Pracownia studencka Zakładu Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Transkrypt

1 UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ EMII Pracownia studencka Zakładu Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 3 Rola wiązań specyficznych i niespecyficznych w mechanizmie rozdzielania związków o właściwościach zasadowych na fazach odwróconych RP-PL KURS: Zastosowanie chromatografii cieczowej w chemii i ochronie środowiska Gdańsk,

2 1. Wstęp teoretyczny 1.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnym i odwróconym układzie faz W zależności od polarności faz wyróżnia się chromatografię w normalnym (ang. NP normal phase) i w odwróconym układzie faz (ang. RP reversed phase). Porównanie tych dwóch układów przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Porównanie układu faz normalnych i odwróconych echy układów Układ faz normalnych Układ faz odwróconych Polarność fazy stacjonarnej wysoka niska Polarność fazy ruchomej niska-średnia średnia-wysoka Typowa faza ruchoma heptan/l 3 3/ Kolejność wymywania Wzrost retencji substancji rozpuszczonych jako pierwszy wymywany jest związek najmniej polarny zmniejszenie polarności fazy ruchomej jako pierwszy wymywany jest związek najbardziej polarny zwiększenie polarności fazy ruchomej Przez normalny układ faz rozumiemy układ, w którym faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma. Mechanizm rozdzielania analitów w NP-PL jest oparty na procesach adsorpcyjnych. Tak jak w innych technikach chromatografii cieczowej, rozdzielenie w NP-PL następuje w wyniku konkurencji pomiędzy cząsteczkami analitu a cząsteczkami fazy ruchomej o miejsca aktywne sorpcyjnie na powierzchni fazy stacjonarnej. Im silniejsze oddziaływanie analit - faza stacjonarna, tym anality są dłużej zatrzymywane w kolumnie (tym większa jest ich retencja). ła adsorpcji wzrasta ze wzrostem polarności analitów. Najczęściej stosowaną fazą stacjonarną w NP-PL jest krzemionka (Rysunek 1). Rzadziej używane są inne porowate tlenki np. tlenek glinu. Powierzchnia tych faz stacjonarnych jest gęsto pokryta grupami hydroksylowymi, które powodują, że powierzchnia ta jest silnie polarna. Rysunek 1. Struktura krzemionki Na powierzchni krzemionki występują różne miejsca aktywne. Są to grupy silanolowe i grupy siloksanowe. Grupy silanolowe występują jako: wolne grupy silanolowe (o najwyższej zdolności adsorpcyjnej), geminalne (podwójne) grupy silanolowe oraz wicynalne grupy silanolowe. Struktury i zawartości procentowe tych grup na powierzchni krzemionki przedstawiono w Tabeli 2. 2

3 Tabela 2. Struktura i zawartość procentowa grup silanolowych występujących na powierzchni krzemionki Nazwa grup silanolowych Struktura Zawartość procentowa [%] WLNE 6 19 WIYNALNE GEMINALNE Dodatkowo na powierzchni krzemionki zlokalizowane są grupy siloksanowe, stanowiące % w porównaniu do całkowitej liczby grup silanolowych, które powstają w wskutek dehydroksylacji grup hydroksylowych. Faza ruchoma w normalnym układzie faz składa się z niepolarnego rozpuszczalnika np. heksanu, heptanu i niewielkiego dodatku modyfikatora o charakterze polarnym. Typowymi dodatkami polarnymi są alkohole (np. metanol, etanol). Ich dodatek pozwala na kontrolowanie retencji analitu w kolumnie. Stosowane rozpuszczalniki, ułożone według wzrastającej polarności i mocy elucyjnej tworzą tak zwany szereg eluotropowy (Rysunek 2). Ze wzrostem polarności fazy ruchomej zwiększa się retencja analitów. Rysunek 2. Szereg eluotropowy rozpuszczalników 3

4 Normalny układ faz jest rzadziej stosowany niż odwrócony układ faz. Spowodowane jest to znaczną hydrofilowością polarnej fazy stacjonarnej w NP-PL, która silnie adsorbuje wodę znajdująca się w niewielkich ilościach w rozpuszczalnikach, co prowadzi do zmian właściwości wypełnienia kolumny i ostatecznie dezaktywacji jej powierzchni. Takie procesy nie zachodzą na fazie stacjonarnej w odwróconym układzie faz, co znacznie wydłuża żywotność kolumny. Faza stacjonarna w RP-PL ma charakter bardziej hydrofobowy w stosunku do fazy ruchomej. Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę wody i rozpuszczalnika organicznego w niej rozpuszczalnego, np. metanolu czy acetonitrylu. Również tutaj siłę wymywającą rozpuszczalnika można określić posługując się szeregiem eluotropowym (Rysunek 2). Natomiast jako fazę stacjonarną używa się najczęściej krzemionkę zmodyfikowaną grupami alkilowymi - alifatycznymi bądź aromatycznymi. gólnie przyjęte jest, że mechanizm rozdzielania w RP- PL oparty jest na oddziaływaniach hydrofobowych, które wynikają z istnienia sił odpychających/przyciągających pomiędzy polarnym eluentem, względnie niepolarnym analitem i niepolarną fazą stacjonarną. RP-PL posiada wiele zalet w porównaniu do NP-PL. Należą do nich m.in.: 1) zdolność rozdzielenia związków o szerokim zakresie polarności, 2) niższy koszt faz ruchomych, 3) szybsze ustalenie stanu równowagi fazy ruchomej w kolumnie, 4) możliwość separacji związków jonowych i jonizowalnych przez użycie odczynników tworzących pary jonowe, 5) szybsze analizy i wyższa ich powtarzalność. dwrócony układ faz ma także pewne ograniczenia. Dla wielu faz związanych, stabilność wypełnienia kolumny utrzymuje się tylko w zakresie p od 3 do 8 (związane jest to ze stabilnością krzemionkowego szkieletu złoża oraz chemicznie związanych modyfikatorów jego powierzchni). Kolejną wadą jest obecność resztkowych grup silanolowych na powierzchni krzemionki, co wynika z niepełnego przereagowania grup hydroksylowych krzemionki z odczynnikami alkilującymi. Może to powodować wydłużenie czasów retencji analitów i niepowtarzalność wyników uzyskanych na różnych kolumnach z powodu silnej adsorpcji substancji badanej oraz asymetrię pików, szczególnie związków o charakterze zasadowym w formie sprotonowanej. W przypadku ogonowania piku współczynnik asymetrii przekracza graniczną wartość symetryczności piku (równą 1,15). Natomiast w przypadku rzadziej występującego zjawiska przodowania piku wartość ta jest niższa od 0,95. Poszerzanie i ogonowanie pików w chromatografii powoduje m.in. niejednorodność fazy stacjonarnej. Wynika to z obecności na jej powierzchni dwóch miejsc adsorpcji, różniących się szybkością kinetyki (przenoszenia masy próbki) oraz procesu adsorpcji-desorpcji. Na powierzchni fazy stacjonarnej występuje kilka silnych miejsc o dużej energii adsorpcji (zjonizowane silanole) w obecności dużej liczby miejsc o małej energii adsorpcji (hydrofobowe ligandy). Sprotonowane formy analitów o charakterze zasadowym silniej oddziałują ze zjonizowanymi silanolami niż za pomocą oddziaływań hydrofobowych z ligandami fazy stacjonarnej. W momencie wzrostu ilości substancji następuje nasycenie miejsc wysokoenergetycznych, wówczas substancja adsorbuje się w miejscach niskoenergetycznych. Biorąc pod uwagę obecność silnych i słabych miejsc adsorpcji ogonowanie pików może wynikać ze znacznie wolniejszego procesu sorpcji-desorpcji cząsteczek analitów z silnych miejsc adsorpcji w porównaniu do słabych miejsc. W celu ujednolicenia energetycznie powierzchni fazy 4

5 stacjonarnej, czyli dążenia do występowania jednego rodzaju oddziaływań dodaje się do fazy ruchomej m.in. ciecze jonowe czy aminy, oddziałujące z miejscami sorpcyjnie aktywnymi. W wyniku tego, desorpcja substancji rozpuszczonej z powierzchni fazy stacjonarnej następuje z taką samą szybkością, powodując poprawę kształtu pików. Innymi źródłami ogonowania lub niesymetryczności pików mogą być m.in: Niewłaściwie zapakowane czoło kolumny - może powodować rozdwajanie pików Zbyt duża siła elucyjna rozpuszczalnika próbki Zanieczyszczone czoło kolumny Wiek kolumny Przebicie kolumny - zmiany kształtu spowodowane mogą być także tym, iż każda kolumna posiada określoną pojemność sorbcyjną (tj. ilość półek teoretycznych dla dalej substancji), zbyt duże objętości nastrzyku lub zbyt duże dozowane stężenia powodują, że kolumna jest przeładowana becnością martwych objętości w kolumnie oraz złe podłączenie kolumny do drenów Zbyt krótki okres kondycjonowania kolumny - wpływa na odtwarzalność kształtu sygnałów, podobnie jak jednorodność przepływu (brak pulsacji w układzie pomp), zmiany składu fazy ruchomej 1.2. Fazy stacjonarne zbudowane ze zmodyfikowanej krzemionki Złoże zbudowane z krzemionki można modyfikować wieloma podstawnikami różniącymi się polarnością, co uznaje się za główną z jej zalet. Wśród niepolarnych podstawników wymienić można łańcuchy alkilowe np. 4, 8, 18, 30 (Rysunek 3). Mniej niepolarne są złoża zmodyfikowane niepolarnymi łańcuchami alkilowymi zawierające polarne grupy takie jak fenyl, amid, -N2, -N, -N2 (Rysunek 3). kazuje się, że nie można całkowicie pokryć grup silanolowych znajdujących się na powierzchni krzemionki. Grupy hydroksylowe niepodstawione nazywane są resztkowymi grupami silanolowymi. Ilość takich grup świadczy o jakości wykonania kolumny. statecznie, zmodyfikowane fazy stacjonarne zawierają najczęściej dwa centra adsorpcji, hydrofobowe grupy alkilowe bądź arylowe, które mogą zawierać polarne grupy funkcyjne oraz polarne, resztkowe grupy silanolowe. Właściwości chemiczne faz stacjonarnych na bazie krzemionki w odwróconym układzie faz są określone przez strukturę związanych z powierzchnią ligandów, ich długości, gęstości pokrycia (stężenia powierzchniowego), jednorodności pokrycia, mobilności, ale także przez obecność resztkowych grup silanolowych. 5

6 Rysunek 3. Różne rodzaje połączeń faz stacjonarnych używanych w chromatografii cieczowej: (A) grupa oktadecylowa, (B) grupa oktylowa, () grupa fenylo-propylowa, (D) grupa amino-propylowa, (E) grupa N- acyloamidowa, (F) cholestero-amidowa Fazy stacjonarne w odwróconym układzie faz traktowane są jako system trójwymiarowy, do których wnętrza substancje rozpuszczone i składniki fazy ruchomej mogą przenikać na różną głębokość. Proces ten jest uzależniony od wielkości i struktury związanych z nimi ligandów. W strukturze fazy stacjonarnej wyróżnia się dwa rodzaje miejsc o właściwościach aktywnie sorpcyjnych, które są określone na podstawie rozkładu energii (Rysunek 4). Miejsca wysokoenergetyczne są najprawdopodobniej ośrodkami głęboko ukrytymi w warstwie związanej z grupami alkilowymi, więc ich dostępność jest kontrolowana przez wielkość tych cząsteczek. Mniejsze substancje rozpuszczone mogą przenikać głębiej wewnątrz warstwy związanej niż większe. Miejsca niskoenergetyczne występują na granicy łańcuchów alkilowych i fazy ruchomej. Rysunek 4. Występowanie miejsc nisko- i wysokoenergetycznych na zmodyfikowanej krzemionce 6

7 1.3. Mechanizm retencji na fazach RP Zatrzymywanie (retencja) analitu w kolumnie zależy od siły jego oddziaływania z fazą stacjonarną wypełnienia kolumny chromatograficznej. W Tabeli 3 znajduje się opis podstawowych oddziaływań, których suma ma pływ na czas retencji analitu. Zostały one także przedstawione graficznie na Rysunku 5. Tabela 3. ddziaływanie cząsteczkowe w RP-PL ddziaływanie cząsteczkowe Wkład do RP Dyspersyjne, hydrofobowe ddziaływanie specyficzne dla układu RP. Występuje pomiędzy hydrofobowymi elementami cząsteczki analizowanej a łańcuchami alkilowymi, które wprowadzono na szkielet krzemionkowy kolumn typu 18 czy 8. Im jest silniejsze tym większa jest retencja analitu, stąd przybliżoną retencję można przewidzieć znając wartości log P mieszaniny analitów. ddziaływania pi-pi, Występujący gdy cząsteczka oznaczana posiada wiązania aromatyczne nienasycone, w tym aromatyczne i gdy faza stacjonarna posiada wbudowane grupy fenolowe Wiązania wodorowe (charakter kwasowy) ddziaływania dipol-dipol (charakter zasadowy) ddziaływania jonowe Występują w przypadku gdy analit może być donorem lub akceptorem wodoru i gdy faza stacjonarna posiada grupy funkcyjne, które takimi donorami lub akceptorami mogą być bserwowane gdy faza stacjonarna posiada specyficzne grupy funkcyjne ddziaływania niespecyficzne dla RP-PL (pierwotne dla faz normalnych) pomiędzy analitem a fazą stacjonarną w przypadku gdy faza posiada dużą gęstość resztkowych grup hydroksylowych. Wiązanie to należy usuwać / supresować, gdyż negatywnie wpływa na retencję związków o właściwościach zasadowych. czywiście na retencję analitu wpływa znacznie więcej czynników, takich jak rodzaj modyfikatora organicznego, rodzaj dodatku do fazy ruchomej i jej p, sprawność układu i jego parametry (przepływ, rodzaj i rozmiary kolumny, temperatura). 7

8 Rysunek 5. Przykłady modyfikacji krzemionki i ich polarność 1.4. Supresja resztkowych grup silanolowych W celu dezaktywowania grup silanolowych stosuje się proces określany w języku angielskim jako end-capping, natomiast w polskim jako zabezpieczanie resztkowych grup silanolowych. Jest to proces, w którym resztkowe grupy silanolowe są przekształcane w znacznie mniej polarne grupy funkcyjne. Wpływa to na zmniejszenie wtórnego ich oddziaływania z cząsteczkami polarnymi analitów. ddziaływania silanolowe prowadzą do asymetrii piku, niskiej wydajności kolumn i nieodtwarzalności retencji. Proces end-capping zmniejsza ogonowanie pików na chromatogramach analiz polarnych analitów. Najczęściej stosowanymi czynnikami chemicznymi używanymi w celu blokowania wolnych grup silanolowych są trimetylochlorosilan (TMS) i heksametylodisilazan (MDS), wprowadzające ugrupowania trimetylosililowe (TMS) (Rysunek 6) wprowadzony ligand (TMS) Rysunek 6. Powierzchnia krzemionki z zabezpieczonymi grupami silanolowymi poprzez wykorzystanie TMS lub MDS szacowano, że efektywność procesu end-capping wynosi 50 %, co oznacza, że następuje zablokowanie tylko około 50 % ilości resztkowych grup silanolowych. Innym sposobem tłumienia oddziaływań pomiędzy analitem a resztkowymi grupami silanolowymi jest 8

9 dodatek do fazy ruchomej alkiloamin, takich jak: trietyloamina (TEA), dimetylooktyloamina (DMA), cykloheksyloamina, czwartorzędowe jony amoniowe, czy rzadziej dwuwartościowe kationy lub po prostu amoniak. Na Rysunku 7 przedstawiono przykładowy wpływ dodatku TEA i zmiany p na czas retencji i symetrię pików związków z grupy pochodnych fenyloetyloamin. Rysunek 7. hromatogram PL-UV/Vis rozdziału związków zasadowych (1. fenylopropanoamina, 2. efedryna, 3. amfetamina, 4. meta-amfetamina, 5. fenteramina) w kolumnie typu 8 (4.6x150mm, 5 µm) z zastosowanie fazy nośnej 85 % buforu fosforanowego 10 mm i 15 % AN oraz jej modyfikacji 1.5. Teoria półek teoretycznych W chromatografii podziałowej rozdzielanie składników próbki jest wynikiem ich różnej rozpuszczalności w fazach chromatograficznych. Dla zobrazowania procesu podziału przyjmuje się, że kolumna chromatograficzna składa się z wielkiej ilości połączonych ze sobą sekcji, czyli tzw. półek teoretycznych. Termin ten został zaczerpnięty z teorii destylacji i ma wymiar całkowicie teoretyczny. Pod pojęciem półki teoretycznej rozumiemy taką objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan (dynamicznej) równowagi pomiędzy stężeniem związku w fazie stacjonarnej, a jego stężeniem w fazie ruchomej. Sprawność kolumn chromatograficznych decyduje o tym, czy uzyskane piki są wąskie czy szerokie. Sprawność kolumn zależy od liczby półek teoretycznych (N) w danej kolumnie. Im więcej półek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych substancji są węższe. 9

10 Liczba półek teoretycznych zależy od długości kolumny L oraz od wysokości pojedynczej półki : N = L/ gdzie: N liczba półek teoretycznych, L długość kolumny, wysokość równoważna półce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT Im większa jest wysokość półki teoretycznej, tym mniej półek teoretycznych znajduje się w danej kolumnie i tym mniej sprawna jest kolumna, co powoduje, że uzyskane piki rozdzielanych substancji są szersze. Liczbę półek teoretycznych, czyli sprawność kolumny można wyznaczyć bezpośrednio z chromatogramu przy użyciu substancji testowej. Substancją testową może być związek, dla którego współczynnik retencji k mieści się w granicach od 5 do 10. Pik substancji testowej powinien być symetryczny. Liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się z następujących zależności: N = ( t 2 R σ ) N = 5,54 ( t R W 1/2 ) N = 16 ( t 2 R ) W B gdzie: σ odchylenie standardowe krzywej Gaussa (szerokość piku na wysokości równej 0,882 h), W1/2 szerokość piku w połowie jego wysokości, WB szerokość piku przy podstawie. Wszystkie wielkości mierzone są w jednostkach czasu i wyznaczane bezpośrednio z chromatogramu (Rysunek 8). Liczba półek teoretycznych jest oczywiście wartością bezwymiarową. 2 Rysunek 8. Sposób wyznaczania wartości niezbędnych do obliczenia sprawności kolumny 10

11 Efektywną liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się z następujących zależności: N ef = 5,54 ( t 2 R t M ) W 1/2 N ef = Nx ( k k ) Sprawność rozdzielenia jest wyrażana także rozdzielczością pików. Rozdzielczość pików określa rozdzielenie dwóch pików z uwzględnieniem ich średnich szerokości na linii podstawy. Rozdzielczość pików liczy się z następującego wzoru: gdzie: R S = 2(t R2 t R1 ) W B1 + W B2 RS rozdzielczość pików, nazywana też zdolnością rozdzielczą kolumny, tr1 czas retencji substancji 1, tr2 czas retencji substancji 2, przy czym tr2 > tr1, WB1 szerokość piku 1 na linii podstawy, WB2 szerokość piku 2 na linii podstawy. 2. el ćwiczenia elem ćwiczenia jest zapoznanie się z mechanizmem rozdzielania w RP-PL na przykładzie leków o właściwościach zasadowych, sposobami supresji oddziaływań niespecyficznych i tworzeniem par jonowych. 3. zęść doświadczalna Przed przystąpieniem do ćwiczenia i włączeniem chromatografu należy sprawdzić jego stan - objętość zlewek i faz ruchomych. Dreny A i B powinny być włożone odpowiednio do butli z wodą i acetonitrylem a pozostałe dreny zanurzone w mieszaninie woda-metanol (1:1). dpowiednimi przyciskami należy włączyć pompy i detektor UV/Vis i poczekać na ustabilizowanie się detektora. W tym czasie można włączyć komputer i program zbierający dane. Następnie należy wykonać odgazowanie systemu, tj. okręcić odpowiedni zawór na pompie i włączyć przycisk purge. Poczekać na automatyczne wyłączenie się opcji purge. W tym czasie, sprawdzić aktualne p pozostałych faz ruchomych niezbędnych do ćwiczenia (Tabela 4) a następnie należy je wstawić na 10 min do łaźni ultradźwiękowej w celu odgazowania. Tabela 4. Skład oraz wartość p składnika A faz ruchomych Nr fazy Składnik A fazy ruchomej p fazy % AN mM octanu amonu + 10% AN mM octanu amonu + kwas octowy + 10% AN mm TEA + kwas octowy + 10 % AN mm heksafluorofosforan amonu +10 % AN 11

12 Wzorce oznaczanych leków (Tabela 5) powinny znajdować się w lodówce. Do analiz PL należy wykorzystać stężenie 10 µg/ml. Jeśli w wialce nie będzie wystarczającej objętości należy wykonać odpowiednie rozcieńczenie wykorzystując stężenia 100 µg/ml pojedynczych leków. Podobnie w przypadku niewystarczającej objętości faz ruchomych należy, po konsultacji z prowadzącym, przygotować odpowiednią ich ilość. Tabela 5. Struktura i właściwości badanych trójcyklicznych antydepresantów (TA) Związek Struktura pka log Ko/w Doksepina 9,3 4,3 N 3 3 Imipramina N 9,4 4,8 N 3 3 Klomipramina N l l 9,5 5,2 N 3 3 Trójcykliczne antydepresanty (ang. TA - Tricyclic Antidepressants) należą do klasy leków przeciwdepresyjnych. Ich działanie polega na blokowaniu wychwytu noradrenaliny i serotoniny w wyniku czego zwiększają poziom tych neuroprzekaźników. Poprzez przywrócenie równowagi tych neuroprzekaźników w mózgu, TA łagodzą stan depresyjny. Dodatkowo powodują uspokojenie i blokują działanie histaminy. Trójcykliczne antydepresanty wpływają również na działanie acetylocholiny, substancji chemicznej w mózgu, która wpływa na ruch mięśni i funkcje organizmu m.in. trawienie. Wyjściowymi parametrami analizy PL jest przepływ 1 ml/min, stosunek fazy A ( % AN) do B (AN) równy 65 do 35, analityczna długość fali 254 nm. Po upewnieniu się, że takie warunki są wprowadzone w systemie, należy włączyć pompę. Po ustabilizowaniu się linii bazowej na podglądzie sygnału detektora (po ok. 10 min od włączenia systemu) należy wykonać analizę mieszaniny TA dozując 10 µl próbki. Próbkę pobierać odpowiednią strzykawką, którą po zadozowaniu należy przemyć specjalnie przygotowanym metanolem. Konieczne jest także możliwe szybkie zakręcenie wialki z badanych roztworem. Po wykonaniu oznaczenia należy zbadać ten sam roztwór z zastosowaniem pozostałych czterech faz ruchomych. Przy każdej podmianie butli należy wykonać purge i odczekać min. 20 min na 12

13 skondycjonowanie systemu. Należy także określić czasy retencji analitów z zastosowaniem wybranej fazy ruchomej. Po zakończonych analizach należy powrócić do pierwotnej fazy i wypłukać kolumnę. statecznie, należy zgrać uzyskane chromatogramy, wyłączyć przepływ na pompie, poczekać aż ciśnienie spadnie do wartości bliskiej zeru, wyłączyć ją, detektor oraz komputer i monitor. 4. Wymagania do ćwiczenia i raportu Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy przygotować się z zagadnień zawartych w części teoretycznej instrukcji oraz: - wartość stałej dysocjacji kwasowej i zasada p - rodzaje wiązań międzycząsteczkowych W raporcie należy przedstawić i odpowiednio opisać uzyskane chromatogramy, policzyć liczbę półek teoretycznych dla każdego z analitu i każdej fazy ruchomej, a także rozdzielczość dla dwóch dowolnych analitów. Należy także odpowiedzieć na pytania: - dlaczego anality wychodzą z kolumny w określonej kolejności? - czy na ich oznaczanie ma wpływ p fazy ruchomej? narysować dysocjację kwasową klomipraminy i wskazać jaką ma postać zjonizowania w p 4, 9 i 11 - czy dodatek TEA jako supresanta był dobrym rozwiązaniem? - czy anality wytworzyły pary jonowe w anionem PF6 -? jak to wpłynęło na ich retencję? - które oddziaływania miały wpływ na retencję TA w kolumnie 18? - wskazać która faz ruchoma była najlepsza do analizy TA i dlaczego. 5. Spis szkła i odczynników - strzykawka mikrolitrowa 50 µl razem z opakowaniem - buteleczka z rozpuszczalnikiem do przepłukiwania - 5 butli 1 L na fazy ruchome - cylinder miarowy na 1000 ml - łaźnia ultradźwiękowa - do przygotowania faz: kwas octowy, octan amonu, trietyloamina, heksafluorofosforan amonu - acetonitryl czystości PL 6. Literatura - Techniki separacyjne, Piotr Stepnowski, Elżbieta Synak, Beata Szafranek, Zbigniew Kaczyński, Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Zygfryd Witkiewicz, Wydawnictwo WNT, opracowania własne 13