. Current Med Chem 2005; 12(2): Geroni C i wsp., Brostallicin, a Novel Anticancer Agent Whose Activity Is Enhanced upon Binding to Glutathione, Cancer Res 2002; 62: ( ). 20. Hall DG., Manku S, Wang F, Solution- and solid-phase strategies for the design, synthesis, and screening of libraries based on natural product templates: a comprehesive survey, J Comb Chem 2001; 32: Bielawski K i wsp., Molecular modeling of the interaction of carbocyclic analogues of netropsin and sitamycin with d(cgcgaattcgcg) 2, Acta Biochim Polon 2000; 47: Bielawski K i wsp., Molecular modeling of the interaction of carbocyclic analogues of netropsin and sitamycin with d(cgcgaattcgcg) 2, Acta Biochim Polon 2000; 47: Bartulewicz D, Bielawski K, Bielawska A. Carbocyclic analogues of netropsin and distamycin: DNA-binding properties and inhibition of DNA topoisomerases, Arch Pharm Pharm Med Chem 2001; 9:

6 24. Bartulewicz D i wsp. Synthesis, molecular modelling, and antiproliferative and cytotoxic effects of carbocyclic derivatives of distamycin with chlorambucil moiety, Eur J Med Chem 2001; 36: Bartulewicz D i wsp. Molecular modelling, synthesis and antitumour activity of carbocyclic analogues of netropsin and distamycin new carriers of alkylating elements, Acta Biochim Polon 2000; 47: Pućkowska A i wsp. New carbocyclic analogues of netropsin: Synthesis and inhibition of topoisomerases, Acta Biochim Polon 2002; 49: Markowska A i wsp. New carbocyclic lexitropsin with dinitromustard as N-terminal fragment. Inhibition of topoisomerases. Acta Polon Pharm 2003; 60: Pućkowska A, Drozdowska D, Midura-Nowaczek K, Carbocyclic analogues of lexitropsin - DNA affinity and endonuclease inhibition. Acta Polon Pharm 2007; 64: Drozdowska D i wsp. Synthesis and biological evaluation of distamycin analogues new potential anticancer agents 342 (2009) Drozdowska D i wsp. Carbocyclic potential DNA minor groove binders and their biological evaluation, J Enz Inhib Med Chem, 2010 (w druku). data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r Adres do korespondencji: Danuta Drozdowska Zakład Chemii Organicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Mickiewicza 2A, Białystok, tel , fax e -mail: danuta.drozdowska@umwb.edu.pl.